Introduction
Regulatie van celgroei en celdood immuunresponsen staat centraal in de rol van de transcriptiefactor familie van interferon regulerende factoren. IRF5 staat aangegeven als cruciaal voor de regulatie van immuunresponsen tussen type 1, een inflammatoire respons stimuleren en type 2, een immuunreactie gericht weefselherstel. IRF5 is belangrijk bij kanker 1, en autoimmuniteit 2, 3, 4, 5.
De strakke huid muis (Tsk / +) is een model voor weefsel fibrose en sclerodermie als gevolg van een verdubbeling mutatie in het fibrillin-1-gen. Deze mutatie resulteert in een strakke huid en een toename van bindweefsel. Deze muizen ontwikkelen myocardiale ontsteking, fibrose en uiteindelijk hartfalen 5, 6, 7,> 8, 9. Scleroderma is een auto-fibrotische aandoening die ongeveer 150.000 patiënten in de Verenigde Staten 6. De kenmerken van deze ziekte fibrose van organen zoals het hart 7, 8, 9, 10, 11.
De aard van de studie eiste het ontwerp van een remmend peptide. De software aanpak werd verkozen boven een traditionele benadering waarbij een faagdisplay. De software benadering is eenvoudiger en minder tijdrovend. De RCSB databank wordt gebruikt om geschikte bindingsplaatsen 12 identificeren. De interactie van de nieuw ontworpen peptide met het recombinante eiwit te bestuderen en te focussen op de binding parameters, werd een techniek genaamd biolayer interferometrie gebruikt. Biolayer interferometrie is een biosensor gebaseerd techniqUE die bepaalt bindingsaffiniteit, vereniging en dissociatie met behulp van een biosensor en een bindend monster. De biosensor kan fluorescent, luminescent, radiometrisch en colorimetrisch gelabeld. De meting is gebaseerd op massa toevoeging of depletie lijkt associatie en dissociatie 13, 14. Het doel van deze studie was de rol van IRF5 myocardiale ontsteking en fibrose begrijpen. Het doel was om inzicht te krijgen in de rol van IRF5 in de ontwikkeling van weefsel fibrose en sclerodermie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (Protocol: AUA # 1517). Alle onderzoek met muizen werd uitgevoerd in overeenstemming met de PHS beleid.
1. Ontwerp van Decoy Peptide
- Vind de IRF5 de 3D-structuur en de basis van het ontwerp op het. Ontwerp een 17 mer, genaamd IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), waarbij aspartaat (D) wordt vervangen door serine (S) aan fosforylering nabootsen IRF5 op 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analyse van 3D sulfhydrylgroepen en kennis van activeringsmechanisme IRF5, dat wil zeggen, serine fosforylering, suggereerde dat een strategie voor het richten IRF5 was een decoy peptide genereren. Zie figuur 1. Om de beste regio te identificeren in de 3D-structuur, gebruik maken van een moleculaire modellering software voor het ontwerpen van kleine molecules en peptiden 15.
OPMERKING: De kritische stap in dit proces is de beschikbaarheid van de 3D structuur van het doeleiwit en de mogelijke bindingsplaatsen. De 3D-structuur van IRF5 vertegenwoordigt hoe nauwkeurig IRF5 dimeriseert na fosforylatie. De vervanging van aspartaat voor serine of threonine wordt uitbesteed. Het peptide wordt afzonderlijk gesynthetiseerd zonder verbonden IRF5. - Repliceren de fosfo-domein door simpelweg vervangen D S. basis van de oorspronkelijke sequentie (ELSWSADSIRLQISNPD, een nieuwe peptide IRF5S met de aminozuursequentie Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D).
2. Biolayer Interferometry (BLI)
LET OP: De zuivering voor recombinante IRF5 werd uitbesteed. 16
- Biotinelabel IRF5 in een molaire verhouding van 1: 1 van biotine ligand met een biotinylatie reagens welke een lange-keten linker. De lange keten linker zal zorgen voor een meer actieve en homogeen ligand oppervlak.
- Voeg 1 ml 2 mg / ml IRF5 tot 13 ul van 20 mM biotine reagens of verhogen volumes indien nodig. Incubeer op ijs gedurende 2 uur. Na labeling Gebruik een ontzouten spin-kolom om het reactiemengsel door de gemerkte eiwitten te verwijderen.
- Incubeer de biotine-gelabelde ligand met biosensoren voor 15 min. Vermijd over-etikettering en aanpassen van de 1: 1 molverhouding. Na labeling Gebruik een ontzouten spin-kolom om het reactiemengsel door de gemerkte eiwitten te verwijderen.
- Incubeer de biotine gelabelde IRF5 biosensoren voor 10 min bij verschillende concentraties van de IRF5 decoy peptide. De associatie- en dissociatie snelheden werden bepaald zoals beschreven 10, 17, 18.
3. apoptose en proliferatie assays
- Proliferatietest via bioreductie van de tetrazolium
- Dien IRF5D verdund in PBS (1 mg /kg / d, injecteer een volume 20 ul in een 20 g muis) subcutaan met een 27-gauge naald door een standaard scruffing techniek of PBS alleen om Tsk / + en C57BL / 6J muizen gedurende 21 dagen.
- Verdoven de muizen met isofluraan (5%) en het uitvoeren van een cervicale dislocatie. Accijnzen de harten door het snijden van de borstkas geopend langs het borstbeen. Hef het hart met een tang en verwijder het hart.
- Lyseren de harten met een eiwit lysisbuffer bevattende 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 en bepaal proteïneconcentratie door Bradford assay 19.
- Coat 96-well platen met C57BL / 6J cardiale matrix geïsoleerd zoals beschreven in hoofdstuk 7 Verdun het PBS gesuspendeerd C57BL / 6J cardiale matrix tot een concentratie van 20 ug / ml en voeg 30 ul van de C57BL / 6J cardiale aan elk putje. Laten bezinken overnacht bij 37 ° C in de incubator.
- Cultuur humane navelstrengader cellen met behulp van 500 ml endotheliale basale media met 0,4% runderhersenen extract, 0,1% ascorbinezuur, 0,1% hydrocortison, 0,1% humane epidermale groeifactor, 2% foetaal runderserum en 0,1% gentamicine / amfotericine B toegevoegd. Cultuur van de cellen op platen met 96 putjes bij 5% CO2 en 95% kamerlucht met een dichtheid van 25.000 cellen per putje. Stimuleer met toenemende concentraties IRF5D tussen 0 - 100 ug / ml in het medium (volumes tussen 0 en 50 ul / ml).
- Bepaal de celproliferatie na drie dagen en verschillen in absorptie op een microplaat reader beoordelen. De reactie is een bioreductie van de MTS tetrazolium verbinding. NADPH of NADH wordt geproduceerd door dehydrogenase enzymen in metabolisch actieve cellen.
- Aangezien de MTS tetrazolium verbinding wordt ingevroren bij -20 ° C ontdooien de verbinding langzaam gedurende ongeveer 90 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer 20 ul in elk putje van een plaat 96, en kweekmedia voeg 100 ul aan. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 1-4 uur in een humidified, 5% CO 2 kamer.
- Lees absorptie bij een golflengte van 490 nm.
- Apoptoseassay via caspase-activiteit
LET OP: De experimentele set-up is hetzelfde als hierboven 3.1.1 naar 3.1.5.- Stimuleren van de cellen met toenemende concentraties van IRF5D tussen 0 - 100 ug / ml in het medium.
- Voeg groene detectie om de caspase 3/7 substraat om de EC en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Beoordeel de fluorescentie op de microplaat lezer gelijktijdig met een golflengte van absorptie / emissie van 502/530 nm. Run de experimenten in drievoud.
OPMERKING: De groen fluorescerend middel een vier aminozuur peptide gebonden aan een nucleïnezuur bindende kleurstof. Dit reagens wordt fluorescerend wanneer gesplitst na caspase 3 en 7 activatie. Deze fluorescentie wordt gemeten. Het voordeel is een vermindering van wasstappen.
4. Beoordeling van de IRF5 en ICAM-1 expressie in de Heart
- Dien IRF5D verdund in PBS (1 mg / kg / d, injecteren volume 20 uL in een 20 g muis) subcutaan met een 27-gauge naald door een standaard scruffing techniek of PBS alleen op Tss / + en C57BL / 6J muizen eenmaal per dag gedurende 21 dagen.
- Verdoven de muizen met isofluraan (5%) en het uitvoeren van een cervicale dislocatie. Accijnzen de harten door het snijden van de borstkas geopend langs het borstbeen. Hef het hart met een tang en verwijder het hart.
- Lyseren de harten met een eiwit lysisbuffer bevattende 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 en bepaal proteïneconcentratie door Bradford assay 19.
- Voer een western smet op lysaten van harten. Verdun de monsters 25 ug totaal eiwit en een volume van 40 pl met Laemmli monsterbuffer bevattende 5% mercaptoethanol. Run de monsters op 4-15% TGX gel bij 50 mV gedurende 5 min. Verhoog de spanning tot 100 mV gedurende 1 uur totdat de kleurstof voorkant opraakt.
- Plaats de gel in 1x overdracht buffer (25 mM Tris, 190 mM glycine, 20% methanol, breng de pH op 8,3 indien nodig) en incubeer gedurende 10 - 15 min.
- Monteer de overdracht sandwich (spons, filter, gel, cellulose membraan, filter, spons). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten in tussen. De blot moet op de kathode en de gel op de anode. Transfer gedurende 1 uur in de koude kamer bij 100 mA.
- De volgende dag, spoel de blot en blokkeren de achtergrond in 5% niet vette droge melk gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de blot met Tris gebufferde zoutoplossing die 5% Tween driemaal gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer overnacht met de primaire antilichamen in het primaire polyklonale antilichamen tegen IRF5 of ICAM-1. Verdun de antilichamen in Tris gebufferde zoutoplossing in een 1: 1000 verdunning.
- Verdun de secundaire antilichamen in Tris gebufferde zoutoplossing en incubeer de blot gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Voor secundaire antilichamen, gebruik mierikswortelperoxidase geconjugeerd ezel anti-muis IgG (1: 10.000) en mierikswortelperoxidase ezel anti-geit IgG (1: 10.000), respectievelijk.
- Solliciteer chemiluminescentie om de vlek na het mengen van componenten volgens het protocol van de fabrikant en incubeer gedurende 3 minuten op de banden van belang oplichten. Maak de blot een röntgenfilm. Gebruik ImageJ om de dichtheid te meten. Normaliseren van de dichtheidswaarden van de controle 10 bands.
5. Beoordeling van Inflammatory Cell Numbers na IRF5 Remming
- Dien IRF5D verdund in PBS (1 mg / kg / d) subcutaan met een 27-gauge naald door een standaard scruffing techniek of PBS alleen op Tss / + en C57BL / 6J muizen gedurende 21 dagen.
- Verdoven de muizen met isofluraan (5%) en het uitvoeren van een cervicale dislocatie. Accijnzen de harten door het snijden van de borstkas geopend langs het borstbeen. Hef het hart met een tang en verwijder het hart. Snap bevriezen en opslaan van de uitgesneden harten tot de analyse.
- Monteer de bevroren harten op tissue houders geschikt is voor de cryostaat in gebruik. Snijd 10 pm dikke bevroren secties over een cryostaat voor immunohistochemie.
- Bevestig de ingevroren secties met 1% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Permeabilize de secties met 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten.
Let op: Paraformaldehyde is een gereglementeerde kankerverwekkend en moet met zorg worden behandeld. - Verdun anti-konijn CD64, een monocyt / macrofaag marker 1: 200 in PBS. Toepassing op het vaste secties en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 min driemaal bij kamertemperatuur.
- Verdun anti-rat NIMP, een primaire neutrofielen marker 1: 200 in PBS. Toepassing op het vaste secties en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Was de dia's voor 5 min driemaal met PBS bij kamertemperatuur.
- Verdun de secundaire antilichamen anti-konijn Alexa 488 geconjugeerd en anti-rat Alexa 488 geconjugeerd 1: 200 in PBS.
- Solliciteer anti-konijn Alexa 488 en geconjugeerd anti-rat Alexa 488 geconjugeerde secundaire antilichamen voor de secties gedurende 30 minuten bij 37 ° C daarvan. Het volume antilichaam afhankelijk van de grootte van de sectie. Het bedrag moet de sectie dekken royaal. In de meeste gevallen het volume tussen 100 en 200 uL.
- Met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) als een nucleaire kleuring in een 1: 1000 verdunning in PBS. Voeg 1 ui in 1 ml PBS en gebruik de DAPI in de laatste wasstap. Voeg waterige montage media om een cover slip en zet het op de dia.
- Analyseer de fluorescent gelabelde secties van confocale microscopie met een 40x olie doelstelling. Gebruik excitatie golflengten 488 en emissie golflengten van meer dan 530 nm voor CD64 en NIMP. DAPI werd enthousiast met 360 nm en uitgezonden op 460 nm in blauw. Onderscheid monocyten / macrofagen en neutrofielen (n = 10 afbeeldingen per antilichaam uit 3 verschillende muizen in elke groep) door hun verschillende kenmerken en tellen. Versneld gegevens als het aantal getelde cellen.
6. Cel afhankelijke vasodilatatie na Remming IRF5
- Verdoven C57BL / 6J controlemuizen en Tss / + muizen met en zonder peptide behandeling met ketamine (80 - 100 mg / kg) / xylazine (10-12,5 mg / kg) mengsel. Spuit de ketamine / xylazine mengsel intraperitoneaal. handmatig Restrain de muis.
- Gebruik een 25 gauge naald of kleiner. Steek de naald in de onderste rechter kwadrant van de buik. Trek de stamper injectie opdat de naald niet in een bloedvat of de darmen.
- Zodra een voldoende niveau van anesthesie is bereikt, zet de muis in rugligging, veeg de vacht met alcohol gedrenkt gaasje, en met behulp van een schaar open de borstholte en verwijder het hart.
LET OP: Exsanguination zal de muis euthanaseren en maak dissectie gemakkelijker door het verlichten van de druk in de bloedvaten waardoor bloeden minimaliseren bij het snijden van de bloedvaten.- Open de huid usinga schaar, snijden van de borst lateraal van het kaakbot voorzichtig over de onderliggende weefsels verstoren naar de voorzijde van de kaak.
- Ontleden de facialis slagader door het verwijderen van het zachte weefsel eromheen.
- Let op: niet verwonden het vaartuig of ruk aan facialis slagader terwijl het blootgestelde weefsel badend in MOPS buffer (2,0 mM CaCl2 · 2 H 2 O, 0,02 mM EDTA, 5,0 mM glucose, 4,7 mM KCI, 1,17 mM MgSO4 · 7H 2 O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCl, 1,2 mM NaH 2PO 4 · H2O, 2,0 mM pyrodruivenzuur) om uitdroging te voorkomen. Presteren onder een binoculair stereo zoom ontleden microscoop (vergroting van 3,5X tot 45X) en een fiber optic lichtbron.
- Isoleer de facialis slagader.
- Pak de facialis proximaal van de eerste distale bifurcatie en waar de slagader wordt afgesneden. Snijd de slagader van de hoofdslagader, de externe halsslagader. Verwijder de facialis arteries van controlemuizen, Tss / + muizen met en zonder IRF5D behandeling.
- Terwijl de slagader in de tang houden, snijden de twee takken gaande de facialis, waardoor het vat voorzichtig op te tillen terwijl een ongesneden omringende weefsel kunnen worden geïdentificeerd en gescheiden.
- Ga door op deze manier tot de splitsing is bereikt snijden beide dochter slagaders vrij van het schip. Er is geen noodzaak om de bloedvaten vóór klem te snijden door verlicht druk in de vasculatuur van het hart verwijderd. Zet het vat in MOPS buffer, terwijl de andere facialis slagader wordt ontleed en geïsoleerd.
- Canule de schepen door koppelverkoop ze op glas pipetten met een terminale diameter van 125-175 urn. Vooraf het glas pipetten en buffer reservoirs met MOPS buffer.
Let op: Voorkom luchtbellen vormen in de pipetten. - Bind de schepen op de pipetten met behulp van oogheelkundige hechtingen.
- Monteer het vat kamers op een omgekeerde triocular MICRoscope met een videocamera beslag. Voer de video door middel van een video remklauw meetsysteem voor metingen op het scherm van de schepen. 20
- Druk ze in een tweestapsproces. Ten eerste, het MOPS gevulde reservoirs op een hoogte boven het vat gelijk aan 20 mmHg druk handmatig plugkraan kleppen in de leidingen reservoir aan het vat te openen. Boord van het vaartuig op tekenen van lekkage rond de band en langs de lengte van het schip. Ten tweede, verhoging van de reservoirs tot 60 mmHg dan en controleer het vat.
- Zodra een druk van 60 mmHg, De kolven equilibreren gedurende 30 min.
- Om vasodilatatie in reactie te evalueren acetylcholine (10 -7 tot 10 -4 M), preconstrict het vat een diameter van 50 - 75% van de maximale diameter behulp 1-3,0 x 10 -8 10 -7 M U46619. Nadat men het vat stabiliseren 6 min, voeg acetylcholine aan het bad in 2 minuten tijd stappen, zodat deeindconcentraties in het bad is 10 -7, 10 -6, -5 10, 10 -4. Meet de vaatverwijding in alle drie de groepen.
7. Isolatie van Cardiac extracellulaire matrix
- Verdoven C57BL / 6J controlemuizen en Tss / + muizen met en zonder behandeling met peptide isofluraan (5%) en het uitvoeren van een cervicale dislocatie. Accijnzen de harten door het snijden van de borstkas geopend langs het borstbeen. Hef het hart met een tang en verwijder het hart.
- Zet de verwijderde harten in een bekerglas en voeg 15 ml hypertone 1% natriumdodecylsulfaat (SDS). Schud de harten in 1% SDS-oplossing gedurende 18 uur bij kamertemperatuur te breken van de cellen door toevoeging van een roerstaaf tot 1% SDS-oplossing en zet het bekerglas op een roerplaat.
Let op: Wees ervan bewust dat de extracellulaire matrix uiteen zal vallen als links te lang in hypertone oplossing. Omgekeerd, als het hart niet lang genoeg wordt geschud in hypertonische oplossing, vervolgens de cellen niet goedlossen en er celresten in het bekerglas worden. - Wassen gedurende 30 minuten in 15 ml 0,5% Triton X-100. Was daarna gedurende 15 minuten met 15 ml PBS. Decellularize elk hart afzonderlijk.
- Snap invriezen de extracellulaire matrix in vloeibare stikstof en de bevroren Verpoeder cardiale extracellulaire matrix met een vooraf gekoelde mortier en stamper.
- Voeg een suspensie van de verpulverde matrix in PBS bevattende 1% antibioticum. Het volume toegevoegd in de meeste gevallen 300 pi. Ultrasone trillingen de schorsing voor 30 - 60 s op het ijs op de hoge instelling.
Opmerking: Het is belangrijk dat het monster blijft koud. Wees ervan bewust dat de schorsing is zeer viskeuze te wijten aan de hoge eiwit glycan content. - Bepaal eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-assay.
LET OP: Zorg ervoor dat er anti-biotische en anti-schimmel in de suspensie. Penicilline / streptomycine zijn de meest gebruikte en aanbevolen.
8. Beoordeling van kerntranslocatie door Immunohistochemistry
- Het coaten gerechten en dia's een eindconcentratie van 20 ug / ml van het cardiale extracellulaire matrix in PBS. Pipet 500 pi van de cardiale extracellulaire matrix oplossing in een 100 mm schaal voor het coaten en 150 pi van de uiteindelijke matrix extracellulaire oplossing op een glijbaan.
- Remmen IRF5 door toevoeging IRF5D in een 50 ug / ml concentratie 24 uur neonatale rat hartmyocyten in kweek. Laat controle myocyte culturen onbehandeld.
- Beoordelen van handel in IRF5 van het cytoplasma naar de kern met behulp van immunofluorescentie en analyseren door confocale microscopie. Identificeer de groene labeling voor IRF5, identificeren van de blauwe DAPI vlek voor de nucleus
- Breng de primaire anti-IRF5 antilichaam. Het primaire antilichaam werd gebruikt in een 1: 200 verdunning in PBS. Incubeer de glaasjes gedurende 30 minuten bij 37 ° C en volgen drie 5-min wasstappen. Het secundaire antilichaam Alexa 488-gelabeld geit anti-muis IgG-antilichaam.
- Verdun het tweede antilichaam 1: 1000 dilutie in PBS. Incubeer het secundaire antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Bereiken nucleaire vlek met DAPI. DAPI verdund 1: 1000 in PBS. Was de dia's in totaal 3 keer gedurende 5 min en voeg DAPI de derde en laatste wasstap.
- Capture handel door confocale microscopie en meet fluorescentie-intensiteit in de kernen en cytosol zoals eerder beschreven 10. Identificeer de groene labeling voor IRF5, identificeren van de blauwe DAPI vlek voor de kern. De cellen die blauwe kernen met groene etikettering in hen vertonen bevatten geactiveerd IRF5, die verhandeld uit het cytoplasma naar de kern. Wanneer IRF5 niet geactiveerd groene etikettering in de cytosol.
- Analyseer de fluorescent gelabelde cellen met confocale microscopie met een 40x olie doelstelling. Gebruik een excitatiegolflengte van 488 nm en emissie golflengtes groter dan 530 nm voor IRF5. Gebruik een excitatiegolflengte van 360 nm en een emissiegolflengte van 460 nm voor visualisatie van DAPI.
- Voer analyse van de variantie (ANOVA) voor herhaalde metingen binnen en tussen groepen. Volg ANOVA met wijziging van Students t-test Bonferroni's. Express-gegevens als de standaard fout van het gemiddelde.
- Verdoven C57BL / 6J controlemuizen en Tss / + muizen met en zonder peptide behandeling met ketamine (80 - 100 mg / kg) / xylazine (10-12,5 mg / kg) mengsel. Spuit de ketamine / xylazine mengsel intraperitoneaal. handmatig Restrain de muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten aangetoond in figuur 1 zien hoe een peptide ontwerpen. Figuur 1, linksboven toont het gebied (tussen de 2 gele pijlen, aminozuren (aa) 425-436) in IRF5 dat wordt gefosforyleerd door een aantal kinasen. Figuur 1, rechtsboven, toont een gele ovaal, waar gefosforyleerd domein IRF5's bindt. De dimere structuur van 3DSH werd gedraaid om een gespleten of de vallei aan de linkerkant van de Helix 2 (aa303-312) in acht nemen. Hier het fosfo-staartdomein van IRF5 wordt verondersteld te binden wanneer het volledig is geactiveerd (dat wil zeggen, gefosforyleerd serine), het vormen van een homodimeer en de veronderstelde biologisch actieve toestand.
In figuur 2 wordt de bindingsactiviteit gemeten biolayer interferometrie afgebeeld. Om te bepalen dat de helper peptide IRF5D niet toxisch, proliferatie en apoptose werd bepaald na behandeling van de cells met toenemende concentraties IRF5D (figuur 3). ICAM-1, een inflammatoire merker en IRF5 uitdrukkingen werden verminderd na behandeling van het Tss / + muizen met IRF5D zoals bepaald door western blot analyse (figuur 4). Het aantal neutrofielen (NIMP) en CD64 werden verlaagd zoals bepaald door immunohistochemie na behandeling met IRF5D (figuur 5). Endotheelfunctie werd verbeterd facialis slagaders Tsk / + muizen na IRF5D opzichte Tss / + muizen zonder IRF5D behandeling (Figuur 6). Grotere aantallen IRF5 positieve kernen in myocyten gekweekt op Tss / + cardiale matrix werden zichtbaar vergeleken met C57BL / 6J cardiale matrix. Behandeling van de culturen met IRF5D geleid verminderd aantal IRF5 positieve kernen (figuur 7).
Figuur 1: 3D Protein Structure van IRF5. A) De linker afbeelding toont de regio het peptide is ontworpen voor. B) De regio die wordt gefosforyleerd benadrukt door de twee gele pijlen zijn aminozuren (aa) 425-436 in IRF5. C) Het onderste paneel toont de homodimere functioneel complex. Het homodimere cijfer wordt gepresenteerd voor een betere weergave van de regio waar de gefosforyleerd staart domein van IRF5 bindt aan een homodimeer te vormen. Dit cijfer is eerder gepubliceerd 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Biolayer interferometrie van IRF5D. Deze figuur toont de binding van IRF5 om IRF5D beoordeeld door biolaye r interferometrie. Analysesoftware gebleken dat IRF5 bindt aan IRF5D met een Kd van 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M (gemiddelde ± SD, n = 3). Dit cijfer is eerder gepubliceerd 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: celproliferatie en apoptose. Deze grafieken tonen dat toenemende concentraties IRF5D hebben geen invloed op celproliferatie (links) of apoptose (rechts) en veranderde niet door de hoeveelheden IRF5D. Dit cijfer is eerder gepubliceerd 21 (gemiddelde ± SD, p <0,05, n = 4).k "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: ICAM-1 en IRF5 expressie in het Hart. ICAM-1 (A) en IRF5 (B) expressies werden afgenomen in het myocardium van Tsk + muizen na behandeling IRF5D zoals aangetoond met Western blot. De gegevens werden genormaliseerd naar de actine beladingscontrole (gemiddelde ± SD, p <0,05, n = 3). Dit cijfer is eerder gepubliceerd 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:CD64 (A) en NIMP (B) Expressie in het Hart. Het aantal monocyten / macrofagen en neutrofielen was verminderd na behandeling IRF5D zoals aangetoond door immunohistochemie (gemiddelde ± SD, * = p <0,05, C57BL / 6J versus Tss / +; # = p <0,025, Tss / + vs. Tsk / + + IRF5D; n = 3, 10 beelden per antilichaam). De pijlen wijzen monocyten / macrofagen (A) en neutrofielen (B). De schaal bars zijn 10 urn. Dit cijfer is eerder gepubliceerd 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Cell Functie en Vasodilatatie. IRF5D administratie verbeterd acetylcholine geïnduceerde vaatverwijding van facialis slagaders van Tsk / + muizen (gemiddelde &# 177; SD, p <0,05, n = 6). Dit cijfer is eerder gepubliceerd 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: IRF5 Nuclear Translocatie van IRF5 in gekweekte Myocytes met IRF5 remming. IRF5 remming door IRF5D (50 ug / ml, 24 uur) leidt tot minder IRF5 positieve kernen in myocyten gekweekt op Tss / + cardiale matrix en C57BL / 6J cardiale matrix. De pijlen tonen IRF5 positieve nuclei (gemiddelde ± SD, p <0,05, n = 3). De schaal bar is 5 micrometer. Dit cijfer is eerder gepubliceerd 21. Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel was om een IRF5 remmer te ontwerpen om de rol van IRF5 op ontsteking, fibrose, en vasculaire functie in de harten van Tsk / + muizen helderen. De bevindingen zijn dat IRF5D geen proliferatie of apoptose induceerde. Bovendien werd inflammatie verminderd en vasculaire functie verbeterd. Deze gegevens suggereren dat IRF5 speelt een belangrijke mechanistische rol in de ontwikkeling van ontsteking en fibrose in het hart van Tsk / + muizen en dat het de potentie om te dienen als een therapeutisch doelwit.
De eerste stap was een remmer te ontwerpen. Wanneer een peptide is ontworpen, een aantal punten rekening moet worden gehouden: reekslengte, secundaire structuur, residuen gevoelig voor oxidatie, aminozuursamenstelling, amidering en capping, aminozuren in het N-terminus en aminozuren in de C-terminus, en ligand gehechtheid. De ideale sequentielengte tussen 10-15 residuen met het oog beste totale opbrengst, minder onzuiverheden en lagere kosten. Het is belang-tant bewust te zijn van secundaire structuren, zoals de vorming van bèta-sheet. Beta velvorming kan leiden tot een hoge mate van verwijderde sequenties. Voorkomen residuen gevoelig voor oxidatie hetgeen kan leiden tot reacties die de effectiviteit van het peptide kan inslagpunt. Oplosbaarheid, synthese, zuivering en controle, houdt de samenstelling van het aminozuur bouwstenen voor het peptide dan 50% hydrofobe aminozuren en zorgen voor voldoende geladen residuen. N- en C- termini moeten worden gekozen een ongeladen toestand. Vermijd glutamaat aan de N-terminus en cysteïne, proline en glycine op de C-terminus voorkomen. Voeg een afstandhouder tussen het peptide en ligand te vouwen minimaliseren. Daarom zou moeten ze worden gemaskeerd als een amide zonder aanklacht.
IRF5D ontwerp is gebaseerd op de 3D-structuur. Een 17 mer, genaamd IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) is gemaakt, waarbij aspartaat (D) werd gesubstitueerd voor serine (S) aan fosforylering nabootsen IRF5 op 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Dezeaanpak is eenvoudig te wijten aan nieuwe computertechnologie. Het nadeel van deze techniek is de initiële investering in de software. Er zijn echter significante algehele besparing in vergelijking met de kosten van arbeid en materialen die in andere inhibitor ontwerpmethoden, zoals faagdisplay 22. De kritische stap in dit proces is de beschikbaarheid van de 3D structuur van het doeleiwit en de mogelijke bindingsplaatsen. De beperking van het ontwerpen van een remmer de mogelijkheid dat verkeerd vermeld wordt gekozen en de remmer niet het gewenste eiwit blokkeren. De andere mogelijkheid is een gedeeltelijke blokkering van het gewenste eiwit.
Met het peptide in de hand verplaatst de actieve het testen van de toxiciteit van de helper peptide door meting van celoverleving. Eerst IRF5D werd getest met verschillende concentraties. IRF5D induceert geen apoptose en proliferatie bevordert niet ook bij hogere concentraties. De hier gebruikte methoden standard en geven betrouwbare gegevens. De tetrazoliumkleurstof bioreductie wordt al vele jaren 23. Deze test werd gekozen vanwege de reproduceerbaarheid en tijd-effectiviteit in vergelijking met andere werkwijzen, bijvoorbeeld handmatig tellen van cellen, wat zeer tijdrovend. Met behulp van BrdU aan delende cellen te labelen vereist radioactiviteit, die gevoelig is, maar kan gevaarlijk zijn. De tetrazoliumkleurstof bioreductie tijd-efficiënt en heeft radioactiviteit niet nodig. De beperkingen van de tetrazolium kleurstof bioreductie heerst in studies met oxido- reductieve potentieel. Waar oxido-reducerende potentieel optreedt, valse positieven komen vaker voor 24.
De isolatie van de extracellulaire matrix is verkregen door het oplossen van alle myocardiale cellen met een hypertone oplossing. Het protocol werd ontwikkeld van studies met een perfusie-inrichting een simpele roeren proces 25. de Duration werd empirisch bepaald door het nemen verschillende tijdstippen: 12, 14, 16, 18, 20 uur. De extracellulaire matrix werd geanalyseerd celresten na verschillende 25 tijdstippen. De belangrijkste valkuilen van ontcelling zijn schimmel- en bacteriële besmetting. Het is aangeraden om anti-schimmel en anti-microbiële verbindingen gebruiken. Bekleden gerechten, wordt de extracellulaire matrix verpoederd en gesuspendeerd in PBS. Vanwege het hoge gehalte aan elastisch materiaal, heeft het monster niet volledig oplossen. Sonicatie op hogere intensiteit instellingen zonder het opwarmen van het monster is noodzakelijk. Het voordeel van extracellulaire matrix via andere bedekkingsmiddelen is dat de extracellulaire matrix is een samensmelting van eiwitten fysiologisch voorkomende en verbindt de in vivo en in vitro assays. Deze benadering is fysiologisch dan coaten met een enkele verbinding zoals collageen of fibronectine alleen. Het geeft ook inzicht in het belang van signalering geïnitieerd door veranderingen inde extracellulaire matrix. Een beperking van dit protocol is duidelijk de vernietiging van de matrix en het verwijderen van belangrijke signaleringscomponenten uit de matrix. Het is absoluut noodzakelijk om voorzichtig te zijn wanneer decellularizing de matrix.
Het gebruik van intacte weefsels zoals geïsoleerde vaten opent de mogelijkheid om vaatverwijding te bestuderen in situ met minimale tussenkomst van enzymen. De methode is adequaat endotheelfunctie bestuderen in een verscheidenheid aan dieren en ziekten. Duling was de eerste die deze methode te beschrijven in varkens. De schepen in de varkens zijn diep in het weefsel; vandaar de krant beschreef de gelatine fixatie. Vroege studies in vaatverwijding gebruikt halsslagaders 26. We verfijnde de techniek facialis slagaders 27 gebruiken. Facialis slagaders zijn gelijk in grootte aan een slagader weerstand dan de halsslagader. Een beperking van dit protocol is de kwetsbaarheid van het schip, dat moet worden verwijderd intact requiring praktijk.
Samengevat, het ontwikkelen van IRF5D stelde ons in staat om de betrokkenheid van IRF5 in een ontsteking en fibrose in het hart te beoordelen. Dit resulteerde in de afgebeelde gegevens in deze studie. IRF5D is een nuttig instrument om de mechanismen van IRF5 in verschillende ziekten en bestuderen suggereert IRF5 als een mogelijk doelwit drug 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
