Introduction
Reglering av celltillväxt och celldöd immunresponser är central för rollen av transkriptionsfaktorn familjen av interferon reglerande faktorer. IRF5 lyfts fram som är avgörande för regleringen av immunsvar mellan typ 1, en inflammatorisk främja respons och typ 2, ett immunsvar inriktning vävnadsreparation. IRF5 är nyckeln i cancer en, och autoimmunitet 2, 3, 4, 5.
Den täta hud mus (TSK / +) är en modell för vävnadsfibros och sklerodermi på grund av en dubbelmutation i fibrillin-1-genen. Denna mutation resulterar i en tät-hud och en ökning av bindväv. Dessa möss utvecklar myokardial inflammation, fibros och slutligen hjärtsvikt 5, 6, 7,> 8, 9. Sklerodermi är en autoimmun fibrotisk sjukdom som drabbar cirka 150.000 patienter i USA 6. Kännetecken av denna sjukdom är fibros i inre organ, inklusive hjärtat 7, 8, 9, 10, 11.
Beskaffenheten av studien krävde konstruktionen av en hämmande peptid. Tillvägagångssättet programvara valdes över en traditionell metod med hjälp av en fag display. Det tillvägagångssätt programvara är lättare och mindre tidskrävande. RCSB databank används för att identifiera lämpliga bindningsställen 12. För att studera interaktionen av nydesignade peptiden med det rekombinanta proteinet och att fokusera på de bindande parametrar, var en teknik som kallas biolayer interferometri används. Biolayer interferometri är en biosensor baserad technique som bestämmer bindningsaffiniteten, förenings- och avståndstagande genom att använda en biosensor och en bindande prov. Biosensorn kan vara fluorescerande, luminescently, radiometriskt och kolorimetriskt märkt. Mätningen baseras på mass tillägg eller utarmning liknar förening och avståndstagande 13, 14. Syftet med denna studie var att förstå betydelsen av IRF5 i hjärtinfarkt inflammation och fibros. Målet var att få inblick i rollen av IRF5 i utvecklingen av vävnadsfibros och sklerodermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (Protokoll: AUA # 1517). All forskning som involverar möss genomfördes i enlighet med PHS politik.
1. Utformning av Decoy peptid
- Hitta IRF5 3D struktur och basera designen på det. Utforma en 17 meren, benämnd IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), där aspartat (D) används i stället för serin (S) för att efterlikna fosforylering i IRF5 vid 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analys av 3D-sulfhydrylgrupper och kunskap om IRF5 mekanism för aktivering, dvs serin fosforylering, föreslog att en strategi för att rikta IRF5 var att skapa ett lockbete peptid. Se figur 1. För att identifiera den bästa regionen i 3D-strukturen, använd en molekylär modellering programvara för att designa små molecules och peptider 15.
OBS: Det kritiska steget i denna process är tillgången på 3D-strukturen för målproteinet och dess möjliga bindningsställen. 3D-strukturen av IRF5 exakt representerar hur IRF5 dimeriserar efter fosforylering. Substitution av aspartat för serin eller treonin är utlagd. Peptiden syntetiseras separat utan koppling till IRF5. - Replikera fosfo-domänen helt enkelt genom att ersätta D för S. Baserat på den ursprungliga sekvensen (ELSWSADSIRLQISNPD, göra en ny peptid IRF5S med aminosyrasekvensen av Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D).
2. Biolayer Interferometri (BLI)
OBS: Reningen för rekombinant IRF5 utlokaliserades. 16
- Biotin label IRF5 i ett molärt förhållande av 1: 1 av biotin till ligand med en biotinyleringsreagens fattande en långkedjig linker. Den långa kedjan länk kommer att säkerställa en mer aktiv och homogen ligand yta.
- Tillsätt 1 ml av 2 mg / ml IRF5 till 13 mikroliter av 20 mM biotin reagens eller öka volymerna om det behövs. Inkubera på is under 2 h. Efter märkning, använd en avsaltningsspinnkolonn för att avlägsna reaktionsblandningen från det märkta proteinet.
- Inkubera biotin-märkta liganden med biosensorer för 15 min. Undvik över märkning och justera 1: 1 molförhållande. Efter märkning, använd en avsaltningsspinnkolonn för att avlägsna reaktionsblandningen från det märkta proteinet.
- Inkubera biotin märkt IRF5 biosensorer under 10 minuter i olika koncentrationer av IRF5 lock peptiden. Föreningen och dissociationshastigheter bestämdes såsom beskrivits 10, 17, 18.
3. apoptos och proliferationsanalyser
- Proliferationsanalys via bioreduktion av tetrazolium
- Administrera IRF5D utspädd i PBS (1 mg /kg / d, injicera en volym 20 mikroliter i en 20 g mus) subkutant med en 27-gauge nål genom en standard scruffing teknik eller genom PBS ensam Tsk / + och C57Bl / 6J möss under 21 dagar.
- Söva möss med isofluran (5%) och utför en cervikal dislokation. Skära hjärtan genom att skära öppna bröstet längs bröstbenet. Lyft upp hjärtat med pincett och ta bort hjärtat.
- Lyserar de hjärtan med en protein lysbuffert innehållande 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 och bestämma proteinkoncentrationen genom Bradford-analysen 19.
- Coat 96 brunnar med C57Bl / 6J hjärt matris isolerades såsom beskrivits i avsnitt 7. Späd PBS suspenderade C57Bl / 6J hjärt matris till en koncentration av 20 mikrogram / ml och tillsätt 30 mikroliter av C57BL / 6J hjärt till varje brunn. Låt den stå över natten vid 37 ° C i inkubatorn.
- Kultur humana navel ven celler med användning av 500 ml av endotelceller basal media med 0,4% bovint hjärnextrakt, 0,1% askorbinsyra, 0,1% hydrokortison, 0,1% human epidermal tillväxtfaktor, 2% fetalt bovint serum och 0,1% gentamicin / amfotericin B tillsätts till den. Odla cellerna på 96-brunnsplattor vid 5% CO2 och 95% rumsluft med en täthet av 25.000 celler per brunn. Stimulera med ökande koncentrationer av IRF5D mellan 0 - 100 | j, g / ml i mediet (volymerna var mellan 0 och 50 | il / ml).
- Bestämma cellproliferationen efter tre dagar och bedöma skillnader i absorbans på en mikroplattläsare. Reaktionen är en bioreduktion MTS tetrazoliumförening. NADPH eller NADH produceras av dehydrogenasenzymer i metaboliskt aktiva celler.
- Som MTS tetrazoliumförening lagras frysta vid -20 ° C, tina föreningen långsamt under ca 90 minuter vid rumstemperatur. Pipett 20 mikroliter till varje brunn i en platta med 96 brunnar och tillsätt 100 mikroliter av odlingsmedier för det. Inkubera plattan vid 37 ° C under 1 till 4 h i en Humidified, 5% CO 2 kammare.
- Läs absorbans vid en våglängd av 490 nm.
- Apoptos assay via kaspas-aktivitet
OBS: Den experimentella uppställningen är samma som ovan 3.1.1 till 3.1.5.- Stimulera cellerna med ökande koncentrationer av IRF5D mellan 0 - 100 | j, g / ml i mediet.
- Lägg grön upptäckt till Caspase 3/7 substratet till EC och inkubera det i 30 minuter vid 37 ° C. Bedöm fluorescens på mikro läsaren samtidigt med en absorption / emissionsvåglängd av 502/530 nm. Köra experimenten i triplikat.
OBS: grönt fluorescerande medlet är en fyra aminosyrapeptid bunden till en nukleinsyrabindande färgämne. Detta reagens blir fluorescerande när klyvs efter kaspas 3 och 7 aktivering. Denna fluorescens mäts. Fördelen är en minskning av tvättstegen.
4. Bedömning av IRF5 och ICAM-1 expression i lyssnat
- Administrera IRF5D utspädd i PBS (1 mg / kg / d, injicera en volym 20 mikroliter i en 20 g mus) subkutant med en 27-gauge nål genom en standard scruffing teknik eller genom enbart PBS till Tsk / + och C57BL / 6J-möss en gång per dag i 21 dagar.
- Söva möss med isofluran (5%) och utför en cervikal dislokation. Skära hjärtan genom att skära öppna bröstet längs bröstbenet. Lyft upp hjärtat med pincett och ta bort hjärtat.
- Lyserar de hjärtan med en protein lysbuffert innehållande 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 och bestämma proteinkoncentrationen genom Bradford-analysen 19.
- Utför en western blöt på lysat av hjärtan. Späd proverna till 25 | j, g totalt protein och en volym av 40 mikroliter med Laemmli provbuffert innehållande 5% merkaptoetanol. Köra proverna på en 4 - 15% TGX gel vid 50 mV under 5 min. Öka spänningen till 100 mV under 1 timme tills färgen tar slut.
- Placera gelén i 1x överföringsbuffert (25 mM Tris, 190 mM glycin, 20% metanol, justera pH till 8,3 om så är nödvändigt) och inkubera under 10 - 15 min.
- Montera överförings sandwich (svamp, filter, gel, cellulosamembran, filter, svamp). Se till att inga bubblor är fångade i mellan. Blotten bör vara på katoden och gelén på anoden. Transfer under 1 timme i kylrummet på 100 mA.
- Nästa dag, skölj blotten och sedan blockera bakgrund i 5% fettfri torrmjölk under 30 minuter vid rumstemperatur. Skölj blotten med Tris buffrad koksaltlösning innehållande 5% Tween tre gånger under 5 min vardera.
- Inkubera över natten med de primära antikroppar med användning av primära polyklonala antikroppar mot IRF5 eller ICAM-1. Späd antikropparna i Tris-buffrad saltlösning i en 1: 1000 utspädning.
- Späd de sekundära antikropparna i Tris-buffrad saltlösning och inkubera blotten under 1 h vid rumstemperatur. För sekundära antikroppar, använda pepparrotsperoxidas konjugerat åsne-anti-mus-IgG (1: 10000) och pepparrotsperoxidas åsna anti-get-IgG (1: 10000), respektive.
- Applicera kemiluminescens till blotten efter blandning komponenter i enlighet med tillverkarens protokoll och inkubera i 3 min för att luminescera banden av intresse. Exponera blotten till en röntgenfilm. Använda ImageJ för att mäta densiteten. Normalisera densitetsvärdena till kontrollbanden 10.
5. Bedömning av inflammatoriska celler Numbers efter IRF5 Hämning
- Administrera IRF5D utspädd i PBS (1 mg / kg / d) subkutant med en 27-gauge nål genom en standard scruffing teknik eller genom enbart PBS till Tsk / + och C57Bl / 6J-möss under 21 dagar.
- Söva möss med isofluran (5%) och utför en cervikal dislokation. Skära hjärtan genom att skära öppna bröstet längs bröstbenet. Lyft upp hjärtat med pincett och ta bort hjärtat. Snap frysa och lagra utskurna hjärtan tills analys.
- Montera frysta hjärtan på tissUE innehavare lämpliga för kryostaten används. Skär 10 ^ m tjocka frysta snitt på en kryostat för immunohistokemi.
- Fixera de frusna sektioner med en% paraformaldehyd i fosfatbuffrad koksaltlösning under 20 min vid rumstemperatur. Permeabilisera sektioner med 0,5% Triton-X 100 i PBS i 5 min.
Varning: Paraformaldehyd är en reglerad cancerframkallande och måste hanteras varsamt. - Späd anti-kanin CD64, en monocyt / makrofag-markör 1: 200 i PBS. Tillämpas på de fasta sektioner och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta objektglasen i PBS under 5 minuter tre gånger vid rumstemperatur.
- Späd anti-rått NIMP, en primär neutrofil markör 1: 200 i PBS. Tillämpas på de fasta sektioner och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta bilderna i 5 minuter tre gånger med PBS vid rumstemperatur.
- Späd de sekundära antikropparna anti-kanin Alexa 488 konjugerad och anti-rått-Alexa 488 konjugerad 1: 200 i PBS.
- Tillämpa anti-kanin Alexa 488 konjugerad och anti-rått-Alexa 488 konjugerade sekundära antikroppar till sektionerna under 30 min vid 37 ° C i enlighet därmed. Volymen av antikropp varierar beroende på storleken av sektionen. Beloppet ska täcka avsnittet generöst. I de flesta fall volymen är mellan 100 och 200 mikroliter.
- Använda 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) som en nukleär färgning i en 1: 1000 spädning i PBS. Tillsätt 1 mikroliter i en ml PBS och använd DAPI i den sista tvättsteget. Lägg till vatten montering media till ett täckglas och placera den på bilden.
- Analysera fluorescerande delarna med konfokalmikroskopi med hjälp av en 40X olja mål. Använd excitation våglängder 488 och emissionsvåglängder större än 530 nm för CD64 och NIMP. DAPI var upphetsad med 360 nm och avges vid 460 nm i blått. Särskilja monocyter / makrofager och neutrofiler (n = 10 bilder per antikropp, från tre olika möss i varje grupp), genom deras olika märkning och räkna dem. Uttrycka data som antalet räknade celler.
6. Cell Beroende Vasodilatation efter IRF5 Hämning
- Söva C57BL / 6J kontrollmöss och Tsk / + möss med och utan peptid behandling med en ketamin (80-100 mg / kg) / xylazin (10 till 12,5 mg / kg) blandningen. Injicera ketamin / xylazin blandning intraperitonealt. Hålla tillbaka musen manuellt.
- Använd en 25 gauge eller mindre nål. Stick in nålen i det nedre högra kvadranten av buken. Dra tillbaka kolven före injektion för att säkerställa att nålen inte kommer in i ett blodkärl eller tarmen.
- När en tillräcklig nivå av anestesi har uppnåtts, fast musen i ryggläge, torka pälsen med alkohol indränkt kompress, och med hjälp av en sax öppna brösthålan och ta bort hjärtat.
OBS: Exsanguination kommer avliva musen och göra dissektion lättare genom att lindra trycket i kärlsystemet vilket minimerar blödning vid kapning blodkärl.- Öppna huden usinga sax, skära upp från bröstet lateralt till käkbenet med omsorg för att inte störa de underliggande vävnader mot framsidan av käken.
- Dissekera facialis artär genom att ta bort den mjuka vävnaden runt det.
- Varning: inte skada fartyg eller ryck på facialis artär medan den exponerade vävnaden badade i MOPS-buffert (2,0 mM CaCl2 · 2 H2O, 0,02 mM EDTA, 5,0 mM glukos, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO 4 · 7H 2 O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4 • H2O, 2,0 mM pyrodruvsyra) för att förhindra uttorkning. Fungera under ett binokulärt stereozoom dissektionsmikroskop (förstoring av 3,5X till 45X) och en fiberoptisk ljuskälla.
- Isolera facialis artär.
- Ta tag i facialis proximal till den första förgreningen och distalt där artären kommer att minska. Skär artären från moderartären, den externa karotidartären. Ta bort facialis arteriear från kontrollmöss, Tsk / + möss med och utan IRF5D behandling.
- Medan han fortfarande håller artären i tången, skär de två grenarna kommer från facialis, vilket gör att fartyget försiktigt lyftas medan någon oklippt omgivande vävnad kan identifieras och avskiljas.
- Fortsätt på detta sätt tills förgreningen har uppnåtts skära båda dotter artärer att befria fartyget. Det finns inget behov för att klämma kärlen före skärning på grund av lättad trycket i vaskulaturen från att ta bort hjärtat. Sätt kärlet i MOPS-buffert, medan den andra facialis artären dissekeras och isolerad.
- Cannulate fartygen genom att binda dem på glaspipetter med en terminal diameter av 125-175 pm. Förspänning glaspipetter och buffertreservoarer med MOPS-buffert.
Varning: Förhindra luftbubblor bildas i pipetterna. - Knyt fartyg på pipetterna med hjälp av ögon suturer.
- Montera kärlkamrarna på ett inverterat triocular microscope med en videokamera fäste. Kör video via ett videotjockleksmätning för på skärmen mätningar av fartyg. 20
- Trycksätta dem i en två-stegsprocess. Först med MOPS-fyllda reservoarer på en höjd ovanför kärlet lika med 20 mmHg tryck, manuellt öppna kranen ventilerna i reservoarledningarna till kärlet. Inspektera fartyget för tecken på att läcka runt banden och ner längden av kärlet. För det andra, höja behållarna till 60 mmHg och reinspect fartyget.
- När tryck på 60 mmHg, tillåta fartyg till jämvikt under 30 minuter.
- För att bedöma vasodilatation som svar på acetylkolin (10 -7 till 10 -4 M), preconstrict kärlet till en diameter 50-75% av sin maximala diameter med hjälp av 1-3,0 x 10 -8 till 10 -7 M U46619. Efter att fartyget stabiliseras under sex minuter, tillsätt acetylkolin till badet i 2 min varaktighet steg så attslutkoncentrationer i badet är 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. Mäta vasodilatation i alla tre grupperna.
7. Isolering av Cardiac extracellulär matrix
- Söva C57BL / 6J kontrollmöss och Tsk / + möss med och utan peptid behandling med isofluran (5%) och utför en cervikal dislokation. Skära hjärtan genom att skära öppna bröstet längs bröstbenet. Lyft upp hjärtat med pincett och ta bort hjärtat.
- Sätt de borttagna hjärtan i en bägare och tillsätt 15 ml hyperton 1% natriumdodecylsulfat (SDS). Agitera hjärtan i 1% SDS-lösning under 18 h vid rumstemperatur för att bryta upp cellerna genom tillsats av en omrörarstav till 1% SDS-lösning och sätta bägaren på en omrörningsplatta.
Varning: Tänk på att extracellulära matrisen kommer att upplösas om de lämnas för länge i hyperton lösning. Omvänt, om hjärtan inte omröres tillräckligt länge i hyperton lösning, varefter cellerna kommer inte ordentligtlösas upp och det kommer att finnas cellfragment kvar i bägaren. - Tvätta i 30 min i 15 ml 0,5% Triton X-100. Tvätta sedan i 15 minuter med 15 ml PBS. Decellularize varje hjärta individuellt.
- Snap-frysa den extracellulära matrisen i flytande kväve och Pulverisera den frysta hjärtextracellulära matrisen med en i förväg kyld mortel och mortelstöt.
- Göra en suspension av det pulvriserade matrisen i PBS innehållande 1% antibiotikum. Volymen tillsätts i de flesta fall är 300 mikroliter. Sonikera suspension 30 - 60 s på is på den höga inställningen.
OBS: Det är mycket viktigt att provet håller kallt. Var medveten om att suspensionen är mycket trögflytande på grund av den höga protein glykan innehåll. - Bestämma proteinkoncentration med användning av en Bradford-analys.
OBS: Se till att det finns anti-biotiska och anti-svamp i suspensionen. Penicillin / streptomycin är de mest använda och rekommenderade.
8. Bedömning av nukleär translokation av Immunohistochemistry
- Att belägga rätter och diabilder använda en slutlig koncentration av 20 mikrogram / ml av hjärtextracellulära matrisen i PBS. Pipettera 500 mikroliter av hjärtextracellulära matrislösning i en 100 mm skål för beläggning och 150 mikroliter av den slutliga extracellulära matrislösning på ett objektglas.
- Inhibera IRF5 genom tillsats IRF5D i en 50 | j, g / ml-koncentrationen för 24 h till råttneonatala hjärtmuskelceller i kultur. Lämna kontrollera myocyt kulturer obehandlade.
- Utvärdera handel med IRF5 från cytosolen till kärnan med hjälp av immunofluorescens och analysera med konfokalmikroskopi. Identifiera den gröna märkning av IRF5 identifiera blå DAPI fläcken för kärnan
- Applicera primära anti-IRF5 antikropp. Den primära antikroppen användes i en 1: 200 spädning i PBS. Inkubera objektglasen under 30 min vid 37 ° C och följer med tre 5-min tvättsteg. Den sekundära antikroppen var Alexa 488-märkt get-anti-mus-IgG-antikropp.
- Späd den sekundära antikroppen 1: 1000 dilution i PBS. Inkubera den sekundära antikroppen under 30 min vid 37 ° C. Uppnå nukleär färgning med DAPI. Späd DAPI 1: 1000 i PBS. Tvätta bilderna totalt 3 gånger under 5 min och tillsätt DAPI till den tredje och sista tvättsteget.
- Capture handel med konfokalmikroskopi och mäta fluorescensintensiteten i kärnan och cytosolen som tidigare beskrivits 10. Identifiera den gröna märkning av IRF5 identifiera blå DAPI fläcken för kärnan. De celler som uppvisar blå kärnor med grön märkning dem innehåller aktiverad IRF5, som trafikeras från cytosolen till kärnan. När IRF5 inte är aktiverad grön märkning återfinns i cytosolen.
- Analysera fluorescerande celler med konfokalmikroskopi med hjälp av en 40X olja mål. Använda en exciteringsvåglängd av 488 nm och emissionsvåglängder större än 530 nm för IRF5. Använda en excitationsvåglängd av 360 nm och en emissionsvåglängd av 460 nm för visualisering av DAPI.
- Utför variansanalys (ANOVA) för upprepade mätningar inom och mellan grupper. Följa ANOVA med Bonferronis modifiering av Students t-test. Uttrycka data som standardfelet av medelvärdet.
- Söva C57BL / 6J kontrollmöss och Tsk / + möss med och utan peptid behandling med en ketamin (80-100 mg / kg) / xylazin (10 till 12,5 mg / kg) blandningen. Injicera ketamin / xylazin blandning intraperitonealt. Hålla tillbaka musen manuellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten visade i fig 1 visar hur man kan utforma en peptid. Figur 1, övre vänstra, visar området (mellan de 2 gula pilar, aminosyror (aa) 425-436) i IRF5 som fosforyleras av ett antal kinaser. Figur 1, övre högra, visar en gul oval där IRF5 s fosforylerad domän binder. Den dimera strukturen hos 3DSH roterades för att observera en klyfta eller dal till vänster om Helix 2 (aa303-312). Det är där den fosfor-svansdomän av IRF5 är tänkt att binda när det är fullt aktiverad (dvs serin fosforylerad), bildar en homodimer och dess antagna biologiskt aktivt tillstånd.
I figur 2, är den bindande aktiviteten mättes genom biolayer interferometri avbildas. Att bestämma att skenmålet peptid IRF5D är inte giftig, rades proliferation och apoptos bedömdes efter behandling av den calnar med ökande koncentrationer av IRF5D (Figur 3). ICAM-1, en inflammatorisk markör, och IRF5 uttryck reducerades efter behandling TSK / + möss med IRF5D bestämt genom Western blot-analys (Figur 4). Antalet neutrofiler (NIMP) och CD64 minskade enligt bestämning genom immunhistokemi efter behandling med IRF5D (Figur 5). Endotelfunktion förbättrades i facialis artärer Tsk / + möss efter IRF5D jämfört med Tsk / + möss utan IRF5D behandling (Figur 6). Större antal IRF5 positiva kärnor i myocyter odlade på Tsk / + hjärt matris visualiserades jämfört med C57BL / 6J hjärt matris. Behandling av kulturerna med IRF5D resulterat i minskat antal IRF5 positiva kärnor (figur 7).
Figur 1: 3D Protein Structure av IRF5. A) Den övre vänstra figuren visar regionen peptiden var avsedd för. B) Regionen som håller på att fosforyleras markeras av de två gula pilar är aminosyror (aa) 425 - 436 i IRF5. C) Den nedre panelen visar homodimera funktionella komplex. Den homodimera siffra presenteras för enklare visning av det område där det fosforylerade svansdomän av IRF5 binder för att bilda en homodimer. Denna siffra har tidigare publicerats 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Biolayer interferometri av IRF5D. Denna figur visar bindningen av IRF5 att IRF5D bedömas av biolaye r interferometri. Analysprogram visade att IRF5 binder till IRF5D med ett Kd av 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M (medelvärde ± SD, n = 3). Denna siffra har tidigare publicerats 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: celltillväxt och apoptos. Dessa stapeldiagram visar att ökande koncentrationer av IRF5D har ingen inverkan på celltillväxt (vänster) eller apoptos (till höger), och ändrades inte genom att öka nivåerna av IRF5D. Denna siffra har tidigare publicerats 21 (medelvärde ± SD, p <0,05, n = 4).k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ICAM-1 och IRF5 Expression i hjärtat. ICAM-1 (A) och IRF5 (B) uttryck hade minskat i myokardiet av Tsk + möss efter IRF5D behandling såsom visas genom western blöt. Data normaliserades till den aktin laddningskontroll (medelvärde ± SD, p <0,05, n = 3). Denna siffra har tidigare publicerats 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:CD64 (A) och NIMP (B) Expression i hjärtat. Antalet monocyter / makrofager och neutrofiler minskades efter IRF5D behandling såsom visas genom immunhistokemi (medelvärde ± SD, * = p <0,05, C57BL / 6J vs. Tsk / +; # = p <0,025, Tsk / + vs. Tsk / + + IRF5D, n = 3, 10 bilder per antikropp). Pilarna markerar monocyter / makrofager (A) och neutrofiler (B). Skal barer är 10 mikrometer. Denna siffra har tidigare publicerats 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: cellfunktion och Vasodilatation. IRF5D administration förbättrad acetylkolin-inducerad vasodilatation av facialis artärer Tsk / + möss (medel &# 177; SD, p <0,05, n = 6). Denna siffra har tidigare publicerats 21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: IRF5 nukleär translokation av IRF5 i odlade Myocyter med IRF5 inhibition. IRF5 hämning av IRF5D (50 mikrogram / ml, 24 h) leder till färre IRF5 positiva kärnor i myocyter odlade på Tsk / + hjärt matris och C57Bl / 6J hjärt matris. Pilarna visar IRF5 positiva kärnor (medelvärde ± SD, p <0,05, n = 3). Skalan bar är 5 pm. Denna siffra har tidigare publicerats 21. vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet var att utforma en IRF5 hämmare att belysa rollen av IRF5 på inflammation, fibros och vaskulär funktion i hjärtat hos Tsk / + möss. Resultaten är att IRF5D inte inducera proliferation eller apoptos. Dessutom har inflammation minskade och vaskulär funktion förbättras. Dessa data tyder på att IRF5 spelar en viktig mekanistisk roll i utvecklingen av inflammation och fibros i hjärtat av Tsk / + möss och att det har potential att fungera som ett terapeutiskt mål.
Det första steget var att designa en inhibitor. När en peptid är utformad, flera punkter måste beaktas: sekvenslängd, sekundär struktur, rester utsatta för oxidation, aminosyrasammansättning, amidering och capping, aminosyror i N-terminalen och aminosyrorna i C-terminalen, och ligand fastsättning. Den idealiska sekvenslängden är mellan 10 till 15 rester för att säkerställa bästa möjliga totala avkastning, färre föroreningar, och minskade kostnader. Det är viktigt att vara medveten om sekundära strukturer som beta arkbildning. Beta arkformning kan resultera i en hög grad av borttagna sekvenser. Undvika rester utsatta för oxidation, som kan leda till sidoreaktioner, som kan påverka effektiviteten av peptiden. Att styra löslighet, syntes och rening, hålla sammansättningen av aminosyrabyggstenar för peptiden under 50% hydrofoba aminosyror och se till att det finns tillräckligt många laddade rester. N- och C- terminalerna måste väljas en oladdad tillstånd. Undvika glutamat vid N-terminalen och undvika cystein, prolin och glycin vid C-terminalen. Lägga till en spacer mellan peptiden och liganden för att minimera veckning. Därför kan de behöva vara maskerad som en amid utan avgift.
IRF5D utformning var baserad på 3D-strukturen. En 17 mer, benämnd IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) utformades, där aspartat (D) ersatte serin (S) för att efterlikna fosforylering i IRF5 vid 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Dettatillvägagångssätt är rakt fram på grund av att ny datorteknik. Nackdelen med denna teknik är den initiala investeringen i mjukvaran. Men det finns betydande besparingar jämfört med de kostnader som är förknippade med arbetskraft och material som används i andra hämmare konstruktionsmetoder, som fagdisplay 22. Det kritiska steget i denna process är tillgången på 3D-strukturen för målproteinet och dess möjliga bindningsställen. Begränsningen av att utforma en inhibitor är möjligheten att ett fel region väljs och inhibitorn inte blockerar det önskade proteinet. Den andra möjligheten är en partiell blockering av det önskade proteinet.
Med peptiden i hand fokus flyttas till att testa toxiciteten hos det lockbete peptiden genom att mäta cellöverlevnad. Först framställdes IRF5D testades med användning av varierande koncentrationer. IRF5D inte framkalla apoptos och inte främja spridningen även vid högre koncentrationer. De metoder som används här är standard och ge tillförlitliga uppgifter. Tetrazoliumfärgämnet bioreduktion har använts under många år 23. Denna analys valdes på grund av dess reproducerbarhet och tids effektivitet som jämfört med andra metoder, t ex, räkna celler manuellt vilket är mycket tidskrävande. Använda BrdU att märka celler som förökar kräver radioaktivitet, som är känslig, men kan vara farlig. Tetrazoliumfärgämnet bioreduktion är tidseffektivt och kräver inte radioaktivitet. Begränsningarna i tetrazoliumfärgämnet bioreduktion är utbredd i studier med oxido-reducerande potential. Överallt där oxido-reducerande potential uppstår falska positiva är mer frekventa 24.
Isoleringen av den extracellulära matrisen förvärvades genom att lösa alla hjärtmuskelceller med en hyperton lösning. Protokollet utvecklades från studier med en perfusion apparat till en enkel agitation process 25. den Duration bedömdes empiriskt genom att ta olika tidpunkter: 12, 14, 16, 18, 20 h. Den extracellulära matrisen analyserades med avseende celldebris efter olika tidpunkter 25. De viktigaste fallgropar decellularisering är svamp- och bakteriekontamination. Det rekommenderas att använda anti-svamp och antimikrobiella föreningar. Att belägga rätter, är den extracellulära matrisen powderized och suspenderades i PBS. På grund av den höga halten av elastiskt material, inte provet inte fullständigt lösa. Ultraljudsbehandling på högre inställningar intensitet utan att värma upp provet är absolut nödvändigt. Fördelen med att använda extracellulära matrisen framför andra beläggningsmedel är att den extracellulära matrisen är en sammanslagning av proteiner fysiologiskt förekommande och den förbinder in vivo och in vitro-analyser. Detta tillvägagångssätt är mer fysiologiska än beläggning med en enda förening som kollagen eller fibronektin ensam. Det ger också insikt om vikten av signalering initieras av förändringar iden extracellulära matrisen. En begränsning av detta protokoll är klart förstörelsen av matrisen och ta bort viktiga signalkomponenter från matrisen. Det är viktigt att vara försiktig när decellularizing matrisen.
Användningen av intakt vävnad som isolerade kärl öppnar upp möjligheten att studera vasodilation in situ och med minimal störning av enzymer. Denna metod är mest lämplig för att studera endotelfunktion i en mängd olika djur och sjukdomar. Duling var först med att beskriva denna metod hos svin. Fartygen i gris är djupt i vävnaden; hence papperet beskrivna gelatin fixering. Tidiga studier i vasodilation används halspulsåder 26. Vi förfinat tekniken för att använda facialis artärer 27. Facialis artärer är mer lika stor som ett motstånd artär än halspulsådern. En begränsning av detta protokoll är bräcklighet av fartyget, som måste tas bort intakt requiring praktiken.
Sammanfattningsvis utveckla IRF5D det möjligt för oss att bedöma medverkan IRF5 i inflammation och fibros i hjärtat. Detta resulterade i de data som avbildas i denna studie. IRF5D är ett användbart verktyg för att studera mekanismerna för IRF5 i olika sjukdomar samt föreslår IRF5 som en möjlig läkemedelsmålet 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
