Introduction
Regulation von Zellwachstum und Zelltod-Immunantworten ist, um die Rolle des Transkriptionsfaktor-Familie von Interferon regulatorischer Faktoren zentral. IRF5 wird als entscheidend für die Regulation von Immunantworten zwischen Typ 1, eine entzündliche Reaktion fördern und Typ 2, eine Immunantwort Targeting Gewebereparatur hervorgehoben. IRF5 ist der Schlüssel in der Krebs - 1 und Autoimmunität 2, 3, 4, 5.
Die straffe Haut Maus (Tsk / +) ist ein Modell für Gewebefibrose und Sklerodermie aufgrund einer Verdopplungsmutation im Fibrillin-1-Gen. Diese Mutation führt zu einer tight-Haut und eine Erhöhung in Bindegewebe. Diese Mäuse entwickeln myokardiale Entzündung, Fibrose und schließlich Herzinsuffizienz 5, 6, 7,> 8, 9. Sklerodermie ist eine Autoimmun fibrotischen Erkrankung beeinflussen etwa 150.000 Patienten in den Vereinigten Staaten von Amerika 6. Die Kennzeichen dieser Krankheit sind Fibrose der inneren Organe einschließlich des Herzens 7, 8, 9, 10, 11.
Die Art der Studie forderte die Gestaltung eines hemmenden Peptids. Der Software-Ansatz wurde eine traditionelle Ansatz unter Verwendung einer Phagen-Display ausgewählt über. Der Software-Ansatz ist einfacher und weniger zeitraubend. Die RCSB Datenbank wird verwendet , 12 geeignete Bindungsstellen zu identifizieren. Um die Interaktion des neu gestalteten Peptid mit dem rekombinanten Protein zu studieren und zu den Bindungsparameter zu fokussieren, eine Technik, genannt Bioschicht Interferometrie verwendet wurde. Bioschicht Interferometrie ist ein Biosensor basiert technique, die bestimmt, Bindungsaffinität, Assoziation und Dissoziation einen Biosensor und eine Bindungsprobe unter Verwendung. Der Biosensor kann fluoreszierend, lumineszierend sein, radiometrisch und kolorimetrisch gekennzeichnet. Die Messung basiert auf Masse zusätzlich oder Abreicherung ähnelt Assoziation und Dissoziation 13, 14. Das Ziel dieser Studie war es, die Rolle der IRF5 in myokardiale Entzündung und Fibrose zu verstehen. Das Ziel war, einen Einblick in die Rolle der IRF5 in der Entwicklung von Gewebefibrose und Sklerodermie zu gewinnen.
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Protocol
Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (: AUA # 1517 Protocol) genehmigt. Alle Forschung mit Mäusen wurde in Übereinstimmung mit PHS Politik durchgeführt.
1. Aufbau von Decoy Peptid
- Finden Sie die 3D-Struktur des IRF5 und stützen das Design auf. Entwerfen Sie ein 17 mer, genannt IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), wobei Aspartat (D) für Serin ersetzt wird (S) zu imitieren Phosphorylierung in IRF5 bei 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analyse von 3D Sulfhydrylgruppen und Kenntnis der IRF5 des Mechanismus der Aktivierung, dh, Serin - Phosphorylierung, vorgeschlagen , dass eine Strategie IRF5 zum Targeting war ein Decoy - Peptid zu erzeugen. Siehe Abbildung 1. Um die beste Region in der 3D-Struktur zu identifizieren, verwenden Sie eine Molecular Modelling-Software für die Gestaltung von kleinen moleculES- und Peptide 15.
HINWEIS: Der kritische Schritt in diesem Verfahren ist die Verfügbarkeit der 3D-Struktur des Zielproteins und seine möglichen Bindungsstellen. Die 3D-Struktur von IRF5 stellt genau wie IRF5 dimerisiert nach der Phosphorylierung. Die Substitution von Aspartat für Serin oder Threonin ist ausgelagert. Das Peptid wird getrennt synthetisiert ohne IRF5 verbunden ist. - Replizieren Sie die Phospho-Domain einfach durch D für S. Basierend auf der ursprünglichen Sequenz zu ersetzen (ELSWSADSIRLQISNPD, stellen ein neues Peptid IRF5S mit der Aminosäuresequenz von Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2 (IRF5D).
2. Bio-Layer-Interferometrie (BLI)
HINWEIS: Die Reinigung für rekombinante IRF5 ausgelagert wurde. 16
- Biotin-Markierung IRF5 in einem Molverhältnis von 1: 1 von Biotin an Liganden mit einem Biotinylierungsreagenz eine langkettige Linker enthält. Die langkettige Linker wird eine aktivere und homogene liga gewährleistennd Oberfläche.
- 1 ml 2 mg / ml IRF5 bis 13 & mgr; l von 20 mM Biotinreagens oder das Volumen zu erhöhen, wenn nötig. Inkubieren auf Eis für 2 Stunden. Nach der Markierung verwenden, um eine Spalte Entsalzung Spin des Reaktionsgemisches aus dem markierten Protein zu entfernen.
- Inkubieren des Biotin-markierten Liganden mit den Biosensoren für 15 min. Vermeiden Sie zu Kennzeichnung und stellen Sie die 1: 1-Molverhältnis. Nach der Markierung verwenden, um eine Spalte Entsalzung Spin des Reaktionsgemisches aus dem markierten Protein zu entfernen.
- Inkubieren der Biotin markiert IRF5 Biosensoren für 10 min in unterschiedlichen Konzentrationen des IRF5 Decoy-Peptid. Die Assoziation und Dissoziation Raten wurden als 10 beschrieben bestimmt, 17, 18.
3. Apoptose und Proliferationsassays
- Proliferationstest über Bioreduktion des Tetrazolium
- Verabreichen IRF5D in PBS verdünnt (1 mg /kg / d, ein Volumen 20 & mgr; l in einer 20 g Maus) subkutan mit einer 27-Gauge-Nadel durch eine Standard-scruffing Technik oder von PBS allein Tsk / + und C57Bl / 6J-Mäuse für 21 Tage zu injizieren.
- Anästhesieren die Mäuse mit Isofluran (5%) und eine zervikale Dislokation zuführen. Excise die Herzen durch Aufschneiden der Brust entlang des Brustbeins. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette und das Herz zu entfernen.
- Lysieren die Herzen mit einem Protein Lysepuffer , enthaltend 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF und 10 bestimmen die Proteinkonzentration durch Bradford - Assay 19.
- Mantel 96-Well-Platten mit C57Bl / 6J Herz Matrix isoliert, wie in Kapitel 7. Verdünnen Sie das PBS suspendiert C57Bl / 6J Herz Matrix zu einer Konzentration von 20 ug / ml, und fügen Sie 30 ul der C57Bl / 6J Herz in jede Vertiefung. Lassen Sie es über Nacht bei 37 ° C im Inkubator absetzen.
- Kultur menschlichen Nabelschnurvenen-Zellen unter Verwendung von 500 ml endothelialer basalen media mit 0,4% Rinderhirnextrakt, 0,1% Ascorbinsäure, 0,1% Hydrocortison, 0,1% human epidermal growth factor, 2% fötales Rinderserum und 0,1% Gentamicin / Amphotericin B hinzugefügt. Kultur die Zellen auf 96 - Well - Platten bei 5% CO 2 und 95% Raumluft mit einer Dichte von 25.000 Zellen pro Vertiefung. Stimulierung mit Konzentrationen von IRF5D zwischen 0 Erhöhung - 100 ug / ml in das Medium (Volumina lagen zwischen 0 und 50 & mgr; l / ml).
- Bestimmen Sie die Zellproliferation nach drei Tagen und zu beurteilen, Unterschiede in der Absorption auf einem Mikroplattenleser. Die Reaktion ist eine Bioreduktion von MTS Tetrazoliumverbindung. NADPH oder NADH wird durch Dehydrogenase-Enzyme in metabolisch aktiven Zellen.
- Da die MTS-Tetrazolium-Verbindung bei -20 ° C eingefroren gelagert, Auftauen, die die Verbindung langsam über etwa 90 Minuten bei Raumtemperatur. Je 20 & mgr; l in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, und mit 100 & mgr; l Kulturmedien zu. Inkubieren Platte bei 37 ° C für 1 bis 4 h in einer humi, verändert und 5% CO 2 Kammer.
- Extinktion bei einer Wellenlänge von 490 nm.
- Apoptosis Assay über Caspase - Aktivität
HINWEIS: Der Versuchsaufbau ist der gleiche wie oben 3.1.1 bis 3.1.5.- Stimulieren der Zellen mit Konzentrationen von IRF5D zwischen 0 zu erhöhen - 100 ug / ml in den Medien.
- In grün Erfassung auf den Caspase 3/7 Substrat auf die ECs und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Beurteilen Sie die Fluoreszenz auf der Mikroplatten-Reader gleichzeitig mit einer Absorption / Emissionswellenlänge von 502/530 nm. Führen Sie die Versuche in dreifacher Ausfertigung.
HINWEIS: Die grüne Fluoreszenzmittel ist ein Vier-Aminosäuren-Peptid an eine Nukleinsäure-bindenden Farbstoff gebunden ist. Dieses Reagenz wird fluoreszierend, wenn sie nach Caspase 3 und 7 Aktivierung abgespalten. Diese Fluoreszenz wird gemessen. Der Vorteil ist eine Verringerung der Waschschritte.
4. Bewertung der IRF5 und ICAM-1 Expression in der Heart
- Verabreichen IRF5D in PBS verdünnt (1 mg / kg / d, injizieren ein Volumen 20 & mgr; l in einer 20 g Maus) subkutan mit einer 27-Gauge-Nadel durch eine Standard scruffing Technik oder von PBS allein Tsk / + und C57BL / 6J-Mäuse einmal pro Tag für 21 Tage.
- Anästhesieren die Mäuse mit Isofluran (5%) und eine zervikale Dislokation zuführen. Excise die Herzen durch Aufschneiden der Brust entlang des Brustbeins. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette und das Herz zu entfernen.
- Lysieren die Herzen mit einem Protein Lysepuffer , enthaltend 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF und 10 bestimmen die Proteinkonzentration durch Bradford - Assay 19.
- Führen Sie einen Western-Blot auf Lysaten von Herzen. Verdünne die Proben auf 25 & mgr; g Gesamtprotein und einem Volumen von 40 ul mit Laemmli-Probenpuffer mit 5% Mercaptoethanol. Führen Sie die Proben auf einem 4-15% TGX Gel bei 50 mV für 5 min. Erhöhen Sie Spannung auf 100 mV für 1 h, bis die Farbstofffront abläuft.
- Legen Sie das Gel in 1x Transferpuffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin, 20% Methanol, pH-Wert auf 8,3, falls erforderlich) und Inkubation 10 - 15 min.
- Montieren Sie den Transfer-Sandwich (Schwamm, Filter, Gel, Cellulosemembran, Filter, Schwamm). Achten Sie darauf, keine Blasen gefangen sind dazwischen. Der Blot sollte auf der Anode auf die Kathode und die Gel sein. Transfer für 1 h im Kühlraum bei 100 mA.
- Am nächsten Tag, spülen Sie den Fleck und dann blockieren den Hintergrund in 5% fettfreie Trockenmilch für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen der Blots mit Tris gepufferter Kochsalzlösung, die 5% Tween dreimal für jeweils 5 Minuten.
- Inkubieren über Nacht mit dem primären Antikörper unter Verwendung von primären polyklonalen Antikörper gegen IRF5 oder ICAM-1. Verdünnen Sie die Antikörper in Tris Salzlösung in einem 1 gepuffert: 1000 Verdünnung.
- Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Tris-gepufferter Saline und Inkubation des Blots für 1 h bei Raumtemperatur. Für sekundäre Antikörper, Verwendung Meerrettich-Peroxidase konjugiert Esel anti-Maus-IgG (1: 10.000) und Meerrettich-Peroxidase-Esel-Anti-Ziegen-IgG (1: 10.000), respectively.
- Bewerben Chemilumineszenz dem Blot nach Vermischen der Komponenten gemäß dem Protokoll des Herstellers und Inkubation für 3 min die Bänder von Interesse zu lumineszieren. Aussetzen des Blots auf einem Röntgenfilm. Verwenden Sie ImageJ Dichte zu messen. Normalisieren der Dichtewerte an die Steuerbänder 10.
5. Bewertung der Entzündungszellen Zahlen nach IRF5 Inhibition
- Verabreichen IRF5D verdünnt in PBS (1 mg / kg / d) subkutan mit einer 27-Gauge-Nadel durch eine Standard scruffing Technik oder von PBS allein Tsk / + und C57BL / 6J-Mäuse für 21 Tage.
- Anästhesieren die Mäuse mit Isofluran (5%) und eine zervikale Dislokation zuführen. Excise die Herzen durch Aufschneiden der Brust entlang des Brustbeins. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette und das Herz zu entfernen. Snap-einfrieren und speichern Sie die ausgeschnittenen Herzen, bis die Analyse.
- Montieren Sie die gefrorenen Herzen auf tissue Halter entsprechend dem Kryostat verwendet wird. Cut 10 & mgr; m dicke gefrorene Schnitte auf einem Kryostaten für die Immunhistochemie.
- Fixieren die Gefrierschnitte mit 1% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung für 20 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren die Abschnitte mit 0,5% Triton-X 100 in PBS für 5 min.
Achtung: Paraformaldehyd ist ein regulierter Karzinogen und muss mit Vorsicht zu behandeln. - Verdünnen Anti-Kaninchen-CD64, ein Monozyten / Makrophagen-Marker 1: 200 in PBS. Übernehmen, um die festen Abschnitte und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Waschen Folien in PBS für 5 min dreimal bei Raumtemperatur.
- Verdünnen Anti-Ratten-NIMP, einen primären Neutrophilen Marker 1: 200 in PBS. Übernehmen, um die festen Abschnitte und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Waschen der Objektträger für 5 Minuten dreimal mit PBS bei Raumtemperatur.
- Verdünnen Sie die sekundäre Antikörper anti-Kaninchen Alexa 488 konjugiert und anti-Ratten-Alexa 488 konjugiert 1: 200 in PBS.
- Bewerben Anti-Kaninchen Alexa 488 konjugiert und anti-Ratte-Alexa 488-konjugierten Sekundärantikörper zu den Abschnitten für 30 min bei 37 ° C entsprechend. Das Volumen des Antikörpers richtet sich nach der Größe des Abschnitts. Der Betrag sollte den Abschnitt großzügig abdecken. In den meisten Fällen ist das Volumen zwischen 100 und 200 & mgr; l.
- Verwenden 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) als Kernfärbung in einer 1: 1.000-Verdünnung in PBS. 1 & mgr; l in 1 ml PBS und verwenden Sie die DAPI in dem letzten Waschschritt. In wässriger Montage Medien auf einem Deckglas und legen Sie sie auf die Folie.
- Analysieren Sie die fluoreszierend markierten Abschnitte durch konfokale Mikroskopie eine 40X Öl-Objektiv verwendet wird. Verwendung Anregungswellenlängen 488 und Emissionswellenlängen von größer als 530 nm für CD64 und NIMP. DAPI wurde mit 360 nm angeregt und bei 460 nm in blau emittiert. Unterscheiden Monozyten / Makrophagen und Neutrophile (n = 10 Bilder pro Antikörper, aus 3 verschiedenen Mäuse in jeder Gruppe) durch ihre unterschiedliche Kennzeichnung und zähle sie. Express-Daten wie Anzahl der gezählten Zellen.
6. Zell-abhängige Vasodilatation nach IRF5 Inhibition
- Anästhesieren C57Bl / 6J-Kontrollmäusen und Tsk / + Mäusen mit und ohne Peptid Behandlung mit einer Ketamin (80 - 100 mg / kg) / Xylazin (10 bis 12,5 mg / kg) -Mischung. Injizieren Sie die Ketamin / Xylazin-Gemisch intraperitoneal. Begrenze die Maus manuell.
- Verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel oder kleiner. Führen Sie die Nadel in den unteren rechten Quadranten des Bauches. Ziehen Sie den Kolben vor der Injektion, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht in ein Blutgefäß oder den Darm gelangt.
- Sobald ein ausreichendes Maß an Anästhesie erreicht ist, sichern Sie die Maus in die Rückenlage, wischen Sie das Fell mit Gazeauflage Alkohol getränkt und unter Verwendung der Brusthöhle Schere öffnen und das Herz zu entfernen.
HINWEIS: Exsanguination wird die Maus einschläfern und Präparation leichter durch den Druck in den Gefäßen entlastet somit Blutungen zu minimieren, wenn die Blutgefäße zu schneiden.- Öffnen Sie die Haut usinga Schere, Schneiden von der Brust lateral der Kieferknochen mit Sorgfalt auf, als nicht das darunter liegende Gewebe in Richtung der Vorderseite des Kiefers zu stören.
- Präparieren Sie die facialis Arterie durch das weiche Gewebe um sie zu entfernen.
- Achtung: Verwenden Sie das Schiff oder Zug an facialis Arterie nicht verletzen , während das freiliegende Gewebe in MOPS - Puffer getaucht zu halten (2,0 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,02 mM EDTA, 5,0 mM Glucose, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO 4 · 7H 2 O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 2,0 mM Brenztraubensäure) Desikkation zu verhindern. Führen Sie unter einem binokularen Stereo-Zoom-Binokular (Vergrößerung von 3,5X bis 45X) und einer Faseroptik-Lichtquelle.
- Isolieren Sie die facialis Arterie.
- Fassen Sie die facialis proximal der ersten Gabelung und distal wo die Arterie geschnitten werden. Schneiden Sie die Arterie aus der Stammarterie, der A. carotis externa. Entfernen Sie die facialis arteries von Kontrollmäusen, Tsk / + Mäuse mit und ohne IRF5D Behandlung.
- Während noch die Arterie in der Zange hält, schneiden die beiden Zweige kommen aus der facialis, so dass der Behälter sanft kann, während jede ungeschnittene umgebende Gewebe identifiziert und abgetrennt werden, angehoben werden.
- Weiter auf diese Weise, bis die Gabelung beide Tochter Arterien Schneiden erreicht ist, das Schiff zu befreien. Es besteht keine Notwendigkeit, die Behälter vor dem Schneiden aufgrund entlasteten Druck im Gefäßsystem von Entfernen des Herzens zu klemmen. Setzen Sie das Gefäß in MOPS-Puffer, während die andere facialis Arterie seziert und isoliert.
- Kanülieren die Gefäße indem sie auf Glaspipetten mit einem Anschlussdurchmesser von 125 binden - 175 & mgr; m. Preload die Glaspipetten und Pufferreservoirs mit MOPS-Puffer.
Achtung: Bildung von Luftblasen in den Pipetten verhindern. - Binden Sie die Schiffe auf den Pipetten mit ophthalmischen Nähten.
- Montieren Sie die Gefäßkammern auf einem invertierten triocular micrOscope mit einer Videokamera Befestigung. Führen Sie das Video über einen Videosattels Messsystem für die Bildschirm Messungen der Gefäße. 20
- Beaufschlagen sie in einem zweistufigen Prozess. Zuerst mit den MOPS gefüllten Reservoire in einer Höhe über dem Behälter gleich 20 mmHg Druck, manuell öffnen die Absperrventilen in den Reservoirleitungen des Behälters. Untersuchen Sie das Gefäß auf Anzeichen von undichten um die Beziehungen und über die gesamte Länge des Schiffes. Zweitens erhöhen die Reservoirs bis 60 mmHg und das Gefäß reinspect.
- Sobald bei 60 mmHg Druck gesetzt wird, damit die Gefße für 30 min äquilibrieren.
- Um Vasodilatation in Reaktion auf Acetylcholin (10 -7 bis 10 -4 M), preconstrict das Gefäß bis zu einem Durchmesser 50 zu beurteilen - 75% seines maximalen Durchmessers unter Verwendung von 1 bis 3,0 x 10 -8 bis 10 -7 M U46619. Nachdem das Schiff für 6 min, fügen Acetylcholin in das Bad in 2 min Dauer Schritten, so dass die zur StabilisierungEndkonzentrationen im Bad sind 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. Messen der Vasodilatation in allen drei Gruppen.
7. Isolierung von Cardiac Extrazellulärmatrix
- Anästhesieren C57Bl / 6J-Kontrollmäusen und Tsk / + Mäusen mit und ohne Peptidbehandlung mit Isofluran (5%) und führen eine zervikale Dislokation. Excise die Herzen durch Aufschneiden der Brust entlang des Brustbeins. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette und das Herz zu entfernen.
- Legen Sie die Herzen entfernt in einen Becher und fügen Sie 15 ml hypertonische 1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Rühre Herzen in der 1% SDS-Lösung für 18 Stunden bei Raumtemperatur, um die Zellen aufzubrechen durch einen Rührstab in die 1% SDS-Lösung Zugabe und das Becherglas auf einer Rührplatte setzen.
Achtung: Beachten Sie, dass extrazelluläre Matrix auflösen, wenn in hypertonischen Lösung zu lange. Umgekehrt, wenn das Herz nicht lange genug in hypertonischen Lösung bewegt werden, dann werden die Zellen nicht richtigauflösen und es wird in das Becherglas Zelldebris verbleiben. - Waschen für 30 min in 15 ml 0,5% Triton X-100. Dann waschen Sie für 15 Minuten mit 15 ml PBS. Dezellularisieren individuell jedes Herz.
- Snap-gefrieren die extrazelluläre Matrix in flüssigem Stickstoff und pulverisieren die gefrorene Herz-extrazellulären Matrix mit einem vorgekühlten Mörser und Stößel.
- Machen Sie eine Suspension des pulverisierten Matrix in PBS 1% Antibiotikum enthält. Das Volumen hinzugefügt in den meisten Fällen von 300 & mgr; l. Beschallen der Suspension für 30 bis 60 s auf Eis auf der hohen Einstellung.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, dass die Probe kalt. Seien Sie sich bewusst, dass die Aussetzung aufgrund der hohen Protein-Glykan-Gehalt sehr zähflüssig ist. - Bestimmen der Proteinkonzentration eines Bradford-Assay.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es anti-biotische und Anti-Pilz in der Suspension. Penicillin / Streptomycin sind die am häufigsten verwendeten und empfohlenen.
8. Beurteilung der nuklearen Translokation von Immunohistochemistry
- Zu beschichten, Geschirr und Folien verwenden, um eine Endkonzentration von 20 ug / ml der kardialen extrazellulären Matrix in PBS. Pipettieren 500 ul der kardialen extrazellulären Matrix-Lösung in einen 100-mm-Schale für die Beschichtung und 150 & mgr; l der endgültigen extrazellulären Matrix-Lösung auf einen Objektträger.
- Inhibit IRF5 durch Zugabe IRF5D in einer 50 ug / ml-Konzentration für 24 h neonatalen Herzmyozyten in Kultur Ratte. Lassen Sie steuern myocyte Kulturen unbehandelt.
- Beurteilen Sie Handel von IRF5 aus dem Cytosol in den Zellkern mit Immunofluoreszenz und zu analysieren, durch konfokale Mikroskopie. Identifizieren Sie die grüne Markierung für IRF5, identifizieren Sie die blaue DAPI-Färbung für den Kern
- Tragen Sie die primäre anti-IRF5 Antikörper. 200-Verdünnung in PBS: Der primäre Antikörper wurde in einer 1 verwendet. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten bei 37 ° C und folgen mit drei 5-minütigen Waschschritten. Der sekundäre Antikörper war Alexa 488-markiertem Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper.
- Verdünnen der sekundäre Antikörper 1: 1000 dilution in PBS. Inkubieren der sekundäre Antikörper für 30 min bei 37 ° C. Erzielen Kernfärbung mit DAPI. Verdünnte DAPI 1: 1000 in PBS. Waschen Sie die Folien mit insgesamt 3-mal für 5 Minuten und fügen Sie DAPI zum dritten und letzten Waschschritt.
- Capture - Handel durch konfokale Mikroskopie und messen Fluoreszenzintensität in den Kernen mit und Cytosol wie zuvor beschrieben 10. Identifizieren Sie die grüne Markierung für IRF5, identifizieren Sie die blaue DAPI-Färbung für den Kern. Die Zellen, die in ihnen blauen Kernen mit grünen Markierung aufweisen enthalten aktiviert IRF5, der aus dem Cytosol in den Zellkern verschleppt. Wenn IRF5 nicht aktiviert grüne Markierung wird im Cytosol gefunden.
- Analysieren Sie die fluoreszierend markierten Zellen durch konfokale Mikroskopie eine 40X Öl-Objektiv verwendet wird. Verwenden einer Anregungswellenlänge von 488 nm und Emissionswellenlängen von größer als 530 nm für IRF5. Verwenden einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm zur Visualisierung von DAPI.
- Führen Varianzanalyse (ANOVA) für wiederholte Messungen innerhalb und zwischen den Gruppen. Folgen Sie ANOVA mit Bonferroni Modifikation von Students t-Test. Express-Daten wie der Standardfehler des Mittelwerts.
- Anästhesieren C57Bl / 6J-Kontrollmäusen und Tsk / + Mäusen mit und ohne Peptid Behandlung mit einer Ketamin (80 - 100 mg / kg) / Xylazin (10 bis 12,5 mg / kg) -Mischung. Injizieren Sie die Ketamin / Xylazin-Gemisch intraperitoneal. Begrenze die Maus manuell.
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Representative Results
Die Ergebnisse sind in Abbildung gezeigt 1 zeigen , wie ein Peptid zu entwerfen. Figur 1 oben links, zeigt der Bereich (zwischen den 2 gelbe Pfeile, Aminosäuren (aa) 425-436) in IRF5 , die durch eine Reihe von Kinasen phosphoryliert wird. Abbildung 1, oben rechts, zeigt ein gelbes Oval , wo IRF5 die phosphoryliert Domäne bindet. Die dimere Struktur von 3DSH wurde gedreht, um eine Spalte oder das Tal auf der linken Seite der Helix 2 (aa303-312) zu beobachten. Hier wird die phospho-Schwanzdomäne von IRF5 soll zu binden , wenn sie vollständig eingeschaltet ist (dh, Serin phosphoryliert), ein Homodimer und ihrer angenommen biologisch aktiven Zustand bildet.
In Figur 2 ist die Bindungsaktivität , gemessen durch Bioschicht Interferometrie dargestellt. Zu bestimmen, dass der Köder Peptid IRF5D nicht toxisch ist, Proliferation und Apoptose wurden nach Behandlung der c beurteiltells mit Konzentrationen von IRF5D Erhöhung (Abbildung 3). ICAM-1, einer entzündlichen Marker und IRF5 Ausdrücke wurden nach Behandlung der Tsk / + Mäuse mit IRF5D reduziert , wie durch Western - Blot - Analyse (Abbildung 4) bestimmt. Die Anzahl der Neutrophilen (NIMP) und CD64 wurden durch Immunhistochemie nach der Behandlung mit IRF5D (Figur 5) bestimmt verringert. Die Endothelfunktion wurde in facialis Arterien TSK / + Mäusen verbesserte sich nach IRF5D im Vergleich zu Tsk / + Mäuse ohne IRF5D Behandlung (Abbildung 6). Eine größere Anzahl von IRF5 positiven Kerne in kultivierten Myozyten an TSK / + Herz-Matrix wurden sichtbar gemacht im Vergleich zu C57BL / 6J-Herz-Matrix. Behandlung der Kulturen mit IRF5D ergab verringerte Anzahl von IRF5 positive Kerne (Abbildung 7).
Abbildung 1: 3D - Protein Structure von IRF5. A) Das linke obere Bild zeigt die Region das Peptid entworfen wurde. B) Die Region , die durch die zwei gelbe Pfeile sind Aminosäuren (aa) 425 markiert phosphoryliert wird - 436 in IRF5. C) Das untere Feld zeigt die homodimeren Funktionskomplex. Die homodimere Figur ist für ein leichteres Ablesen der Region präsentiert, wo die phosphoryliert Schwanzdomäne von IRF5 bindet ein Homodimer zu bilden. Diese Zahl wurde bisher 21 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Bio-Layer-Interferometrie von IRF5D. Diese Abbildung zeigt die Bindung von IRF5 von biolaye bewertet IRF5D r Interferometrie. Analysesoftware hat gezeigt , dass IRF5 bindet mit einem K d von 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M bis IRF5D (Mittelwert ± SD, n = 3). Diese Zahl wurde bisher 21 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Zellproliferation und Apoptose. Diese Balkendiagramme zeigen, dass steigende Konzentrationen von IRF5D haben keinen Einfluss auf die Zellproliferation (links) oder Apoptose (rechts), und wurden nicht verändert durch Ebenen der IRF5D erhöht. Diese Zahl wurde veröffentlicht früher 21 (Mittelwert ± SD, p <0.05, n = 4).k "> Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: ICAM-1 und IRF5 Expression im Herzen. ICAM-1 (A) und IRF5 (B) Ausdrücke wurden im Myokard von Tsk + Mäusen nach IRF5D Behandlung verringert , wie durch Western - Blot nachgewiesen. Die Daten wurden an das Aktin Ladekontrolle normalisiert (Mittelwert ± SD, p <0.05, n = 3). Diese Zahl wurde bisher 21 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:CD64 (A) und NIMP (B) Expression im Herzen. Die Anzahl der Monozyten / Makrophagen und Neutrophile wurde nach IRF5D Behandlung verringert, wie durch Immunhistochemie nachgewiesen werden (Mittelwert ± SD, * = p <0,05, C57BL / 6J vs. Tsk / +; # = p <0,025, Tsk / + vs. Tsk / + + IRF5D; n = 3, 10 Bilder pro Antikörper). Die Pfeile markieren Monozyten / Makrophagen (A) und Neutrophilen (B). Die Maßstabsbalken sind 10 & mgr; m. Diese Zahl wurde bisher 21 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Zellfunktion und Vasodilatation. IRF5D Verwaltung verbessert Acetylcholin induzierte Vasodilatation von facialis Arterien TSK / + Mäusen (Mittelwert &# 177; SD, p <0.05, n = 6). Diese Zahl wurde bisher 21 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: IRF5 nukleäre Translokation von IRF5 in kultivierten Myozyten mit IRF5 Hemmung. IRF5 Hemmung durch IRF5D (50 ug / ml, 24 h) führt zu weniger IRF5 positive Kerne in Myozyten kultiviert auf Tsk / + kardialen Matrix und C57Bl / 6J Herz Matrix. Die Pfeile zeigen IRF5 positiven Kerne (Mittelwert ± SD, p <0.05, n = 3). Der Maßstab beträgt 5 um. Diese Zahl wurde bisher 21 veröffentlicht. Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Ziel war es, ein IRF5 Inhibitor zu entwerfen, die Rolle der IRF5 auf Entzündung, Fibrose und Gefäßfunktion in den Herzen der Tsk / + Mäuse aufzuklären. Die Ergebnisse sind, dass IRF5D haben Proliferation oder Apoptose nicht induziert. Darüber hinaus wurde die Entzündung reduziert und Gefäßfunktion verbessert. Diese Daten legen nahe, dass IRF5 spielt eine wichtige mechanistische Rolle bei der Entwicklung der Entzündung und Fibrose im Herzen von Tsk / + Mäusen und daß sie das Potential als therapeutisches Ziel zu dienen.
Der erste Schritt war, einen Inhibitor zu entwerfen. Wenn ein Peptid konzipiert ist, haben mehrere Punkte berücksichtigt werden: Sequenzlänge, Sekundärstruktur, Rückstände anfällig für Oxidation, Aminosäurezusammensetzung, Amidierung und Capping, Aminosäuren im N-Terminus und Aminosäuren im C-Terminus, und Ligand Bindung. Die ideale Sequenzlänge zwischen 10 und 15 Reste am besten Gesamtausbeute, weniger Verunreinigungen und reduzierten Kosten zu gewährleisten. Es ist wichtitant bewusst zu sein, Sekundärstrukturen wie Beta Blattbildung. Beta Blattbildung kann in einem hohen Grad der deletierten Sequenzen führen. Vermeiden Rückstände neigen zu Oxidation führen kann, die zu Nebenreaktionen, die die Wirksamkeit des Peptids beeinflussen können. Zur Steuerung der Löslichkeit, die Synthese und Reinigung, halten die Zusammensetzung der Aminosäure-Bausteine für das Peptid weniger als 50% hydrophobe Aminosäuren und sicherzustellen, dass es genügend geladene Reste. N- und C-Termini müssen in einem ungeladenen Zustand gewählt werden. Vermeiden Glutamat am N-Terminus und vermeiden Cystein, Prolin und Glycin am C-Terminus. Hinzufügen, einen Abstandshalter zwischen dem Peptid und Ligand Faltung zu minimieren. Daher könnten sie müssen als Amid ohne Ladung maskiert werden.
IRF5D Design wurde auf der 3D-Struktur. Ein 17 mer, genannt IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) wurde entwickelt, wobei Aspartat (D) für Serin (S) ersetzt wurde bei 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD) Phosphorylierung in IRF5 nachzuahmen. DiesAnsatz ist gerade nach vorne durch neuartige Computertechnik. Der Nachteil dieser Technik ist die Anfangsinvestition in die Software. Allerdings gibt es erhebliche Gesamteinsparungen im Vergleich zu den Kosten im Zusammenhang mit Arbeits- und Materialkosten in anderen Inhibitor Design - Methoden verwendet, wie Phagen - Display - 22. Der kritische Schritt in diesem Verfahren ist die Verfügbarkeit der 3D-Struktur des Zielproteins und seine möglichen Bindungsstellen. Die Begrenzung eines Inhibitors der Gestaltung ist die Möglichkeit, dass eine falsche Region gewählt wird und der Inhibitor nicht das gewünschte Protein zu blockieren. Die andere Möglichkeit ist eine teilweise Blockierung des gewünschten Proteins.
Mit dem Peptid in der Hand bewegt sich der Fokus um die Toxizität des Decoy-Peptid zu testen, indem das Überleben der Zelle zu messen. Zuerst wurde IRF5D unter Verwendung variierender Konzentrationen getestet. IRF5D nicht induziert Apoptose und fördert nicht die Proliferation auch bei höheren Konzentrationen. Die Methoden, die hier verwendet werden, sind standard und zuverlässige Daten liefern. Das Tetrazolium - Farbstoff Bioreduktion wurde 23 seit vielen Jahren verwendet. Dieser Test wurde wegen ihrer Reproduzierbarkeit und Zeitwirksamkeit gewählt als Vergleich zu anderen Verfahren, beispielsweise Zellen manuell welche Zählung ist sehr zeitaufwendig. Mit BrdU wuchernden Zellen zu markieren erfordert Radioaktivität, die empfindlich ist, kann aber gefährlich sein. Das Tetrazolium-Farbstoff Bioreduktion ist zeiteffizient und keine Radioaktivität erforderlich. Die Grenzen der Tetrazoliumfarbstoff Bioreduktion ist weit verbreitet in Studien oxido-reduktives Potential beteiligt sind. Überall dort , wo Oxido-Reduktionspotential auftritt, Fehlalarme sind häufiger 24.
Die Isolierung der extrazellulären Matrix wurde hergestellt, indem alle myokardialen Zellen mit einer hypertonischen Lösung erworben. Das Protokoll wurde von Studien entwickelt 25 eine Perfusionsgerät zu einer einfachen Bewegung Verfahren. Die duration wurde bestimmt, indem verschiedene Zeitpunkte empirisch beurteilt: 12, 14, 16, 18, 20 h. Die extrazelluläre Matrix wurde für die Zelltrümmer analysiert , nachdem die verschiedenen Zeit 25 Punkte. Die wichtigsten Gefahren des Dezellularisierung sind Pilz- und bakterielle Kontamination. Es wird empfohlen, antimykotische und antimikrobielle Verbindungen zu verwenden. Zu beschichten Geschirr, wird die extrazelluläre Matrix pulverisiert und in PBS suspendiert. Aufgrund der hohen Gehalt an elastischem Material, wird die Probe nicht vollständig auflösen. Ultraschall-Behandlung auf höhere Intensität Einstellungen, ohne die Probe Erwärmung ist zwingend notwendig. Der Vorteil der Verwendung der extrazellulären Matrix gegenüber anderen Beschichtungsmitteln ist , dass die extrazelluläre Matrix ist ein Zusammenschluss von Proteinen physiologisch vorkommende und verbindet die in vivo und in vitro - Assays. Dieser Ansatz ist physiologische als Beschichtung mit einer einzigen Verbindung wie Kollagen oder Fibronektin allein. Es gibt auch einen Einblick in die Bedeutung von Veränderungen in initiierte Signalisierungdie extrazelluläre Matrix. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist deutlich die Zerstörung der Matrix und Entfernen wichtige Signalkomponenten aus der Matrix. Es ist zwingend notwendig, vorsichtig zu sein, wenn die Matrix Dezellularisieren.
Die Verwendung von intaktem Gewebe wie isoliert Gefäße eröffnet die Möglichkeit, zu Vasodilatation in situ und mit minimaler Störung von Enzymen untersuchen. Dieses Verfahren ist am besten geeignete Endothelfunktion in einer Vielzahl von Tieren und Krankheiten zu studieren. Duling war die erste Methode bei Schweinen zu beschreiben. Die Gefäße in der Schweine sind im Gewebe tief; daher beschrieben das Papier die Gelatine-Fixierung. Frühe Studien in Vasodilatation verwendet Karotiden 26. Wir verfeinert die Technik facialis Arterien 27 zu verwenden. Facialis Arterien sind äquivalent in der Größe einer Widerstands Arterie als die Arteria carotis. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Fragilität des Schiffes, die intakte requirin entfernt werden muss,g Praxis.
Zusammenfassend ermöglicht die Entwicklung IRF5D uns die Beteiligung von IRF5 bei der Entzündung und Fibrose im Herzen zu beurteilen. Dies führte zu den Daten in dieser Studie gezeigt. IRF5D ist ein nützliches Werkzeug , um die Mechanismen der IRF5 bei verschiedenen Krankheiten sowie zu studieren als 28 IRF5 als mögliches Medikament Ziel schlägt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
