Introduction
Regulering af cellevækst og celledød immunreaktioner er centralt for den rolle af transkriptionsfaktoren familien af interferon regulatoriske faktorer. IRF5 fremhæves som værende af afgørende betydning for reguleringen af immunreaktioner mellem type 1, en inflammatorisk fremme respons og type 2, et immunrespons rettet mod væv reparation. IRF5 er nøglen i kræft 1, og autoimmunitet 2, 3, 4, 5.
Den stramme hud mus (Tsk / +) er en model for væv fibrose og sklerodermi på grund af en overlapning mutation i fibrillin-1-genet. Denne mutation resulterer i en tæt hud og en stigning i bindevæv. Disse mus udvikler myocardial inflammation, fibrose og endelig hjertesvigt 5, 6, 7,> 8, 9. Sklerodermi er en autoimmun fibrotisk sygdom, der påvirker ca. 150.000 patienter i USA 6. De kendetegnende for denne sygdom er fibrose af indre organer, herunder hjertet 7, 8, 9, 10, 11.
Arten af studiet krævede udformningen af en inhibitorisk peptid. Softwaren fremgangsmåde blev valgt frem for en traditionel fremgangsmåde ved anvendelse af en fag-display. Softwaren fremgangsmåde er lettere og mindre tidskrævende. Den RCSB databank bruges til at identificere egnede bindingssteder 12. For at undersøge interaktionen af nyudviklede peptid med det rekombinante protein og for at fokusere på de bindende parametre, blev en teknik kaldet biolayer interferometri anvendes. Biolayer interferometri er en biosensor baseret Technique der afgør bindende affinitet, forenings- og afstandtagen ved hjælp af en biosensor og en bindende prøve. Biosensoren kan være fluorescens, luminescens, radiometrisk og kolorimetrisk mærket. Målingen er baseret på masse tilføjelse eller udtømning ligner forening og afstandtagen 13, 14. Formålet med denne undersøgelse var at forstå den rolle IRF5 i myocardial inflammation og fibrose. Målet var at få indsigt i den rolle, IRF5 i udviklingen af væv fibrose og sklerodermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (Protokol: AUA # 1517). Al forskning involverer mus blev gennemført i overensstemmelse med PHS politik.
1. Design af Decoy peptid
- Find den IRF5 3D struktur og basere designet på det. Design en 17 mer, betegnes IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), hvor aspartat (D) i stedet for serin (S) for at efterligne fosforylering i IRF5 på 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analyse af 3D sulfhydrylgrupper og viden om IRF5 mekanisme af aktivering, dvs. serin-phosphorylering, foreslået, at én strategi til målretning IRF5 var at generere en attrap peptid. Se figur 1. For at identificere den bedste region i 3D struktur, brug en molekylær modellering software til at designe små molecules og peptider 15.
BEMÆRK: Det kritiske trin i denne proces er tilgængeligheden af 3D-strukturen af målproteinet og dens mulige bindingssteder. 3D struktur IRF5 repræsenterer præcist hvordan IRF5 dimeriserer efter fosforylering. Substitution af aspartat til serin eller threonin er outsourcet. Peptidet syntetiseres separat uden at være knyttet til IRF5. - Kopiere phospho-domænet simpelthen ved at substituere D for S. Baseret på den oprindelige sekvens (ELSWSADSIRLQISNPD, lave en ny peptid IRF5S med aminosyresekvensen af Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D).
2. Biolayer interferometri (BLI)
BEMÆRK: Rensningen for rekombinant IRF5 blev outsourcet. 16
- Biotinmærke IRF5 i et molært forhold på 1: 1 af biotin til ligand med en biotinyleringsreagens inkorporerer en langkædet linker. De langkædede linker vil sikre en mere aktiv og homogen ligand overflade.
- Tilsæt 1 ml 2 mg / ml IRF5 til 13 pi 20 mM biotin-reagens eller øge mængden, hvis nødvendigt. Der inkuberes på is i 2 timer. Efter mærkning bruge en afsaltning spin-kolonne for at fjerne reaktionsblandingen fra det mærkede protein.
- Inkubér biotin-mærket ligand med biosensorer til 15 min. Undgå over-mærkning og juster 1: 1 molforhold. Efter mærkning bruge en afsaltning spin-kolonne for at fjerne reaktionsblandingen fra det mærkede protein.
- Inkubér biotinmærket IRF5 biosensorer i 10 minutter i forskellige koncentrationer af IRF5 attrap peptid. Foreningen og dissociationshastigheder blev bestemt som beskrevet 10, 17, 18.
3. apoptose og proliferationsassays
- Proliferationsassay via bioreduktion af tetrazolium
- Administrere IRF5D fortyndet i PBS (1 mg /kg / d, injiceres et volumen 20 pi i en 20 g mus) subkutant med en 27-gauge nål ved en standard scruffing teknik eller PBS alene til Tsk / + og C57BL / 6J-mus i 21 dage.
- Anesthetize mus med isofluran (5%) og udføre en cervikal dislokation. Udskære hjerter ved at skære åben brystet langs brystbenet. Løft hjerte med pincet og fjern hjerte.
- Lyse hjerter med et protein lyseringsbuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 og bestemme proteinkoncentration ved Bradford-assay 19.
- Coat 96-brønds plader med C57BL / 6J cardiac matrix isoleret som beskrevet i afsnit 7. Fortynd PBS suspenderede C57BL / 6J cardiac matrix til en koncentration på 20 ug / ml og tilsættes 30 pi af C57BL / 6J cardiac til hver brønd. Lad det stå natten over ved 37 ° C i inkubatoren.
- Kultur humane navlevene-celler under anvendelse af 500 ml endothelial basal media med 0,4% bovin hjerne ekstrakt, 0,1% ascorbinsyre, 0,1% hydrocortison, 0,1% human epidermal vækstfaktor, 2% kalvefosterserum og 0,1% gentamicin / amphotericin B tilsat til det. Kultur cellerne på plader med 96 brønde ved 5% CO2 og 95% luft i rummet med en densitet på 25.000 celler per brønd. Stimulere med stigende koncentrationer af IRF5D på 0 - 100 pg / ml i mediet (volumen var mellem 0 og 50 pl / ml).
- Bestem celleproliferation efter tre dage og vurdere forskelle i absorbans på en mikropladelæser. Reaktionen er en bioreduktion af MTS tetrazoliumforbindelse. NADPH eller NADH produceres af dehydrogenaseenzymer i metabolisk aktive celler.
- Som MTS tetrazoliumforbindelse opbevares frosset ved -20 ° C, optøs forbindelsen langsomt over cirka 90 minutter ved stuetemperatur. Pipetter 20 pi i hver brønd på en plade med 96, og tilsættes 100 pi dyrkningsmedier til den. Inkuber plade ved 37 ° C i 1 til 4 timer i en Humidified, 5% CO2 kammer.
- Læs absorbans ved en bølgelængde på 490 nm.
- Apoptose assay via caspaseaktivitet
BEMÆRK: Den eksperimentelle set-up er den samme som ovenfor 3.1.1 til 3.1.5.- Stimulere cellerne med stigende koncentrationer af IRF5D på 0 - 100 pg / ml i mediet.
- Tilføj grøn detektion til Caspase 3/7 substrat til ECS og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Vurdere fluorescens på mikropladelæseren samtidigt med absorption / emission bølgelængde på 502/530 nm. Kør forsøgene i tre eksemplarer.
BEMÆRK: grønt fluorescerende middel er en fire aminosyre peptid bundet til en nukleinsyre bindende farvestof. Dette reagens bliver fluorescerende, når spaltes efter caspase 3 og 7 aktivering. Denne fluorescens måles. Fordelen er en reduktion i vasketrin.
4. Vurdering af IRF5 og ICAM-1-ekspression i høret
- Administrere IRF5D fortyndet i PBS (1 mg / kg / d, injiceres et volumen 20 pi i en 20 g mus) subkutant med en 27-gauge nål ved en standard scruffing teknik eller PBS alene til TSK / + og C57BL / 6J-mus en gang per dag i 21 dage.
- Anesthetize mus med isofluran (5%) og udføre en cervikal dislokation. Udskære hjerter ved at skære åben brystet langs brystbenet. Løft hjerte med pincet og fjern hjerte.
- Lyse hjerter med et protein lyseringsbuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 og bestemme proteinkoncentration ved Bradford-assay 19.
- Udfør en western blot på lysater af hjerter. Fortynd prøverne til 25 ug totalt protein og et volumen på 40 pi med Laemmli prøvepuffer indeholdende 5% mercaptoethanol. Kør prøverne på en 4 - 15% TGX gel ved 50 mV i 5 min. Forøge spændingen til 100 mV i 1 time indtil farvefronten løber ud.
- Gelen anbringes i 1x transfer buffer (25 mM Tris, 190 mM glycin, 20% methanol, justere pH til 8,3 om nødvendigt) og inkuberes i 10 - 15 min.
- Saml overførslen sandwich (svamp, filter, gel, cellulose membran, et filter, svamp). Sørg er fanget ingen bobler i mellem. Blottet bør være på katoden og gelen på anoden. Transfer i 1 time i det kolde rum på 100 mA.
- Den næste dag, skylles blottet og derefter blokere baggrunden i 5% fedtfri tørmælk i 30 minutter ved stuetemperatur. Skyl blot med Tris-bufret saltvand indeholdende 5% Tween tre gange i 5 min hver.
- Inkuber natten over med de primære antistoffer ved anvendelse af primære polyklonale antistoffer mod IRF5 eller ICAM-1. Fortynd antistofferne i Tris-bufret saltvand i en 1: 1.000 fortynding.
- Fortynd de sekundære antistoffer i Tris-bufret saltvand og inkuberes blottet i 1 time ved stuetemperatur. Til sekundære antistoffer, brug peberrodsperoxidase konjugeret æsel-anti-muse-IgG (1: 10.000) og peberrodsperoxidase æsel-anti-gede-IgG (1: 10.000), hhv.
- Påfør kemiluminescens til blottet efter blanding komponenter i henhold til fabrikantens protokol og inkuberes i 3 min at luminescere båndene af interesse. Udsætte blottet til en røntgenfilm. Brug ImageJ til at måle densitet. Normalisere værdierne tæthed til kontrolbånd 10.
5. Vurdering af inflammatoriske Cell Numbers efter IRF5 Hæmning
- Administrere IRF5D fortyndet i PBS (1 mg / kg / d) subkutant med en 27-gauge nål ved en standard scruffing teknik eller PBS alene til Tsk / + og C57BL / 6J-mus i 21 dage.
- Anesthetize mus med isofluran (5%) og udføre en cervikal dislokation. Udskære hjerter ved at skære åben brystet langs brystbenet. Løft hjerte med pincet og fjern hjerte. Snap fryse og gemme udskårne hjerter indtil analyse.
- Monter de frosne hjerter på tissUE holdere egnede til kryostaten i brug. Skær 10 um tykke frosne snit på en kryostat til immunhistokemi.
- Fastgør frosne snit med 1% paraformaldehyd i phosphatpufret saltopløsning i 20 minutter ved stuetemperatur. Permeabilisere sektionerne med 0,5% Triton-X 100 i PBS i 5 min.
Advarsel: Paraformaldehyd er et reguleret kræftfremkaldende og skal håndteres med forsigtighed. - Fortynd anti-kanin CD64, et monocyt / makrofag markør 1: 200 i PBS. Anvendelse på de faste sektioner og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Skylning af objektglas i PBS i 5 minutter tre gange ved stuetemperatur.
- Fortynd anti-rotte NIMP, et primært neutrofil markør 1: 200 i PBS. Anvendelse på de faste sektioner og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Vaskes objektglassene i 5 minutter tre gange med PBS ved stuetemperatur.
- Fortynd de sekundære antistoffer anti-kanin Alexa 488 konjugeret og anti-rotte Alexa 488 konjugeret 1: 200 i PBS.
- Påfør anti-kanin Alexa 488 konjugeret og anti-rotte Alexa 488 konjugerede sekundære antistoffer til afsnittene i 30 minutter ved 37 ° C i overensstemmelse hermed. Den mængde antistof, varierer alt efter størrelsen af sektionen. Beløbet skal dække afsnittet generøst. I de fleste tilfælde mængden er mellem 100 og 200 pi.
- Brug 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) som et nukleart plet i en 1: 1.000 fortynding i PBS. Tilsæt 1 pi til 1 ml PBS og bruge DAPI i sidste vasketrin. Tilføj vandige montering medier til en dækning slip og sætte det ind på dias.
- Analyser fluorescensmærkede sektioner ved konfokal mikroskopi under anvendelse af en 40X olie mål. Brug excitationsbølgelængder 488 og emissionsbølgelængder på over 530 nm for CD64 og NIMP. DAPI blev ophidset med 360 nm og udsendes ved 460 nm i blåt. Skelne monocytter / makrofager og neutrofiler (n = 10 billeder pr antistof, fra 3 forskellige mus i hver gruppe) ved deres forskellige mærkning og tælle dem. Udtrykke data som antallet af optalte celler.
6. Cell vasodilatation efter IRF5 Inhibering
- Bedøver C57BL / 6J kontrolmus og TSK / + mus med og uden peptid behandling med en ketamin (80 - 100 mg / kg) / xylazin (10 - 12,5 mg / kg) blanding. Sprøjt ketamin / xylazin blanding intraperitonealt. Begrænse musen manuelt.
- Brug en 25 gauge eller mindre nål. Stik nålen ind i den nedre højre kvadrant af maven. Træk stemplet før injektion for at sikre, at nålen ikke kommer ind i et blodkar eller tarmen.
- Når et tilstrækkeligt anæstesi er nået, fastgøre musen i liggende stilling, tørre pelsen med alkohol gennemblødt gaze, og ved hjælp af en saks åbne brysthulen og fjern hjerte.
BEMÆRK: Exsanguination vil aflive musen og gøre dissektion lettere ved at lindre trykket i karrene dermed minimere blødning, når der skæres blodkar.- Åbn huden usinga saks og tilskæring fra brystet lateralt til kæbebenet med omhu for ikke at forstyrre de underliggende væv mod forsiden af kæben.
- Dissekere facialis arterie ved at fjerne det bløde væv omkring det.
- Forsigtig: Må ikke skade fartøjet eller slæbebåd på facialis arterie samtidig holde det eksponerede væv badet i MOPS buffer (2,0 mM CaCl2 · 2H 2 O, 0,02 mM EDTA, 5,0 mM glucose, 4,7 mM KCI, 1,17 mM MgSO4 · 7H 2 O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCl, 1,2 mM NaH 2 PO4 · H2O, 2,0 mM pyrodruesyre) for at forhindre udtørring. Fungere under binokulaer stereo zoom dissektionsmikroskop (forstørrelse på 3,5X til 45X) og en fiberoptisk lyskilde.
- Isoler facialis arterie.
- Tag fat i facialis proximalt til den første bifurkation og distal til hvor arterien vil blive skåret. Skær arterien fra selve arterien, den ydre carotidarterie. Fjern facialis arteries fra kontrolmus, TSK / + mus med og uden IRF5D behandling.
- Mens han stadig holder arterien i tangen, skar de to grene kommer fra facialis, så skibet skal forsigtigt løftes, mens enhver uslebne omkringliggende væv kan identificeres og brudt.
- Fortsæt på denne måde indtil forgreningen er nået at skære både datter arterier at befri skibet. Der er ikke behov for at fastspænde fartøjer måde inden skæringen grund lettet trykket i vaskulaturen i at fjerne hjertet. Sætte fartøjet i MOPS-buffer, mens den anden facialis arterie dissekeres og isoleret.
- Kanyler skibene ved at binde dem på glas pipetter med en terminal diameter på 125-175 um. Preload glas pipetter og bufferreservoirer med MOPS-buffer.
Forsigtig: Undgå luftbobler dannes i pipetterne. - Bind skibene ind på pipetter hjælp oftalmologiske suturer.
- Monter fartøj kamre på en omvendt triocular MICRoscope med et videokamera vedhæftet fil. Kør video via en video caliper målesystem til på skærmen målinger af skibene. 20
- Presse dem i en to-trins proces. Først med MOPS-fyldte reservoirer i en højde over beholderen lig med 20 mmHg tryk, manuelt Vandhanen åbnes ventilerne i reservoiret linjer til fartøjet. Inspicere fartøjet for tegn på lækage rundt båndene og ned på længden af fartøjet. For det andet, hæve reservoirerne til 60 mmHg og reinspect fartøjet.
- Når tryk på 60 mmHg, lade skibene at komme i ligevægt i 30 min.
- For at vurdere vasodilation som respons på acetylcholin (10 -7 til 10 -4 M), preconstrict fartøjet til et diameter på 50 - 75% af dens maksimale diameter ved anvendelse af 1 - 3,0 x 10 -8 til 10 -7 M U46619. Efter at fartøjet at stabilisere i 6 min, tilsæt acetylcholin til badet i 2 min varighed trin, således at denslutkoncentrationer i badet er 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. Mål vasodilatation i alle tre grupper.
7. Isolering af Cardiac ekstracellulære matrix
- Bedøver C57BL / 6J kontrolmus og TSK / + mus med og uden peptid behandling med isofluran (5%) og udføre en cervikal dislokation. Udskære hjerter ved at skære åben brystet langs brystbenet. Løft hjerte med pincet og fjern hjerte.
- Sætte de fjernede hjerter i et bægerglas og tilsættes 15 ml hypertonisk 1% natriumdodecylsulfat (SDS). Agitere hjerter i 1% SDS-opløsning i 18 timer ved stuetemperatur for at bryde op cellerne ved tilsætning af en omrører til 1% SDS-opløsning og sætte bægerglasset på en omrøringsplade.
Advarsel: Vær opmærksom på at ekstracellulær matrix vil gå i opløsning, hvis venstre for længe i hypertonisk løsning. Omvendt, hvis hjerter ikke omrystes længe nok i hypertonisk opløsning, hvorefter cellerne vil ikke korrektopløses og der vil være cellerester stå i bægerglasset. - Vask i 30 minutter i 15 ml 0,5% Triton X-100. Vask derefter i 15 minutter med 15 ml PBS. Decellularize hvert hjerte individuelt.
- Snap-fryse den ekstracellulære matrix i flydende nitrogen og pulveriseres det frosne hjerte- ekstracellulære matrix med en forafkølet morter og støder.
- Foretag en suspension af det pulveriserede matrix i PBS indeholdende 1% antibiotikum. Den tilføjede i de fleste tilfælde volumen er 300 uL. Sonikeres suspensionen i 30 - 60 s på is på den høje indstilling.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt, at prøven holder koldt. Vær opmærksom på at suspensionen er meget tyktflydende på grund af det høje proteinindhold glycan indhold. - Bestem protein koncentration på en Bradford assay.
BEMÆRK: Sørg for, at der er anti-biotiske og anti-svampe i suspensionen. Penicillin / streptomycin er de mest almindeligt anvendte og anbefalede.
8. Vurdering af Nuclear Translokation af Immunohistochemistry
- At overtrække retter og slides bruge en slutkoncentration på 20 ug / ml af den kardiale ekstracellulære matrix i PBS. Pipetter 500 pi af hjerte- ekstracellulær matrix opløsning i en 100 mm skål til coating og 150 pi af den endelige ekstracellulære matrix opløsning på et objektglas.
- Inhibere IRF5 ved tilsætning IRF5D i en 50 pg / ml koncentration i 24 timer til rotte neonatale hjertemyocytter i kultur. Efterlad kontrollere myocyt kulturer ubehandlet.
- Vurdere handel med IRF5 fra cytosolen til kernen ved hjælp immunofluorescens og analysere ved konfokal mikroskopi. Identificer den grønne mærkning for IRF5 identificere blå DAPI pletten for kernen
- Påfør den primære anti-IRF5 antistof. Det primære antistof blev anvendt i en 1: 200 fortynding i PBS. Glassene inkuberes tildækket i 30 minutter ved 37 ° C og følge med tre 5-min vasketrin. Det sekundære antistof var Alexa 488-mærket gede-anti-muse-IgG-antistof.
- Fortynd det sekundære antistof 1: 1.000 dilution i PBS. Inkubér det sekundære antistof i 30 minutter ved 37 ° C. Opnå nukleare pletten med DAPI. Fortynd DAPI 1: 1.000 i PBS. Vaskes objektglassene i alt 3 gange i 5 minutter og tilsæt DAPI til den tredje og sidste vasketrin.
- Capture handel ved hjælp konfokal mikroskopi og måle fluorescensintensiteten i kerner og cytosol som tidligere beskrevet 10. Identificer den grønne mærkning for IRF5 identificere blå DAPI pletten for kernen. De celler, der udviser blå kerner med grøn mærkning i dem indeholder aktiveret IRF5, som solgt fra cytosolen til cellekernen. Når IRF5 ikke er aktiveret grøn mærkning findes i cytosolen.
- Analyser fluorescensmærkede celler ved konfokal mikroskopi under anvendelse af en 40X olie mål. Brug en excitationsbølgelængde på 488 nm og emission bølgelængder på over 530 nm for IRF5. Brug en excitationsbølgelængde på 360 nm og en emission på 460 nm til visualisering af DAPI.
- Udfør variansanalyse (ANOVA) for gentagne målinger i og mellem grupperne. Følg ANOVA med Bonferroni modifikation af Studerende t-test. Hurtig data som standard på middelværdien.
- Bedøver C57BL / 6J kontrolmus og TSK / + mus med og uden peptid behandling med en ketamin (80 - 100 mg / kg) / xylazin (10 - 12,5 mg / kg) blanding. Sprøjt ketamin / xylazin blanding intraperitonealt. Begrænse musen manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne viste i figur 1 viser, hvordan man designer et peptid. Figur 1, øverst til venstre, viser området (mellem de 2 gule pile, aminosyrer (aa) 425-436) i IRF5 der phosphoryleres af en række kinaser. Figur 1, øverst til højre, viser en gul oval hvor IRF5 s phosphoryleret domæne binder. Den dimere struktur 3DSH blev drejet for at observere en kløft eller dal til venstre for Helix 2 (aa303-312). Det er her phospho-hale-domænet af IRF5 formodes at binde, når det er fuldt aktiveret (dvs. serin phosphoryleret), der danner en homodimer og dets antages biologisk aktive tilstand.
I figur 2 er bindingsaktiviteten målt ved biolayer interferometri afbildet. For at bestemme, at afledningsindretningen peptid IRF5D er ikke giftigt, blev proliferation og apoptose vurderet efter behandling af calen med stigende koncentrationer af IRF5D (figur 3). ICAM-1, en inflammatorisk markør, og IRF5 udtryk blev reduceret efter behandling af TSK / + mus med IRF5D som bestemt ved Western blot-analyse (Figur 4). Antallet af neutrofiler (NIMP) og CD64 blev nedsat som bestemt ved immunhistokemi efter behandling med IRF5D (figur 5). Endothelfunktion blev forbedret i facialis arterier i TSK / + mus efter IRF5D sammenlignet med Tsk / + mus uden IRF5D behandling (figur 6). Større antal IRF5 positive kerner i myocytter dyrket på Tsk / + kardial matrix blev visualiseret sammenlignet med C57BL / 6J kardial matrix. Behandling af kulturerne med IRF5D resulterede i reduceret antal IRF5 positive kerner (figur 7).
Figur 1: 3D Protein Structure af IRF5. A) Øverste venstre figur viser området peptidet er designet til. B) Den region, der er ved at blive phosphoryleres fremhævet af de to gule pile er aminosyrer (aa) 425 - 436 i IRF5. C) Den nedre panel viser den homodimere funktionelle kompleks. Den homodimere tal præsenteres lettere at se det område, hvor det phosphorylerede hale domæne IRF5 binder til at danne en homodimer. Dette tal er tidligere blevet publiceret 21.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Biolayer interferometri of IRF5D. Denne figur viser binding af IRF5 at IRF5D vurderet af biolaye r interferometri. Analyse software viste, at IRF5 binder til IRF5D med en Kd på 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M (gennemsnit ± SD, n = 3). Dette tal er tidligere blevet publiceret 21.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cell Proliferation og apoptose. Disse søjlediagrammer viser, at stigende koncentrationer af IRF5D har ingen indflydelse på celleproliferation (venstre) eller apoptose (til højre), og blev ikke ændret ved at øge niveauet af IRF5D. Dette tal er tidligere blevet publiceret 21. (middelværdi ± SD, p <0,05, n = 4).k "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ICAM-1 og IRF5 Ekspression i hjertet. ICAM-1 (A) og IRF5 (B) udtryk blev reduceret i myokardiet af Tsk + mus efter IRF5D behandling som påvist ved western blot. Dataene blev normaliseret til actin ladningskontrol (gennemsnit ± SD, p <0,05, n = 3). Dette tal er tidligere blevet publiceret 21.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:CD64 (A) og NIMP (B) Ekspression i hjertet. Antallet af monocytter / makrofager og neutrofiler blev reduceret efter IRF5D behandling som påvist ved immunhistokemi (gennemsnit ± SD, * = p <0,05, C57BL / 6J vs. Tsk / +; # = p <0,025, Tsk / + vs. Tsk / + + IRF5D; n = 3, 10 billeder pr antistof). Pilene fremhæve monocytter / makrofager (A) og neutrofiler (B). Skalaen barer er 10 um. Dette tal er tidligere blevet publiceret 21.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Cell Funktion og Vasodilatation. IRF5D administration forbedret acetylcholin-induceret vasodilation af facialis arterier i TSK / + mus (betyder &# 177; SD, p <0,05, n = 6). Dette tal er tidligere blevet publiceret 21.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: IRF5 Nuclear Translokation af IRF5 i Kulturperler Myocytter med IRF5 hæmning. IRF5 inhibering med IRF5D (50 ug / ml, 24 h) fører til færre IRF5 positive kerner i myocytter dyrket på Tsk / + cardiac matrix og C57BL / 6J kardial matrix. Pilene afbilder IRF5 positive kerner (gennemsnit ± SD, p <0,05, n = 3). Skalaen bar er 5 um. Dette tal er tidligere blevet publiceret 21.. venligst klikk her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet var at designe en IRF5 inhibitor at belyse den rolle, IRF5 på inflammation, fibrose, og vaskulær funktion i hjertet på TSK / + mus. Resultaterne er, at IRF5D ikke inducerer proliferation eller apoptose. Endvidere inflammation blev reduceret og vaskulær funktion forbedres. Disse data antyder, at IRF5 spiller en vigtig mekanistisk rolle i udviklingen af inflammation og fibrose i hjertet af TSK / + mus, og at det har potentiale til at tjene som et terapeutisk mål.
Det første skridt var at designe en hæmmer. Når et peptid er udformet, flere punkter skal tages i betragtning: sekvenslængde, sekundær struktur, rester tilbøjelige til oxidation, aminosyresammensætning, amidering og capping, aminosyrer i N-terminalen og aminosyrer i C-terminalen, og ligand binding. Den ideelle sekvens er mellem 10 til 15 rester for at sikre bedst samlet udbytte, færre urenheder, og reducerede omkostninger. Det er vig-tigt at være opmærksom på sekundære strukturer som beta-sheet-dannelse. Beta-sheet-dannelse kan resultere i en høj grad af deleterede sekvenser. Undgå rester tilbøjelige til oxidation som kan føre til sidereaktioner, der kan påvirke effektiviteten af peptidet. For at styre opløselighed, syntese og oprensning, holde sammensætningen af aminosyre-byggestenene til peptidet under 50% hydrofobe aminosyrer og sikre, at der er nok ladede rester. N- og C- Termini skal vælges i en opladet tilstand. Undgå glutamat ved N-terminus og undgå cystein, prolin, og glycin ved C-terminalen. Tilføj et afstandsstykke mellem peptidet og liganden at minimere foldning. Derfor er de måske nødt til at være maskeret som en amid uden beregning.
IRF5D design var baseret på 3D-struktur. En 17 mer, betegnes IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) er designet, hvor aspartat (D) blev erstattet af serin (S) for at efterligne fosforylering i IRF5 på 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Det herfremgangsmåde er ligetil på grund af ny computerteknologi. Ulempen ved denne teknik er den oprindelige investering i softwaren. Der er dog betydelige samlede besparelser sammenlignet med omkostningerne i forbindelse med arbejdskraft og anvendes i andre inhibitor design metoder, ligesom fagvisning 22 materialer. Den kritiske trin i denne proces er tilgængeligheden af 3D-strukturen af målproteinet og dens mulige bindingssteder. Begrænsningen af designe en inhibitor er muligheden for, at en forkert region vælges og inhibitoren ikke blokerer det ønskede protein. Den anden mulighed er en delvis blokering af det ønskede protein.
Med peptidet i hånden flytter fokus til at teste toksiciteten af attrap-peptid ved måling af celleoverlevelse. Først IRF5D blev testet under anvendelse af varierende koncentrationer. IRF5D ikke inducere apoptose og ikke fremmer proliferation selv ved højere koncentrationer. De her anvendte metoder er standard og give pålidelige data. Tetrazoliumfarvestoffet bioreduktion har været brugt i mange år 23. Dette assay blev valgt på grund af dens reproducerbarhed og tid-effektivitet i forhold til andre metoder, f.eks, tælle celler manuelt som er meget tidskrævende. Brug af BrdU at mærke prolifererende celler kræver radioaktivitet, som er følsom, men kan være farlige. Tetrazoliumfarvestoffet bioreduktion er tidsbesparende og kræver ingen radioaktivitet. Begrænsningerne i tetrazoliumfarvestoffet bioreduktion er fremherskende i undersøgelser med oxido-reduktiv potentiale. Hvor oxido-reduktiv potentiale sker, falske positiver er hyppigere 24.
Isoleringen af den ekstracellulære matrix blev erhvervet ved at opløse alle myocardiale celler med en hypertonisk opløsning. Protokollen blev udviklet sig fra undersøgelser under anvendelse af en perfusion apparat til en simpel agitation proces 25. Den Varigh./takstion blev vurderet empirisk ved at tage forskellige tidspunkter: 12, 14, 16, 18, 20 timer. Den ekstracellulære matrix blev analyseret for cellerester efter forskellige tidspunkter 25. De vigtigste faldgruber decellularization er svampe- og bakteriel forurening. Det tilrådes at bruge anti-svampe og anti-mikrobielle stoffer. At overtrække retter, er den ekstracellulære matrix powderized og suspenderes i PBS. På grund af det høje indhold af elastisk materiale, er prøven ikke opløses fuldstændigt. Sonikering på indstillingerne højere intensitet uden opvarmning af prøven er bydende nødvendigt. Fordelen ved at anvende ekstracellulære matrix i forhold til andre coatingmidler er, at den ekstracellulære matrix er en sammenlægning af proteiner fysiologisk forekommende og den forbinder in vivo og in vitro assays. Denne fremgangsmåde er mere fysiologisk end overtrækning med en enkelt forbindelse som collagen eller fibronectin alene. Det giver også indsigt i betydningen af signalering initieres af ændringer iden ekstracellulære matrix. En begrænsning ved denne protokol er klart ødelæggelsen af matrixen og fjerne vigtige signalsystemer komponenter fra matrixen. Det er bydende nødvendigt at være forsigtig, når decellularizing matricen.
Anvendelsen af intakt væv, såsom isolerede fartøjer åbner mulighed for at studere vasodilation in situ og med minimal interferens af enzymer. Denne metode er mest passende at studere endothelfunktion i en række forskellige dyr og sygdomme. Duling var den første til at beskrive denne metode hos svin. Skibene i svin er dybt i vævet; dermed papiret beskrev gelatine fiksering. Tidlige studier i vasodilation anvendes halspulsårer 26. Vi forfinet teknik til at bruge facialis arterier 27. Facialis arterier er mere svarer i størrelse til en modstand arterie end halspulsåren. En begrænsning af denne protokol er skrøbeligheden af fartøjet, der skal fjernes intakt requiring praksis.
Sammenfattende udvikle IRF5D muligt for os at vurdere inddragelsen af IRF5 i inflammation og fibrose i hjertet. Dette resulterede i dataene afbildet i denne undersøgelse. IRF5D er et nyttigt værktøj til at studere de mekanismer IRF5 i forskellige sygdomme samt antyder IRF5 som et muligt mål stof 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
