Introduction
hücre büyümesi ve hücre ölümü, bağışıklık karşılıklarının düzenlenmesinde, interferon ayarlayıcı faktör transkripsiyon faktörü ailesinin rolü için esastır. IRF5 tip 1 arasında, bağışıklık karşılıklarının düzenlenmesinde, bir enflamatuar teşvik yanıt ve tip 2, bir bağışıklık tepkisi hedefleme doku onarımı için çok önemli olarak vurgulanır. IRF5 kanseri 1 ve otoimmünite, 2, 3, 4, 5 anahtardır.
Sıkı cilt fare (Tsk / +) nedeniyle fibrillin-1 genindeki bir mutasyon çoğaltma doku fibrozis ve skleroderma için bir modeldir. sıkı cilt Bu mutasyon sonuçları ve bağ dokusu bir artış. Bu fareler, miyokardiyal inflamasyon, fibrozis ve son olarak, kalp yetmezliği 5, 6, 7 geliştirilmesi> 8, 9. Skleroderma Amerika Birleşik Devletleri'nde 6 yaklaşık 150.000 hasta etkileyen bir otoimmün fibrotik bozukluktur. Bu hastalığın diğerlerinden ayıran kalp 7, 8, 9, 10, 11 dahil olmak üzere, iç organların fibroz bulunmaktadır.
Çalışmanın doğası inhibitör peptid tasarımını talep etti. yazılım yaklaşımı bir faj ekranı kullanarak geleneksel bir yaklaşım üzerinde seçildi. yazılım yaklaşımı daha kolay ve daha az zaman alıcıdır. RCSB veri bankası, uygun bağlanma bölgelerini 12 tanımlamak için kullanılır. rekombinant protein ile yeni tasarlanmış peptid etkileşimini incelemek ve bağlayıcı parametreleri üzerinde odaklanmak, bir teknik denilen biolayer enterforemetre kullanıldı. Biolayer interferometri, bir biyosensor göre TECHNIQ olanue bir biyosensör ve bağlayıcı bir örneği kullanarak bağlanma afinitesi, dernek ve ayrılmayı belirler. biyosensör floresan, luminescently, radyometrik ve kolorimetrik etiketli olabilir. Ölçüm kütle eklenmesi veya tükenmesi birleşme ve ayrışma 13, 14 benzer dayanır. Bu çalışmanın amacı, miyokard inflamasyon ve fibrozis IRF5 rolünü anlamak oldu. hedef doku fibrozis ve skleroderma gelişiminde IRF5 rolünü anlamak için oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. protokol Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (: AUA # 1517 Protokolü) tarafından onaylandı. fareler içeren tüm araştırmalar PHS politikasına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Decoy Peptid 1. Tasarım
- IRF5 3D yapısını bulun ve üzerinde tasarım temel. 438 (ELSWSADSIRLQISNPD) - 17 mer Tasarım, aspartat (D), 421 de IRF5 fosforilasyon taklit etmek için serin (S) için ikame edilmiş olan IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) olarak adlandırılan. 3D sülfhidril grupları ve aktivasyon IRF5 en mekanizmasının bilgisi, yani, serin fosforilasyon analizi IRF5 hedefleme için bir strateji, bir yem peptidi üretmek üzere olduğunu göstermiştir. Bkz: Şekil 1. 3D yapısında en iyi bölgeyi tanımlamak için, küçük Molekül tasarımı için bir moleküler modelleme yazılımı kullanmakes ve peptidler 15.
NOT: Bu süreçte kritik adım 3D hedef proteinin yapısı ve olası bağlanma sitelerinin mevcut olmasıdır. IRF5 3 boyutlu yapısı doğru fosforilasyon sonra nasıl IRF5 dimerleşir temsil eder. serin veya treonin için aspartat ikame dış kaynaklı. Peptit IRF5 bağlı olmadan ayrı ayrı olarak sentez edilir. - Sadece orijinal sekansı temelinde S. D ile ikame ederek, fosfo-alan çoğaltma (ELSWSADSIRLQISNPD Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D) amino asidi dizisi ile, yeni bir peptid IRF5S olun.
2. Biolayer İnterferometri (BLI)
Not: yeniden birleştirici IRF5 için arıtma dış kaynaklı edildi. 16
- 1 bir mol oranında Biyotin etiketli IRF5: biotin 1 uzun zincirli bağlayıcı içeren bir biyotinilasyon maddesi ile ligand. uzun zincirli bağlayıcı bir daha aktif ve homojen liga sağlayacaktırnd yüzey.
- 20 mM biotin reaktif 13 uL 2 mg 1 ml / ml IRF5 ekleyin veya gerekirse hacmini artırmak. 2 saat buz üzerinde inkübe edin. Etiketlemeden sonra, işaretlenmiş protein reaksiyon karışımının ayrılması için bir tuz giderme spin kolon kullanımı.
- 15 dakika boyunca biyosensör ile biyotin etiketli ligand inkübe edin. aşırı etiketleme önlemek ve 1 ayarlayın: 1 molar oranı. Etiketlemeden sonra, işaretlenmiş protein reaksiyon karışımının ayrılması için bir tuz giderme spin kolon kullanımı.
- IRF5 decoy peptidin farklı konsantrasyonlarda 10 dakika için biyotin etiketli IRF5 biyosensörler inkübe edin. Birleşme ve ayrılma hızları, 18 17, 10 tarif edildiği gibi tespit edilmiştir.
3. Apoptoz ve Çoğalma Tahlilleri
- Tetrazolyum ve bioreduction ile çoğalma tahlili
- IRF5D PBS içinde seyreltilmiş olarak uygulanabilir (1 mg /kg / gün, 21 gün Tsk / + ve C57BL / 6J farelerine tek başına PBS standart scruffing tekniği ya da bir 27 gauge iğne ile deri altına), 20 g fare bir hacmi 20 uL enjekte edilir.
- izofluran (% 5) ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak.
- Lyse 50 mM Tris-HCI pH 7.4, Bradford tahlili 19% 0.5 NP-40, 250 mM NaCI, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 ve tespit protein konsantrasyonu ihtiva eden bir protein liziz tamponuyla kalpler.
- bölüm 7'de tarif edildiği gibi izole edilmiş C57BL / 6J kardiyak matrisle tabakalı 96-gözlü plakalar seyreltin PBS 20 ug / mL 'lik bir konsantrasyona kadar C57BL / 6J kalp matrisinin süspansiyon haline getirilmiş ve her bir C57BL / 6J kalp 30 mcL ekleyin. Bu kuluçka makinesi içinde 37 ° C de bir gece boyunca çökelmeye olsun.
- endotel bazal m 500 mi kültür, insan göbek damarı hücrelerinin% 0.4 sığır beyin ekstresi,% 0.1 askorbik asit,% 0.1 hidrokortizon,% 0.1 insan epidermal büyüme faktörü,% 2 fetal sığır serumu ve gentamisin / amfoterisin B için eklenen% 0.1 edia. Kültür oyuk başına 25,000 hücre yoğunluğunda% 5 CO2 ve% 95 hava odası 96 yuvalı plakalar üzerinde hücreleri. 0 ile IRF5D artan konsantrasyonları ile teşvik - ortama 100 ug / mL (miktarlar, 0 ve 50 ul / ml arasında idi).
- Üç gün sonra, hücre çoğalmasını belirlemek bir mikroplaka okuyucusu üzerinde absorbans farkları değerlendirmek. Reaksiyon MTS tetrazolyum bileşiğinin bioreduction olup. NADPH ve NADH, metabolik olarak aktif hücrelerin deki dehidrojenaz enzimleri yoluyla üretilir.
- MTS tetrazolyum bileşiği, -20 ° C'de donmuş olarak saklanır gibi, bileşik oda sıcaklığında yavaş yavaş yaklaşık 90 dakika eritin. Pipet 20, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna uL, ve buna kültür ortamı, 100 uL ilave edin. Bir Humi 1 ila 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakasıasitleştirildi,% 5 CO 2 odacık.
- 490 nm'lik bir dalga boyunda emicilik okuyun.
- Kaspaz aktivitesi ile Apoptosis denemesi
NOT: Deneysel set-up 3.1.5 için 3.1.1 yukarıdaki aynıdır.- ortama 100 ug / mL - 0 ile IRF5D artan konsantrasyonları ve hücreleri uyarır.
- EC'ler için Kaspaz 3/7 alt-tabaka için yeşil algılama ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika için inkübe edilir. 502/530 nm'lik bir emme / emisyon dalga ile eş zamanlı olarak mikroplaka okuyucusu üzerinde flüoresans değerlendirmek. üç nüsha olarak denemeler.
Not: yeşil flüoresan madde, bir nükleik asit bağlayıcı bir boya bağlı bir dört amino asitli bir peptiddir. kaspaz 3 ve 7 aktivasyon sonrasında parçalanan Bu reaktif floresan olur. Bu floresans ölçülmüştür. avantajı, yıkama basamakları bir azalmadır.
Duyun IRF5 ve ICAM-1 ifadesinin 4. Değerlendirmet
- Standart bir scruffing tekniği ile ya da tek başına Elbette bu / + ve C57BL / 6J fareleri bir kez PBS ile 27 gauge iğne ile deri altından (20 g fare bir hacmi 20 uL enjekte 1 mg / kg / gün), PBS içinde seyreltilmiş IRF5D yönetme 21 gün boyunca günde.
- izofluran (% 5) ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak.
- Lyse 50 mM Tris-HCI pH 7.4, Bradford tahlili 19% 0.5 NP-40, 250 mM NaCI, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 ve tespit protein konsantrasyonu ihtiva eden bir protein liziz tamponuyla kalpler.
- kalplerin lizatları üzerinde bir batı leke gerçekleştirin. 25 ug toplam protein ve% 5 mersaptoetanol ihtiva eden Laemmli numune tampon maddesi ile 40 ul bir hacme kadar örnekleri seyreltilir. 5 dakika boyunca 50 mV% 15 TGX jel - 4 örnekleri çalıştırın. Boya ön bitene kadar 1 saat boyunca 100 mV gerilim artırın.
- 15 dakika - (gerekirse 8.3 pH ayarlamak, 25 mM Tris, 190 mM glisin,% 20 metanol) ve 10 boyunca inkübe 1x transfer tampon maddesi içinde jel yerleştirin.
- Transfer sandviç (sünger, filtre, jel, selüloz membran, filtre, sünger) birleştirin. kabarcıklar arasında sıkışıp emin olun. leke katot ve anot üzerinde jel üzerinde olmalıdır. 100 mA soğuk odada 1 saat aktarın.
- Sonraki gün, leke yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 yağsız kuru süt içine bir arka plan blok. Tris benek her biri 5 dakika süreyle% 5 Tween üç kez içeren tamponlu tuz durulayın.
- IRF5 veya ICAM-1 için primer poliklonal antikorları kullanılarak primer antikorlar ile gece boyunca inkübe edin. 1000 seyreltme: Tris antikorlar bir 1 tamponlu tuz ile seyreltilir.
- Tris ikincil antikorlar tamponlu tuz ile seyreltilir ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca leke inkübe edin. İkincil antikorlar için, kullanımı yabanturpu peroksidaz konjüge edilmiş eşek anti-fare IgG (1: 10,000) ve yaban turbu peroksidaz eşek anti-keçi IgG (1: 10,000), sırasıyla.
- üreticinin protokolüne uygun olarak, karıştırma bileşenleri sonra, blot kemilüminesans uygulanır ve ilgili bantlar luminesce 3 dakika inkübe edilir. bir X-ışını filmine leke Açığa. yoğunluğunu ölçmek için ImageJ kullanın. Kontrol bantları 10 yoğunluk değerlerini normalize.
IRF5 İnhibisyon sonra İltihaplı Hücre Sayıların 5. Değerlendirme
- Standart bir scruffing tekniği ile veya PBS ile deri altından 27 gauge iğne ile, PBS (1 mg / kg / gün) ile seyreltilmiş IRF5D yönetme başına TSK / + ve 21 gün C57BL / 6J fareler.
- izofluran (% 5) ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak. Yapış dondurmak ve analize kadar eksize kalpleri saklayın.
- Tiss donmuş kalpleri monteKullanılan kriyostat uygun vi sahipleri. immünohistokimya için bir kriyostat üzerinde 10 mikron kalınlığında donmuş kesitler halinde kesilmiştir.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz içerisinde% 1 paraformaldehit ile dondurulmuş bölümler düzeltildi. 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton-X 100 ile bölümleri geçirgenliği.
Dikkat: Paraformaldehyde düzenlenmiş kanserojen ve dikkatle ele alınması gerekmektedir. - anti-tavşan CD64, bir monosit / makrofaj işaretleyici 1 seyreltin: 200 PBS içinde. sabit bölümleri için de geçerlidir ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde üç kez slaytlar yıkayın.
- anti-fare NIMP, birincil nötrofil işaretleyici 1 seyreltin: 200 PBS içinde. sabit bölümleri için de geçerlidir ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS ile üç kez slaytlar yıkayın.
- İkincil antikorların anti-tavşan sulandırmak Alexa 488 konjuge ve anti-sıçan Alexa 488 1 konjuge: 200 PBS içinde.
- anti-tavşan Alexa 48 uygula8 konjüge anti-fare Alexa 37 ° C'de 30 dakika boyunca bölümlere 488 konjuge sekonder antikor duruma göre. antikor hacmi bölümün boyutuna bağlı olarak değişir. miktar cömertçe bölümü kapsamalıdır. Çoğu durumda hacmi 100 ila 200 ml.
- PBS içinde 1000 seyreltme: 1 bir nükleer boya olarak 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanın. 1 ml PBS içine 1 uL ekleyin ve son yıkama aşamasında DAPI kullanın. Bir kapak kayma sulu montaj medya ekleyin ve slayt üzerine koydu.
- 40X petrol objektif kullanarak konfokal mikroskobu ile floresan işaretli bölümleri analiz edin. Kullanım uyarma CD64 ve NIMP için daha büyük 530 nm 488 ve emisyon dalga boylarını dalga boylarını. DAPI 360 nm ile heyecanlı ve mavi 460 nm'de yayılan edildi. Farklı etiketleme ile (her grupta 3 farklı farelerden, n = antikor başına 10 görüntü) monositler / makrofajlar ve nötrofiller ayırt ve say. sayılan hücrelerin sayısı; ifade eder.
IRF5 inhibisyonu sonra 6. Hücre bağlı damar genişlemesi
- (- 100 mg / kg 80) / ksilazin (10-12,5 mg / kg) karışımı ile ve bir ketamin ile peptid tedavisiz C57BL / 6J fareler, kontrol TSK / + fareler anestezi. intraperitoneal ketamin / ksilazin karışımı enjekte edilir. elle fare kısıtlamaktadır.
- 25 göstergesi veya daha küçük iğne kullanın. karın sağ alt kadranda içine iğne takın. iğne kan damarı ya da bağırsak girmemesini sağlamak için enjeksiyondan önce pistonu geri çekin.
- anestezi yeterli düzeyde ulaşıldıktan sonra, yatar pozisyonda fare sabitleyin alkol batırılmış gazlı bezle kürk silin ve bir makas göğüs boşluğu açmak ve kalp kaldırmak kullanarak.
NOT: eksanguinasyonla fare euthanize ve kan damarlarını keserken, böylece kanama en aza indirmek damarsal basıncı azaltarak daha kolay diseksiyonu yapacaktır.- cilt usin açınçenenin öne doğru yatan dokuları rahatsız değil için makas ga çifti, özenle çene kemiğine göğüs yanal kadar kesim.
- etrafında yumuşak dokuyu kaldırarak facialis arteri teşrih.
- Dikkat: MOPS tampon kalmış maruz doku tutarken facialis arter üzerinde gemi veya römorkör zarar vermeyin (2.0 mM CaCl2 · 2H 2 O, 0.02 mM EDTA, 5.0 mM glukoz, 4.7 mM KCI, 1.17 mM MgSO 4 · 7H 2 O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCI, 1.2 mM NaH 2 PO 4 · H2O, 2.0 mM pirüvik asit) kuruma önlemek için. binoküler stereo zoom diseksiyon mikroskobu (45x için 3.5x büyütme) ve fiber optik ışık kaynağı altında gerçekleştirin.
- facialis arteri izole edin.
- arter kesilecektir nerede ilk çatallanma ve distaline facialis proksimal kavrayın. ebeveyn arter, eksternal karotid arterden artere kesin. facialis Arterie kaldırve IRF5D tedavi olmadan kontrol farelerinde, Tsk / + farelerin s.
- hala forseps arter tutarken, iki şube herhangi kesilmemiş çevresindeki doku tespit ve kopmuş edilebilir ise gemi nazikçe kaldırdı sağlayan, facialis geliyor kesti.
- çatallanma gemiyi kurtarmak için hem kızı arterleri kesme ulaşana kadar bu şekilde devam edin. kalp kaldırmasını vaskülatürde rahatlamış basınç nedeniyle kesme önce gemi sıkıştırmak için gerek yoktur. Diğer facialis arter disseke ve izole iken MOPS tamponunda bir kap yerleştirin.
- 175 mikron - 125 terminal çapa sahip cam pipetler üzerine onları bağlayarak damarları cannulate. MOPS tamponu ile cam pipetler ve tampon rezervuarları önyükleyebilir.
Dikkat: pipetler oluşumunu hava kabarcıklarını önleyin. - Oftalmik sütür ile pipetler üzerine damarları kravat.
- ters triocular MICR damar odaları monteBir video kamera eki ile Oscope. gemilerin ekran ölçümleri için bir video kumpas ölçüm sistemi üzerinden video çalıştırın. 20
- iki aşamalı bir süreç içinde basınç. İlk olarak, 20 mmHg basınca eşit kap üzerindeki bir yükseklikte MOPS doldurulmuş rezervuarlar, el teknesine rezervuar hatlarında musluk vanalarını açın ile. bağları ve çevresinde geminin uzunluğu aşağı sızıntı işaretleri için gemi kontrol edin. İkincisi, 60 mmHg rezervuarları yükseltmek ve gemi reinspect.
- 60 mmHg basınç sonra kaplar, 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
- 3.0 x 10 -8 10 7 M U46619 - 1 kullanılarak maksimum çapının% 75 - asetilkolin (10 -7 M -4 10) yanıt olarak damar genişlemesini belirlemek üzere, bir çapa 50 kap preconstrict. bırakıldıktan sonra kabı, 6 dakika için stabilize edilmesi 2 dakika süresi adımda banyosuna asetilkolin ekleme şekildebanyoda nihai konsantrasyonlar 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 vardır. Her üç grupta da vazodilatasyon ölçün.
Kardiyak Ekstrasellüler Matrix 7. İzolasyonu
- ve izofluran (% 5) ile peptid tedavi olmadan C57Bl / 6J kontrol fareleri ve Tsk / + fareler anestezi ve servikal dislokasyon gerçekleştirin. sternum boyunca göğüs açık keserek kalbini tüketim. forseps ile kalbi yukarı kaldırın ve kalp kaldırmak.
- bir kap içine çıkarıldı kalpleri koyun ve 15 ml hipertonik% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ilave edin. % 1 SDS çözeltisine bir karıştırma çubuğu ilave edilmesi ve bir karıştırma plakası üzerinde kabı koyarak hücreleri parçalamak için oda sıcaklığında 18 saat süre ile% 1 SDS çözeltisi içinde kalpleri çalkalayın.
Dikkat: hipertonik çözelti içinde çok uzun süre bırakılırsa hücre dışı matriks parçalanır farkında olun. kalpleri hipertonik çözelti içinde yeterince uzun ajite değilse Tersine, daha sonra hücrelerin düzgün olmazçözülür ve beherde kalan hücre döküntüsü olacaktır. - 15 ml% 0.5 Triton X-100 içinde, 30 dakika boyunca yıkanır. Daha sonra 15 ml PBS ile 15 dakika boyunca yıkanır. tek tek her kalbi Decellularize.
- sıvı nitrojen içinde hücre dışı matris ek bileşen dondurma ve önceden soğutulmuş havan ve havan tokmağı ile dondurulmuş kardiyak hücre dışı matrisi powderize.
- PBS% 1 antibiyotik ihtiva eden toz haline getirilmiş bir matris süspansiyonu yapın. Çoğu durumda ilave hacmi 300 uL olan. yüksek ayarında buz üzerinde 60 sn - 30 süspansiyon sonikasyon.
NOT: Numune soğuk tutar çok önemlidir. Süspansiyon nedeniyle yüksek protein glikan içeriği çok viskoz olduğunu unutmayın. - Bir Bradford tahlili kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
NOT: süspansiyon anti-biyotik ve anti-mantar olduğundan emin olun. Penisilin / Streptomisin en yaygın olarak kullanılan ve tavsiye edilir.
Immunohistochemist Nükleer Translokasyon 8. Değerlendirmery
- kat yemekleri ve slaytlar 20 ug PBS kardiyak hücre dışı matris / ml bir son konsantrasyon kullanımı. kardiyak hücre dışı matris kaplama için 100 mm tabak içine çözeltisi ve bir slayt üzerine nihai hücre dışı matris çözeltisi 150 uL pipetleyin 500 uL.
- Kültür neonatal kalp miyositleri sıçan 24 saat boyunca 50 ug / ml arasında bir konsantrasyonda IRF5D ekleyerek IRF5 inhibe eder. Tedavi edilmeyen miyosit kültürleri kontrol bırakın.
- çekirdek kullanarak Immünofloresan sitoselden IRF5 kaçakçılığı değerlendirmek ve konfokal mikroskobu ile analiz edin. , IRF5 yeşil etiketleme belirlemek çekirdeğin mavi DAPI leke tespit
- birincil anti-IRF5 antikor uygulayın. PBS içinde 200 seyreltme: Primer antikor, bir 1 kullanılmıştır. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin slaytlar ve üç 5 dakika Yıkama adımları ile takip edin. İkincil antikor Alexa 488-işaretlenmiş keçi anti-fare IgG antikoru idi.
- Sulandırmak ikincil antikor 1: 1,000 diPBS içinde dökülmesinden. 37 ° C'de 30 dakika için ikincil antikor inkübe edin. DAPI ile nükleer leke elde edin. PBS 1000: DAPI 1 seyreltin. 5 dakika boyunca slaytlar 3 kez toplam yıkayın ve üçüncü ve son yıkama adımına DAPI ekleyin.
- Daha önce olduğu gibi konfokal mikroskopi ve çekirdeklerde ölçü floresan ve sitoplazmada kullanarak yakalama kaçakçılığı 10 nitelendirdi. , IRF5 yeşil etiketleme belirlemek çekirdeğin mavi DAPI leke tanımlar. Onlara yeşil etiketleme ile mavi çekirdekleri sergileyen hücreler çekirdeğe sitoplazmada trafiğe IRF5 aktif içerir. IRF5 aktif değil yeşil etiketleme sitoplazmada bulunur.
- 40X petrol objektif kullanarak konfokal mikroskobu ile floresan işaretli hücrelerin analiz. IRF5 için daha büyük 530 nm 488 nm ve emisyon dalga boylarında bir eksitasyon dalga boyu kullanın. 360 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve DAPI görüntülenmesi için 460 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanın.
- içinde ve gruplar arasında tekrarlanan ölçümler için varyans (ANOVA) analizi yapın. Öğrenciler t-testi Bonferroni değişiklik ile ANOVA izleyin. ortalama standart hata gibi verileri ifade eder.
- (- 100 mg / kg 80) / ksilazin (10-12,5 mg / kg) karışımı ile ve bir ketamin ile peptid tedavisiz C57BL / 6J fareler, kontrol TSK / + fareler anestezi. intraperitoneal ketamin / ksilazin karışımı enjekte edilir. elle fare kısıtlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 'de gösterilen sonuçlar, bir peptid tasarım şeklini göstermektedir. Şekil 1, sol üst, kinazlar bir dizi ile fosforile olduğu IRF5 bölgeyi (2 sarı oklar arasında, amino asitler (aa) 425-436) gösterir. Şekil 1, sağ üst, IRF5 en fosforile etki bağlayan sarı oval gösterir. 3DSH dimerik yapı Helix 2 (aa303-312) solundaki bir yarık ya da vadi gözlemlemek için döndürüldü. IRF5 ve fosfor-kuyruk alanı tam olarak (yani, serin fosforile), şekillendirme homodimer ve kabul biyolojik olarak aktif duruma etkinken bağlamak gerekiyordu yerdir.
Şekil 2'de, biolayer interferometri ile ölçülen bağlama etkinliği gösterilmiştir. yem peptid IRF5D toksik olmadığını belirlemek için, çoğalması ve apoptoz c tedavi sonrasında değerlendirildiIRF5D konsantrasyonları (Şekil 3) artan arşın. ICAM-1, enflamatuar markeri ve IRF5 ifadeleri western blot analizi (Şekil 4) ile belirlenen IRF5D TSK / + fareleri tedavi sonrasında azaltılmıştır. IRF5D ile muamele (Şekil 5) sonra imünohistokimya ile tespit edildiği üzere nötrofillerin (NIMP) ve CD64 sayısı azalmıştır. IRF5D IRF5D tedavisi (Şekil 6) olmadan Elbette bu / + farelerine göre sonrası endotel fonksiyon Tsk / + fareler fasiyalis arterlerde geliştirilmiştir. Elbette bu / + kalp matrisinin kültüre miyositlerde IRF5 pozitif çekirdeklerin daha fazla sayıda C57BL / 6J kalp matrisinin göre görselleştirilmiştir. IRF5D kültürlerin tedavisi IRF5 pozitif çekirdeklerin (Şekil 7) daha az sayıda sonuçlandı.
Şekil 1: 3D Protein StructurIRF5 e. A) sol üst rakam peptid için tasarlanmış bölgeyi gösterir. IRF5 436 - B) iki san oklarla vurgulanır fosforile edilmiş olan bölgenin amino asit (aa) 425 vardır. C) alt panel homodimerik fonksiyonel kompleks göstermektedir. homodimerik rakam IRF5 fosforile kuyruk alanı bir homodimer oluşturacak şekilde bağlanır bölgenin daha kolay görüntüleme için sunulmuştur. Bu rakam daha önce 21 yayımlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: IRF5D of Biolayer İnterferometre. Bu rakam biolaye tarafından değerlendirilir IRF5D için IRF5 bağlanmasını gösterir r enterforemetre. Analiz yazılımı IRF5 3.72 ± 0.75 x 10 -6 M bir Kd ile IRF5D bağlandığım göstermiştir (ortalama ± SD, n = 3). Bu rakam daha önce 21 yayımlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: hücre çoğalmasının ve apoptozun. Bu çubuk grafikler IRF5D artan konsantrasyonları, hücre çoğalması (sol) veya apoptosis (sağ) üzerinde herhangi bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir ve IRF5D seviyelerini arttırarak değişmemiştir. Bu rakam daha önce 21 (ortalama ± SD, p <0.05, n = 4) yayımlanmıştır.k "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Kalp ICAM-1 ve IRF5 ifadesi. Western Blot ile gösterildiği gibi ICAM-1 (A) ve IRF5 (B) ifadeleri IRF5D tedavi sonrası Tsk + farelerin miyokardiyumda azalmıştır. veri aktin yükleme kontrolü için normalize edildi (SD, p <0.05 ortalama ± n = 3). Bu rakam daha önce 21 yayımlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:Heart CD64 (A) ve NIMP (B) ekspresyonu. monositler / makrofajlar ve nötrofiller sayısı (ortalama ± SD immünhistokimya ile gösterildiği gibi IRF5D tedavisinden sonra azalmıştır * = p <0.05, Tsk vs C57BL / 6J / +; # p = <0.025, Tsk / + Tsk vs / + IRF5D n = 3 olduğunda, antikor başına 10 görüntü). Oklar monosit / makrofajlar (A) ve nötrofillerin (B) vurgulamaktadır. Ölçek çubukları 10 mikron bulunmaktadır. Bu rakam daha önce 21 yayımlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Hücre Fonksiyonu ve Vazodilatasyon. IRF5D Yönetim Tsk / + fareler fasiyalis arterlerin asetilkolin kaynaklı damar genişlemesi (yani, geliştirilmiş,177.; SD, p <0.05, n = 6). Bu rakam daha önce 21 yayımlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: IRF5 inhibisyonu ile kültürlü miyositlerde IRF5 arasında IRF5 nükleer translokasyonu. IRF5D ile IRF5 inhibisyonu (50 ug / ml, 24 saat) Elbette bu / + kalp matrisinin ve C57BL / 6J kalp matrisinin kültüre miyositlerde az IRF5 pozitif çekirdeklerin yol açar. oklar IRF5 pozitif çekirdekler (SD, p <0.05 ortalama ± n = 3) tasvir. Ölçek çubuğu 5 mm. Bu rakam daha önce 21 yayımlanmıştır. tiklayiniz LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya k.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gol Tsk / + farelerin kalplerinde inflamasyon, fibrozis, ve vasküler fonksiyon üzerine IRF5 rolünü aydınlatmak için bir IRF5 inhibitörü tasarlamak oldu. Bulgular IRF5D proliferasyonu veya apoptosisi teşvik etmediğini bulunmaktadır. Ayrıca, iltihabın azalır ve damar fonksiyon geliştirildi. Bu veriler IRF5 Tsk / + farelerin kalp inflamasyon ve fibrozis gelişiminde önemli bir mekanik rol oynadığını düşündürmektedir ve bir tedavi hedefi olarak hizmet potansiyeline sahip olduğunu.
İlk adım, bir önleyici tasarlamaktı. bir peptit tasarlanmıştır, birkaç noktalar dikkate alınması gerekir: dizi uzunluğu, sekonder yapısı, C-terminal N-terminal amino asit oksidasyonu, amino asit bileşimi, amidasyon ve Kapatma, amino asitler eğilimli kalıntılar ve ligand eki. İdeal dizi uzunluğu en iyi genel verimi, daha az yabancı maddeleri, ve düşük maliyet sağlamak için 15-10 arasındaki tortudur. Bu önemli bir soruntant beta tabakası oluşumundan gibi ikincil yapıların farkında olmak. Beta tabakası oluşumundan silinmiş sekansların yüksek derecede neden olabilir. Peptidin etkinliğini etkileyebilir yan reaksiyonlara yol açabilir oksitlenmeye eğilimlidir artıkları kaçının. çözünürlük, sentezi, ve arıtma kontrol etmek için,% 50, hidrofobik amino asitler aşağıdaki peptit için amino asit yapı bloklarının bileşimi tutmak yeterli yüklü artıklar olmasını sağlamak. N- ve C-termini, bir şarj edilmemiş seçilmiş olması gerekir. N-ucunda glutamat önlemek ve C-terminal sistein, prolin, glisin kaçının. katlama en aza indirmek için peptit ve ligand arasında bir mesafe parçası ekleyin. Bu nedenle, onlar şarj olmadan bir amid olarak maskeli gerekebilir.
IRF5D tasarım 3D yapı dayanıyordu. Bir 17 mer, aspartat (D), 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD) en IRF5 fosforilasyon taklit etmek için serin (S) ile ikame edilmiştir burada IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) tasarlanmıştır olarak adlandırılır. Buyaklaşım nedeniyle yeni bilgisayar teknolojisi yalındır. Bu tekniğin dezavantajı yazılımı ilk yatırım olduğunu. Ancak, emek ve faj gösterim 22 gibi diğer inhibitör tasarım yöntemlerinde kullanılan malzemeler ile ilişkili maliyetler ile karşılaştırıldığında önemli genel tasarruf vardır. Bu süreçte kritik adım 3D hedef proteinin yapısı ve olası bağlanma sitelerinin mevcut olmasıdır. bir inhibitör tasarlama sınırlama yanlış bölge seçilir ve inhibitör istenen proteini bloke değil ihtimaldir. Diğer bir olasılık, istenen proteinin kısmi engelliyor.
elinde peptid ile odak hücre sağkalım ölçerek tuzak peptid toksisitesini test taşır. İlk olarak, IRF5D değişken konsantrasyonlarda kullanarak test edilmiştir. IRF5D apoptosisi teşvik etmez hatta daha yüksek konsantrasyonlarda çoğalmayı teşvik etmez. Burada kullanılan yöntemler sta vardırard ve güvenilir veriler verir. Tetrazolyum boya bioreduction yıllardır 23 kullanılmaktadır. Örneğin diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında Bu deney ait olan zaman alıcı elle hücre sayımı nedeniyle, tekrarlanabilirlik ve zaman etkinliğinin seçildi. çoğalan hücreleri etiketlemek için BrdU kullanarak duyarlı radyoaktiviteyi gerektirir, ama tehlikeli olabilir. tetrazolyum boya bioreduction zaman etkilidir ve radyoaktivite gerektirmez. tetrazolyum boya bioreduction sınırlamaları oksido-indirgeyici potansiyelini içeren çalışmalar yaygındır. Oksido-indirgeyici potansiyeli oluştuğunda her yerde, yanlış pozitif 24 daha sıktır.
hücre dışı matriks izolasyon hipertonik çözelti ile tüm miyokard hücreleri eriterek tarafından satın alınmıştır. Protokol, basit karıştırma işlemi 25 bir perfüzyon cihazı kullanılarak çalışmalar terketmektedir. duratİyon farklı zaman noktalarında alarak deneysel değerlendirildi: 12, 14, 16, 18, 20, H. Farklı zaman 25 işaret sonra ekstrasellüler matriks hücre artıkları için analiz edildi. Decellularization ana tuzaklar fungal ve bakteriyel kontaminasyon vardır. Anti-mantar ve anti-mikrobiyal bileşikler kullanılması tavsiye edilir. kaplama yemekler için, hücre dışı matris toz haline ve PBS içinde süspansiyon haline getirildi. Nedeniyle elastik malzemenin yüksek içeriği, örnek tamamen çözülmez. örnek ısınma olmadan yüksek yoğunluklu ayarlarına Sonication zorunludur. Diğer kaplama maddeleri üzerinde dışı matris kullanılmasının avantajı, hücre dışı matris proteinlerinin bir birleşmesi fizyolojik olarak oluşan ve in vivo ve in vitro deneylerde bağlanır olmasıdır. Bu yaklaşım tek başına kolajen ya da fibronektin gibi tek bir bileşik ile kaplanması daha fizyolojik olduğunu. Aynı zamanda değişim tarafından başlatılan sinyalizasyon önemi hakkında fikir verirhücre dışı matriks. Bu protokolün bir sınırlama açıkça matristen matris ve kaldırma önemli sinyal bileşenlerinin imha olduğunu. Matris decellularizing dikkatli olmak şarttır.
Sağlam doku gibi izole gemilerin kullanılması yerinde ve enzimlerin minimal müdahale ile vazodilatasyon çalışma imkanı yaratır. Bu yöntem, hayvanlarda ve çeşitli hastalıkların endotel fonksiyonunu çalışma için en uygundur. Duling domuzlarda bu yöntemi tanımlamak için ilk oldu. domuz gemiler dokuda derin; dolayısıyla kağıt jelatin tespit nitelendirdi. Vazodilatasyon Erken çalışmalar karotis arterler 26 kullanılır. Biz facialis arterler 27 kullanmak için teknik rafine. Facialis arterler karotid arter daha direnç artere boyutu daha eşdeğerdir. Bu protokolün bir sınırlama ihtiyacı geminin, kırılganlığı bozulmamış requirin kaldırılacakg uygulama.
Özetle, gelişmekte IRF5D kalbinde inflamasyon ve fibrozis IRF5 katılımını değerlendirmek sağladı. Bu, bu çalışmada açıklanan veriler ile sonuçlanmıştır. IRF5D olası bir ilaç hedefi 28 olarak IRF5 anlaşılacağı gibi çeşitli hastalıklarda IRF5 mekanizmaları incelemek için yararlı bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
