Introduction
ויסות צמיחת תא ומות תא תגובה חיסונית היא מרכזית תפקידה של המשפחה גורם שעתוק של גורמי רגולטוריים אינטרפרון. IRF5 מודגשת כמו להיות חיוני לוויסות התגובה החיסונית בין סוג 1, תגובה לקידום דלקתי מסוג 2, תגובה חיסונית תיקון רקמות מיקוד. IRF5 הוא מפתח סרטן 1, ו אוטואימוניות 2, 3, 4, 5.
עכבר קפוצת העור (טפו / +) הוא מודל עבור סיסטיק רקמות סקלרודרמה עקב מוטציה שכפול בגן fibrillin-1. תוצאות מוטציה זו בתוך עור חזק ועליית רקמת חיבור. עכברים אלו לפתח דלקת שריר הלב, סיסטיק ולבסוף אי ספיקת לב 5, 6, 7,> 8, 9. סקלרודרמה היא מחלה פיברוטית אוטואימוניות ומשפיעה על כ 150,000 חולים בארצות הברית 6. סימני ההיכר של מחלה זו הם סיסטיק של האיברים הפנימיים כולל הלב 7, 8, 9, 10, 11.
טבעו של המחקר דרש את העיצוב של פפטיד מעכבות. גישת התוכנה נבחרה על גישה מסורתית באמצעות תצוגת הפאג. גישת התוכנה היא קל יותר ופחות זמן רב. מאגר RCSB משמש לזיהוי אתרי קישור מתאים 12. כדי לחקור את האינטראקציה של הפפטיד החדש תוכנן עם חלבון רקומביננטי להתמקד הפרמטרים הכבילה למעסיק, interferometry biolayer שנקרא טכניקה היה בשימוש. אינטרפרומטריה Biolayer הוא techniq מבוסס biosensorue הקובע זיקה מחייבת, עמותה וניתוק באמצעות biosensor ומדגם מחייב. Biosensor יכול להיות פלורסנטי, luminescently, radiometrically ו colorimetrically שכותרתו. המדידה מבוססת על תוספת מסה או דלדול דומת עמותה וניתוק 13, 14. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להבין את התפקיד של IRF5 בדלקת שריר הלב סיסטיק. המטרה היתה לקבל תובנות לגבי התפקיד של IRF5 בפיתוח סיסטיק רקמות סקלרודרמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם המלצות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. הפרוטוקול אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש (פרוטוקול: AUA # 1517). כל המחקר מעורב עכברים נערך בהתאם למדיניות PHS.
עיצוב 1. הפתיונות פפטיד
- מצא את מבנה 3D של IRF5 ולבסס את העיצוב על זה. עיצוב 17 mer, כינה IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), שבו aspartate (D) מוחלף סרין (S) לחקות זירחון ב IRF5 ב 421 - 438 (ELSWSADSIRLQISNPD). ניתוח של קבוצות sulfhydryl 3D והכרת המנגנון של IRF5 הפעלה, כלומר, זרחון סרין, הציע אסטרטגיה אחת למיקוד IRF5 הייתה לייצר פפטיד דמה. ראה איור 1. כדי לזהות את האזור הטוב ביותר במבנה 3D, להשתמש בתוכנת הדמיה מולקולרית לעיצוב molecul הקטןes ופפטידים 15.
הערה: השלב הקריטי בתהליך זה הוא הזמינות של מבנה 3D של חלבון המטרה ואתרי המחייב האפשריים. מבנה 3D של IRF5 מייצג באופן מדויק כיצד dimerizes IRF5 לאחר זירחון. ההחלפה של אספרטט עבור סרין או תראונין במיקור חוץ. הפפטיד הוא מסונתז בנפרד שאינו קשור IRF5. - לשכפל את תחום phospho פשוט על ידי החלפת D עבור ס בהתבסס על הרצף המקורי (ELSWSADSIRLQISNPD, לבצע IRF5S פפטיד חדש עם רצף החומצות האמיניות של Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2 (IRF5D).
2. Interferometry Biolayer (BLI)
הערה: טיהור IRF5 רקומביננטי במיקור חוץ. 16
- התווית ביוטין IRF5 ב טוחנת יחס של 1: 1 של ביוטין ליגנד עם ריאגנט biotinylation המשלב מקשר בשרשרת ארוכה. ומקשר השרשרת הארוך יבטיח Liga פעיל יותר הומוגניתמשטח nd.
- הוסף 1 מ"ל של 2 מ"ג / מ"ל IRF5 עד 13 μL של מגיב ביוטין 20 מ"מ או להגדיל את נפחי במידת הצורך. לדגור על קרח במשך 2 שעות. לאחר תיוג, השתמש טור ספין desalting להסיר את תערובת התגובה של חלבון הנקרא.
- דגירה ליגנד שכותרתו ביוטין עם biosensors במשך 15 דקות. הימנע על התיוג ולהתאים ביחס של 1: 1 הטוחן. לאחר תיוג, השתמש טור ספין desalting להסיר את תערובת התגובה של חלבון הנקרא.
- דגירה biosensors IRF5 שכותרתו ביוטין במשך 10 דקות בריכוזים שונים של הפפטיד דמה IRF5. שיעורי ההתאגדות דיסוציאציה נקבעו כמתואר 10, 17, 18.
מבחני 3. אפופטוזיס ושגשוגם
- Assay הפצת נשק באמצעות bioreduction של tetrazolium
- לנהל IRF5D מדולל PBS (1 מ"ג /ק"ג / ד, להזריק נפח 20 μL ב עכבר 20 גרם) תת עורי עם מחט 27-מד ידי טכניקה scruffing רגיל או על ידי PBS לבד כדי Tsk / + ו C57Bl / 6J במשך 21 ימים.
- להרדים את העכברים עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב.
- Lyse את ליבם עם חיץ חלבון תמוגה המכיל 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.5% NP-40, 250 מ"מ NaCl, 5 EDTA מ"מ, 50 מ"מ NaF 10 ולקבוע ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay 19.
- מעיל צלחות 96-היטב עם C57Bl / 6J מטריקס הלב מבודד כמתואר בסעיף 7. לדלל את PBS מושעה C57Bl / 6J מטריקס לב לריכוז של 20 מיקרוגרם / מ"ל ולהוסיף 30 μL של הלב C57Bl / 6J היטב כל אחד. תן לו להתיישב לילה בשעה 37 ° C בחממה.
- תאי וריד תרבות טבור אנושיים באמצעות 500 מיליליטר של מ 'בסיס אנדותלedia עם תמצית מוח 0.4% שור, חומצה אסקורבית 0.1%, 0.1% הידרוקורטיזון, 0.1% גורם גדילה באפידרמיס אנושי, 2% בסרום שור עוברי 0.1% גנטמיצין / amphotericin B להתווסף אליו. התרבות התאים על 96 צלחות גם ב 5% CO 2 ו -95% באוויר חדר עם צפיפות של 25,000 תאים בכל טוב. לגרות עם ריכוז גדל והולך של IRF5D בין 0 - 100 מיקרוגרם / מ"ל לתוך התקשורת (כרכים היו בין 0 ל 50 μL / מ"ל).
- קבע את התפשטות התאים לאחר שלושה ימים להעריך הבדלים ספיגים על קורא microplate. התגובה הינה bioreduction של המתחם tetrazolium MTS. NADPH או NADH מופק על ידי אנזימי dehydrogenase בתאים פעילים מבחינה מטבולית.
- כמתחם tetrazolium MTS מאוחסן קפוא ב -20 ° C, להפשיר את המתחם לאט מעל כ 90 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה 20 μL לבאר כל צלחת 96 באר, ולהוסיף 100 μL של התקשורת בתרבות אליו. דגירה צלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 עד 4 שעות ב humidified, 5% CO 2 קאמרית.
- קרא ספיגת באורך גל של 490 ננומטר.
- Assay אפופטוזיס באמצעות פעילות caspase
הערה: ניסוי ההגדרה זהה מעל 3.1.1 כדי 3.1.5.- לגרות את התאים עם ריכוז גדל והולך של IRF5D בין 0 - 100 מיקרוגרם / מ"ל לתוך התקשורת.
- הוספת זיהוי ירוק למצע caspase 3/7 אל ECS ו דגירה אותו במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להעריך את הקרינה על הקורא microplate בד בבד עם גל קליטה / פליטה של 502/530 ננומטר. הפעל את הניסויים בשלושה עותקים.
הערה: הסוכן פלואורסצנטי הירוק הוא פפטיד ארבע חומצות אמינו חייב לצבוע מחייב חומצות גרעין. מגיב זה הופך ניאון כאשר בקעו לאחר caspase 3 והפעלה 7. קרינה זו נמדדת. היתרון הוא הפחתת שלבים לשטוף.
הערכה 4. IRF5 והביטוי ICAM-1 Heart
- נהל IRF5D מדולל PBS (1 מ"ג / ק"ג / ד, להזריק נפח 20 μL ב עכבר 20 גרם) תת עורי עם מחט 27-מד ידי טכניקה scruffing רגיל או על ידי PBS לבד כדי Tsk / + ו C57Bl / 6J פעם ליום במשך 21 ימים.
- להרדים את העכברים עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב.
- Lyse את ליבם עם חיץ חלבון תמוגה המכיל 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.5% NP-40, 250 מ"מ NaCl, 5 EDTA מ"מ, 50 מ"מ NaF 10 ולקבוע ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay 19.
- בצע כתם מערבי על lysates של לבבות. לדלל את הדגימות עד 25 מיקרוגרם חלבון סך נפח של 40 μL עם חיץ מדגם Laemmli המכיל 5% mercaptoethanol. הפעל את הדגימות על 4 - ג'ל 15% TGX ב -50 mV למשך 5 דקות. גדל מתח ל -100 mV עבור h 1 עד בחזית לצבוע שנגמרה.
- מניחים את הג'ל במאגר 1x ההעברה (25 מ"מ טריס, 190 גליצין מ"מ, 20% מתנול, כדי להתאים את pH 8.3 במידת הצורך) דגירה במשך 10 - 15 דקות.
- הרכב את כריך ההעברה (ספוג, מסנן, ג'ל, קרום תאי, מסנן, ספוג). ודא שאין בועות לכודים בין. הכתם צריך להיות על הקתודה לבין הג'ל על האנודה. העבר של 1 ש 'בחדר קר ב 100 מילי-אמפר.
- למחרת, לשטוף את הכתם ואז לחסום כשהרקע 5% חלב יבש ללא שומן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את הכתם עם טריס שנאגר מלוחים המכילים 5% Tween שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
- דגירת הלילה עם הנוגדנים הראשוניים באמצעות נוגדני polyclonal עיקריים IRF5 או ICAM-1. לדלל את הנוגדנים טריס שנאגרו מלוחים ב דילול 1: 1,000.
- לדלל את הנוגדנים משני טריס שנאגרו מלוחים הדגירה כתם עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר. עבור נוגדנים משני, חמור מצומדות peroxidase חזר שימוש אנטי העכבר איגG (1: 10,000) ו IgG נגד עז חזרה החמורה peroxidase (1: 10,000), בהתאמה.
- החל chemiluminescence אל הכתם לאחר רכיבי ערבוב על פי הפרוטוקול של יצרן דגירה במשך 3 דקות כדי luminesce הלהקות של עניין. לחשוף את הכתם סרט רנטגן. השתמש ImageJ למדידת צפיפות. לנרמל את ערכי צפיפות הלהקות המלאות 10.
הערכת 5. של מספרים סלולריים דלקתיים לאחר IRF5 עיכוב
- נהל IRF5D מדולל PBS (1 מ"ג / ק"ג / ד) תת עורי עם מחט 27-מד ידי טכניקה scruffing רגיל או על ידי PBS לבד כדי Tsk / + ו C57Bl / 6J במשך 21 ימים.
- להרדים את העכברים עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב. הצמד להקפיא ולאחסן את לבם ניכר עד ניתוח.
- הר הלבבות הקפואים על Tissמחזיקי ue הולם cryostat בשימוש. חותכים 10 מיקרומטר חלקים קפואים עבה על cryostat אימונוהיסטוכימיה.
- תקן את חלקים קפואים עם paraformaldehyde 1% בופר פוספט במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize את החלקים עם 0.5% Triton-X 100 ב PBS במשך 5 דקות.
זהירות: Paraformaldehyde הוא קרצינוגן מוסדר וצריך לטפל בהם בזהירות. - לדלל CD64 ארנבת אנטי, סמן מונוציטים / מקרופאג 1: 200 ב PBS. החל על סעיפים קבועים דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- לדלל אנטי עכברוש NIMP, סמן נויטרופילים עיקרי 1: 200 ב PBS. החל על סעיפים קבועים דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- שטפו את השקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר.
- לדלל את נוגדנים משני ארנבת אנטי Alexa 488 מצומדות ואנטי-עכברוש אלקסה 488 מצומדות 1: 200 ב PBS.
- החל ארנבת אנטי Alexa 488 מצומדות ואנטי-עכברוש אלקסה 488 נוגדנים משני מצומדות בסעיפים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהתאם. היקף הנוגדן משתנה בהתאם לגודל של הסעיף. הסכום אמור לכסות את הסעיף בנדיבות. ברוב המקרים את עוצמת הקול הוא בין 100 ל -200 μL.
- השתמש 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ככתם גרעיני דילול 1: 1,000 ב PBS. הוסף 1 μL לתוך 1 מ"ל PBS ולהשתמש DAPI בשלב לשטוף האחרון. הוסף מדיה הרכבה מימית תלוש כיסוי והכניס אותו לשקופית.
- לנתח את הסעיפים שכותרתו fluorescently על ידי מיקרוסקופ confocal באמצעות מטרת שמן 40X. השתמש עירור אורכי גל 488 ופליטת אורכי גל של יותר מ 530 ננומטר עבור CD64 ו NIMP. DAPI התלהב עם 360 ננומטר הנפלט ב 460 ננומטר בכחול. להבדיל מונוציטים / מאקרופאגים נויטרופילים (n = 10 תמונות לכל נוגדן, בין 3 עכברים שונים בכל קבוצה) על ידי התיוג השונה שלהם ולספור אותם. לבטא מידע כמו מספר התאים נספרו.
תא 6. Vasodilation Dependent לאחר עיכוב IRF5
- להרדים C57Bl / 6J מלאה Tsk / + עכברים עם ובלי טיפול הפפטיד עם קטמין (80 - 100 מ"ג / ק"ג) / xylazine (10 - 12.5 מ"ג / ק"ג) תערובת. להזריק את התערובת קטמין / xylazine intraperitoneally. לרסן את העכבר באופן ידני.
- השתמש 25 מד או מחט קטנה. הכנס את המחט לתוך ברבע הימני התחתון של הבטן. למשוך את הבוכנה לפני הזריקה על מנת להבטיח כי המחט לא להיכנס כלי דם או המעי.
- לאחר לרמה של הרדמה מספיק הושג, לאבטח את העכבר במצב שכיבה, לנגב את הפרווה עם פד גזה ספוג אלכוהול, ושימוש זוג מספריים ופתח את חלל בית החזה ולהסיר את הלב.
הערה: Exsanguination יהיה להרדים את העכבר ולעשות לנתיחה יותר על ידי להקלת הלחץ בכלי הדם ובכך לצמצם דימום בעת חיתוך כלי הדם.- פתח את usin העורזוג מספרי ga, חותך מן לרוחב החזה אל עצם הלסת עם אכפתיות לתוצאה לא להפריע הרקמות הבסיסיות כלפי חלק הקדמי של הלסת.
- לנתח את עורק facialis ידי הסרת הרקמות הרכות סביב זה.
- זהירות: אל לפגוע בכלי השיט או משיכה על העורק facialis תוך שמירה על רקמות חשוף שטוף חיץ מגבים (2.0 מ"מ CaCl 2 · 2H 2 O, 0.02 mM EDTA, 5.0 גלוקוז מ"מ, 4.7 מ"מ KCl, 1.17 מ"מ MgSO 4 · 7H 2 O, 3.0 מגבים מ"מ, 145 מ"מ NaCl, 1.2 מ"מ לאא 2 PO 4 · H 2 O, 2.0 מ"מ פירובט) כדי למנוע התייבשות. בצע תחת מיקרוסקופ לנתח זום סטריאו המשקפת (הגדלה של 3.5x כדי 45X) ומקור אור סיבים אופטיים.
- לבודד את עורק facialis.
- אחוז הפרוקסימלי facialis אל הסתעפות ו דיסטלי הראשון שבו העורק יקוצץ. חותך את העורק מעורק ההורה, עורק התרדמה החיצוני. הסר את facialis arterieים מעכברים שליטים, טפו / + עכברים עם ובלי טיפול IRF5D.
- בעוד עדיין מחזיק את עורק המלקחיים, לחתוך את שני הסניפים מגיעים מחוץ facialis, המאפשר הכלי שירים בעדינות בעוד כל רקמה שמסביב נימול ניתן לזהות ניתק.
- המשיך בדרך זו עד ההסתעפות הוא הגיעה חותכי עורקים הבת לשחרר את הכלי. אין צורך לצבוט את הכלי לפני חיתוך בשל לחץ קל בכלי הדם מן הסרת הלב. מכניס את הכלי במאגר מגבים תוך עורק facialis האחר הוא גזור ומבודד.
- Cannulate הכלי על ידי קשירה אותם על טפטפות זכוכית בקוטר מסוף 125 - 175 מיקרומטר. טען מראש את טפטפות זכוכית ומאגרי חיץ עם חיץ מגבים.
זהירות: מנע בועות אוויר מ טביעה טפטפות. - לקשור את הכלי על טפטפות באמצעות תפרי עיניים.
- הר לתאי הכלי על micr triocular הפוךoscope עם קובץ מצורף מצלמת וידאו. הפעל את הווידאו באמצעות מערכת מדידת קליפר וידאו על מדידות מסך של הכלי. 20
- לחצים אותם תהליך בן שני שלבים. ראשית, עם המאגרים מלאי מגבים בגובה מעל הכלי השווה ללחץ 20 מ"מ כספי, באופן ידני לפתוח את שסתומי ברזלים בקווי המאגר לכלי השיט. בדוק את כלי סימנים של דולף סביב קשרים ובמורד אורך הספינה. שנית, להעלות את מאגרי עד 60 מ"מ כספית ו reinspect הספינה.
- לאחר בלחץ ב -60 מ"מ כספית, לאפשר כלי כדי לאזן במשך 30 דקות.
- על מנת להעריך התרחבות בתגובה אצטילכולין (10 -7 עד 10 -4 M), preconstrict הספינה כדי בקוטר 50 - 75% של הקוטר המרבי שלה באמצעות 1 - 3.0 x 10 -8 עד 10 -7 U46619 M. לאחר המאפשר הכלי לייצב במשך 6 דקות, להוסיף אצטילכולין לאמבטיה בצעדי משך 2 דקות כךריכוזים סופיים באמבטיה הם 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. מדוד את ההתרחבות בכל שלוש הקבוצות.
בידוד 7. של Cardiac תאי מטריקס
- להרדים C57Bl / 6J מלאה Tsk / + עכברים עם ובלי טיפול הפפטיד עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב.
- מכניסים את הלב הסיר לתוך מבחנה ולהוסיף 15 סולפט dodecyl מ"ל היפרטוני 1% נתרן (SDS). להתסיס לבבות הפתרון 1% SDS במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר כדי לשבור את התאים על ידי הוספת בר ומערבבים לפתרון 1% SDS ומכניסים את הכוס על צלחת ומערבבים.
זהירות: עליך להיות מודעת לכך מטריקס יתפורר אם נותר זמן רב מדי פתרון היפרטוני. לעומת זאת, אם את ליבם אינם נסער מספיק זמן בתמיסה היפרטוני, אז התאים לא כראוילפזר ויהיו פסול תא השאיר בכוס. - לשטוף למשך 30 דקות ב 15 מ"ל 0.5% Triton X-100. לאחר מכן לשטוף במשך 15 דקות עם 15 מ"ל PBS. Decellularize כל לב בנפרד.
- הצמד להקפיא את תאי מטריקס בחנקן נוזלי powderize מטריקס הלב הקפוא עם במכתש ועלי מראש מקורר.
- לעשות השעיה של מטריקס מרסקים PBS המכיל אנטיביוטיקה 1%. ההיקף הוסיף ברוב המקרים הוא 300 μL. Sonicate ההשעיה עבור 30 - 60 s על קרח על ההגדרה הגבוהה.
הערה: חשוב מאוד כי המדגם שומר קר. שימו לב כי ההשעיה היא צמיגה מאוד בשל תכולת חלבון גבוהה glycan. - קביעת ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד.
הערה: ודא שיש אנטי ביוטיים ואנטי פטרייתי ההשעיה. פניצילין / סטרפטומיצין הם נפוצים ביותר ומומלצים.
8. הערכת טרנסלוקציה הגרעיני על ידי Immunohistochemistר"י
- כדי מעיל מנות ומגלשות להשתמש לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל של תאי מטריקס הלב ב PBS. Pipet 500 μL של פתרון מטריקס הלב לתוך צלחת 100 מ"מ עבור ציפוי 150 μL של פתרון מטריקס הסופי לשקופית.
- לעכב IRF5 ידי הוספת IRF5D בריכוז 50 מיקרוגרם / מ"ל במשך 24 שעות להלשין myocytes לב בילוד בתרבות. השאירו לשלוט תרבויות myocyte מטופל.
- להעריך סחר IRF5 מן cytosol אל immunofluorescence באמצעות גרעין ולנתח ידי מיקרוסקופיה confocal. זהה את התיוג הירוק IRF5, לזהות את כתם DAPI כחול הגרעין
- החל את הנוגדן אנטי IRF5 העיקרי. הנוגדן העיקרי ששימש דילול 1: 200 ב PBS. דגירת השקופיות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ופעלתי עם שלושה שלבים לשטוף 5 דקות. הנוגדן המשני היה Alexa 488 שכותרתו עזה נגד עכבר נוגדן IgG.
- לדלל את הנוגדנים משני 1: 1,000 di lution ב PBS. דגירת הנוגדנים משני למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להשיג גרעיני כתם עם DAPI. לדלל DAPI 1: 1,000 ב PBS. שטפו את השקופיות סך של 3 פעמים במשך 5 דקות ולהוסיף DAPI לשלב לשטוף השלישי והאחרון.
- סחר לכיד באמצעות מיקרוסקופיה confocal ועוצמת קרינה מודדת את הגרעינים ואת cytosol כפי שתואר לעיל 10. זהה את התיוג הירוק IRF5, לזהות את כתם DAPI כחול הגרעין. התאים כי תערוכת גרעינים כחולים עם תיוג ירוק בם מכילים מופעל IRF5, אשר נסחר מן cytosol לגרעין. כאשר IRF5 אינו מופעל תיוג ירוק נמצא cytosol.
- לנתח את התאים שכותרתו fluorescently על ידי מיקרוסקופ confocal באמצעות מטרת שמן 40X. השתמש גל עירור של 488 באורכי גל nm ופליטה של יותר מ 530 ננומטר עבור IRF5. השתמש גל עירור של 360 ננומטר ו אורך גל פליטה של 460 ננומטר עבור להדמיה של DAPI.
התחת = "jove_title"> 9. סטָטִיסטִיקָה
- בצע ניתוח שונה (ANOVA) עבור מדידות חוזרות בתוך ובין קבוצות. עקוב ANOVA עם שינוי של Bonferroni של סטודנטים מבחן t. לבטא מידע כטעות תקן של הממוצע.
- להרדים C57Bl / 6J מלאה Tsk / + עכברים עם ובלי טיפול הפפטיד עם קטמין (80 - 100 מ"ג / ק"ג) / xylazine (10 - 12.5 מ"ג / ק"ג) תערובת. להזריק את התערובת קטמין / xylazine intraperitoneally. לרסן את העכבר באופן ידני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות הראו באיור 1 להראות כיצד לעצב פפטיד. איור 1, השמאלית העליונה, מראה את האזור (בין 2 חצים צהובים, חומצות אמינו (אא) 425-436) ב IRF5 כי עובר פוספורילציה על ידי מספר קינאזות. איור 1, ימני עליון, המראה סגלגל צהוב שבו תחום פוספורילציה של IRF5 נקשר. מבנה dimeric של 3DSH היה לסובב להתבונן שסוע או עמק שמאלה של 2 Helix (aa303-312). זוהי הנקודה בה את תחום זנב phospho של IRF5 אמורה לאגד כאשר הוא יופעל באופן מלא (כלומר, סרין פוספורילציה), ויצר homodimer ומדינתו להניח פעילים ביולוגיים.
באיור 2, פעילות מחייב נמדדת interferometry biolayer מתוארת. כדי לקבוע כי IRF5D פפטיד דמה אינו רעיל, התפשטות אפופטוזיס הוערכו לאחר טיפול גאמות עם ריכוז גדל והולך של IRF5D (איור 3). ICAM-1, סמן דלקתי, וביטויים IRF5 הופחתו לאחר טיפול העכברים Tsk / + עם IRF5D כפי שנקבע על ידי ניתוח כתם המערבי (איור 4). מספר נויטרופילים (NIMP) ו CD64 ירדו כפי שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה לאחר טיפול IRF5D (איור 5). תפקוד האנדותל השתפר בעורקים facialis של עכברים Tsk / + לאחר IRF5D לעומת Tsk / + עכברים ללא טיפול IRF5D (איור 6). מספר גדול יותר של גרעינים חיוביים IRF5 ב myocytes בתרבית על מטריקס לב Tsk / + היו דמיינו לעומת C57BL / 6J מטריקס לב. טיפול של תרבויות עם IRF5D הביא מספר המופחת של גרעינים חיוביים IRF5 (איור 7).
איור 1: חלבון 3D structurדואר של IRF5. א) הדמות השמאלית העליונה מראה את האזור הפפטיד היה מיועד. ב) באזור שבו מתבצע פוספורילציה מודגש על ידי שני החצים הצהובים הם חומצות אמינו (אא) 425 - 436 ב IRF5. ג) הפאנל התחתון מתאר את מורכבות תפקודית homodimeric. דמות homodimeric מוצגת לצפייה קלה של האזור בו נמצאו תחום הזנב פוספורילציה של IRF5 נקשר יוצרי homodimer. נתון זה כבר פורסם בעבר 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Biolayer Interferometry של IRF5D. נתון זה מראה את הכריכה של IRF5 כדי IRF5D העריכו ידי biolaye אינטרפרומטריה r. תוכנת ניתוח הנתונים הראה כי IRF5 נקשר IRF5D עם ד K של 3.72 ± 0.75 x 10 -6 M (ממוצע ± סטיית תקן, n = 3). נתון זה כבר פורסם בעבר 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: התפשטות תאי אפופטוזיס. גרפים ברים אלה מראים כי ריכוזים גוברים של IRF5D אין כל השפעה על שגשוג תאים (משמאל) או אפופטוזיס (מימין), ולא שונו על ידי הגדלת הרמות של IRF5D. נתון זה כבר פורסם בעבר 21 (ממוצע ± סטיית תקן, p <0.05, n = 4).k "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ICAM-1 ו IRF5 ביטוי הלב. ICAM-1 (א) ו IRF5 (B) ביטויים ירדו ב שריר הלב של עכברים Tsk + לאחר טיפול IRF5D כפי שהוכח על ידי כתם המערבי. הנתונים מנורמל ל טעינה מלאה אקטין (ממוצע ± סטיית תקן, p <0.05, n = 3). נתון זה כבר פורסם בעבר 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:CD64 (א) ו NIMP (B) ביטוי הלב. מספר מונוציטים / מאקרופאגים נויטרופילים הוקטן לאחר טיפול IRF5D כפי שהוכח על ידי אימונוהיסטוכימיה (ממוצע ± סטיית התקן, * = p <0.05, C57BL / 6J לעומת Tsk / +; # = p <0.025, טפו / + לעומת Tsk / + + IRF5D; n = 3, 10 תמונות לכל נוגדן). החיצים להדגיש מונוציטים / מאקרופאגים (א) ו נויטרופילים (B). ברי המידה 10 מיקרומטר. נתון זה כבר פורסם בעבר 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: תפקוד התא Vasodilation. ממשל IRF5D השתפר התרחבות מושרה אצטילכולין של עורקי facialis של עכברי Tsk / + (ממוצע &# 177; SD, p <0.05, n = 6). נתון זה כבר פורסם בעבר 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: IRF5 גרעיני טרנסלוקציה של IRF5 ב מתורבתות myocytes עם עיכוב IRF5. עיכוב IRF5 ידי IRF5D (50 מיקרוגרם / מיליליטר, 24 ח) מוביל גרעינים חיוביים פחות IRF5 ב myocytes בתרבית על מטריקס לב Tsk / + ו- מטריקס לב C57Bl / 6J. החצים מתארים גרעינים חיוביים IRF5 (ממוצע ± סטיית תקן, p <0.05, n = 3). סרגל הסולם הוא 5 מיקרומטר. נתון זה כבר פורסם בעבר 21. אנא Click כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה היתה לעצב מעכב IRF5 מנת להבהיר את התפקיד של IRF5 על דלקת, פיברוזיס, ואת תפקוד כלי הדם בליבם של עכברים Tsk / +. הממצאים כי IRF5D לא לגרום התפשטות או אפופטוזיס. יתר על כן, דלקת צומצמה שיפור תפקוד כלי דם. נתונים אלה מראים כי IRF5 ממלא תפקיד מכניסטית חשוב בהתפתחות של דלקת ופיברוזיס בלב Tsk / + עכברים וכי יש לו את הפוטנציאל לשמש מטרה טיפולית.
הצעד הראשון היה לעצב מעכב. כאשר הפפטיד נועד, כמה נקודות צריכות להילקח בחשבון: אורך רצף, מבנה משני, שאריות נוטות חמצון, רכב חומצות אמינו, amidation וסגירה, חומצות אמינו חומצות N-למסוף אמינו C- הסופי, והתקשרות ליגנד. אורך הרצף האידיאלי הוא בין 10 עד 15 שאריות כדי להבטיח תשואה כוללת הטובה ביותר, זיהומים פחות, בעלות מופחתת. זה important להיות מודע מבנים משניים כמו היווצרות משטח בטא. היווצרות משטח בטא יכולה לגרום רמה גבוהה של רצפים נמחקו. הימנע שאריות נוטות חמצון אשר יכול להוביל לצד תגובות אשר יכול להשפיע על האפקטיביות של הפפטיד. כדי לשלוט מסיסות, סינתזה, וטיהור, לשמור על הרכב אבני הבניין של חומצות אמיניות לייצור הפפטיד מתחת חומצות אמינו הידרופוביות 50% ולהבטיח כי יש מספיק שאריות טעונה. N- ו- C- טרמיני צריכים להיבחר במצב בלתי טעון. הימנע גלוטמט בתחנה הסופית-N ולהימנע ציסטאין, פרולין, גליצין על הסופית- C. הוספת רווח בין הפפטיד ליגנד למזער מתקפלים. לכן, הם עלולים צריך להיות רעולי פנים כמו אמיד ללא תשלום.
עיצוב IRF5D התבסס על מבנה 3D. A 17 mer, כינה IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) תוכנן, שבו aspartate (D) הוחלף על סרין (S) לחקות זירחון ב IRF5 ב 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). זֶהגישה היא ישר קדימה בשל טכנולוגיית מחשב רומן. החיסרון של שיטה זו הוא ההשקעה הראשונית בתוכנה. עם זאת, יש חיסכון משמעותי כולל בהשוואת העלויות הכרוכות עבודה וחומרים המשמשים שיטות עיצוב מעכב אחרות, כמו תצוגה הפאג 22. השלב הקריטי בתהליך זה הוא הזמינות של מבנה 3D של חלבון המטרה ואתרי המחייב האפשריים. המגבלה של עיצוב מעכב היא את האפשרות כי באזור הלא נכון נבחר ואת המעכב אינו חוסם את החלבון הרצוי. האפשרות האחרת היא חסימה חלקית של החלבון הרצוי.
עם פפטיד ביד המוקד עובר בדיקת רעילות של הפפטיד דמה ידי מדידת הישרדות התא. ראשית, IRF5D נבדק באמצעות ריכוזים שונים. IRF5D לא לגרום אפופטוזיס אינו מקדם התפשטות אפילו בריכוזים גבוהים. השיטות השונות שהופעלו הנה STAndard ולתת נתונים אמינים. Bioreduction לצבוע tetrazolium שימש במשך שנים רבות 23. Assay זה נבחר בשל יעילות זמן השחזור שלה לעומת שיטות אחרות, למשל, לספור תאים ידניים אשר מאוד זמן רב. שימוש BrdU לתייג מתרבים התאים דורש רדיואקטיביות, שהוא רגיש, אך יכול להיות מסוכן. Bioreduction לצבוע tetrazolium הוא זמן יעיל ואינו דורש רדיואקטיביות. המגבלות של bioreduction לצבוע tetrazolium נפוצה במחקרים בהם היו מעורבים פוטנציאליים oxido-רדוקטיבי. בכל מקום-רדוקטיבי oxido פוטנציאל מתרחש, תוצאות חיוביות שגויות הם תכופות יותר 24.
בידודו של מטריקס נרכש על ידי המסת כל בתאי שריר הלב עם פתרון היפרטוני. שהפרוטוקול התפתח ממחקרים באמצעות מנגנון זלוף תהליך תסיסה פשוט 25. duratיון הוערכה באופן אמפירי על ידי לקיחת בנקודות זמן שונות: 12, 14, 16, 18, 20 שעות. מטריקס נותח עבור פסולת תא לאחר הזמן השונה מצביע 25. החסרונות העיקריים של decellularization הם זיהום פטרייתי חיידקים. מומלץ להשתמש תרכובות אנטי פטרייתי ואנטי מיקרוביאלי. כדי מנות מעיילות, המטריצה התאית היא powderized ותלוי PBS. בשל התכולה הגבוהה של חומר אלסטי, המדגם אינו מתמוסס לחלוטין. Sonication על הגדרות בעוצמה גבוהה יותר בלי חימום המדגם הוא הכרחי. היתרון של שימוש מטריקס מעל סוכני ציפוי אחרים הוא כי מטריקס היא התמזגות של חלבונים המתרחשת פיזיולוגית וזה מחבר את in vivo ו מבחני חוץ גופייה. גישה זו היא יותר פיזיולוגית מאשר ציפוי עם תרכובת אחת כמו קולגן או פיברונקטין לבד. זה גם נותן יובן את החשיבות של איתות ביוזמת שינוייםהבין-תאי. הגבלה של פרוטוקול זה היא בבירור את ההרס של המטריצה ורכיבי איתות חשובות הסרה מהמטריצה. זה הכרחי כדי להיות זהיר כאשר decellularizing המטריצה.
השימוש של כלי שלם רקמות כמו מבודדים פותח את האפשרות ללמוד התרחבות באתרו תוך הפרעה מינימאלית של אנזימים. שיטה זו היא המתאימה ביותר ללמוד את תפקוד האנדותל במגוון חיות ומחלות. Duling היה הראשון לתאר שיטה זו בחזירים. הכלי ב חזיר עמוק בתוך הרקמה; ומכאן העיתון תיאר את הקיבעון ג'לטין. מחקרים מוקדמים ב התרחבות בשימוש עורקי הראש 26. מיקדנו את הטכניקה להשתמש העורקים facialis 27. העורקים Facialis יותר שווה ערך בגודלו עורק התנגדות מאשר בעורק התרדמה. הגבלה של פרוטוקול זה היא שברירי של כלי השיט, אשר צריך להיות מוסרת requirin ללא פגעבפועל גרם.
לסיכום, פיתוח IRF5D אפשר לנו להעריך את מעורבותם של IRF5 בתהליכים דלקתיים סיסטיק בלב. זה הביא את הנתונים המתוארים במחקר זה. IRF5D הוא כלי שימושי כדי לחקור את המנגנונים של IRF5 במחלות שונות כמו גם מרמז IRF5 כמטרת תרופה אפשרית 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111 (2011).
- Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
- Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
- Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
- Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
- Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
- Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
- Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
- Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
- Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046 (2012).
- Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
- Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
- Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
- Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69 (2006).
- Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
- Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
- Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882 (2014).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999 (2016).
- Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1 (2015).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
- Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
- Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35 (2011).
