Summary
우리 화학 요소 존재 원래의 인간 세포에 그들의 생체 외에서 정량화의 검출을 위한 절차를 설명합니다. 메서드는 모든 셀 종류에 적합 하 고는 금속 산화물 나노 입자 노출 체 외에서 다음 단일 셀에 정량적 화학 분석에 특히 유용.
Abstract
화학 원소 영상 기반 마이크로 분석 기법 지역화 및 세포 수준에서 화학 성분의 정량화를 활성화 합니다. 그들은 생활 시스템의 특성에 대 한 새로운 가능성을 제공 하 고 특히 탐지, 지역화 및 생물 표본 및 환경 모두에서 금속 산화물 나노 입자의 존재를 측정에 적합. 사실, 이러한 기술을 모든 (i) (1에서 최대 건조 질량의 10 µg.g-1 ), (ii) 마이크로미터 범위 공간 해상도, 및 (iii) 여러 요소 검색 관련 요구 사항을 충족. 이러한 특성을 감안할 때, microbeam 화학 원소 영상 수 있습니다 강력 하 게 보완 일상적인 이미징 기술을 같은 광학 및 형광 현미경 검사 법. 이 프로토콜에는 경작된 한 세포 (U2OS) 이산화 티타늄 나노 입자에 노출에 핵 현미경 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 셀 성장 해야 한다 고 핵 현미경 분석 단계와 광학 현미경에 사용 되는 특별히 설계 된 샘플 홀더에서 직접 노출. 샘플의 식이 동결 극저온 고정 세포 조직과 화학 원소 분포를 유지합니다. 샘플에 동시 핵 현미경 분석 (스캐닝 전송 이온 현미경, 러더퍼드 backscattering 분석 및 입자 유도 된 x 선 방출) 세포 밀도의 지역 분포에 대 한 정보를 제공 합니다. 화학 요소 뿐만 아니라 나노 입자의 휴대 전화 콘텐츠. 생물학, 특히 Nanotoxicology 및 나노 입자와 생물 학적 샘플 사이의 상호 작용의 우리의 이해를 심화 해야 합니다는 Nanomedicine 신흥 컨텍스트 내에서 이러한 분석 도구에 대 한 필요성이 있다. 특히, 핵 현미경 분석 이라는 것을 나노 입자를 필요로 하지 않습니다, 나노 나타났는데 그들의 표면 상태에 상관 없이 세포 인구에서 개별 셀 수준까지 가늠할 수 있습니다.
Introduction
세포질 항상성 이해 컨트롤, 동화 작용, 및 다른 성분 (이온, 금속, 세 무기 화합물)의 세포내 지역화에 의해 결정 됩니다. 이러한 구성 요소 추적의 형태로 자주 하지만 그럼에도 불구 하 고 시스템 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 정상 및 병리학/스트레스 상황에서 세포 생화학의 연구 세포 대사 메커니즘에 대 한 전반적인 이해 향한 키 단계입니다. 따라서, 세포내 화학 나타났는데, 구조적 조직 및 그들의 관련된 대사 기능 조사를 사용 하는 이미징 및 분석 기술의 개발이 필요한 됩니다. 아주 몇 가지 방법이 제자리에 정량의 한 조각이 주어진된 샘플의 전반적인 화학 본질에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 벌크 형태로 샘플을 분석 하는 방법 외에도 현장에서 분석 고려 생물 학적 샘플 자신의 완전에 질량과 구조 정보, 그로 인하여 그들의 구성 화학 물질 (미 량 원소와 이온) 보존을 잃지 않고, 단백질입니다. 또한, 지속적으로 개발 하는 nanosciences, 향상 된 이미징 및 세포 규모 환경 모니터링에 대 한 분석 방법 됩니다 관찰 하 고 계량 나노 개체 동작 및 상호 작용 하는 데 필요한. 1
나노 (NPs) 전시 범위 1와 100 nm에 최소한 하나의 얼굴 차원으로 정의 되었습니다. 2 그들의 특정 물리 화학적 특성 때문에 NPs는 광범위 하 게 업계에서 사용. NPs는 nanomedicine 및 바이오 응용 프로그램에서 채택 된다. 3 , 4 NPs의 수많은 물리 화학적 특성에도 불구 하 고 인간의 건강 및 환경에 불리 한 영향의 몇 가지 위험을 생성할 수 있습니다 그들은. 이러한 위험 다양 한 농도 수준에서 장기간 및 반복 노출에 의해 유도 될 수 있다 그리고 이것은 아직 명확 하 게 설립 되지. 5 , 6 , 7 , 8 특히, 셀과 연결 된 세포질 응답 내부 NPs의 운명은, 날짜, 완전히 설명. 이것은 탐지를 허용 하는 방법의 부족 및 정량화는 단일 셀에 내 면된 NPs의 일부입니다. 9
나노 입자의 셀룰러 복용량 microscopies, 질량 분석 (MS), 추정 하는 데 사용 하는 고전 분석 도구 유도 결합 플라즈마 (ICP-MS) MS10,11 및 액체 크로마토그래피 석사 (LC-석사), 하지만 그들은 단지 제공 거시적인 규모에서 유용한 정보입니다. 그들 중 누구도 subcellular NPs 콘텐츠 분류 방법의 사용 없이 NPs 배급의 정확한 평가 제공할 수 있습니다. 복용량 응답의 체계적인 평가 불가능 따라서 이러한 방법으로, 반대로 핵 현미경 분석12,13, 싱크 로트 론 x-선 형광 현미경14 같은 원자 분광학에 기반으로 하는 방법 , 그리고 2 차 이온 질량 분석 (SIMS). 15 , 16 그들은 형광 현미경을 사용 하 여 만든 관측을 보완, NPs 형광 분자와 함께 표시 될 수 없습니다 및 따라서 그들의 네이티브 국가에서 공부 하는 경우에 특히 이러한 방법은 특히 흥미 있다. 어느 정도까지, NPs는 fluorophores, 함께 융합 하는 경우에 (i) 정량화 남아 어려운 NP 당 태그 수준 알려져 있기 때문에 (ii) NP 표면 화학 수정 세포의 분포를 수정할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리가 이미징 형태학 및 주, 부, 생물학 견본의 원소 구성에 핵 현미경 기술의 조합에 따라 방법에 집중 하 고 농도 추적.
원자력 현미경 분석 특히 생물학 조직에 화학 성분의 측정에 적합을 증명 한다. 빔 측면 해상도 (0.3 ~ 1 μ m) 및 화학 원소 검출에서 감도 (1 ~ 10 µg.g-1 건조 질량)는 세포 수준에서 연구 하는 데 적합 하다. 원자력 현미경 기법 샘플에 존재 원자와 상호 작용 하는 (일반적으로 MeV 에너지에서 실행 되는) 이온 빔 후 방출 입자 검출 (광자, 전자, 이온)를 기반으로 합니다. 셀에 발생 하는 상호 작용은 주로: 1) 여기/이온화 원자 원자를 기본 상태로; 반환 후 광자의 방출 다음의 그리고 2) 그들의 에너지와 방향을 선도 하는 들어오는 입자의 확산. 상호 작용에 관련 된 원자의 방출된 입자 에너지 allowsthe 식별 측정. 요소의 매핑을 수행 하 이온 microbeam는 반복 검색 샘플 표면에 종종 100 µ m2 여러 셀을 포함 하 여 약 100의 지역. 내보낸된 입자 감지 하 고 그들의 에너지는 각 광속 위치에 대 한 기록. 빔 위치에 따라 입자의 정렬, 데이터 처리의 목표는 이러한 입자의 방출에 대 한 책임 구조를 따라서 식별. 여기, 우리는 정확 하 게 형광 현미경 검사 법 및 핵 현미경 분석 검색으로 생활 NP 상호 작용의 결과 조사 하기 위하여 세포질과 세포 하위 스케일에서 exogenous NPs를 계량에 따라 접근을 설명 시스템입니다. 우리는 특히 제자리에 정량화 subcellular 수준에서 이산화 티타늄 나노 (티 오2 NPs)의 관점에서이 방법으로 제공 하는 기회에 집중 한다.
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Protocol
1. 샘플 홀더 준비
-
샘플 홀더 설계 및 준비
- 1 m m 두께 픽 프레임에 5mm x 5mm 스퀘어 드릴 여 샘플 홀더를 제조 한다.
- 에탄올 70% (v/v)로 헹 궈 서 깨끗 하 고 살 균 판에 사용할 준비가 될 때까지 계속.
참고입니다. 세포 배양 및 세포 처리에 대 한 적절 한 샘플 홀더는 필요 합니다. 그것은 세포 배양, 체 외에서 관찰 광학 현미경 검사 법, 그리고 핵 현미경 분석 및 이미징에 대 한 설계 될 필요가 있다. 이 홀더는 슬쩍 프레임13의 이루어집니다.
- 샘플 홀더 준비
- 클로 프롬의 100 ml에서 Formvar 분말의 1 mg를 용 해 하 여 Formvar 솔루션을 준비 합니다.
- 아니 배 선물을 금속 프레임에 폴 리카 보 네이트 호 일을 스트레칭.
- 멸 균 팁을 사용 하 여 샘플 홀더 구멍 주위 Formvar 솔루션을 확산.
- 섬세 하 게 샘플 홀더 뻗어 폴 리 카보 네이트 호 일 (5mm x 5mm 스퀘어)에 접착제를 내려 놔.
- 각 복제에 대 한 하나의 샘플 홀더를 준비 하려면 이전 시퀀스를 반복 합니다.
참고입니다. 폴 리카 보 네이트 (PC) 영화는 생체, 충분히 두껍고 다른 프로토콜 및 분석 제약.
주의-클로 프롬은 독성이 있습니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.
- 샘플 홀더 살 균
- 인큐베이터/교 반기를 사용 하 여 에탄올 70% (v/v), 180 rpm 및 +37 ° C 동요의 50 mL와 원뿔 플라스 크에 탑재 된 샘플 홀더를 놓습니다.
- 홀더를 살 균 증류수에 여러 번 헹 구 십시오.
- 공기 메 마른 조건에서 그들을 건조 하 고 각 면에 30 분 동안 자외선 (Biosafety 벤치, 클래스 II에서에서 살 균 램프)에 그들을 노출.
- 사용할 준비가 될 때까지 무 균 12-잘 접시 (우물 당 1 개 견본 홀더)에서 샘플을 유지.
참고: 여러 샘플 홀더 살 균과 건조 12-잘 접시 몇 일 동안 parafilm으로 밀봉 상 온에서 저장할 수 있습니다.
2. 적절 한 샘플 홀더 셀의 성장.
주의: 프로토콜은 biosafety 층 류 벤치 (종류 II) 오염 미생물 제외 하에 실시 해야 합니다. 장갑과 항생제 (예: 페니실린, 스)를 처리 합니다. (셀 라인, 유전자 변형 인간 세포 파생) 생물 학적 자료를 처리할 때 유용한 정보를 존중 합니다.
중요: 사용 세포 선 그들은 하지와 Mycoplasma감염을 확인 하 여야 한다.
- 매트릭스-roGFP 17,,1819 transfection 메서드를 사용 하 여 프로토콜 제조 업체에 의해 설립에 따라 베어링 플라스 미드와 U2OS 셀 라인 transfect.
- 플라스 미드-휴대용 transfection를 확인 하는 바이오 센서 및 손실을 방지 하기 위해 플라스 미드를 선택 하 고 적절 한 문화 매체에 transfected 세포를 유지.
- 형광 현미경 검사 법은 transfection 발생 했습니다 보장 형광의 표현과 관으로 미토 콘 드 리아 네트워크19의 표시를 확인 하 고 여 transfected 세포를 시각화.
일시 중지 포인트: 셀 몇 년 동안 액체 질소에 동결 될 수 있습니다. - 적절 한 매체에서 세포를 배양 하 여 transfected 세포 인구를 사용 하 여 하위 confluent 세포 인구를 얻기 위하여. 37 ° C, 5% (v/v) CO2 포화 물 분위기에서에서 세포 성장.
- 씨와 같은 그들은 80% 합류에 정착의 하루는 농도에 세포. 일반적으로, µ L 당 500 세포의 농도 사용 될 수 있습니다. 0.25% Trypsin EDTA의 400 µ L를 사용 하 여 셀 (v/v)을 수확 하 고 37 ° c.에 3 분 동안 유지 문화 매체의 1 mL와 트립 신 작업을 중지 합니다. 230 x g와 + 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 세포를 작은, 다음 상쾌한, 제거 하 고 신선한 문화 매체의 원하는 볼륨 추가.
참고. 프로토콜은 모든 세포 종류에 적용 하 고 시드 셀 수와 시간을 두 배로 하는 셀에 셀 크기에 따라 달라 집니다.
주의: 트립 신, 항생제, 및 혈 청 반복된 freeze-thaw 주기를 겪고 하지 마십시오. 살 균 보관. Aliquots로 재고 솔루션을 분할 하 고 −20 ° c.에서 그들을 멈추게합니다 만료 날짜까지에 aliquots를 저장 합니다. 신중 하 게는 트립 신을 완전히 제거 하려면 셀 펠 릿을 씻어. 잔여 trypsin의 지연 하 고 도금 효율 감소. - 셀을 계산 하 고 µ L 당 500 세포와 세포 현 탁 액을 얻기 위하여 37 ° C에서 유지 하는 신선한 완전 한 문화 매체와 희석을 수행 합니다.
참고: 세포 현 탁 액의 농도 40 µ L 드롭 접시 위해서는 세포 유형의 기능으로 적용할 수 있다. - 폴 리 카보 네이트 호 일의 중심에 40 µ L 드롭 접시 신중 하 게 포화 물 분위기에서 +37 ° C에서 2 h, 5% (v/v) CO2 에 대 한 샘플을 놓습니다.
중요 한: 샘플 인큐베이터에 배치 되 면 최대한 빠른 셀 첨부 파일 하나를 어떤 기계적인 운동을 제한 합니다. 셀 형식에 따라 최적의 platting 효율성을 위한 2 시간 이상 세포를 품 어 해야 할 수 있습니다. 체크 방울 증발 하지 않도록 포화 인큐베이터 분위기는 잘. - 세포는 광학 현미경을 사용 하 여 폴 리카 보 네이트 호 일에 잘 연결 되는지 확인 합니다. 부드럽게 신선한 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 24 시간 동안 계속.
3. 나노 준비 및 노출
참고: 형광 염료 수정 티 오2 NPs 했다 설계, 합성, 그리고 화학적 tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)로 변경. 20 , 21 이 표면 개 질 나노 입자 감지, 추적 및 지역화에 제자리에 및 cellulo에 생활 및 고정 세포 또는 다세포 생물을 수 있습니다. 12 , 13 , 18
주의: 나노 소재 및 나노 치료와 함께 처리 되어야 합니다. 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 공기에서 보급을 방지 하기 위해, 나노 솔루션 (초순)에 유지 됩니다.
- 티 오2 초순에 NPs의 1 mg.mL− 1 의 현 탁 액을 준비 합니다. 티 오2 NPs RT에서 강렬한 1 분 쥡니다 펄스를 사용 하 여 분산 (750 W, 20 kHz, 진폭: 30%)는 초음파 발생기와 전용된 원뿔 현미경을 사용 하 여.
- 4 µg.cm−2 (최종 농도)의 노출 중단을 얻기 위해 티 오2 NPs에서 문화 매체에서 원하는 농도 희석. 적절 한 양의 셀에 중간 포함 NPs와 매체를 장착 하 고 티 오2 NPs의 추가 없이 마찬가지로 컨트롤 셀 티 오2 NPs 준비의 균질 배급에 대 한 부드럽게 혼합.
- 37 ° C, 5% (v/v) CO2 와 포화 물 분위기에서 24 h에 대 한 세포 인구를 품 어.
4. paraformaldehyde 기정 그리고 형광 현미경
- 인산 염 버퍼 (PBS, pH 7.4)에 버퍼 paraformaldehyde 솔루션 (PFA, 4 %w / v)의 새로운 솔루션을 준비 합니다.
- 100 ml PBS의 PFA 가루 4g을 디졸브. 증기 두건에서 자석 및 자석 교 반기를 사용 하 여 교 반 하면서 65 ° C에 솔루션을 열. 해결 될 때까지 한 번에 1 M NaOH 한 방울을 추가 하 여 pH를 증가. 실내 온도에 해결책을 냉각 하 고 pH 7.4에 조정. 즉시 갓된 솔루션을 사용 하 여 또는 + 4 ° C에서 유지 하 고 빛 으로부터 보호.
참고: 그러나 더 나은 품질의 고정 및 고정된 샘플의 장기 보존을 보장 하는 PFA의 임기 응 변의 준비 미리 만든된 PFA 솔루션을 사용할 수 있습니다.
주의: PFA는 독성; 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 항상 제대로 작동 화학 증기 두건 및 적절 한 필터를 사용 합니다.
- 100 ml PBS의 PFA 가루 4g을 디졸브. 증기 두건에서 자석 및 자석 교 반기를 사용 하 여 교 반 하면서 65 ° C에 솔루션을 열. 해결 될 때까지 한 번에 1 M NaOH 한 방울을 추가 하 여 pH를 증가. 실내 온도에 해결책을 냉각 하 고 pH 7.4에 조정. 즉시 갓된 솔루션을 사용 하 여 또는 + 4 ° C에서 유지 하 고 빛 으로부터 보호.
- 일단, 보육 시간 경과, 포함 된 티 오2 NPs 린스 한번 신선한 문화 매체와 함께 한 번 PBS (2 mL)는 세포 인구 세포 배양 매체를 제거 합니다. PBS를 제거, 신속 하 게 신선 하 고 차가운 PFA (4 %w / v, + 4 ° C)의 약 수와 린스.
- PFA (2 mL, 4 %w / v, + 4 ° C)를 추가 합니다. 실 온에서 15 분을 품 어.
- 제거는 PFA, 동요에서 PBS (2 mL, 3 시간, 5 분)와 셀 린스.
일시 중지 포인트: 이러한 화학적 샘플 고정 형광 이미징 (단계 5로 이동) 후 "급락-동결" 절차에 사용할 수 있습니다 또는 형광 이미징 (4.3 단계로 이동)에 사용.
- Hoechst33342 PBS에서 10 분 셀 잠복기와 핵을 얼룩. 500의 최종 농도에 사용 되는 Hoescht33342 nM. 부 화 후 솔루션을 제거 하 고 PBS로 씻어.
주의: Hoechst33342 셀 permeant 이며 독성이 있을 수 있습니다. 직접 접촉을 방지 하 고 장갑을 준비 하는 동안 Hoechst33342를 사용 하 여 사용.
중요: Hoechst33342 솔루션 얼룩은 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지. - 프로세스 현장 및 형광 현미경 검사 법 (그림 1)를 사용 하 여 단일 셀 이미징에 대 한 샘플 고정.
5. "식이 어" 고정 및 탈수
- 액체 질소에 냉각 하 여 알루미늄 전송 접시를 준비 합니다. 저장소 상자에 접시 액체 질소로 채워진 고 차가운 질소 증기에 액체 위에 접시 표면 유지.
참고: 어떤 금속 격판덮개의 전송 접시를 만들 수 있습니다 (여기서, 우리가 알루미늄을 사용)는 액체 질소 온도, 냉각 수 고 그 동결 건조 시료 챔버를 입력할 수 있습니다.
중요 한: 상자 지켜져야 한다 폐쇄 가능한 한 많이 찬 격판덮개 표면에 수증기 공 술 서를 방지 하기 위하여. 샘플 준비 하는 동안에 저장 된 액체 질소에 의해 포함 되지 않습니다 한다. - 세포 배양에 한 번 헹 구 고 두 번 더, 짧게, 살 균과 초순 물의 얻을 제거 나머지 extracellular 소금의 흔적.
중요 한: 미디어는 갓 준비 하 고 메 마른 조건에서 유지를 확인 합니다. 사용 되기 전에 37 ° C에서 모든 미디어를 열. 린스는 아주 짧은 (몇 초) 하며 샘플에 액체의 초과 제거 가능한 한 빨리. - 식이-동결 세포-150 ° c 액체 질소 냉장 2-methylbutane 30 s 및 장소 중에서 알루미늄에 그들 격판덮개 전송. 다른 모든 샘플의 준비 하는 동안 여기 샘플을 저장 합니다. 샘플 모든 cryofixed 때, 모든-에-한 번 전송 접시 동결 건조 기에 배치 하 여 전송 합니다.
중요 한: 전반적인 cryofixation 프로세스 구조 수정 전송 상자에 임시로 저장 하는 샘플에 표시를 방지 하기 위해 20 분 이상 지속 하지. - 다음 시퀀스를 사용 하 여 샘플을 freeze-dry: 1) 낮은 압력과 낮은 온도에서 12 ~ 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar)에 대 한 기본 건조 수행 후 2) 판 온도를 증가 적어도 24 h에 대 한 보조 건조 단계 수행 + 40 ° C (+ 40 ° C, 10-3 mbar) 압력 낮은 유지 하는 동안.
주의: 액체 질소는 매우 추운 이며 접촉 시 심한 동상 또는 눈 손상 될 수 있습니다. 전송에 대 한 적응된 벤치 최고 컨테이너를 사용 하 고 (극저온 장갑, 눈과 얼굴 보호) 안전 장비를 착용.
주의: 2 Methylbutane는 매우 가연성. 공기의 유해한 오염 + 20 ° c.에이 물질의 증발에 오히려 신속 하 게 도달 될 수 있다 흡입, 섭취를 피 하거나 피부 접촉. 사용 하 여 호흡과 눈 보호 및 보호 장갑. 항상 제대로 작동 화학 연기 후드를 사용 하 여. + 4 ° c.에 저장 될 수 있습니다.
중요 한: "급락-동결" 세션 2-Methylbutane 온도 모니터링 하는 적절 한 온도계 (-150 ° C)를 사용 합니다. 2-methylbutane 액체 단계에서 유지 되어야 한다. 주변 분위기에 cryofixed 샘플을 전송 하는 것은 온도 증가 또는 샘플 표면에 집 광 수증기 세포 손상을 발생할 수 있습니다. 따라서, 전송 한다 합리적으로 가능한 한 빨리 (30 s)
일시 중지 포인트: Cryofixation, 후 샘플 (먼지와 습기 로부터 보호) 살 균과 건조 조건에서 몇 일 동안 실내 온도에 저장 수 있습니다. 신중 하 게 좋은 집게와 샘플을 처리 하 고 parafilm으로 밀봉 살 균 12-잘 접시에 그들을 배치. 건조 시키는 건조 한 분위기를 사용할 수 있습니다.
6. 핵 현미경 분석
참고: 핵 현미경 분석 실시 되었다 보완 이온 빔 분석 기법 입자 유도 된 x 선 방출 (µ-를 사용 하 여 AIFIRA (응용 프로그램 Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en 지구의 아키텐)의 microbeam 라인에 PIXE) 및 스캐닝 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM). 시설 제공 빛 이온 빔 백만 전자 볼트 에너지 범위에 3.5 MV 입자 가속기를 기반으로 합니다. 22 , 23
일시 중지 포인트: AIFIRA 제안 된 실험의 과학적 평가 후 국내 및 국제 팀에 대 한 액세스를 제공 하는 보르도의 대학에 의해 접대 하는 이온 빔 시설입니다.
- 양면 테이프를 사용 하 여 apertured 접시에 슬쩍 시료 홀더를 탑재 합니다.
- 수직 빔 방향에 수직인 평면에서 샘플을 지 원하는 접시를 놓습니다.
- 분석 챔버를 닫고 분석 챔버를 진공.
- 스캔 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM)
참고: STIM 사용 됩니다 세포 질량, 에너지 손실의 변환 후 셀의 영역 밀도 지도 기록 에너지 손실은 이다 (µg.cm-2에서 표현) 샘플 면 적당 밀도에 비례 하는 사실을 활용.- 2 MeV의 헬륨 (그+) microbeam를 사용 하 여 약 300의 초점면에 크기와 프로브로 nm 직경에서 및 낮은 유창 (2000 ions.s-1). 평면 실리콘 검출기 (PIPS 검출기, 25 m m2, 5.4 MeV @ 11 keV 에너지 분해능), 전송 된 이온의 측정 에너지 빔 축에 샘플 뒤에 배치 합니다.
- 입자 유도 x 선 방출 (µ-PIXE) 및 러더포드 Backscattering 분석 (µ-RBS).
참고: µ Pixe 및 µ-RBS 분석 공간 배급 및 서브 마이크로미터 해상도와 화학 성분의 정량화를 제공합니다.- 8 시간 4에서 STIM와 약 100 x 100 µ m2에 의해 발견 하는 관심의 동일한 셀에 1 µ m 및 스캔의 직경까지 집중 1.5 MeV 양성자 (H+) microbeam (50-150 pA)를 사용 합니다.
- 원자는 고해상도 Si(Li) 고체 검출기 (145 eV 에너지 분해능, @Mn-Kα)에 의해 (나 보다 더 무거운) 샘플에 들어오는 광속 축에서 45 °에 위치에서 방출 된 유도 x 선 광자를 수집 합니다. 검색 된 광자 에너지를 사용 하 여 미터 (요소 예: Z) 및 x 선 강도 요소 농도 결정의 성격을 파악.
- 실리콘 검출기-135 °에 다시 흩어져 양자를 동시에 수집 (부분적으로 고갈된 검출기, 25 m m2, 11 케빈 5.4 MeV @ FWHM) 들어오는 입자의 총 수를 측정 하 고 x 선 강도 정상화를.
중요 한: 원자 농도 정량화에 대 한 인증된 교정 표준 컬렉션 x 선 검출기 응답을 보정 하기 위해 사용 됩니다. 참고 자료는 6.3 µ m 두께 Mylar 포 일에 원자 박막의 모음. 20.2 0.6 (Li, K 선)에서 x 선 에너지 범위 방출 케빈 (Rh, K 선).
7. 데이터 분석
- ImageJ를 위한 IBA J 플러그인을 사용 하 여 화학 원소 지도 재구성 합니다. 24
참고: ImageJ 위한 플러그인의 형태로 전용된 소프트웨어 원시 핵 현미경 분석 데이터를 처리 하도록 개발 되었습니다. 원시 데이터 연대기 순서로 빔 위치와 함께 기록 됩니다 세포와 상호 작용 입자 빔에서에서 발생 하는 이벤트의 목록에 해당 합니다.- IBA J 플러그인을 사용 하 여 정렬 유형에 따라 이벤트: 이온 에너지 (STIM) 전송, backscattered 이온 에너지 (RBS) 또는 x 선 광자 에너지 (PIXE). 그런 다음 별도로 각 유형의 데이터를 처리 합니다.
- STIM 지도 밀도 계산
- 평균 x 선 광자 에너지 스펙트럼을 계산 하 고 요소 공간 분포를 검색 하려면 관심 있는 에너지 창 각 화학 원소에 대 한 정의.
- 관심 (ROI) (예: 개별 셀, 조밀한 구조, 집계, 등등.) 영역을 정의 하 고 해당 x 선 스펙트럼을 계산.
- 입사 입자25의 총 수를 계산 하려면 해당 RBS 스펙트럼을 분석 합니다.
- 26 Gupix 소프트웨어 사용 하 여 각 ROI에 대 한 요소 농도 결정 하는 x 선 스펙트럼에 맞게.
참고: 방법에 대 한 탐지 (LOD)의 일반적인 제한 요소 (LOD는 Z와 감소)의 원자 번호에 따라 건조 질량 범위 1 ~ 10 µg.g-1 에.
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Representative Results
세포 배양 및 붙일 레이블된 티 오의 형광 이미징 2 NPs
우리는 샘플 홀더를 복합 분석 뿐만 아니라 세포 배양, 세포 처리에 맞게 설계 되었습니다. 특히, 중요 한 홀더 음 핵 현미경 분석 및 이미징으로 일상적인 광학 현미경을 허용 했다. 이 샘플 홀더 픽 프레임에 2 µ m 두께 폴 리카 보 네이트 호 일을 기반으로 합니다. 셀은 폴 리카 보 네이트, 몇 일 동안 메 마른 문화 조건에 직접 성장 하 고 NPs 노출 등 다른 실험 설정에 대 한 사용.
Fluorophores (TRITC)와 화학 표면 수정 paraformaldehyde 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀을 고정 또는 생활에서 그들의 원위치에 생체 외에서 현지화로 서 티 오2 NPs의 검출을 허용. 세포 핵과 미토 콘 드리 아 (파란색 핵에 대 한) 중요 한 염료 Hoechst33342 그리고 transfected 매트릭스-roGFP (미토 콘 드리 아에 대 한 녹색), 각각 사용 하 여 얼룩이 있었다. 이 여러 얼룩 허용 TRITC-티 오2 NPs의 세포내 지역화 (레드에 의해 그것의 형광 방출) 20 h 노출 후. NPs는 핵에서 전혀 검출만 노출된 셀의 세포질에서 발견 됐다. NPs는 세포질의 perinuclear 지역에서 무작위로 지역화 되었고 (없음 겹치는 TRITC GFP 사이 신호) 미토 콘 드리 아에서 완전히 제외.
형광 현미경 검사 법은 매우 유용한 노출된 셀 안에 NPs를 지역화, 그것은 셀 당 NPs의 정확한 수를 평가 하기 위해 수 없습니다. NPs의 정량화에 관한 형광 현미경 검사 법의 주요 어려움 (i) fluorophores 관찰 하는 동안 주어진된 NP 및 선택한 fluorophore의 표백 안정성에 연결의 수에 대 한 불확실성에 연결 되 고 (ii) 셀 내부를 NPs의 상태를 집계입니다.
그림 1 : 생체 외에서 그리고 현장에서 매트릭스-RoGFP을 표현 하는 U20S 유전자 변형 세포의 이미징 및 TRITC-티 오에 노출 형광 2 NPs. U2OS 셀 (맨 위) Hoechst33342 (파란색), 매트릭스-roGFP (녹색) 표시 4 µg.cm-2 TRITC 표시 된 티 오2 나노 입자에 노출 되는 (빨간색) 20 h. 관측 나타냅니다 그 티 오2 셀에 집계 NPs는 perinuclear 지역입니다. 눈금 막대: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이러한 단점을 극복 하기 위해 핵 현미경 분석 techniquesprovide 기존의 광학 현미경을 방지 모든 중간 신호를 사용 하 여 NPs에 그들의 감도 때문에 상호 보완적인 접근 처럼는 이식할에서 형광 염료. 또한, 그들은 또한 완벽 하 게 양적은 그렇지 않으면 알 수 없는, 하위 세포 생화학 콘텐츠 (i) 및 (ii) 단일 셀 수준에서 NPs의 세포내 수량에 대 한 데이터를 제공 하.
라이브 영상 후 셀의 Cryofixation입니다.
핵 현미경 분석에 가장 높은 제약 진공 조건 하에서 작업입니다. 우리는 생물 학적 열 대권 외의 보존 및 생물 시료의 생 화 확 적인 무결성 셀 고정 프로토콜을 개발 했습니다. 화학 고정 세포 열 대권 외의를 보존 하는 데 사용 하는 폴리머에 의해 그들의 세포 매체의 교체를 요구 하기 때문에 세포의 추적 요소 구성 수정으로 알려져 있다. 또한, 물 제거 또한 출시 무료 이온 및 전체 수정 다른 종 샘플 구성. 따라서, 그것은 물리적 고정 방법, 특히 극저온 방법에 우선 순위를 부여 하기 된다. 이러한 극저온 절차 밀리초 시간 규모에서 세포 활동 하 고,이의 신속한 중단을 유도.
원자력 현미경 분석 현미경 및 세포 규모에서 NPs의 정량화.
스캔 전송 이온 현미경 검사 법 (μ-STIM) 및 x 선 입자 유도 방출 (µ-PIXE) 분석은 cryofixation 및 그들의 원소 화학 성분에 정확한 양적 데이터를 얻기 위해 탈수 후 샘플에 수행 했다.
Μ-STIM 이미지 밀도 지역 차이 공개 하 고 핵 및 세포질 같은 셀 구조의 탐지를 허용 한다. 빔 측면 해상도 수 밀도의 관찰에서 세포질 구조 처럼 300 nm는 폭 좁은 얇은 집계 표시 여기, STIM 메서드 NP 집계 및 다른 고밀도 세포 구조 사이 차별 수 없습니다. 이 같은 전송 전자 현미경 (TEM)에 대 한 전송된 에너지에 변화를 선도 하는 물리적 과정은 원자 전자 구름과 함께 들어오는 이온의 상호 작용 때문입니다. 그러나 TEM 분석 달리, 전체 셀 볼륨 분석 하기 때문에 로컬 두께 변화 방지 높은 Z 구조와 세포 밀도의 증가 지역 차별.
그림 2 : µ STIM 및 µ-PIXE cryo 고정 U2OS 세포에 의해 얻은 이미지 밀도 및 원소 분포. (최대) U2OS 컨트롤 셀 cryo 고정 U2OS 셀 (아래로 4 µg.cm-2 티 오2 NPs, 노출) 노출에 비해 있으며 핵 현미경 분석/현미경을 사용 하 여 관찰. STIM 현미경 (왼쪽, 회색조 지도) 조밀한 내부 또는 여분 cellular 구조 (핵, 소금 집계, 나노 입자)를 공개 했다. 공간적 해상도 (300 nm) 형광 현미경 검사 법에 비해 고 perinuclear 지역에 NP 집계 등의 구조를 보여줍니다. 그들의 밀도에 기반으로 하는 구조의 식별 역시 모호한 수 있습니다. K, P, Ti (열 색 눈금)의 μ PIXE 원소 지도 µ STIM 지도를 보완 있습니다. 그들은 셀에 NPs의 존재를 보장 하기 위해 사용할 수 있습니다. 각 셀은 개별적으로 요소 농도 점에서 분석 될 수 있다 ( 그림 3참조). 스케일 바: 10 µ m. 색조 범위는 최소 (파란색)에서 최대 강도 (회색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2에서 볼 수 있듯이 µ STIM 렌더링 인구와 또한 핵소체 등 핵 세포내 하위 구획 내에서 개별 셀의 인식 수 있습니다. 불운 하 게, 그리고 이전에 언급 한 NPs 수 항상 감지 되지 않을 µ STIM 개조를 사용 하 여.
입자 유도 된 x 선 방출 (µ-PIXE) 분석 샘플 뿐만 아니라 그들의 원소 매핑 (그림 2)의 화학 성분을 뿐만 아니라 제공합니다. 흥미로운 빔과 상호 작용 하는 동안 화학 요소는 결국 흥분된 성분의 원자 번호의 특성 에너지를 전시 하는 광자의 방출에 지도 하는 원자 여기-드-여기 프로세스를 받 다. 특성 피크 스펙트럼 모든 내보낸된 광자 이벤트의 합계에서 건축 되 고 샘플의 화학 서명을 하는 것으로 간주 됩니다.
표준 실험 설정 및 µ PIXE 실험을 위해 사용 하는 감지기 동시 정량화의 모든 요소를 1 ~ 10 µg.g− 1 건조 대량 검출 한계를 나 보다 더 무거운 수 있습니다. 원소 농도 측정 정확도 일반적으로 충전 컬렉션 및 발견자 효율성 때문에 약 20%로 제한 됩니다.
이 연구에서 티 오2 NPs 티타늄 매핑 세포내 양을 계량 하 고 칼륨과 인 같은 요소의 분포 핵 현미경 분석에 의해 관찰 된다. 화학 원소 지도 광자 녹음 및 특정 요소 중심 에너지 창 선택의 타이밍에 빔 위치에 따라 정렬 후 계산 됩니다. 지도 빔 위치에서 검색 된 이벤트의 수를 대표 하 고 양적입니다. 잡음과 배경 숫자 시뮬레이션 이며 필터링. 또한, 화학 매핑 추출 정량화에 필요한 로컬 PIXE 스펙트럼을 사용할 수 있습니다.
그림 2에서 볼 수 있듯이 인 homogenously 배포, 셀에서 예상 대로 핵 지역에서 훨씬 높은 농도. 칼륨은 균질 셀 볼륨에서 배포 됩니다. 티타늄은 집계, 이전 형광 현미경 검사 법 (그림 1)를 사용 하 여 관찰의 형태로 세포질 perinuclear 지역에 위치 해 있습니다. NPs 표시 같은 perinuclear 지역화 어떤 그들의 표면 상태: 기능성된 (그림 1) 또는 네이티브 (그림 2). 한편, 티타늄의 흔적 µ PIXE에 의해 관찰 티타늄 배포 티 오2 NPs, 형광 현미경 검사 법에 의해 우리의 이전 분석 계약 할당 해야 합니다 확인 하는 제어 셀에서 발견 되었다.
또한, 그림 2에서 볼 수 있듯이 그것은 관심의 특정 영역에서 NPs의 세포내 분포 및 양적 NPs 농도 추출 가능. STIM 지도 인/칼륨 배포판과 상관 관계에서 기반으로, 단일 세포 분석 가능 하다.
그림 3 : µ PIXE를 사용 하 여 단일 셀 정량 분석. 개별 x 선 스펙트럼을 그림 2 에 표시 된 셀에 대 한 계산 세포 수준에서 요소 농도 결정 하기 위해 장착 될 수 있습니다. 이 기능은 세포 농도 일반적으로 동일한 인구 안에 강한 유사 표시 NP 분석을 위해 특히 재미 있다. 예를 들어 같은 노출, 1.8 µg.cm-2까지 0.2에서 Ti 농도 범위를 의미 합니다. 컨트롤 치료 세포 인구에 해당합니다. 노출 복용량: 4 µg.cm-2. Boxplots 중간 값 (가로줄)와 개별 세포 농도의 분포 나타내고 바 최저 및 최고 확장 측정 값. 셀 컨트롤: N = 14; 세포 노출: N = 16.
따라서, 우리는 세포 인구에서 티타늄의 평균 콘텐츠를 측정할 뿐만 아니라 또한 특정 실험 상태에서 한 인구에 셀 당 티타늄 분포를 표시. 티타늄 여기 측정의 평균 콘텐츠 이며 꽤 (500 ng.cm-2) 셀 인구 (그림 3)의 4 µg.cm-2 노출 복용량에 비해 낮은 셀 사이의 변화는 큰 (Ti 농도 범위에서 1.8 µg.cm 최대 0.2 -2 분석된 셀에 따르면). 우리는 또한 티 오2 NPs, 여러 작가 의해 이전 설명의 존재에 의해 유도 된 세포질 변경 항상성 제안 노출된 샘플에서 칼슘 칼륨 등 세포내 이온의 증가 발견. 21 , 27
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Discussion
우리는 subcellular 수준에서 특히 다른 이미징 기술로 가능한 유용한 정보를 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이미징 능력, 더불어 핵 현미경 분석 또한 생물 학적 샘플의 구성에서 입력 하는 화학 성분의 정량화의 가능성을 제공 합니다. 현재 작업에서 우리 인간의 세포 인구를 공부 하 고 티 오2 NPs에 노출 하는 단일 셀에 따라 관심의 선택한 영역의 분석으로 집중. 다른 기술을 조합 원소 화학 성분에 형태학 상 세포 이미징 및 정확한 정량적 데이터를 제공합니다.
성공적으로 적용 하려면 핵 현미경 분석, 존중 하는 잠재적인 함정을 피하기 위해 다음 사항을 필수입니다. 첫째, 열 대권 외의의 및 생화학의 무결성을 유지 하기 위해 셀 고정을 위한 극저온 프로토콜을 사용 하는 것이 필수적입니다. 둘째, 그것은 또한 아래 20 µ m 두께 얇은 샘플 분석을 수행 하는 필수입니다. 필요한 경우, cryofixed 샘플의 단면을 수행할 수 수 있습니다. 샘플은 절대적으로 냉동 지켜져야 한다. 셋째, 그것은 또한 핵 현미경 분석 생물 샘플의 2 차원 표현을 보여 마음에 유지 하는 것이 중요입니다. 따라서, 얻은 화학 원소 분포 misinterpretations 소개 가능 하 게 수 있는 2 차원 투영 이다. 이 제한 단층 인수 사용 하 여 미래에 무시 될 것입니다.
원자력 현미경 분석에는 제한이 있습니다. 그것은 그것의 주요 제약 진공에서 분석을 수행 하는 필요는 강조 되어야 한다. 따라서, 세포 열 대권 외와 생화학 무결성 유지 셀 고정 프로토콜 사용 하는 것이 필수적입니다. 그것은 생물 학적 샘플 (화학 수 지의 추가) 없이 저온 학 절차에의 저항을 테스트 하는 데 필요한 따라서. 이 핵 현미경 분석의 사용을 제한할 수 있습니다.
또 다른 한계는 핵 현미경 분석 수행에 대 한 시설에 대 한 접근 이다. 할당 된 빔 있다 따라서 가끔 제한, 그리고이 시간이 걸리는 실험의이 종류는 추가 제약 조건입니다. 한 인수 종종 몇 시간이 필요 합니다.
이 기술은 현미경 검사 법, 질량 분석 (MS), 유도 결합 플라즈마 석사 (ICP-석사), 액체 크로마토그래피 (LC-석사), MS 포함 하 여 다른 분석 방법에서 다르다 고 방사성 동위 원소. 후자는 실제로 사용 화학 성분의 세포 복용량 추정 하지만 그들은 한 거시적인에 정보를 제공할 수 있게 샘플의 거시적인 금액 즉 확장. 그들 중 누구도 액세스할 수, 핵 현미경 분석이, 정확한 탐지 및 특정 화학 성분의 subcellular 복용량의 매핑 (이온, 금속 또는 금속 산화물 NPs). 이러한 데이터 복용량 응답 평가의 더 체계적인 연구를 액세스 하는 데 도움이.
셀에 NPs의 국제화를 공부 하면 복용량의 정확한 추정은 모두 양적 NP 독물학과 약 학 보기의 지점에서 결정적 이다. 보여주는 사진 차이 최소 및 최대 농도 (그림 3)을 관찰, 관찰된 NP 내용에 큰 차이가 제안으로 의미 세포 농도 관련 매개 변수 설명 되지 않을 수도 있습니다는 입자 노출의 현상입니다. 이 임계값 효과 휘도가 복용량 노출 모순 된 관측으로 이어질 수 있기 때문에 자리를 차지할 되어 때 특히 사실 이다. 나노 입자의 분류 한 자연 세포 수준에서 명확 하 게 나타납니다, 이후이 연구 따라서 포즈 다시 동작 주위에 노출 하는 셀의 주소 지정 질문에 전역 변수를 분석에 따라 방법의 관련성의 질문 오염 물질의 휘도가 복용량.
여기 공부 하는 경우에 볼 수 있듯이 관찰 및 개별 셀 내에서 NPs의 부 량 수 금속 산화물 NPs 같은 내 생/외 인 요소의 bioaccumulation 이해. 이것은 의학에서 NPs의 추가 응용 프로그램에 대 한 중요 한 작업, 셀에 NP 배포 오해 결과로 이어질 수 있는 기본의 빈약한 이해.
이 프로토콜 다른 기술로 핵 현미경 분석을 사용 하 여 생물학 견본으로 NP 상호 작용의 미래 평가 대 한 적합성을 강조 표시 합니다. 양적 접근 탐지, 식별, 지역화, 및 1 개의 단일 세포 수준에서 정량화 같은 NPs의 영향에 대 한 정보를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 Serge Borderes 감독 및 비디오의 편집. 프랑스 국립 연구 기관 연구 프로그램 TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01)을 지원합니다. CNRS와 통합 활동으로 유럽 공동체 "지원의 공공 및 산업 연구를 사용 하 여 이온 빔 기술 (정신)" EC 계약 n ° 227012에서 제공. 이 작품 EC 계약 번호 317169 마리 퀴리 작업-초기 교육 네트워크 (ITN) "통합 활동 지원 대학원 연구와 인턴쉽에 산업 및 교육 우수" (스프라이트, D1.3)로 지원 되어 있다. C'NANO 그랜드 Sud Ouest 및 지역 아키텐 연구 프로그램 TOX-나노 (n ° 20111201003)와 POPRA (n ° 14006636-034) 연구 프로그램을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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