Summary
Мы описываем процедуры для обнаружения химических элементов настоящего в situ в клетки человека, а также их количественная оценка в пробирке . Этот метод хорошо подходит для любого типа клеток и особенно полезен для количественного химического анализа в одиночных клетках в vitro воздействия наночастиц оксидов металлов.
Abstract
Микро аналитические методы, основанные на химический элемент визуализации возможность локализации и количественная оценка химического состава на клеточном уровне. Они предлагают новые возможности для характеристики живых систем и особенно подходят для обнаружения, локализации и количественной оценки присутствия наночастиц оксидов металлов в биологических образцов и окружающей среды. Действительно эти методы все соответствующие требованиям с точки зрения (i) (от 1 до 10 мкг/г-1 сухой массы), (ii) микрометра диапазон пространственное разрешение и (iii) многоэлементных обнаружения. Учитывая эти характеристики, Микролучевой химический элемент изображения могут мощно дополнить обычные методы визуализации такие как оптические и микроскопии флуоресцирования. Этот протокол описывает, как выполнить ядерной рентгенофлуоресцентного анализа на культивируемых клеток (U2OS) подвергается наночастиц двуокиси титана. Клетки должны расти и быть предоставлены непосредственно в держатель специально образца используется на оптический микроскоп и ядерной рентгенофлуоресцентного анализа этапов. Плунге замораживание криогенных фиксации образцов сохраняет клеточной организации и распределения химических элементов. Одновременная ядерной рентгенофлуоресцентного анализа (сканирования передачи ионная микроскопия, Резерфорд обратного рассеяния спектрометрии и частицы индуцированной рентгеновское излучение) на образце предоставляет сведения о сотовых плотность, местного распределения химические элементы, а также клеточного содержания наночастиц. Существует растущая потребность в таких аналитических инструментов в биологии, особенно в контексте возникающих нанотоксикология и наномедицины, для которого необходимо углубить наше понимание взаимодействия между наночастицами и биологических образцов. В частности как ядерная рентгенофлуоресцентного анализа не требует наночастиц для наноситься, обилия наночастиц измеримы вплоть до уровня отдельных клеток в популяции клеток, независимо от состояния их поверхности.
Introduction
Клеточного гомеостаза определяется управления поглощения, ассимиляции и внутриклеточной локализации различных микроэлементов (ионы, металлы, экзогенных неорганических соединений). Эти компоненты являются часто в виде следов, но тем не менее может оказать значительное влияние в физиологии системы. Таким образом исследование клеток биохимии в нормальных и патологических/подчеркнул ситуациях является ключ шаг к достижению общего понимания механизмов клеточного метаболизма. Таким образом развитие изображений и аналитических методов, позволяя расследование внутриклеточных Распространённость химических, структурной организации и их соответствующих метаболических функций становится необходимым. Очень немногие методы способны обеспечить в situ количественных кусок информации, касающейся общей химической природы данного образца. Помимо методов анализа образцов в балк-форме, в situ анализа рассмотреть биологических образцов в их целостность без потери массы и структурной информации, тем самым сохраняя их химических компонентов (ионов и микроэлементы) и белки. Кроме того поскольку нанонауки продолжают развиваться, улучшение изображений и аналитических методов для мониторинга окружающей среды на клеточном уровне необходимо будет наблюдать и количественной оценке нано объект поведения и взаимодействия. 1
Наночастицы (NPs) были определены как объекты выставке по крайней мере одного лица измерения в диапазоне 1 и 100 Нм. 2 из-за их конкретных физико-химических свойств, NPs широко используются в промышленности. ЯИЭ используются в био приложений и наномедицины. 3 , 4 несмотря на многочисленные физико-химические характеристики NPs, они могут создавать некоторые риски неблагоприятных последствий для здоровья человека и окружающей среды. Эти риски можно индуцировать путем длительного и повторяющиеся воздействия на различных уровнях концентрации, и это еще не была четко установлена. 5 , 6 , 7 , 8 в частности, судьба NPs внутри клетки и связанные клеточных реакций являются, на сегодняшний день, описал не полностью. Это отчасти из-за нехватки методов, которые позволяют выявлять и количественной оценки внутренней сети в одну ячейку. 9
Классических аналитических инструментов, используемых для оценки клеточного дозы наночастиц, microscopies, масс-спектрометрия (МС), индуктивно сочетании плазмы мс (ИСП-МС)10,11 и жидкостной хроматографии, MS (LC-MS), но они только обеспечивают Полезная информация на макроскопическом уровне. Ни один из них может предоставить точную оценку субцеллюлярные NPs содержание ни NPs распределения без использования методов фракционирования. Систематическая оценка доза ответ таким образом невозможно с помощью этих методов, в отличие от методов, основанных на атомной спектроскопии таких ядерных рентгенофлуоресцентного анализа12,13, Синхротрон рентгеновской микроскопии флуоресцирования14 и масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS). 15 , 16 эти методы особенно интересны, поскольку они дополняют замечания, сделанные с помощью микроскопии флуоресцирования, особенно когда NPs не могут быть помечены с помощью флуоресцентных молекул и таким образом изучены в их родном государстве. В некоторой степени даже когда NPs привитый с флуорофоров, (i) количественная оценка остается сложной потому, что пометки уровне за NP неизвестна и (ii) химическая модификация поверхности NP может изменить его сотовой распределения.
В этой статье мы ориентируемся на метод, основанный на сочетании методов ядерной микрозондирования, направленный на imaging морфологию и химический состав биологических образцов мажор, минор и проследить концентрации.
Ядерные рентгенофлуоресцентного анализа окажется особенно подходит для измерения химических микроэлементов в биологических тканях. Луч латеральное разрешение (0,3 до 1 мкм) и чувствительность обнаружения химического элемента (от 1 до 10 мкг/г-1 сухой массы) хорошо подходят для исследования на клеточном уровне. Методы ядерной рентгенофлуоресцентного основаны на частицы обнаружения (фотоны, электроны, ионы), выбрасываемых после ионного пучка (обычно работает на энергий МэВ) взаимодействует с атомами в образце. Взаимодействия, происходящие в клетках, в основном: 1) возбуждения/ионизации атомов, следуют излучение фотонов после того, как атомы вернуться к их фундаментальных состояние; и 2) распространение поступающих частиц приводит к изменению их энергия и направление. Измерение выбрасываемых частиц энергии allowsthe идентификации атомов, участвующие во взаимодействии. Чтобы выполнить сопоставление элементов, Ион Микролучевой неоднократно сканируется над поверхностью образца, часто на площади около 100 100 мкм2 , содержащий несколько ячеек. Обнаруживаются испускаемых частиц и их энергия записывается для каждого луча. Сортировка частиц согласно позиции луча, таким образом определение структуры, отвечающей за выброс таких частиц является цель обработки данных. Здесь мы точно описать подход, основанный на микроскопии флуоресцирования и ядерной рентгенофлуоресцентного анализа для обнаружения, а также для количественного определения внешних NPs на клеточном и субклеточном уровнях, с целью изучения последствий NP взаимодействий с живой систем. Мы особенно должны сосредоточиться на возможности, предоставляемые этот метод с точки зрения количественной оценки в situ агрегатов наночастиц (TiO2 NPs) двуокиси титана на субклеточном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. держатель пробоподготовки
-
Держатель образца и подготовка
- Производство держатель образца путем бурения угольником 5 x 5 мм в PEEK рамку толщиной 1 мм.
- Чистота, полоскание с этанол 70% (v/v) и держать в стерильных пластин до готовой к использованию.
Примечание. Держатель образца для культуры клеток и клеток обработки не требуется. Она должна быть разработана для культивирования, в пробирке наблюдения с оптической микроскопии и ядерной рентгенофлуоресцентного анализа и визуализации ячейки. Этот держатель изготовлен из PEEK кадр13.
- Подготовка держатель образца
- Приготовляют раствор Formvar, растворяя 1 мг порошка Formvar в 100 мл хлороформа.
- Растянуть поликарбоната фольги на металлической раме, таким образом, что в нем не раз.
- Используете стерильные подсказка для распространения Formvar раствора вокруг отверстие держателя образца.
- Положите деликатно держателя образца с клеем на натянутой поликарбоната фольги (5 x 5 мм площадь).
- Повторение предыдущей последовательности подготовить один держатель образца для каждого репликации.
Примечание. Поликарбонат (ПК) фильм биосовместимых, достаточно толстые и устойчивы к различные протоколы и аналитические трудности.
Осторожно- хлороформ является токсичным. Избегать вдыхания, при приеме внутрь или контакта с кожей. Всегда используйте должным образом функционирующей Химический вытяжной шкаф и соответствующие фильтры.
- Стерилизация держателя образца
- Место держатель установлен образец в коническую колбу с 50 мл, этанол 70% (v/v) под агитации на 180 об/мин и + 37 ° C на ночь, с помощью инкубатора/мешалкой.
- Промойте держатель в стерильной дистиллированной воде в несколько раз.
- Сушат их в стерильных условиях и подвергать их ультрафиолетового света (бактерицидные лампы от биобезопасности скамейке, класс II) за 30 минут на каждой стороне.
- Сохранить образцы в стерильных 12-ну пластины (один образец держателя за хорошо) до готовой к использованию.
Примечание: Несколько держатели образца может храниться при комнатной температуре в стерильных и сухой плиты 12-ну опечатаны с парафина на несколько дней.
2. рост клеток в держателя соответствующего образца.
Осторожностью: Протокол должен осуществляться в лавочке ламинарного потока по биобезопасности (класс II), чтобы исключить загрязняющих микро организмов. Обработайте антибиотиков (например пенициллин, стрептомицин) с перчатками. Уважать наилучшей практики при обращении с биологическими материалами (клеточных линий, генетически полученных клетки человека).
Критической: клеток линии, используемые должны быть проверены для обеспечения, что они не заражены микоплазмы.
- Transfect U2OS клеточной линии с плазмида с учетом матрица roGFP 17,18,19 с помощью трансфекции метода в соответствии с протоколом, установленным производителем.
- Для подтверждения трансфекции с плазмида переноски биосенсора для предотвращения потери плазмида, выбрать и сохранить transfected клеток на соответствующий носитель культуры.
- Визуализация transfected клеток при микроскопии флуоресцирования обеспечить произошла transfection и подтвердить выражение флуоресценции и отображение митохондриальной сети ретикулярные и трубчатых19.
Приостановка точка: Клетки могут быть заморожены в жидком азоте на протяжении нескольких лет. - Используйте transfected клеток населения путем культивирования клеток в соответствующей среде для того чтобы получить югу вырожденная клеточных популяций. Рост клеток при 37 ° C, 5% (v/v) CO2 в атмосфере насыщенного водой.
- Семя клеток в концентрации, такие, как они находятся на 80% слияния в день фиксации. Как правило могут использоваться концентрацию 500 клеток / мкл. Урожай клеток с использованием 400 мкл трипсина-ЭДТА 0,25% (v/v) и держать на 3 мин при температуре 37 ° C. Прекращение действия трипсина с 1 мл питательной среды. Пелле клетки центрифугированием на 5 мин на 230 x g и + 4 ° C, затем удалить супернатант и добавьте желаемый объем свежей питательной среды.
Примечание. Протокол применяется для всех клеточных типов и количество клеток посеян зависит от размера ячейки и ячейки, время удвоения.
Осторожностью: Избегайте, подвергая трипсина, антибиотики и сыворотки циклов повторных замораживания оттаивания. Держите их стерильными. Разделите Стоковый раствор на аликвоты и заморозить их на −20 ° C. Храните аликвоты до истечения срока. Тщательно промойте Пелле ячейки для того, чтобы полностью удалить трипсина. Следы остаточной трипсина задержки и снижение эффективности покрытия. - Подсчитать количество ячеек и разрежения с свежей полной питательной среды, держал при 37 ° C для получения суспензии клеток с 500 клеток / мкл.
Примечание: Концентрация суспензию клеток должен быть адаптированы в зависимости от типа клеток, чтобы пластина 40 мкл падение. - Пластина 40 мкл падение на центр поликарбоната фольги. Осторожно поместите образец для 2 ч при 37 ° C, 5% (v/v) CO2 в атмосфере насыщенного водой.
Критические: После того, как образец помещается в инкубаторе, максимально ограничивайте любое механическое движение в пользу быстро клеток вложений. В зависимости от типа ячейки это может быть необходимым для инкубации клеток длиннее 2 ч для оптимальной эффективности, сплетши. Проверьте что инкубатор атмосфера хорошо насыщенных для предотвращения испарения капель. - Проверьте, что клетки являются хорошо прилагаемый на фольге поликарбоната с помощью оптического микроскопа. Аккуратно добавить 2 мл свежего полного среднего и держать за 24 ч.
3. наночастицы подготовка и экспозиции
Примечание: Флуоресцентные краски модифицированные TiO2 NPs были разработаны, синтезируется и химически модифицированных тетраметилсвинца родамин Изотиоцианаты (TRITC). 20 , 21 этой модификации поверхности позволяет наночастиц обнаружения, отслеживания и локализации в situ и в cellulo клетках как живых, так и фиксированной или многоклеточных организмов. 12 , 13 , 18
Осторожностью: Наноматериалы и наночастиц должны рассматриваться с осторожностью. Избегать вдыхания, при приеме внутрь или контакта с кожей. Для предотвращения распространения в воздухе, наночастицы поддерживаются в растворе (ультрачистая вода).
- Подготовьте подвеска 1 mg.mL−1 TiO2 ЯИЭ в ультрачистая вода. Разогнать TiO2 NPs с помощью интенсивной 1-мин sonication импульсов на RT (750 Вт, 20 кГц, амплитуда: 30%) с использованием ультра-звуковой генератор и выделенный конические рентгенофлуоресцентного.
- Разбавьте TiO2 NPs на желаемой концентрации в среде культуры для того, чтобы получить воздействия приостановления 4 µg.cm– 2 (конечная концентрация). Замените соответствующий объем среднего содержащие NPs на клетки средних и смешайте нежно за равномерное распределение TiO2 NPs. Подготовка клетки управления аналогично без добавления TiO2 NPs.
- Инкубируйте клеточных популяций для 24 ч при 37 ° C, 5% (v/v) CO2 и насыщенных водой атмосферу.
4. параформальдегида фиксации и флуоресцентной микроскопии.
- Готовить свежий раствор параформальдегида раствора (ПФА, 4% w/v) буфера в буфер солевой фосфат (PBS, рН 7,4).
- Растворите 4 g порошка ПФА в 100 мл ФСБ. Нагрейте раствор до 65 ° C во время перемешивания, с помощью магнита и магнитной мешалкой в зонта. Увеличение pH, добавив 1 M NaOH одна капля в то время, пока решение очищается. Cool решение до комнатной температуры и скорректировать рН 7,4. Сразу использовать свежеприготовленный раствор или хранить при температуре + 4 ° C и защищать от света.
Примечание: Можно использовать готовые решения PFA, однако импровизированный подготовка PFA гарантирует лучшее качество фиксации и долгосрочное сохранение фиксированных выборок.
Осторожностью: PFA токсичен; избегать вдыхания, при приеме внутрь или контакта с кожей. Всегда используйте должным образом функционирующей Химический вытяжной шкаф и соответствующие фильтры.
- Растворите 4 g порошка ПФА в 100 мл ФСБ. Нагрейте раствор до 65 ° C во время перемешивания, с помощью магнита и магнитной мешалкой в зонта. Увеличение pH, добавив 1 M NaOH одна капля в то время, пока решение очищается. Cool решение до комнатной температуры и скорректировать рН 7,4. Сразу использовать свежеприготовленный раствор или хранить при температуре + 4 ° C и защищать от света.
- Однажды, инкубации время прошло, удалить среды культуры клетки, содержащие TiO2 NPs. Промойте клеточных популяций с свежей питательной среды и один раз с PBS (2 мл). Удаление PBS, быстро промойте Алиготе свежей и холодной PFA (4% w/v, + 4 ° C).
- Добавьте PFA (2 мл, 4% w/v, + 4 ° C). Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
- Удаление PFA, промойте клетки с PBS (2 мл 3 раза, 5 мин) под агитации.
Приостановка точка: Эти химически фиксированной образцов может использоваться для «Плунге замораживание» процедура после флуоресценции изображений (перейдите к шагу 5) или используются только для флуоресценции изображений (перейдите к шагу 4.3).
- Пятно ядро с Hoechst33342 инкубации клеток для 10 мин в PBS. Hoescht33342 используется в конечной концентрации 500 Нм. После инкубации выньте решение и промойте с PBS.
Осторожностью: Hoechst33342 клеток permeant и могут быть токсичными. Избегайте прямого контакта и использовать перчатки при подготовке и использовании Hoechst33342.
Критической: убедитесь, что Hoechst33342 окрашивание раствора свежезаваренным подготовлен и в стерильных условиях. - Процесс фиксированной образцы для in situ и одноклеточного изображений с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1).
5. «погружение замораживание» фиксации и обезвоживания
- Подготовьте алюминиевой пластины передачи, охлаждения в жидком азоте. Магазин пластину в коробку с жидким азотом и поддерживать поверхности плиты выше жидкости в пар холодного азота.
Примечание: Пластина передачи могут быть изготовлены из любого металлические плита (здесь, мы использовали алюминий) которые могут охлаждается до температуры жидкого азота, и что можно ввести замораживание сушка образца камеры.
Критические: Поле должно быть закрыты максимально для предотвращения осаждения паров воды на поверхность холодной пластины. Образца хранится на тарелке во время подготовки не должны быть охвачены жидкого азота. - Промойте клетки один раз в среде культуры и затем дважды, кратко, в стерильных и сверхчистого воды, чтобы получить избавиться от следов оставшихся внеклеточного солей.
Критические: Убедитесь, что средства массовой информации свежезаваренным подготовлен и в стерильных условиях. Тепло все СМИ при 37 ° C перед использованием. Полоскание должно быть кратким (несколько секунд), и избыток жидкости на образцах удалены как можно быстрее. - Плунге замораживание клеток на-150 ° C в жидкий азот охлажденный 2-methylbutane течение 30 s и место их на алюминий передачи пластины. Хранить образцы здесь во время подготовки всех других образцов. Когда образцы всех cryofixed, передавать все в-один раз путем размещения пластины передачи в замораживания сушилка.
Критические: Общий процесс cryofixation не должна длиться более чем 20 мин для того, чтобы предотвратить структурные изменения появляются в образцах, временно храниться в окне передачи. - Freeze-Dry образцы, с помощью следующей последовательности: 1) выполняет основной сушки для 12-24 ч (-99 ° C, 10-3 мбар) при низком давлении и низкой температуре, затем 2) выполняет этап вторичного сушки для по крайней мере 24 часа, повышение температуры пластина для + 40 ° C при сохранении низкого давления (+ 40 ° C, 10-3 мбар).
Осторожностью: Жидкий азот очень холодно и может повредить тяжелых обморожений или глаз после контакта. Использовать адаптированные скамейке Топ контейнеры для транспортировки и носить оборудование безопасности (криогенные перчатки, защита глаз и лица).
Осторожностью: 2-Methylbutane чрезвычайно легковоспламеняющийся. Вредного загрязнения воздуха можно довольно быстро добраться на испарение этого вещества при температуре + 20 ° C. Избегать вдыхания, при приеме внутрь или контакта с кожей. Используйте дыхание и защиты глаз и защитные перчатки. Всегда используйте должным образом функционирующей Химический вытяжной шкаф. Может храниться при температуре + 4 ° C.
Критические: Используйте соответствующие термометр (-150 ° C) для мониторинга температуры 2-Methylbutane во время сессии «Плунге замораживание». 2-methylbutane должны храниться в прохладном в жидкой фазе. Передача образцов cryofixed окружающей атмосферы может вызвать клеточных повреждений из-за повышения температуры или паров воды, конденсата на поверхности образца. Соответственно, перевод должен быть произведен так же быстро, как это реально возможно (30 s)
Приостановка точка: После cryofixation образцы можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней в стерильных и сухих условиях (защищены от проникновения пыли и влаги). Тщательно обрабатывать образцов с тонкой щипцами и поместите их в стерильных пластины 12-хорошо запечатанный с парафина. Осушитель может использоваться для сухой атмосфере.
6. Ядерная рентгенофлуоресцентного анализа
Примечание: Ядерная рентгенофлуоресцентного анализа была проведена на линии Микролучевой AIFIRA (приложения Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en округов Аквитания) с помощью дополнительных Ион луч аналитических методов частиц индуцированной рентгеновское излучение (µ- PIXE) и сканирование передачи ионная микроскопия (µ-STIM). Фонд основан на ускорителе частиц 3,5 МВ, обеспечивая легкий ионных пучков в диапазоне энергий МэВ. 22 , 23
Приостановка точка: AIFIRA представляет собой Ион луч организовано Университет Бордо, который предлагает доступ к национальной и международной команды после научной оценки предлагаемого эксперимента.
- Закрепите держатели образца PEEK на перфорированной пластиной с помощью двухсторонней ленты.
- Место пластину поддержки образца в вертикальной плоскости, перпендикулярно направлению луча.
- Закрыть камеру анализ и вакуумной камере анализа.
- Сканирование передачи ионная микроскопия (µ-STIM)
Примечание: STIM используется для записи карты ареальная плотность клеток после преобразования потери энергии в клеточной массы, воспользовавшись тем, что потеря энергии пропорциональна плотности записи образца (выраженный в µg.cm-2).- Используйте 2 МэВ Микролучевой гелия (он+) как зонд с размером в фокальной плоскости около 300 Нм в диаметре и низкой беглости (2000 ions.s-1). Мера энергии передаваемой ионов с планарной кремниевый детектор (детектор ПИПСОВ, 25 мм2, 11 кэВ энергетическое разрешение @ 5.4 МэВ), размещенных за образец в оси пучка.
- Частица индуцированной рентгеновское излучение (µ-PIXE) и Резерфорд обратного спектрометрии (µ-RBS).
Примечание: анализ µ-Pixe и µ-RBS обеспечивают пространственного распределения и количественная оценка химических элементов с разрешением суб микрометра.- Использование 1.5 МэВ Протон (H+) Микролучевой (50-150 Па), сосредоточены вплоть до диаметра 1 мкм и сканирования же клетки интереса, заметили STIM от 4 до 8 часов и около 100 x 100 мкм2.
- Собирайте индуцированных рентгеновских фотонов, излучаемый атомами в образце (тяжелее, чем Na) с высоким разрешением Si(Li) полупроводниковый детектор (145 eV энергии резолюция, @Mn-Kα) расположены под углом 45 ° от входящей оси пучка. Используйте обнаруженных Фотонная энергия для определения природы излучателей (например, Z элемента) и интенсивности рентгеновского для определения концентрации элемента.
- Одновременно собирать обратно рассеянном протонов на-135 ° с кремниевый детектор (частично обедненного детектор, 25 мм2, 11 кэВ FWHM @ 5.4 МэВ) для измерения общее количество входящих частиц и нормализовать интенсивности рентгеновского.
Критические: Совокупность сертифицированных калибровки стандартов для квантификации атомной концентрации используется для калибровки детектора рентгеновского. Справочные материалы представляют собой набор пленок атомной, хранение на 6,3 мкм толщиной лавсановые пленки. Излучаемый рентгеновского энергии колеблется от 0,6 (Li, линия K) до 20,2 кэВ (Rh, линия K).
7. анализ данных
- Реконструировать химических Элементаль карты, используя плагин IBA-J для ImageJ. 24
Примечание: Программное обеспечение в виде плагина для ImageJ был разработан для обработки сырья ядерных рентгенофлуоресцентного анализа данных. Необработанные данные соответствуют список событий, связанных с лучевой взаимодействия с клетками, которые записываются вместе с луч позиции в хронологической последовательности.- Использовать плагин IBA-J для сортировки событий в зависимости от их типа: передается энергией ионов (СТИМ), рассеяния энергии ионов (RBS) или энергии фотона рентгеновские (PIXE). Затем обрабатывать отдельно каждого типа данных.
- Вычислить плотность карта СТИМ
- Рассчитать средний рентгеновских фотонов энергетические спектры и определить для каждого химического элемента энергии окна для получения элемент пространственного распределения.
- Определить регионы интереса (ROI) (например отдельные клетки, плотная структура, агрегаты, и т.д.) и рассчитать соответствующие рентгеновских спектров.
- Анализ соответствующих спектров СДРес для того чтобы рассчитать общее количество инцидентов частиц25.
- Установите рентгеновские спектры с использованием программного обеспечения Gupix26 с целью определения концентрации элемента для каждого ROI.
Примечание: Типичный предел обнаружения (LOD) для метода находится в диапазоне 1-10 мкг/г-1 в сухой массы в зависимости от Атомный номер элементов (LOD уменьшается с Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Культура клеток и флуоресценции изображений дневно обозначенные Тио 2 NPs
Мы разработали держатель образца, адаптированные для культуры клеток, клеток обработки, а также смешанных анализ. В частности важно, что держатель допускается обычной оптической микроскопии также ядерной рентгенофлуоресцентного анализа и обработки изображений. Этот держатель образца на основе фольги поликарбоната толщиной 2 мкм, хранение на раме PEEK. Клетки непосредственно выращенных на поликарбонат, в условиях стерильной культуры на несколько дней и затем используется для различных экспериментальных параметров, таких как воздействие NPs.
Химической модификации поверхности с флуорофоров (TRITC) позволило обнаружения TiO2 NPs, а также их in situ и в пробирке локализации в жизни или в фиксированной клетки, с помощью микроскопии флуоресцирования параформальдегида. Клеточное ядро и митохондрий окрашивали с использованием жизненно краситель Hoechst33342 (синий для ядра) и transfected матрица roGFP (зеленый для митохондрии), соответственно. Это несколько пятнать разрешено внутриклеточной локализации TRITC-TiO2 NPs (его красный, испуская флуоресценции) 20 h после воздействия. НПС были отмечены только в цитоплазме клеток подвергается с без обнаружения в ядре. NPs были случайным образом локализованы в perinuclear регионе цитоплазмы и полностью исключены из митохондрий (отсутствие дублирования между TRITC и GFP сигналов).
Хотя микроскопии флуоресцирования очень полезен для локализации NPs внутри клетки подвергаются, это не смогли оценить точное количество NPs в ячейке. Основная трудность микроскопии флуоресцирования, относительно количественной оценки NPs связан с неопределенность (i количество флуорофоров, присоединяется к заданным NP и отбеливания стабильности выбранного Флюорофор во время наблюдения и (ii агрегирование состояние NPs внутри клетки.
Рисунок 1 : в vitro и in situ флуоресценции imaging трансгенных клеток U20S, выражая матрица-RoGFP и подвержены TRITC-Тио 2 NPs. U2OS клетки (вверху) матрица roGFP (зеленый), отмеченные Hoechst33342 (синий), подвергаются 4 µg.cm-2 TRITC-меченых TiO2 наночастиц (красный) для 20 h. наблюдения показывают, что TiO2 NPs агрегатные в ячейках perinuclear региона. Линейки: 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Чтобы преодолеть эти недостатки, ядерных рентгенофлуоресцентного анализа techniquesprovide взаимодополняющего подхода к обычной оптической микроскопии вследствие их чувствительность к NPs, который предотвращает использование каких-либо промежуточных сигнала как флуоресценции от привитого краситель. Кроме того они также являются полностью количественных, предоставление данных о (i) субклеточном биохимических содержание, которое в противном случае неизвестен и (ii внутриклеточных количество NPs на уровне отдельной ячейки.
Cryofixation клеток после живой съемки.
Высоким ограничением в ядерной рентгенофлуоресцентного анализа является работают в условиях вакуума. Мы разработали протокол фиксации клетки, позволяя сохранение биологических Ультраструктура и биохимические целостности биологического образца. Химическая фиксация известен для изменения элемента trace состав клеток, потому что он требует замены их клеточной среды полимер используется для сохранения сотовой Ультраструктура. Кроме того, удаление воды также выпускает свободные ионы и других видов, который изменяет общий образец композиции. Следовательно она становится обязательной уделять первоочередное внимание физической фиксации метод, особенно криогенных методов. Эти криогенных процедуры вызывают быстрое прекращение клеточную активность, и это, в масштабе времени миллисекунду.
Микроскопия ядерной рентгенофлуоресцентного анализа и количественной оценки NPs на клеточном уровне.
Сканирования передачи ионная микроскопия (µ-STIM) и частица индуцированной рентгеноструктурного анализа выбросов (µ-PIXE) были выполнены на образцах после cryofixation и обезвоживания для получения точных количественных данных о их элементарного химического состава.
µ-STIM изображения показали местные различия в плотности и позволяет обнаружения клеточных структур таких как ядра и цитоплазмы. Хотя резолюции боковых луча позволяет наблюдение за плотной структуры как узкие, как 300 Нм широкий, как тонкий агрегатов видимые здесь в цитоплазме, STIM методы не может различать NP агрегатов и других плотных клеточных структур. Это потому что, как и для просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА), физический процесс, ведущий к вариации в передаваемой энергии взаимодействия входящих иона с облаком атомных электронов. В отличие от анализа ТЕА однако, потому что объем всей ячейки анализируется, местные толщина вариации предотвращения дискриминации между структурами high-Z и локальное увеличение плотности клеточных.
Рисунок 2 : Изображения плотности и элементарного распределения полученных µ СТИМ и µ-PIXE на крио Исправлена U2OS клетки. U2OS управления клетки (вверх) по сравнению с подвергаются крио Исправлена U2OS клетки (подвергается 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, вниз) и отметил использование ядерных рентгенофлуоресцентного анализа/микроскопия. STIM микроскопии (слева, серого карты) показали плотной внутри или загородный cellular структур (ядро, соль агрегатов наночастиц). Пространственное разрешение (300 Нм) сопоставима с флуоресцентной микроскопии и показывает структуры, как агрегатов НП в регионе perinuclear. Выявление структуры, основанные лишь на их плотность тем не менее может быть неоднозначным. Элементаль карты µ-PIXE K, P и Ti (тепловой цветовая шкала) дополняют µ-STIM карты. Они могут использоваться для обеспечения присутствия ЯИЭ в клетках. Каждая ячейка может быть индивидуально проанализирован с точки зрения концентрации элемента (см. рис. 3). Масштаб бары: 10 мкм. цветовые шкалы в диапазоне от минимального (синий) до максимальной интенсивности (серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Как показано на рисунке 2, µ-STIM рендеринг позволяет признание отдельных ячеек в как населения, так и внутриклеточных суб отсеков ядрышко и ядро. К сожалению и, как упоминалось ранее NPs может не всегда быть обнаружить с помощью µ-STIM реконструкции.
Частицы индуцированной рентгеноструктурного анализа выбросов (µ-PIXE) обеспечивает не только химический состав образца, но и их элементного сопоставления (рис. 2). Во время взаимодействия с захватывающий луч химические элементы проходят атомной процессов возбуждения де возбуждения, которые в конечном итоге привести к выбросам фотон, которая exhibits характерные энергии Атомный номер элемента возбужденных. Спектр характерных пик построен из суммы всех событий, излучаемых фотонов и считается химические подписи образца.
Стандартный экспериментальных установок и детекторы, используемые для µ-PIXE экспериментов позволяют одновременное количественная оценка всех элементов тяжелее, чем Na с лимитом 1 до 10 мкг/г сухой массы обнаружения−1 . Точность измерения концентраций элементарного обычно ограничивается примерно 20% за счет эффективности сбора и детектор заряда.
В этом исследовании распределение элементов как калий и фосфор и количественно внутриклеточных количество TiO2 NPs с сопоставлением титана наблюдается ядерных рентгенофлуоресцентного анализа. Химический элемент карты вычисляются после того, как фотоны сортируются согласно луч позиции на время записи и выбор окна энергии вокруг определенного элемента. Карты являются представитель количество обнаруженных событий в положении луч и количественные. Уровень шума и фона численно моделируется и отфильтрованы. Кроме того химического сопоставления может использоваться для извлечения местного PIXE спектр, необходимый для количественной оценки.
Как показано на рисунке 2, фосфора содержанием однородно распределяется в камере с, как и ожидалось, гораздо более высокой концентрации в ядерной области. Калия однородно распределяется в объем ячейки. Титан расположен в регионе цитоплазматических perinuclear в виде агрегатов, как ранее отметил, с помощью микроскопии флуоресцирования (рис. 1). Сервер политики сети отображается же perinuclear локализации независимо от состояния их поверхности: функционализированных (рис. 1) или родной (рис. 2). Тем временем никаких следов титана был обнаружен в клетках управления, подтверждающий, что распределение титана наблюдается µ-PIXE должна быть возложена на TiO2 NPs, по согласованию с нашего предыдущего анализа в микроскопии флуоресцирования.
Кроме того как показано на рисунке 2, можно извлечь внутриклеточного распределения NPs и количественные NPs концентрации из конкретных регионов, представляющих интерес. Основываясь на картах СТИМ и в корреляции с распределениями фосфора/калия, возможен анализ одной ячейки.
Рисунок 3 : Одну ячейку количественный анализ с помощью µ-PIXE. Для определения концентрации элемента на клеточном уровне могут быть установлены отдельные рентгеновских спектров рассчитаны для клеток, показан на рисунке 2 . Эта функция особенно интересна для анализа НП где сотовая концентрации обычно показывают сильные вариации внутри той же самой популяции. Например для того же означает экспозиции, диапазон концентраций Ti от 0,2 до 1.8 µg.cm-2. Элементы управления соответствуют необработанных клеточных популяций. Экспозиционная доза: 4 µg.cm-2. Boxplots представляют собой распределения концентраций отдельных клеточных с значение медианы (горизонтальная линия) и бары сторону высокиx и низкиx измеренных значений. Контроль клетки: N = 14; Воздействию клетки: N = 16.
Соответственно мы не только количественно среднее содержание титана в популяции клеток, но также показано распределение титана в клетку в одной популяции в конкретных экспериментальных состоянии. Среднее содержание титана, измеряется здесь является довольно низким (500 ng.cm-2) по сравнению с 4 µg.cm-2 Экспозиционная доза клеток населения (рис. 3) и вариации между ячейками большой (Ti концентрации варьируются от 0,2 до 1,8 µg.cm -2 согласно анализируемого клетки). Мы также заметили увеличение внутриклеточных ионов калия и кальция в выставленных образцов, предлагая сотовой изменения гомеостаза, вызванных наличием TiO2 NPs, как описывалось ранее несколькими авторами. 21 , 27
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем метод предоставления полезной информации за пределы возможно с другими методы визуализации, особенно на субклеточном уровне. В дополнение к способность изображений ядерных рентгенофлуоресцентного анализа также предлагает возможности количественной оценки химических элементов ввода в состав биологических образцов. В настоящей работе мы изучили человека клеточных популяций и сосредоточено до анализа выбранного региона интерес, на основе одной ячейки подвержены TiO2 NPs. Его сочетание с другими методами обеспечивает морфологических сотовой изображения и точные количественные данные элементарного химического состава.
Чтобы успешно применить ядерные рентгенофлуоресцентного анализа, это обязательно соблюдать следующие моменты, чтобы избежать потенциальных ошибок. Во-первых крайне важно использовать криогенные протокол для фиксации ячейки для того, чтобы сохранить его Ультраструктура и биохимические целостности. Во-вторых это также обязательным для выполнения анализа тонких образцов с толщиной ниже 20 мкм. При необходимости, секционирование образцов cryofixed может быть выполнена. Абсолютно образцы должны храниться замороженные. В-третьих важно также иметь в виду, что ядерные рентгенофлуоресцентного анализа показывает представление двумерных биологических образцов. Таким образом химический элемент распределения полученного является двумерной проекции, что возможно предусмотреть недоразумения. Это ограничение будет обойдена в будущем с помощью томографических приобретения.
Ядерные рентгенофлуоресцентного анализа также имеет ограничения. Он должен подчеркнуть, что главным препятствием является необходимость выполнения анализа под вакуумом. Таким образом крайне важно использовать протоколы клетки фиксации, которые сохраняет ультраструктуру клетки и биохимических целостности. Поэтому необходимо проверить сопротивление биологических образцов в криогенике процедуру (без добавления химических смолы). Это может ограничить использование ядерных рентгенофлуоресцентного анализа.
Еще одним ограничением является доступность для удобства для проведения ядерных рентгенофлуоресцентного анализа. Назначенные луч раз иногда таким образом ограничены, и это дополнительное ограничение для такого рода времени эксперимент. Несколько часов часто требуются для приобретения одного.
Этот метод отличается от других аналитических методов, включая микроскопии, масс-спектрометрия (МС), индуктивно сочетании плазмы мс (ICP-MS), жидкостной хроматографии мс (LC - MS) и радиоактивных изотопов. Последний действительно используются для оценки клеточного дозы химических элементов, но только они способны предоставить информацию на макроскопическом т.е. масштаб на макроскопическом количество образца. Никто из них не может дать доступ, как ядерная рентгенофлуоресцентного анализа, для точного обнаружения и отображение субцеллюлярные дозы конкретных химических элементов (ионы, металла или металлических оксидных NPs). Эти данные помогают, доступа к дальнейшее систематическое изучение оценки доза ответ.
Точные оценки дозы при изучении интернализации NPs в клетках имеет решающее значение как количественные NP токсикологии и фармакологии точек зрения. Как это было предложено большое расхождение в наблюдаемых содержимое НП, который показывает десятикратного разница между минимумом и максимумом в концентрациях (рис. 3), средняя концентрация клеточного не может быть соответствующего параметра для описания феномен воздействия частиц. Это особенно верно, когда пороговый эффект должен занять место, потому что неоднородных доза облучения может привести к противоречивым наблюдений. Так как фракционированный характер наночастиц появляется четко на клеточном уровне, это исследование поэтому снова ставит вопрос о значимости методы, основанные на анализе глобальных переменных при решении вопросов вокруг поведение клеток, подвергается неоднородное дозы загрязняющих веществ.
Как показано в случае здесь учились, наблюдения и количественной оценки ЯИЭ в отдельных ячейках позволяют нам лучше понять биоаккумуляции внутренних/внешних элементов, таких как оксид металла NPs. Это критические задачи для дальнейшего применения ЯИЭ в биомедицине, где плохое понимание лежащих в основе распределения НП в клетках может привести к неверно результаты.
Этот протокол выделяет пригодности использования ядерных рентгенофлуоресцентного анализа с другими методами для будущих оценок NP взаимодействий с биологических образцов. Количественный подход обеспечивает информацию о влиянии таких ЯИЭ с точки зрения обнаружения, идентификации, локализации и количественная оценка на уровне одной одной ячейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим ограниченный Serge за руководство и редактирования видео. Французский национальный исследовательское агентство поддерживает программу исследований TITANIUMS (НРУ КЕС 2010, n ° CESA 009 01). CNRS и Европейское сообщество как интеграция деятельности представила «поддержка из общественных и промышленных исследований с использованием Ион луч технологии (дух)» под EC контракт n ° 227012. Эта работа была поддержана Мари Кюри действия - начальной подготовки сети (ОИС) как «интеграции деятельности поддержку последипломного исследований с стажировки в промышленности и подготовки передового опыта» (СПРАЙТ, D1.3) по контракту № 317169 ЕС. C'NANO Grand Sud Ouest и региона Аквитания поддерживают программы исследований TOX-NANO (n ° 20111201003) и программа исследований POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , Elsevier Ltd. (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
