Summary
Vi beskriver en prosedyre for påvisning av kjemiske elementer stede i situ i menneskeceller samt kvantifisering i vitro . Metoden er velegnet for en celle type og er spesielt nyttig for kvantitative kjemiske analyser i enkeltceller etter i vitro metalloksid nanopartikler eksponering.
Abstract
Mikro-analytiske teknikker basert på grunnstoff imaging Aktiver lokalisering og kvantifisering av kjemiske sammensetning på cellenivå. De tilbyr nye muligheter for karakterisering av levende systemer og er spesielt passende for å oppdage, lokalisere og kvantifisere tilstedeværelsen av metalloksid nanopartikler både i biologiske prøver og miljø. Faktisk oppfyller disse teknikkene alle relevante krav i form av (i) følsomhet (fra 1 til 10 µg.g-1 på tørr masse), (ii) mikrometer utvalg romlig oppløsning og (iii) flere elementer gjenkjenning. Gitt disse egenskapene, microbeam grunnstoff bildebehandling kan kraftfullt utfylle rutinemessig Bildeteknikker som optisk og fluorescens mikroskopi. Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en kjernefysisk microprobe analyse på kulturperler celler (U2OS) utsatt for titandioksid nanopartikler. Cellene må vokse og utsettes direkte i en spesialdesignet eksempel holder brukes på optisk mikroskopet og de kjernefysiske microprobe analyse stadiene. Spranget frostvæske kryogene fiksering av prøvene beholder både mobilnettet organisasjonen og grunnstoff distribusjon. Samtidige kjernefysiske microprobe analyse (skanning overføring ion mikroskopi, Rutherford backscattering massespektrometri og partikkel indusert X-ray utslipp) utføres på prøven gir informasjon om mobilnettet tetthet, lokal distribusjon av grunnstoffene, i tillegg til mobilnettet innholdet i nanopartikler. Det er et økende behov for slike analyseverktøy biologi, spesielt i fremvoksende sammenheng med Nanotoxicology og Nanomedicine som vår forståelse av samspillet mellom nanopartikler og biologiske prøver må utdypes. Spesielt som kjernefysisk microprobe analyse ikke krever nanopartikler skal merkes, er hydrogenion krillens kvantifiserbare ned til enkeltcelle nivå i en celle befolkningen, uavhengig av deres overflate tilstand.
Introduction
Mobilnettet homeostase bestemmes av opptak kontroll, assimilering og intracellulær lokalisering av ulike sporstoffer (ioner, metaller, eksogene uorganiske forbindelser). Disse komponentene er ofte i form av spor, men likevel kan ha en betydelig innvirkning på systemet fysiologi. Dermed er studiet av cellen biokjemi både normal og patologisk/stresset situasjoner en nøkkel-skritt mot en helhetlig forståelse av mobilnettet metabolske mekanismer. Derfor blir utviklingen av tenkelig og analytiske teknikker slik at etterforskningen av intracellulær kjemiske krillens, strukturelle organisasjon og sine metabolske funksjoner nødvendig. Svært få metoder er kjøpedyktig skaffe en i situ kvantitative opplysning om generell kjemisk natur et gitt utvalg. Bortsett fra metoder analysere prøver i skjemaet bulk, i situ analyser vurdere biologiske prøver i deres integrality uten å miste og strukturelle informasjon, dermed bevare deres konstituerende kjemikalier (sporstoffer og ioner) og proteiner. Videre, som nanosciences fortsetter å utvikle, forbedret bildebehandling og analytiske metoder for miljøovervåking i mobilnettet skala vil være nødvendig å observere og kvantifisere nano-objekt atferd og interaksjoner. 1
Nanopartikler (NPs) er definert som objekter viser minst én ansikts dimensjon i område 1 og 100 nm. 2 på grunn av bestemt mekanisk-egenskaper, NPs er mye brukt i industrien. NPs er ansatt i bio-programmer og nanomedicine. 3 , 4 til tross for mange mekanisk-egenskapene til NPs, kan de genererer noen risiko for uønskede effekter på helse og miljø. Disse risikoene kan indusert ved både langvarig og repeterende eksponeringer på ulike konsentrasjon nivåer og dette har ennå ikke blitt klart etablert. 5 , 6 , 7 , 8 spesielt skjebnen til NPs inne celler og tilknyttede mobilnettet svarene er hittil ikke fullstendig beskrevet. Dette er delvis på grunn av knapphet på metoder som gjør oppdagelsen og kvantifisering av internalisert NPs i en enkelt celle. 9
De klassiske analyseverktøy som brukes til å beregne mobilnettet dosen av nanopartikler er microscopies, massespektrometri (MS), kombinert Induktivt plasma MS (ICP-MS)10,11 og flytende kromatografi MS (LC-MS), men de bare gir nyttig informasjon på makroskopisk skala. Ingen av dem kan gi en nøyaktig vurdering av subcellular NPs innholdet eller NPs distribusjon uten bruk av fraksjoneres metoder. En systematisk vurdering av dose-respons er derfor umulig med disse metodene, i motsetning til metoder basert på Atom spektroskopi som kjernefysisk microprobe analyse12,13, synchrotron X-ray fluorescens mikroskopi14 , og sekundære Ion massespektrometri (SIMS). 15 , 16 disse metodene er spesielt interessant som de utfyller observasjoner med fluorescens mikroskopi, spesielt når NPs ikke merkes med fluorescerende molekyler og er dermed studerte i sin opprinnelige tilstand. I noen grad, selv når NPs er podet med fluorophores, fortsatt (i) kvantifisering vanskelig fordi merking per NP er ukjent og (ii) kjemisk endring av NP overflaten kan endre mobilnettet distribusjon.
I denne artikkelen vi fokusere på en metode basert på en kombinasjon av kjernefysiske microprobe teknikker sikte på imaging morfologi og elementær sammensetning av biologiske prøver i store, små, og spore konsentrasjoner.
Kjernefysiske microprobe analyse viser seg for å være spesielt egnet for måling av kjemiske sporstoffer i biologisk vev. Både strålen lateral oppløsning (0,3 til 1 µm) og følsomhet i grunnstoff gjenkjenning (fra 1 til 10 µg.g-1 tørr masse) er godt egnet for studier på cellenivå. Kjernefysiske microprobe teknikker er basert på partikler gjenkjenning (fotoner, elektroner, ioner) slippes ut etter ion strålen (vanligvis kjører på MeV energier) samhandler med atomer i utvalget. Samhandlinger som oppstår i cellene er hovedsakelig: 1) eksitasjon/ionisering atomer etterfulgt av et utslipp av fotoner etter atomer tilbake til grunnleggende tilstand; og 2) spredning av innkommende partikler fører til endring i sin energi og retning. Måling av slippes ut partikkel energi allowsthe identifikasjon av atomer som er involvert i interaksjonen. For å utføre kartlegging av elementer, skannes ion microbeam gjentatte ganger over eksempel overflaten, ofte over et område på ca 100 av 100 µm2 som inneholder flere celler. Slippes ut partikler oppdages og energi er registrert for hver bjelke posisjon. Sortering av partikler i henhold til strålen posisjon, er således identifiserte strukturen ansvarlig for utslipp av slike partikler målet med behandling av personopplysninger. Her beskriver vi nettopp tilnærming basert på fluorescens mikroskopi og kjernefysiske microprobe analyse å merker samt å kvantifisere eksogene NPs på mobilnettet og sub mobilnettet skalaer, for å undersøke konsekvensene av NP interaksjon med levende systemer. Vi skal spesielt fokusere på mulighetene som tilbys av denne metoden i i situ kvantifisering av titandioksid nanopartikler (TiO2 NPs) aggregater på subcellular nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sample Holder forberedelse
-
Eksempel holderen design og forberedelse
- Produsere en prøve holder ved å bore et 5 x 5 mm kvadrat i 1 mm tykk titt ramme.
- Rent av skylling med etanol 70% (v/v) og holde i sterilt plater til klar til bruk.
Merk. En eksempel holder passer for cellekultur og cellen håndtering er nødvendig. Det må være utformet for celle dyrking, i vitro observasjoner med optisk mikroskopi, og kjernefysiske microprobe analyse og bildebehandling. Denne holderen er laget av en titt ramme13.
- Eksempel holderen forberedelse
- Forbered den Formvar løsningen ved oppløsning 1 mg av Formvar pulver i 100 mL kloroform.
- Strekke polykarbonat folien på en metallisk rammen slik at det gir noen ganger.
- Bruk en steril tips for å spre Formvar løsningen rundt eksempel holderen hullet.
- Sette ned delikat utvalg holderen med lim på strukket polykarbonat folien (en 5 x 5 mm firkantet).
- Gjenta forrige sekvens for å forberede en prøve abonnent hver replikere.
Merk. Polykarbonat (PC) filmen er biokompatible, tykk nok og motstandsdyktig mot forskjellige protokoller og analytisk begrensninger.
Forsiktig- kloroform er giftig. Unngå innånding, inntak eller kontakt med huden. Bruk alltid fungerende kjemiske avtrekksvifte og riktig filtre.
- Eksempel holderen sterilisering
- Plass montert prøven holderen i en konisk bolle med 50 mL av etanol 70% (v/v) under omrøring på 180 rpm og +37 ° C over natten, bruker en inkubator/agitator.
- Skyll abonnenten flere ganger i sterilt destillert vann.
- Luft tørke dem i sterile forhold og utsette dem for ultrafiolett lys (bakteriedrepende lampe fra biosikkerhet benk, klasse II) i 30 minutter på hver side.
- Holde eksemplene i sterilt 12-vel plater (ett utvalg holderen per brønn) til klar til bruk.
Merk: Flere prøven holdere kan lagres ved romtemperatur i steril 12-vel plater forseglet med parafilm i flere dager.
2. vekst av celler i passende eksempel holderen.
Forsiktig: Protokollen må utføres i en biosafety laminær strømning benk (klasse II) å utelukke skadelige mikroorganismer. Håndtere antibiotika (f.eks penicillin, streptomycin) med hansker. Respekterer fremgangsmåter ved håndtering av biologisk materiale (cellelinjer, genmodifiserte avledet menneskelige celler).
Kritisk: cellelinjer brukes bør kontrolleres slik at de ikke er infisert med Mycoplasma.
- Transfect U2OS celle linje med plasmider bærer Matrix-roGFP 17,18,19 bruker en transfection metoden i henhold til protokollen fastsatt av produsenten.
- Å bekrefte hva med plasmider-gjennomføring av biosensor og for å hindre tap av plasmider, velge og opprettholde transfekterte cellene i den aktuelle kultur mediet.
- Visualisere transfekterte celler av fluorescens mikroskopi å sikre transfection oppstod og bekrefte uttrykk for fluorescensen og visning av en reticular og rørformede mitokondrie nettverk19.
Pause punkt: Cellene kan fryses i flytende nitrogen i flere år. - Bruke transfekterte celle befolkningen ved dyrking cellene i et passende medium for å få sub confluent celle populasjoner. Vokse celler ved 37 ° C, 5% (v/v) CO2 i en mettet vann atmosfære.
- Frø celler i en konsentrasjon, som de er på 80% samløpet dag fiksering. Vanligvis brukes en konsentrasjon av 500 celler per µL. Høste celler med 400 µL av Trypsin-EDTA 0,25% (v/v) og holde i 3 minutter på 37 ° C. Stoppe trypsin handlingen med 1 mL av kultur medium. Pellets cellene med sentrifugering i 5 min på 230 x g og 4 ° C, deretter fjerne nedbryting, og legg det ønskede volumet av frisk kultur medium.
Merk. Protokollen gjelder for alle cellular antallet celler seeded er avhengig cellestørrelsen og celle dobling tid.
Forsiktig: Unngå å utsette trypsin, antibiotika og serum for gjentatte fryse-Tin sykluser. Holde dem sterile. Dele lager løsningen i dele og fryse dem på −20 ° C. Lagre dele før utløpsdatoen. Nøye skyll celle pellet for å fjerne trypsin. Spor av gjenværende trypsin vil forsinke og redusere plating effektiviteten. - Telle celler og utføre en fortynning med fersk fullstendig kultur medium holdt på 37 ° C for å få en celle hjuloppheng med 500 celler per µL.
Merk: Konsentrasjonen av cellen suspensjon har tilpasses som en funksjon av hvilken celle for å plate en 40 µL dråpe. - Plate en 40 µL slipp på midten av polykarbonat folien. Forsiktig plassere utvalget for 2t ved +37 ° C, 5% (v/v) CO2 i en mettet vann atmosfære.
Kritisk: Når prøven er plassert i inkubator, begrense så mye som mulig alle mekanisk bevegelse til fordel rask celle vedlegg. Etter hvilken celle, kan det være nødvendig å ruge celler lengre enn 2t for optimal platting effektivitet. Sjekk mettet at inkubator atmosfæren er godt for å hindre drops fordamper. - Kontroller at cellene er godt festet på polykarbonat folie bruker en optisk mikroskop. Forsiktig legge 2 mL av fersk komplett medium og holde for 24 timer.
3. nanopartikler forberedelse og eksponering
Merk: Fluorescerende fargestoff endret TiO2 NPs ble utformet, syntetisk og kjemisk endret med tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC). 20 , 21 denne overflaten endringen kan hydrogenion gjenkjenning, sporing og lokalisering i situ og i cellulo i både levende og fast celler eller i multicellular organismer. 12 , 13 , 18
Forsiktig: Nanomaterialer og nanopartikler må håndteres med forsiktighet. Unngå innånding, inntak eller kontakt med huden. For å hindre spredning i luften, vedlikeholdes nanopartikler i løsning (ultrapure vann).
- Forberede en suspensjon av 1 mg.mL−1 avTiO2 NPs i ultrapure vann. Spre TiO2 NPs med intense 1-min sonication pulser på RT (750 W, 20 kHz, amplitude: 30%) med en ultra lyd generator og en dedikert koniske microprobe.
- Fortynne TiO2 NPs på ønsket konsentrasjonen i kultur medium for å få en eksponering suspensjon av 4 µg.cm2 (siste konsentrasjon). Erstatt medium med riktig volumet av middels inneholder NPs på celler og bland forsiktig for homogen distribusjon av TiO2 NPs. Forbered kontroll celler på samme måte uten tilsetning av TiO2 NPs.
- Inkuber celle populasjoner 24 h 37 ° C, 5% (v/v) CO2 og en mettet vann atmosfære.
4. paraformaldehyde fiksering og fluorescens mikroskopi.
- Utarbeide en fersk løsning paraformaldehyde løsning (PFA, 4% w/v) bufret i fosfat Buffer saltvann (PBS, pH 7.4).
- Oppløse 4 g PFA pulver i 100 mL PBS. Varme løsningen til 65 ° C under omrøring med en magnet og en magnetisk rørestang i avtrekksvifte. Øke pH ved å legge til 1 M NaOH en dråpe om gangen til løsningen fjerner. Cool løsningen til romtemperatur og justere pH 7,4. Bruke nylagde løsningen umiddelbart eller holde på 4 ° C og beskytte mot lyset.
Merk: Pre-laget PFA løsninger kan brukes imidlertid en extemporaneous utarbeidelse av PFA garanterer bedre fiksering kvalitet og langsiktig bevaring av fast prøvene.
Forsiktig: PFA er giftig; Unngå innånding, inntak eller kontakt med huden. Bruk alltid fungerende kjemiske avtrekksvifte og riktig filtre.
- Oppløse 4 g PFA pulver i 100 mL PBS. Varme løsningen til 65 ° C under omrøring med en magnet og en magnetisk rørestang i avtrekksvifte. Øke pH ved å legge til 1 M NaOH en dråpe om gangen til løsningen fjerner. Cool løsningen til romtemperatur og justere pH 7,4. Bruke nylagde løsningen umiddelbart eller holde på 4 ° C og beskytte mot lyset.
- En gang, inkubasjon tiden har gått, fjerne celle kultur mediet som inneholder TiO2 NPs. skyll celle populasjoner gang med fersk kultur medium og med PBS (2 mL). Fjern PBS, skyll raskt med en aliquot av frisk og kalde PFA (4% w/v, 4 ° C).
- Legge til PFA (2 mL, 4% w/v, 4 ° C). Inkuber 15 min ved romtemperatur.
- Fjern PFA, skyll cellene med PBS (2 mL, 3 ganger, 5 min) under omrøring.
Pause punkt: Disse kjemisk fast prøver kan brukes for "stupe-fryser" prosedyren etter fluorescens imaging (gå å trinn 5) eller brukes bare til fluorescens imaging (gå for å gå 4.3).
- Stain kjernen med Hoechst33342 rugende celler for 10 min i PBS. Hoescht33342 brukes på en siste konsentrasjon av 500 nM. Etter inkubasjon fjerne løsningen og skyll med PBS.
Forsiktig: Hoechst33342 celle permeant og kan være giftig. Unngå direkte kontakt, og bruke hansker mens forbereder og bruke Hoechst33342.
Kritisk: sikre at Hoechst33342 flekk løsning er ferskt tilberedt og vedlikeholdes i sterile forhold. - Prosessen fast prøver for i situ og enkelt celle bildevisning fluorescens mikroskopi (figur 1).
5. "stupe-frysing" fiksering og dehydrering
- Forberede en aluminiumsplate overføring ved å kjøle den i flytende nitrogen. Butikken platen i en boks fylt med flytende nitrogen og opprettholde tallerken overflaten over væske i den kalde nitrogen dampen.
Merk: Overføre platen kan være laget av en metallisk plate (her, vi brukte aluminium) som kan være nedkjølt flytende nitrogen temperatur, og som kan angi fryse-tørker eksempel kammeret.
Kritisk: Boksen bør holdes lukket så mye som mulig for å hindre vanndamp avsetning på kald tallerken overflaten. Prøven lagret på platen under forberedelse bør ikke dekkes av flytende nitrogen. - Skyll celler i kultur medium og deretter to ganger, kort, i sterilt og ultrapure vann for å bli kvitt alle spor av gjenværende ekstracellulære salter.
Kritisk: Kontroller at media er ferskt tilberedt og vedlikeholdes i sterile forhold. Varme alle medier på 37 ° C før den brukes. Skylling må være svært korte (noen få sekunder) og overflødig væske på prøvene fjernet så fort som mulig. - Spranget frostvæske cellene ved-150 ° C i flytende nitrogen-kjølt 2-methylbutane under 30 s og sted overføre dem til aluminium plate. Lagre prøver her under utarbeidelsen av alle andre prøver. Når prøvene er alle cryofixed, overføre all-at-once ved å plassere overføring platen i fryse-tørker.
Kritisk: Hele cryofixation prosessen bør ikke vare mer enn 20 min for å hindre strukturelle endringer skal vises i prøver midlertidig lagret i boksen overføring. - Freeze-Dry eksemplene bruker følgende sekvenser: 1) utføre en primær uttørking for 12 til 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) på lavtrykk og lav temperatur, så 2) utfører en sekundær uttørking fase for minst 24 h, øke plate temperaturen å + 40 ° C samtidig trykket lavt (+40 ° C, 10-3 mbar).
Forsiktig: Flytende nitrogen er svært kaldt og kan forårsake alvorlige frostskader eller øye skade ved kontakt. Bruk tilpasset benk toppen beholdere for transport og ha sikkerhetsutstyr (kryogene hansker, øye og ansikt beskyttelse).
Forsiktig: 2-Methylbutane er ekstremt brannfarlig. En skadelig forurensing av luften kan nås ganske raskt på fordampning av dette stoffet på +20 ° C. Unngå innånding, inntak eller kontakt med huden. Bruk puste og vernebriller og vernehansker. Bruk alltid fungerende kjemiske avtrekksvifte. Lagres på 4 ° C.
Kritisk: Bruke en passende termometer (-150 ° C) å overvåke temperaturen 2-Methylbutane under "Stupe-fryser" økten. 2-methylbutane må holdes kjølig i flytende fase. Overfører cryofixed prøver å ambient atmosphere kan forårsake cellular skade på grunn av temperaturen økes eller vanndamp kondenserende på prøven overflaten. Følgelig overføringen skal utføres så fort som mulig (30 s)
Pause punkt: Etter cryofixation, kan prøver lagres ved romtemperatur i flere dager i steril forhold (beskyttet mot støv og fukt). Nøye håndtere prøvene med fine tang og plassere dem i en steril 12-vel plate forseglet med parafilm. Tørkemiddel kan brukes å tørke atmosfæren.
6. kjernefysiske Microprobe analyse
Merk: Kjernefysiske Microprobe analyse ble gjennomført microbeam linjen av AIFIRA (applikasjoner Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions no Région Aquitaine) ved hjelp av komplementære ion strålen analytiske teknikker partikkel indusert X-ray utslipp (μ- PIXE) og skanning overføring Ion mikroskopi (μ-STIM). Anlegget er basert på en 3,5 MV Partikkelakseleratoren levere lys ion bjelker i området MeV energi. 22 , 23
Pause punkt: AIFIRA er en ion strålen anlegget drives av universitetet i Bordeaux som gir tilgang til nasjonale og internasjonale grupper etter vitenskapelig evaluering av foreslåtte eksperimentet.
- Montere titt eksempel innehaverne på en apertured plate med dobbeltsidig tape.
- Plass platen støtter utvalg i et loddrett plan vinkelrett strålen retning.
- Lukk analyse kammeret og vakuum analyse kammeret.
- Skanning overføring Ion mikroskopi (μ-STIM)
Merk: STIM brukes til å registrere områdetetthet kart av cellene etter konvertering av energi tapet til mobilnettet masse, utnytter det faktum at energi tapet er proporsjonal med eksempel områdetetthet (uttrykt i µg.cm-2).- Bruke en 2 MeV Helium (han+) microbeam som en sonde med en størrelse i fokalplanet rundt 300 nm i diameter og lav flyt (2000 ions.s-1). Mål energien på de overførte ionene med en plan silisium detektor (PIPS detektor, 25 mm2, 11 keV energi oppløsning @ 5.4 MeV) plassert bak eksemplet i strålen aksen.
- Partikkel indusert X-ray utslipp (μ-PIXE) og Rutherford Backscattering massespektrometri (μ-RBS).
Merk: μ-Pixe og μ-RBS analyser gi romlige fordelingen og kvantifisering av grunnstoff med sub mikrometer oppløsning.- Bruk en 1,5 MeV proton (H+) microbeam (50-150 pA), fokusert til en diameter på 1 µm og skanning over de samme cellene rundt oppdaget av STIM fra 4 til 8 timer og rundt 100 x 100 µm2.
- Samle indusert X-ray fotoner slippes ut fra atomer i prøven (tyngre enn Na) ved en høy oppløsning Si(Li) SSD detektor (145 eV energi oppløsning, @Mn-Kα) på 45 ° fra innkommende strålen akse. Bruk oppdaget Foton energi for å identifisere emittere (f.eks Z av element) og X-ray intensitet for å bestemme konsentrasjonen element.
- Samtidig samle tilbake-spredt protoner ved-135 ° med en silisium-detektor (delvis utladet detektor, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5.4 MeV) å måle antall innkommende partikler og normalisere X-ray intensiteter.
Kritisk: En samling av sertifisert kalibrering standarder for Atom konsentrasjon kvantifisering brukes for å kalibrere X-ray detektor svaret. Referansemateriale er en samling av tynne Atom filmer avsatt på 6,3 µm tykk Mylar-folier. Slippes ut X-Ray energier varierer fra 0,6 (Li, K line) til 20.2 keV (Rh, K linje).
7. dataanalyse
- Rekonstruere kjemiske grunnleggende kart med IBA-J plugin for ImageJ. 24
Merk: Dedikert programvare i form av en plugin for ImageJ er utviklet for å behandle raw kjernefysiske microprobe analyse data. Rå data samsvarer med en liste over hendelser som oppstår fra partikkel strålen interaksjon med celler som registreres sammen med som en kronologisk rekkefølge strålen.- Bruke IBA-J plugin for å sortere hendelsene etter deres type: overføres ion energi (STIM), backscattered ion energi (RBS) eller X-ray Foton energi (PIXE). Deretter behandle separat hver type data.
- Beregne STIM området tetthet kart
- Beregne gjennomsnittlig X-ray Foton energi spectra og definere for hver grunnstoff rundt en energi-vinduet for å hente elementet romlige fordelingen.
- Definere områder av interesse (ROI) (f.eks enkeltceller, tett struktur, aggregater, osv.) og beregner de tilsvarende x-ray spectra.
- Analysere til tilsvarende RBS spectra for å beregne totalt antall hendelsen partikler25.
- Passer X-ray spectra med Gupix programvare26 for å bestemme konsentrasjonen element for hver avkastning.
Merk: Typisk grensen for påvisning (LOD) metoden er i området 1 til 10 µg.g-1 i tørr masse hvor atomic mange elementer (LOD er synkende med Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellekultur og fluorescens bildebehandling for fluorescently merket TiO 2 NPs
Vi utviklet en prøve holder tilpasset cellekultur, celle håndtering samt flere analyse. Spesielt var det viktig at abonnenten tillatt rutinemessig optisk mikroskopi som vel som kjernefysiske microprobe analyse og bildebehandling. Denne prøven holderen er basert på en 2-µm tykk polykarbonat folie avsatt på en titt ramme. Celler er direkte dyrket på polykarbonat, steril kultur forhold i flere dager og deretter brukt for annerledes eksperimentell innstillinger, for eksempel NPs eksponering.
Den kjemiske overflaten modifiseringen med fluorophores (TRITC) lov påvisning av TiO2 NPs samt deres i situ og i vitro lokalisering i levende eller paraformaldehyde fast celler med fluorescens mikroskopi. Cellekjernen og mitokondrier var farget med den vitale-dye Hoechst33342 (blå for kjernen) og det transfekterte Matrix-roGFP (grønn for mitokondrier), henholdsvis. Denne flere flekker tillatt den intracellulære lokaliseringen av TRITC-TiO2 NPs (av sin rød emitting fluorescens) 20 h etter eksponering. NPs bare funnet i cytoplasma synlige celler med ingen gjenkjenning i kjernen. NPs var tilfeldig lokalisert i perinuclear regionen i cytoplasma og helt ekskludert fra mitokondrier (ingen overlappende mellom TRITC og GFP signaler).
Selv om fluorescens mikroskopi er svært nyttig å lokalisere NPs inne synlige celler, er det ikke mulig å vurdere nøyaktig antall NPs per celle. Den største vanskeligheten av fluorescens mikroskopi om kvantifisering av NPs er knyttet til usikkerheten om (i) antall fluorophores knyttet til en gitt NP og bleking stabiliteten på den valgte fluorophore under observasjon og (ii) aggregering delstaten NPs i cellen.
Figur 1 : in vitro og på stedet fluorescens imaging U20S transgene celler uttrykke Matrix-RoGFP og utsatt for TRITC-TiO 2 NPs. U2OS celler (øverst) merket med Hoechst33342 (blå), Matrix-roGFP (grønn) er utsatt for 4 µg.cm-2 TRITC-merket TiO2 nanopartikler (rød) for 20 h. observasjoner indikerer at TiO2 NPs samlet i celler i en perinuclear-regionen. Skala bar: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Å overkomme disse manglene, kjernefysiske microprobe analyse techniquesprovide en utfyllende tilnærming til den konvensjonelle optisk mikroskopi på grunn av deres følsomhet NPS som hindrer bruk av alle mellomliggende signal som fluorescens fra en podet fargestoff. Videre, de er også fullt kvantitativ, gir data om (i) sub mobilnettet biokjemiske innholdet som ellers er ukjent, og (ii) intracellulær antall NPs på enkeltcelle nivå.
Cryofixation av cellene etter live bildebehandling.
Den høyeste begrensningen i kjernefysiske microprobe analyse er å arbeide under vakuum forhold. Vi har utviklet en celle fiksering protokoll slik at bevaring av den biologiske ultrastructure og biokjemiske integriteten til biologiske prøven. Kjemisk fiksering er kjent endre spor element sammensetningen av celler fordi det krever utskifting av deres cellular medium av en polymer brukes å bevare det cellular ultrastructure. Videre fjerning av vann også utgivelser gratis ioner og andre arter, som endrer totalt prøve komposisjon. Dermed blir det obligatorisk å gi prioritet til en fysisk fiksering metode, spesielt kryogene metoder. Prosedyrene kryogene indusere en rask opphør av cellulære aktiviteten, og dette, i millisekunder tidsskalaen.
Kjernefysiske microprobe analyse mikroskopi og kvantifisering av NPs i mobilnettet skala.
Skanning overføring ion mikroskopi (μ-STIM) og partikkel-indusert X-ray utslipp (μ-PIXE) analyse var utført på prøver etter cryofixation og dehydrering å få presis kvantitative data på deres grunnleggende kjemiske sammensetning.
Μ-STIM bilder avslørte lokale forskjellene i tetthet og tillater påvisning av cellen strukturer som kjernen og cytoplasma. Selv om strålen lateral oppløsning gjør observasjon av tett strukturer like smale som 300 nm bred, like tynn aggregater synlig her i cytoplasma, metodene STIM kan ikke forskjellsbehandle NP aggregater og andre tett cellular strukturer. Dette er fordi, som for overføring elektronmikroskop (TEM), fysiske prosessen fører til variasjon i overført energi er samspillet av innkommende ion med Atom elektron skyen. I motsetning til TEM analyse imidlertid hindre fordi hele cellen volum er analysert, lokale tykkelse variasjoner diskriminering mellom high-Z strukturer og en lokal økning av mobilnettet.
Figur 2 : Bilder av tetthet og elementær distribusjon oppnås ved μ-STIM og μ-PIXE på cryo-fast U2OS celler. U2OS kontroll celler (opp) er sammenlignet med utsatt cryo-fast U2OS celler (utsatt for 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, ned) og observert ved hjelp av kjernefysiske microprobe analyse/mikroskopi. STIM mikroskopi (venstre, gråtone kart) avslørte tett intra - eller ekstra cellular strukturer (kjernen, salt aggregater, nanopartikler). Romlig oppløsning (300 nm) sammenlignes fluorescens mikroskopi og viser strukturer som NP aggregater i regionen perinuclear. Identifikasjon av strukturer basert på deres tetthet kan likevel være tvetydig. De μ-PIXE grunnleggende kartene over K, P og Ti (termisk fargeskala) er komplementære μ-STIM kart. De kan brukes til å sikre tilstedeværelsen av NPs i celler. Hver celle kan analyseres individuelt i elementet konsentrasjon (se fig. 3). Skalere barer: 10 µm. fargeskalaer spenner fra minimum (blå) til maksimale intensitet (grå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som illustrert i figur 2, gjør μ-STIM gjengivelsen anerkjennelse av enkeltceller i både innbyggere, og også intracellulær sub deler som kjerne og kjernen. Dessverre, og som nevnt tidligere ble NPs ikke alltid funnet med μ-STIM gjenoppbygging.
Partikkel-indusert X-ray utslipp (μ-PIXE) analyse gir ikke bare den kjemiske sammensetningen av prøven, men også deres grunnleggende kartlegging (figur 2). Under samhandling med spennende strålen gjennomgå grunnstoffene atomic eksitasjon-de-eksitasjon prosesser som føre til utslipp av et foton som viser karakteristiske energien av atomic antall spent elementet. Et karakteristisk peak spektrum er er bygget fra summen av alle slippes ut Foton hendelser og en kjemisk signatur av prøven.
Standard eksperimentelle oppsett og detektorer brukes for μ-PIXE eksperimenter kan samtidig kvantifisering av alle elementer tyngre enn Na med en 1-10 µg.g−1 tørr masse oppdagelsen grense. Måle elementær konsentrasjoner er vanligvis begrenset til 20% på grunn av gratis samling og detektoren effektivitet.
I denne studien er fordelingen av elementer som kalium og fosfor og kvantifisere intracellulær mengden TiO2 NPs med titanium kartlegging observert av kjernefysiske microprobe analyse. Grunnstoff kartene beregnes etter fotoner sorteres i henhold til strålen posisjon på tidspunktet for opptak og valg av en energi window sentrert rundt et bestemt element. Kartene er representant for antall oppdaget hendelser på strålen posisjon og kvantitative. Både støy og bakgrunnen er numerisk simulert og filtrert ut. Videre kan kjemiske kartlegging brukes til å trekke ut lokale PIXE spekteret kreves for kvantifisering.
Som illustrert i figur 2, fosfor distribueres homogenously i cellen med, som forventet, en mye høyere konsentrasjon i kjernefysiske området. Kalium er homogent distribuert i celle volum. Titan ligger i regionen cytoplasmatiske perinuclear i form av aggregater, som tidligere observert med fluorescens mikroskopi (figur 1). NPs vises den samme perinuclear lokaliseringen uansett deres overflate tilstand: functionalized (figur 1) eller innfødt (figur 2). I mellomtiden, ingen spor av Titan ble oppdaget i kontroll celler bekrefter at Titan fordelingen observert av μ-PIXE må tilskrives TiO2 NPs, med våre tidligere analyser av fluorescens mikroskopi.
I tillegg som illustrert i figur 2, er det mulig å trekke intracellulær fordelingen av NPs og kvantitative NPs konsentrasjoner fra bestemte områder av interesse. Basert på STIM kartene og i sammenheng med fosfor/kalium-distribusjoner, er enkelt celle analyse mulig.
Figur 3 : Enkelt celle kvantitativ analyse bruker μ-PIXE. Individuelle X-ray spectra beregnet for celler som vises i figur 2 kan monteres for å bestemme element konsentrasjonen på cellenivå. Denne funksjonen er spesielt interessant for NP analyse der mobilnettet konsentrasjoner vanligvis viser sterk variasjoner innenfor samme populasjon. For eksempel for samme mener eksponering, Ti konsentrasjonene varierer fra 0,2 til 1,8 µg.cm-2. Kontroller tilsvarer ubehandlet celle populasjoner. Eksponering dose: 4 µg.cm-2. Boxplots representerer distribusjon av individuelle mobilnettet konsentrasjoner med medianverdien (vannrett linje) og barer mot laveste og høyeste målte verdier. Kontrollere celler: N = 14; Eksponert cellene: N = 16.
Følgelig, vi har ikke bare kvantifisert gjennomsnittlig innholdet av Titan i en celle befolkningen men også vist Titan distribusjon per celle i en befolkning i en bestemt eksperimentelle tilstand. Median innholdet av Titan målt her er ganske lav (500 ng.cm-2) sammenlignet med 4 µg.cm-2 eksponering dosen av celle befolkningen (Figur 3) og variasjon mellom celler er store (Ti konsentrasjonene varierer fra 0,2 til 1,8 µg.cm -2 etter analysert cellene). Vi har også merket en økning av intracellulær ioner som kalium og kalsium i utsatte prøver foreslå en mobilnettet endring homeostase av tilstedeværelsen av TiO2 NPs, som tidligere beskrevet av flere forfattere. 21 , 27
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode for å gi nyttig informasjon utover det som er mulig med andre Bildeteknikker, særlig på subcellular nivå. I tillegg til sin bildebehandling evne tilbyr kjernefysiske microprobe analyse også muligheter for kvantifisering av kjemiske elementer inn i sammensetningen av en biologisk prøve. Den nåværende arbeidet, vi studerte menneskelige celle populasjoner og fokusert til analyse av en valgt region på rente basert på en enkelt celle utsatt for TiO2 NPs. Kombinasjonen med andre teknikker gir både morfologiske mobil bildebehandling og presis kvantitative data om elementær kjemiske sammensetning.
For å kunne bruke kjernefysiske microprobe analyse, er det obligatorisk å respektere følgende punkter å unngå potensielle feller. Først er det viktig å bruke en kryogene protokoll for cellen fiksering for å beholde sin ultrastructure og integriteten biokjemiske. Andre, det er også obligatorisk å utføre analyse av tynne prøver med tykkelse under 20 µm. Eventuelt snitting av cryofixed prøver kan utføres. Prøver bør absolutt holdes frosset. Tredje er det også viktig å huske på at kjernefysisk microprobe analysen avdekker en todimensjonal visning av biologiske prøver. Dermed er grunnstoff distribusjon oppnås en to-dimensjonal projeksjon som muligens kunne introdusere feiltolkninger. Denne begrensningen vil bli forbigått i fremtiden ved bruk av tomographic oppkjøpet.
Kjernefysiske microprobe analyse har også begrensninger. Det må understrekes at den viktigste betingelsen er behovet for å utføre analyse under vakuum. Derfor er det viktig å bruke celle fiksering protokoller som bevarer celler ultrastructure og biokjemiske integritet. Det er derfor nødvendig å teste holdbarheten av de biologiske prøvene i cryogenics prosedyren (uten tillegg av kjemiske harpiks). Dette kan begrense bruk av kjernefysiske microprobe analyse.
En annen begrensning er tilgang til fasiliteter for gjennomføring av kjernefysiske microprobe analyse. Tildelte strålen tidene er derfor noen ganger begrenset, og dette er en ekstra betingelse for denne typen tidkrevende eksperiment. Flere timer er ofte nødvendig for en oppkjøp.
Denne teknikken er forskjellig fra andre analytiske metoder, inkludert mikroskopi, massespektrometri (MS), Induktivt kombinert plasma MS (ICP-MS), flytende kromatografi MS (LC - MS), og radioaktivt isotop. Sistnevnte er faktisk brukes til å beregne mobilnettet dosen av kjemiske elementer, men de er bare kunne gi informasjon på en makroskopisk skala dvs en makroskopisk mengden et utvalg. Ingen av dem kan gi tilgang, som kjernefysisk microprobe analyse, nøyaktig gjenkjenning og kartlegging av en subcellular dose av bestemte kjemiske elementer (ioner, metall eller metall oksid NPs). Disse dataene hjelper tilgang til en mer systematisk studie av dose-respons evaluering.
Nøyaktig beregningen av dosen når studere internalization NPs i celler er avgjørende fra både kvantitative NP toksikologi og farmakologi synsvinkler. Som foreslått av det store avviket i observerte NP innholdet, som viser en 10 ganger forskjell mellom minimum og maksimum observert konsentrasjoner (Figur 3), kanskje ikke bety mobilnettet konsentrasjonen relevante parameter å beskrive den fenomenet partikkel eksponering. Dette gjelder særlig når en terskel effekt skal skje fordi ikke-homogen doseeksponering kan føre til motstridende observasjoner. Siden fraksjonert natur nanopartikler vises tydelig på cellenivå, utgjør denne studien derfor igjen spørsmålet om relevansen av metoder basert på analysere globale variabler i adressering spørsmål rundt virkemåten celleområde utsatt ikke-homogen doser av miljøgifter.
Som illustrert i tilfelle studert her, tillater observasjon og kvantifisering av NPs i enkeltceller oss å forstå bioakkumulering av endogene/eksogene elementer som metalloksid NPs. Dette er en kritisk aktivitet for ytterligere programmer av NPs i biomedisin, der en dårlig forståelse av underliggende NP distribusjon i celler kan føre til feiltolket resultater.
Denne protokollen høydepunkter hensiktsmessigheten av bruker kjernefysiske microprobe analyse med andre teknikker for fremtidige vurderinger av NP interaksjoner med biologiske prøver. Kvantitativ tilnærming gir informasjon om virkningen av slike NPs oppdagelse, identifikasjon, lokalisering og kvantifisering på nivå med en enkelt celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Serge Borderes for regi og redigering av video. Fransk National Research Agency støtter forskningsprogrammet TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). CNRS og EU som en integrering aktivitet gitt "støtte av offentlig og industriell forskning bruker Ion strålen teknologi (SPIRIT)" under EU kontrakt n ° 227012. Dette arbeidet har blitt støttet av Marie Curie handlinger - første trening nettverk (ITN) som en "integrere aktivitet støtte Postgraduate forskning med praksisplasser i industrien og trening Excellence" (SPRITE, D1.3) under EF kontrakt nr. 317169. C'NANO Grand Sud Ouest og regionen Aquitaine støtte forskningsprogrammet TOX-NANO (n ° 20111201003) og forskningsprogrammet POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , Elsevier Ltd. (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
