Summary
Descriviamo una procedura per l'individuazione di elementi chimici presenti in situ in cellule umane, nonché la loro quantificazione in vitro . Il metodo è adatto a qualsiasi tipo di cellula ed è particolarmente utile per l'analisi chimiche quantitative in singole cellule in vitro esposizione di nanoparticelle di ossido di metallo.
Abstract
Tecniche di micro-analitico basati su formazione immagine elemento chimico consentono la localizzazione e la quantificazione della composizione chimica a livello cellulare. Essi offrono nuove possibilità per la caratterizzazione dei sistemi viventi e sono particolarmente appropriati per rilevare, localizzare e quantificare la presenza di nanoparticelle di ossido di metallo sia in campioni biologici e per l'ambiente. Infatti, queste tecniche tutti i pertinenti requisiti in termini di (i) sensibilità (da 1 fino a 10 µg.g-1 di massa secca), (ii) micrometro gamma risoluzione spaziale e (iii) multi-elemento rilevamento. Date queste caratteristiche, formazione immagine di elemento chimico microbeam possa potentemente integrare tecniche di imaging routine come ottica e microscopia a fluorescenza. Questo protocollo viene descritto come eseguire un'analisi della microsonda nucleare su cellule in coltura (U2OS) esposte alle nanoparticelle di biossido di titanio. Le cellule devono crescere ed essere esposte direttamente in un portacampioni appositamente utilizzato il microscopio ottico e nelle fasi di analisi della microsonda nucleare. Tuffo-congelamento criogenica fissazione dei campioni conserva sia l'organizzazione e la distribuzione di elemento chimico. Analisi simultanea della microsonda nucleare (microscopia dello ione trasmissione, Rutherford backscattering spettrometria e particella indotto da emissione di raggi x) eseguita sul campione fornisce informazioni circa la densità cellulare, la distribuzione locale di gli elementi chimici, come pure il contenuto cellulare di nanoparticelle. C'è un crescente bisogno di tali strumenti analitici all'interno di biologia, soprattutto in ambito emergente di nanotossicologia e nanomedicina per cui occorre approfondire la nostra comprensione delle interazioni tra nanoparticelle e campioni biologici. In particolare, come analisi della microsonda nucleare non richiedono le nanoparticelle siano etichettati, abbondanze di nanoparticelle sono quantificabili fino al livello di singola cellula in una popolazione di cellule, indipendentemente dal loro stato superficiale.
Introduction
L'omeostasi cellulare è determinato dal controllo di assorbimento, assimilazione e localizzazione intracellulare di diversi oligoelementi (ioni, metalli, composti inorganici esogeni). Questi componenti sono frequentemente sotto forma di tracce, ma tuttavia possono avere un impatto considerevole nella fisiologia del sistema. Così, lo studio della biochimica cellulare in situazioni sia normali che patologiche/sottolineato è un chiave-passo verso una comprensione globale dei meccanismi metabolici cellulari. Di conseguenza, lo sviluppo di tecniche di imaging e analitiche che consente l'indagine delle abbondanze chimiche intracellulari, organizzazione strutturale e delle funzioni metaboliche correlate diventa necessario. Metodi molto pochi sono in grado di fornire un pezzo di in situ quantitativa di informazioni riguardanti la natura chimica complessiva di un dato campione. Oltre a metodi di analisi dei campioni in forma bulk, analisi in situ considerano campioni biologici nella loro integralità senza perdere le informazioni strutturali e massa, preservando così le loro sostanze chimiche (oligoelementi e ioni) e proteine. Inoltre, come le nanoscienze continuano a sviluppare, formazione immagine migliorata e metodi analitici per il monitoraggio ambientale su scala cellulare sarà necessari osservare e quantificare le interazioni e comportamenti di nano-oggetto. 1
Le nanoparticelle (NP) sono state definite come oggetti che esibiscono almeno una dimensione facciale nell'intervallo da 1 e 100 nm. 2 a causa di loro particolari proprietà fisico-chimiche, NPs sono ampiamente utilizzati nell'industria. Dei criteri di rete sono impiegati in bio-applicazioni e nella nanomedicina. 3 , 4 nonostante le numerose caratteristiche fisico-chimiche di NPs, potrebbero generare alcuni rischi di effetti negativi sulla salute umana e l'ambiente. Questi rischi possono essere indotti da esposizioni sia prolungate e ripetitive a vari livelli di concentrazione e questo non è ancora stata chiaramente stabilito. 5 , 6 , 7 , 8 In particolare, il destino di NPs all'interno di cellule e le risposte cellulari associate sono, ad oggi, non completamente descritto. Ciò è in parte dovuto la scarsità di metodi che consentono la rilevazione e quantificazione di NPs interiorizzata in una singola cella. 9
Gli strumenti analitici classici usati per stimare la dose cellulare delle nanoparticelle sono microscopie, spettrometria di massa (MS), accoppiato induttivamente al plasma (ICP-MS) MS10,11 e cromatografia liquida (LC-MS) MS, ma forniscono solo informazioni utili su scala macroscopica. Nessuno di loro può fornire una valutazione precisa del contenuto NPs subcellulare né la distribuzione dei criteri di rete senza l'uso di metodi di frazionamento. Una valutazione sistematica della dose-risposta è dunque impossibile con questi metodi, in contrasto con metodi basati sulla spettroscopia atomica come microsonda nucleare analisi12,13, microscopia di fluorescenza di raggi x di sincrotrone14 e spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS). 15 , 16 questi metodi sono particolarmente interessanti come si completano le osservazioni fatte utilizzando la microscopia a fluorescenza, soprattutto quando NPs non possono essere etichettati con molecole fluorescenti e sono quindi studiati nel loro stato nativo. In una certa misura, anche quando NPs si innestano con fluorofori, (i) quantificazione rimane difficile perché il livello di codifica per NP è sconosciuto e (ii) la modificazione chimica della superficie NP può modificare la sua distribuzione cellulare.
In questo articolo, ci concentriamo su un metodo basato su una combinazione di tecniche nucleari della microsonda puntando la morfologia e la composizione elementare di campioni biologici in maggiore, minore, di imaging e le concentrazioni di traccia.
Analisi della microsonda nucleare dimostra di essere particolarmente adatto per la misura di elementi chimici in traccia nei tessuti biologici. La risoluzione laterale fascio (0.3-1 µm) e la sensibilità nella rilevazione di elemento chimico (da 1 a 10 µg.g-1 massa secca) sono adatti per studi a livello cellulare. Nucleare della microsonda tecniche si basano sulla rilevazione di particelle (fotoni, elettroni, ioni) generato dopo che il fascio di ioni (in genere in esecuzione alle energie di MeV) interagisce con gli atomi presenti nel campione. Interazioni che si verificano nelle cellule sono principalmente: 1) eccitazione/ionizzazione degli atomi seguita da un'emissione di fotoni dopo atomi tornano allo stato fondamentale; e 2) diffusione delle particelle in arrivo che porta a cambiare nella loro energia e direzione. La misurazione di identificazione permette di particella emessa energia degli atomi coinvolti nell'interazione. Per eseguire il mapping di elementi, la microbeam ione viene analizzato ripetutamente sopra la superficie del campione, spesso su una superficie di circa 100 da 100 µm2 contengono parecchie cellule. Particelle emesse vengono rilevate e la loro energia è registrato per ogni posizione di fascio. L'ordinamento delle particelle in base alla posizione di fascio, identificando così la struttura responsabile per l'emissione di tali particelle è lo scopo del trattamento dei dati. Qui, descriviamo precisamente un approccio basato sulla microscopia a fluorescenza e analisi nucleari della microsonda per rilevare così come quantificare esogeno NPs alla scala cellulare e subcellulare, al fine di indagare le conseguenze delle interazioni di NP con soggiorno sistemi. Ci concentreremo in particolare sulle opportunità offerte da questo metodo in termini di quantificazione in situ di biossido di titanio (TiO2 NPs) nanoparticelle aggregati a livello subcellulare.
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Protocol
1. titolare preparazione del campione
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Preparazione e progettazione titolare campione
- Fabbricare un portacampioni perforando un quadrato di 5 x 5 mm in una cornice PEEK spessa 1 mm.
- Risciacquo con etanolo 70% (v/v) per pulire e mantenere in piastre sterili fino all'uso.
Nota. Un titolare di campione appropriato per colture cellulari e la manipolazione delle cellule è richiesto. Esso deve essere progettato per cella coltura, osservazioni in vitro con microscopia ottica e analisi della microsonda nucleare e imaging. Questo supporto è costituito da un telaio PEEK13.
- Preparazione del campione titolare
- Preparare la soluzione di Formvar sciogliendo 1 mg di polvere di Formvar in 100 mL di cloroformio.
- Estendere l'estruso in policarbonato su una struttura metallica, in modo che non presenta nessuna piega.
- Utilizzare una punta sterile per diffondere la soluzione di Formvar intorno al foro di supporto del campione.
- Posare delicatamente il supporto del campione con la colla lungo l'estruso in policarbonato allungato (un quadrato di 5 x 5 mm).
- Ripetere la sequenza precedente per preparare un supporto del campione per ogni replica.
Nota. Il film di policarbonato (PC) è biocompatibile, abbastanza spessa e resistente ai diversi protocolli e vincoli analitici.
Attenzione- cloroformio è tossico. Evitare l'inalazione, ingestione o contatto con la pelle. Utilizzare sempre una corretto funzionamento cappa chimica e filtri appropriati.
- Sterilizzazione di titolare campione
- Collocare il supporto montato campione in un matraccio conico con 50 mL di etanolo al 70% (v/v) sotto agitazione a 180 giri/min e + 37 ° C durante la notte, utilizzando un incubatore/agitatore.
- Sciacquare il titolare più volte in acqua distillata sterile.
- Aria asciugarli in condizioni sterili ed esporli alla luce ultravioletta (lampada germicida da banco di biosicurezza, classe II) per 30 minuti su ogni lato.
- Mantenere i campioni in sterile 12 pozzetti (titolare di un campione per pozzetto) fino all'uso.
Nota: Più titolari di campione possono essere conservati a temperatura ambiente in sterile e secco 12 pozzetti sigillato con parafilm per diversi giorni.
2. la crescita delle cellule nel campione adeguato supporto.
Attenzione: Protocollo deve essere eseguito in un banco di flusso laminare di biosicurezza (classe II) per escludere microrganismi contaminanti. Gestire gli antibiotici (ad es. penicillina, streptomicina) con i guanti. Rispettare procedure consigliate durante la manipolazione di materiali biologici (linee cellulari, geneticamente derivato cellule umane).
Critica: le linee cellulari utilizzate devono essere controllate per garantire che non sono infettati con micoplasma.
- Transfect U2OS linea cellulare con plasmide cuscinetto Matrix-roGFP 17,18,19 utilizzando un metodo di transfezione in conformità al protocollo stabilito dal produttore.
- Per confermare la transfezione con il plasmide-trasportare il biosensore e per evitare la perdita del plasmide, selezionare e mantenere le cellule transfected su terreno di coltura appropriato.
- Visualizzare cellule trasfettate mediante microscopia a fluorescenza per assicurare che la transfezione è verificato e confermare l'espressione della fluorescenza e la visualizzazione di una rete mitocondriale reticolare e tubolare19.
Pausa punto: Le cellule possono essere congelate in azoto liquido per diversi anni. - Utilizzare la popolazione delle cellule trasfettate coltivando le cellule in un terreno adeguato al fine di ottenere popolazioni di cellule Sub-confluenti. Crescere le cellule a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 in atmosfera satura d'acqua.
- Seme di cellule in concentrazione, così come sono alla confluenza di 80% il giorno della fissazione. In genere, una concentrazione di 500 cellule per µ l potrebbe essere utilizzata. Raccogliere le cellule utilizzando 400 µ l di tripsina-EDTA 0,25% (v/v) e tenere per 3 min a 37 ° C. Interrompere l'azione della tripsina con 1 mL di terreno di coltura. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione per 5 min a 230 x g e + 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante e aggiungere il volume di terreno di coltura fresco.
Nota. Il protocollo è applicabile per tutti i tipi di cellulari e il numero delle cellule seminate dipende la dimensione della cella e il tempo di raddoppiamento delle cellule.
Attenzione: Evitare di sottoporre la tripsina, antibiotici e siero a cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Mantenerli sterili. Dividere la soluzione madre in aliquote e congelarli a − 20 ° C. Conservare le aliquote fino alla data di scadenza. Risciacquare accuratamente il pellet cellulare al fine di rimuovere completamente la tripsina. Tracce di tripsina residua saranno ritardare e ridurre l'efficienza di placcatura. - Contare le celle ed eseguire una diluizione con terreno di coltura completo nuovo mantenuto a 37 ° C al fine di ottenere una sospensione di cellule con 500 cellule per µ l.
Nota: La concentrazione della sospensione delle cellule deve essere adeguata in funzione del tipo di cella, al fine di una goccia di 40 µ l del piatto. - Piastra di una goccia di 40 µ l al centro della lamina in policarbonato. Posizionare il campione per 2 ore a + 37 ° C, 5% (v/v) CO2 in un'atmosfera satura di acqua.
Critico: Una volta che il campione viene messo nell'incubatrice, limitare quanto più possibile alcun movimento meccanico per favorire il collegamento veloce delle cellule. Secondo il tipo di cella, potrebbe essere necessario per incubare le cellule più di 2 h per un'efficienza ottimale platting. Verificare che l'atmosfera di incubatrice è ben saturo per impedire l'evaporazione di gocce. - Verifica che le cellule sono ben attaccate sulla lamina di policarbonato utilizzando un microscopio ottico. Delicatamente aggiungere 2 mL di terreno completo nuovo e mantenere per 24 h.
3. nanoparticelle preparazione ed esposizione
Nota: Fluorescente tintura-modificato TiO2 NPs erano progettati, sintetizzati e chimicamente con tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC). 20 , 21 questa modificazione superficiale permette di nanoparticelle rilevamento, rilevamento e localizzazione in situ e in cellulo in cellule vivente e fisse o negli organismi multicellulari. 12 , 13 , 18
Attenzione: Nanomateriali e le nanoparticelle devono essere maneggiate con cura. Evitare l'inalazione, ingestione o contatto con la pelle. Per impedire la diffusione nell'aria, le nanoparticelle sono mantenute in soluzione (acqua ultrapura).
- Preparare una sospensione di 1 mg.mL− 1 diTiO2 NPs in acqua ultrapura. Disperdere il TiO2 NPs utilizzando impulsi di sonicazione intenso 1 min a RT (750 W, 20kHz, ampiezza: 30%) utilizzando un generatore di ultrasuono e una microsonda conica dedicata.
- Diluire il TiO2 NPs alla concentrazione desiderata nel terreno di coltura al fine di ottenere una sospensione di esposizione di 4 µg.cm− 2 (concentrazione finale). Sostituire il mezzo con il volume appropriato di NPs contenente medio sulle cellule e mescolare delicatamente per una distribuzione omogenea del TiO2 NPs. Prepare le cellule di controllo allo stesso modo senza l'aggiunta di TiO2 NPs.
- Incubare le popolazioni delle cellule per 24 h a 37 ° C, 5% (v/v) di CO2 e un'atmosfera satura di acqua.
4. microscopia di fluorescenza e di fissaggio paraformaldeide.
- Preparare una soluzione fresca di tamponata paraformaldeide (PFA, 4% p/v) in tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4).
- Sciogliere 4 g di polvere PFA in 100 mL di PBS. Riscaldare la soluzione a 65 ° C mescolando utilizzando un magnete e un agitatore magnetico in una cappa aspirante. Aumentare il pH aggiungendo 1 M NaOH una goccia alla volta fino a quando la soluzione Cancella. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e regolare il pH a 7,4. Utilizzare la soluzione appena preparata immediatamente o conservare a + 4 ° C e proteggere dalla luce.
Nota: Soluzioni pre-fatte di PFA potrebbero essere usati tuttavia una preparazione estemporanea di PFA garantisce la migliore qualità di fissazione e la conservazione a lungo termine di campioni fissati.
Attenzione: PFA è tossico; evitare l'inalazione, ingestione o contatto con la pelle. Utilizzare sempre una corretto funzionamento cappa chimica e filtri appropriati.
- Sciogliere 4 g di polvere PFA in 100 mL di PBS. Riscaldare la soluzione a 65 ° C mescolando utilizzando un magnete e un agitatore magnetico in una cappa aspirante. Aumentare il pH aggiungendo 1 M NaOH una goccia alla volta fino a quando la soluzione Cancella. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e regolare il pH a 7,4. Utilizzare la soluzione appena preparata immediatamente o conservare a + 4 ° C e proteggere dalla luce.
- Una volta, il tempo di incubazione, rimuovere il terreno di coltura cellulare contenente il TiO2 NPs. Sciacquare le popolazioni delle cellule una volta con terreno di coltura fresco e una volta con PBS (2 mL). Rimuovere il PBS, sciacquare rapidamente con un'aliquota del PFA fresca e fredda (4% w/v, + 4 ° C).
- Aggiungere PFA (2 mL, 4% w/v, + 4 ° C). Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il PFA, sciacquare le cellule con PBS (2 mL, 3 volte, 5 min) sotto agitazione.
Pausa punto: Questi chimicamente fissi campioni può essere utilizzati per la procedura di "tuffo-freeze" dopo fluorescenza imaging (Vai al passo 5) o utilizzati solo per fluorescenza imaging (Vai a fare un passo 4.3).
- Macchia del nucleo con Hoechst33342 incubando le cellule per 10 min in PBS. Hoescht33342 viene utilizzato ad una concentrazione finale di 500 nM. Dopo l'incubazione rimuovere la soluzione e risciacquare con PBS.
Attenzione: Hoechst33342 è cella permeante e può essere tossico. Evitare il contatto diretto e usare i guanti durante la preparazione e l'utilizzo di Hoechst33342.
Critica: garantire che la Hoechst33342 macchiatura soluzione è preparata e mantenuta in condizioni sterili. - Processo fissa i campioni per in situ e l'imaging singola cella utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura 1).
5. "plunge-congelamento" fissazione e disidratazione
- Preparare un piatto di alluminio trasferimento raffreddandola in azoto liquido. Archivio la piastra in una scatola riempito con azoto liquido e mantenere la superficie della piastra sopra il liquido in vapore freddo azoto.
Nota: La piastra di trasferimento può essere fatto di qualsiasi piatto metallico (qui, abbiamo usato alluminio) che potrebbe essere raffreddato alla temperatura dell'azoto liquido, e che possono entrare nella camera del campione liofilizzatore.
Critico: Quanto più possibile la casella dovrebbe essere tenuta chiusa al fine di evitare la deposizione di vapore acqueo sulla superficie del piatto freddo. L'esempio memorizzato sulla piastra durante la preparazione non dovrebbe rientrare di azoto liquido. - Sciacquare le cellule una volta nel terreno di coltura e quindi due volte più, brevemente, in acqua ultrapura e sterile per ottenere sbarazzarsi di qualsiasi traccia di sali extracellulare rimanenti.
Critico: Garantire che i mezzi sono appena preparati e mantenuti in condizioni sterili. Tutti i media a 37 ° C di calore prima di essere utilizzati. Il risciacquo deve essere molto breve (pochi secondi) e l'eccesso di liquido sui campioni rimosso velocemente come possibile. - Tuffo-congelare le cellule a-150 ° C in liquido azoto, refrigerato 2-metilbutano durante 30 s e posto loro sull'alluminio piano di trasferimento. Conservare i campioni qui durante la preparazione di tutti gli altri campioni. Quando i campioni sono tutti cryofixed, trasferire tutti-at-once inserendo la piastra di trasferimento in un liofilizzatore.
Critico: Il processo complessivo di cryofixation non dovrebbe durare più di 20 min al fine di evitare modifiche strutturali per apparire nei campioni memorizzati temporaneamente nella finestra di trasferimento. - Liofilizzare i campioni utilizzando le seguenti sequenze: 1) eseguire un essiccamento primario per 12-24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) a bassa pressione e bassa temperatura, quindi 2) eseguire una fase di essiccazione secondaria per almeno 24 h, aumentando la temperatura della piastra a + 40 ° C, mantenendo la pressione bassa (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
Attenzione: Azoto liquido è estremamente freddo e può causare gravi danni di congelamento o occhio al contatto. Utilizzare contenitori senza panca adattati per il trasporto e indossare i dispositivi di sicurezza (Guanti criogenici, protezione degli occhi e del viso).
Attenzione: 2-metilbutano è estremamente infiammabile. Una contaminazione dannosa dell'aria può essere raggiunto piuttosto rapidamente su evaporazione della sostanza a + 20 ° C. Evitare l'inalazione, ingestione o contatto con la pelle. Utilizzare guanti protettivi e protezione degli occhi e respirazione. Sempre utilizzare una cappa chimica correttamente funzionante. Può essere conservato a + 4 ° C.
Critico: Utilizzare un termometro adatto (-150 ° C) per monitorare le temperature di 2-metilbutano durante la sessione di "Tuffo-freeze". 2-metilbutano dovrà essere tenuto al fresco in una fase liquida. Trasferimento cryofixed campioni in atmosfera ambiente può causare il danno cellulare dovuto l'aumento della temperatura o il vapore acqueo condensa sulla superficie del campione. Di conseguenza, il trasferimento deve avvenire velocemente quanto ragionevolmente possibile (30 s)
Pausa punto: Dopo cryofixation, i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente per diversi giorni in condizioni di asciutto e sterile (proteggere da polvere e umidità). Con attenzione maneggiare i campioni con una pinzetta e metterli in un piatto 12-pozzetti sterile sigillato con parafilm. Essiccante può essere utilizzato per asciugare l'atmosfera.
6. nucleare Microprobe Analysis
Nota: Nucleare della microsonda analisi è stata condotta presso la linea di microbeam di AIFIRA (applicazioni Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine) utilizzando le tecniche analitiche del fascio complementari dello ione particella indotto da emissione di raggi x (µ- PIXE) e microscopia di ioni di trasmissione (µ-STIM). L'impianto è basato su un acceleratore di particelle MV 3,5 consegna fasci di ioni leggeri nell'intervallo di energia MeV. 22 , 23
Pausa punto: AIFIRA è una struttura di fascio di ioni ospitata dall'Università di Bordeaux che offre un accesso alle squadre nazionali e internazionali dopo la valutazione scientifica dell'esperimento proposto.
- Montare i portacampioni PEEK su una piastra catodica mediante nastro biadesivo.
- Posizionare la piastra porta campione in un piano verticale perpendicolare alla direzione del raggio.
- Chiudere la camera di analisi e di vuoto della camera di analisi.
- Microscopia a scansione trasmissione dello ione (µ-STIM)
Nota: STIM è utilizzato per registrare le mappe di densità areale delle cellule dopo la conversione della perdita di energia per massa cellulare, approfittando del fatto che la perdita di energia è proporzionale alla densità areale di campione (espressa in µg.cm-2).- Utilizzare un microbeam di elio (He+) 2 MeV come una sonda con una dimensione nel piano focale di circa 300 nm di diametro e a bassa fluenza (2000 ions.s-1). Misura l'energia degli ioni trasmessi con un rilevatore di planari al silicio (rilevatore di PIPS, 25mm2, 11 risoluzione di energia di keV @ 5,4 MeV), posizionata dietro il campione all'asse del fascio.
- Particella indotto da emissione di raggi x (µ-PIXE) e Rutherford Backscattering Spectrometry (µ-RBS).
Nota: analisi Pixe µ e µ-RBS forniscono la distribuzione spaziale e la quantificazione degli elementi chimici con risoluzione sub-micrometriche.- Utilizzare un microbeam protone (H+) di 1,5 MeV (50-150 pA), focalizzato verso il basso per un diametro di 1 µm e scansione sopra le stesse celle di interesse notato da STIM da 4 a 8 ore e circa 100 x 100 µm2.
- Raccogliere indotti fotoni dei raggi x emessi dagli atomi presenti nel campione (più pesante di Na) da un rivelatore a stato solido di Si(Li) ad alta risoluzione (risoluzione energetica eV 145, @Mn-Kα) posizionati a 45 ° dall'asse del fascio in ingresso. Utilizzare l'energia dei fotoni rilevati per identificare la natura di emettitori (ad es. Z dell'elemento) e l'intensità dei raggi x per determinare la concentrazione di elemento.
- Contemporaneamente raccogliere sparsi schiena protoni a-135 ° con un rilevatore di silicio (parzialmente impoverito rivelatore, 25mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) per misurare il numero totale di particelle in arrivo e per normalizzare l'intensità dei raggi x.
Critico: Un insieme di standard di calibrazione certificata per la quantificazione di concentrazione atomica viene utilizzato al fine di calibrare la risposta del rivelatore di raggi x. Materiali di riferimento sono una raccolta di film atomico sottili depositati su 6,3 µm spessore fogli di Mylar. Emessa la gamma di energie dei raggi x da 0,6 (Li, linea K) a 20,2 keV (Rh, K line).
7. analisi dei dati
- Ricostruire la chimiche elementare mappe utilizzando il plugin di IBA-J per ImageJ. 24
Nota: Software dedicato sotto forma di un plugin per ImageJ è stato sviluppato per elaborare i dati grezzi della microsonda nucleare analisi. Dati grezzi corrispondono a un elenco di eventi derivanti dall'interazione del fascio di particelle con le cellule che vengono registrati insieme con la posizione di fascio come una sequenza cronologica.- Utilizzare il plugin di IBA-J per ordinare gli eventi in base al loro tipo: trasmettono energia dello ione (STIM), retrodiffusa energia dello ione (RBS) o energia dei fotoni dei raggi x (PIXE). Quindi, elaborare separatamente ogni tipo di dati.
- Calcolare la mappa di densità di area STIM
- Calcolare la medio spettri di energia del fotone di raggi x e definire per ogni elemento chimico di interesse una finestra di energia al fine di recuperare la distribuzione spaziale di elemento.
- Definire le aree di interesse (ROI) (ad es. singole celle, struttura densa, aggregati, ecc.) e calcolare i corrispondenti spettri di raggi x.
- Analizzare gli spettri RBS corrispondenti al fine di calcolare il numero totale di particelle incidente25.
- Spettri di raggi x utilizzando il software Gupix26 al fine di determinare la concentrazione di elemento per ogni ROI in forma.
Nota: Tipico limite di rilevabilità (LOD) per il metodo è nella gamma da 1 a 10 µg.g-1 in massa secca a seconda del numero atomico degli elementi (LOD è in diminuzione con Z).
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Representative Results
Coltura delle cellule e formazione immagine di fluorescenza del TiO fluorescente contrassegnato 2 NPs
Abbiamo progettato un portacampioni adattato per coltura cellulare, la gestione delle cellule come pure analisi multimodale. In particolare, era importante che il titolare consentito microscopia ottica sistematica come bene come nucleare analisi della microsonda e imaging. Questo supporto del campione si basa su un foglio di policarbonato dello spessore di 2-µm depositato su un telaio PEEK. Le cellule sono direttamente coltivate in policarbonato, in condizioni di coltura sterile per diversi giorni e quindi utilizzate per diverse impostazioni sperimentali, come l'esposizione dei criteri di rete.
La modificazione chimica di superficie con fluorofori (TRITC) ha permesso l'individuazione di TiO2 NPs, come pure la loro localizzazione in situ ed in vitro in soggiorno o in paraformaldeide fissata cellule mediante microscopia a fluorescenza. Il nucleo cellulare e i mitocondri sono stati macchiati usando il colorante vitale Hoechst33342 (blu per il nucleo) e la matrice-roGFP trasfettate (verde per i mitocondri), rispettivamente. Questa colorazione più consentita la localizzazione intracellulare di TRITC-TiO2 NPs (dal suo colore rosso che emette fluorescenza) 20 h dopo l'esposizione. Dei criteri di rete sono stati trovati soltanto nel citoplasma delle cellule esposte con nessun rilevamento nel nucleo. NPs sono stati casualmente localizzato nella regione perinucleare del citoplasma e totalmente esclusi dai mitocondri (nessuna sovrapposizione tra TRITC e GFP segnali).
Sebbene la microscopia di fluorescenza è molto utile per localizzare dei criteri di rete all'interno di cellule esposte, non è in grado di valutare il numero esatto di NPs per cella. La difficoltà principale di microscopia di fluorescenza riguardanti la quantificazione di NPs è legata all'incertezza circa (i) il numero di fluorofori collegato a un determinato NP e la stabilità d'imbianchimento del fluoroforo selezionata durante l'osservazione e (ii) la stato di aggregazione di NPs all'interno della cellula.
Figura 1 : in vitro ed in situ fluorescenza imaging delle cellule transgeniche U20S esprimendo Matrix-RoGFP ed esposti a TRITC-TiO 2 NPs. Le cellule di U2OS (in alto) marcate con Hoechst33342 (blu), Matrix-roGFP (verde) sono esposte a 4 µg.cm-2 con etichetta TRITC TiO2 nanoparticelle (rosso) per 20 h. osservazioni indicano che TiO2 NPs aggregazione nelle cellule in un regione perinucleare. Barra della scala: 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per superare queste carenze, microsonda nucleare analisi techniquesprovide un approccio complementare alla microscopia ottica convenzionale dovuto la loro sensibilità a NPs che impedisce l'utilizzo di qualsiasi segnale intermedio come fluorescenza da un innestate la tintura. Inoltre, essi sono anche pienamente quantitative, fornendo dati relativi a (i) il contenuto di biochimico subcellulare che altrimenti è sconosciuto e (ii) la quantità intracellulare di NPs a livello di singola cellula.
Cryofixation delle cellule dopo formazione immagine dal vivo.
Il vincolo più alto nell'esecuzione di analisi della microsonda nucleare è quello di lavorare in condizioni di vuoto. Abbiamo sviluppato un protocollo di fissazione delle cellule che permette la conservazione dell'ultrastruttura biologica e l'integrità biochimica del campione biologico. Fissaggio chimico è conosciuto per modificare la composizione dell'oligoelemento delle cellule, perché richiede la sostituzione del loro mezzo cellulare da un polimero utilizzato per preservare l'ultrastruttura cellulare. Inoltre, la rimozione dell'acqua inoltre rilascia ioni liberi e altre specie, che modifica il totale del campione di composizione. Quindi, diventa obbligatorio a dare priorità a un metodo di fissazione fisica, in particolare metodi criogenici. Queste procedure criogeniche inducono una rapida cessazione dell'attività cellulare e questo, alla scala di tempo di millisecondo.
Microsonda nucleare analisi microscopia e quantificazione di NPs su scala cellulare.
Microscopia a scansione trasmissione dello ione (µ-STIM) e analisi di emissione (µ-PIXE) di raggi x indotta da particelle sono state eseguite su campioni dopo cryofixation e disidratazione per ottenere dati quantitativi precisi sulla loro composizione chimica elementare.
Immagini di µ-STIM ha rivelato le differenze locali nella densità e permette la rilevazione delle strutture cellulari come il nucleo e citoplasma. Anche se la risoluzione laterale fascio permette l'osservazione di denso strutture come stretta come 300 nm ampia, sottile aggregati visibili qui nel citoplasma, i metodi STIM non possono discriminare tra NP aggregati ed altre strutture cellulari densi. Infatti, come per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), il processo fisico che porta alla variazione di energia trasmessa è l'interazione dello ione in arrivo con la nube di elettroni atomici. A differenza dell'analisi TEM tuttavia, perché il volume dell'intera cella è analizzato, variazioni di spessore locale evitare discriminazioni tra strutture ad alto Z e un aumento locale della densità cellulare.
Figura 2 : Immagini di densità e distribuzione elementale ottengono µ-STIM e µ-PIXE sulle cellule di cryo-fisso U2OS. U2OS cellule di controllo (up) sono rispetto agli esposti celle U2OS cryo-fisse (esposte a 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, giù) e osservate mediante analisi della microsonda nucleare/microscopia. Microscopia STIM (a sinistra, mappe in scala di grigi) ha rivelato intra - o extra - cellulare strutture dense (nucleo, sale aggregati, nanoparticelle). La risoluzione spaziale (300 nm) è paragonabile alla microscopia a fluorescenza e mostra strutture come NP aggregati nella regione perinucleare. Identificazione delle strutture basate solo sulla loro densità può tuttavia risultare ambiguo. Le mappe di elemental µ-PIXE K, P e Ti (scala termica a colori) sono complementari a µ-STIM mappe. Servono a garantire la presenza di NPs in cellule. Ogni cella può essere analizzato singolarmente in termini di concentrazione dell'elemento (vedere la Figura 3). Scala bar: 10 µm. scale di colori vanno da minimo (blu) a massima intensità (grigio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Come illustrato nella Figura 2, il rendering di µ-STIM permette il riconoscimento delle cellule individuali all'interno di una popolazione sia sub-compartimenti intracellulari come il nucleolo e nucleo. Purtroppo e come accennato in precedenza, dei criteri di rete potrebbe non essere sempre rilevati mediante ricostruzione µ-STIM.
Analisi di emissione (µ-PIXE) raggi x indotta da particelle forniscono non solo la composizione chimica del campione, ma anche loro mappatura elementare (Figura 2). Durante l'interazione con il fascio eccitante, elementi chimici subiscono processi atomici di eccitazione-de-eccitazione che alla fine portano all'emissione di un fotone che esibisce l'energia caratteristica del numero atomico dell'elemento eccitato. Uno spettro caratteristico picco è costruito dalla somma di tutti gli eventi del fotone emesso ed è considerato una firma chimica del campione.
Messe a punto sperimentali standard e rivelatori usati per esperimenti di µ-PIXE consentono quantificazione simultanea di tutti gli elementi più pesanti di Na con un limite di rilevazione di masse secche− 1 µg.g 1 a 10. Precisione nella misurazione concentrazioni elementari è di solito limitata a circa il 20% a causa di efficienza di collezione e rivelatore di carica.
In questo studio, la distribuzione degli elementi come potassio e fosforo e per quantificare la quantità intracellulare di TiO2 NPs con mapping di titanio è osservata dall'analisi della microsonda nucleare. Elemento chimico mappe vengono calcolate dopo i fotoni vengono ordinati in base alla posizione fascio i tempi di registrazione e la selezione di una finestra di energia centrata intorno a un elemento specifico. Mappe sono rappresentante del numero di eventi rilevati dalla posizione di fascio e quantitative. Rumore e sfondo sono simulati numericamente e filtrati. Inoltre, chemical mapping può essere utilizzato per estrarre lo spettro PIXE locale richiesto per la quantificazione.
Come illustrato nella Figura 2, fosforo è omogeneamente distribuito in cella con, come previsto, una concentrazione molto superiore nell'area nucleare. Potassio è distribuito in modo omogeneo il volume cellulare. Titanio è situato nella regione perinucleare citoplasmatica in forma di aggregati, come precedentemente osservato utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura 1). Dei criteri di rete visualizzata la stessa localizzazione perinucleare qualunque loro stato superficiale: funzionalizzati (Figura 1) o nativo (Figura 2). Nel frattempo, nessuna traccia di titanio è stata rilevata in cellule di controllo conferma che la distribuzione di titanio osservata da µ-PIXE deve essere attribuita al TiO2 NPs, in accordo con le nostre precedenti analisi mediante microscopia a fluorescenza.
Inoltre, come illustrato nella Figura 2, è possibile estrarre la distribuzione intracellulare di NPs e quantitativa NPs concentrazioni da specifiche regioni di interesse. Basato sulle mappe STIM e in correlazione con le distribuzioni di fosforo/potassio, analisi unicellulare è possibile.
Figura 3 : Analisi quantitativa singola cella usando µ-PIXE. Calcolata per celle illustrate nella Figura 2 singoli spettri di raggi x possono essere montati al fine di determinare la concentrazione dell'elemento al livello cellulare. Questa funzionalità è particolarmente interessante per l'analisi di NP dove le concentrazioni cellulari di solito mostrano forti variazioni all'interno della popolazione stessa. Ad esempio, per la stessa esposizione, l'intervallo di concentrazioni Ti da 0,2 fino a 1,8 µg.cm-2media. Controlli corrispondono a popolazioni di cellule non trattate. Dose di esposizione: 4 µg.cm-2. BoxPlot rappresentare la distribuzione delle singole concentrazioni cellulari con valore mediano (linea orizzontale) e bar che si estende verso più basso e più alto misurato valori. Cellule di controllo: N = 14; Esposto le cellule: N = 16.
Di conseguenza, abbiamo non solo quantificato il contenuto medio di titanio in una popolazione delle cellule ma anche mostrato la distribuzione di titanio per la cellula in una popolazione in una specifica condizione sperimentale. Il mediano contenuto di titanio misurato qui è abbastanza basso (500 ng.cm-2) rispetto alla dose di esposizione 4 µg.cm-2 della popolazione cellulare (Figura 3) e la variazione tra le cellule è grande (Ti concentrazioni gamma da 0,2 fino a 1,8 µg.cm -2 secondo cellule analizzate). Abbiamo anche notato un aumento di ioni intracellulari quali potassio e calcio in campioni esposti suggerendo un'omeostasi cellulare alterazione indotta dalla presenza di TiO2 NPs, come descritto in precedenza da diversi autori. 21 , 27
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Discussion
Descriviamo un metodo che fornisce informazioni utili di là di ciò che è possibile con altre tecniche di imaging, soprattutto a livello subcellulare. Oltre alla sua capacità di imaging, analisi della microsonda nucleare offre anche possibilità di quantificazione degli elementi chimici che entrano nella composizione di un campione biologico. Nel lavoro attuale, abbiamo studiato le popolazioni delle cellule umane e concentrata verso il basso per l'analisi di una regione selezionata di interesse basato su una singola cellula esposta a TiO2 NPs. La sua combinazione con altre tecniche fornisce sia morfologiche imaging cellulare e dati quantitativi precisi sulla composizione chimica elementare.
Per applicare con successo analisi nucleari della microsonda, è obbligatorio rispettare i seguenti punti per evitare potenziali insidie. In primo luogo, è indispensabile utilizzare un protocollo criogenico per la fissazione delle cellule al fine di mantenere la sua ultrastruttura e la sua integrità biochimica. In secondo luogo, è anche obbligatorio per eseguire l'analisi di campioni sottili con spessori inferiori a 20 µm. Se necessario, può essere eseguita la divisione dei campioni di cryofixed. Campioni devono assolutamente essere tenuti congelati. In terzo luogo, è anche importante tenere a mente che l'analisi della microsonda nucleare rivela una rappresentazione bidimensionale di campioni biologici. Così, la distribuzione di elemento chimico ottenuta è una proiezione bidimensionale che potrebbe provocare interpretazioni errate. Questa limitazione verrà ignorata in futuro tramite l'uso di acquisizione tomografica.
Analisi della microsonda nucleare presenta anche limitazioni. Deve essere sottolineato che il relativo vincolo principale è la necessità di eseguire analisi sotto vuoto. Pertanto, è imperativo utilizzare protocolli di fissazione delle cellule che conserva le cellule ultrastruttura e integrità biochimica. Pertanto è necessario testare la resistenza dei campioni biologici per la procedura di criogenia (senza l'aggiunta di resina chimica). Questo potrebbe limitare l'uso dell'analisi della microsonda nucleare.
Un'altra limitazione è l'accessibilità alle strutture per lo svolgimento di analisi della microsonda nucleare. I tempi assegnati fascio si limita quindi a volte, e questo è un vincolo aggiuntivo per questo tipo di esperimento che richiede tempo. Diverse ore sono spesso necessarie per un'acquisizione.
Questa tecnica è diversa da altri metodi analitici, compreso microscopia, plasma di spettrometria di massa (MS), ad accoppiata induttivo (ICP-MS), MS cromatografia liquida (LC - MS), MS e isotopo radioattivo. Questi ultimi sono infatti utilizzati per stimare la dose cellulare di elementi chimici, ma sono solo in grado di fornire informazioni a un macroscopico scala cioè su una quantità macroscopica di un campione. Nessuno di loro può dare accesso, come analisi della microsonda nucleare, ad un preciso rilevamento e mappatura di una dose subcellulare di elementi chimici specifici (ioni, in metallo o metallo ossido NPs). Questi dati aiutano l'accesso a un ulteriore studio sistematico della valutazione di dose-risposta.
La stima precisa della dose quando si studia l'interiorizzazione di NPs in cellule è cruciale da entrambi NP tossicologia e farmacologia punti di vista quantitativi. Come suggerito dal grande discrepanza nei contenuti NP osservati, che mostra una differenza di 10 volte tra il minimo e il massimo osservate concentrazioni (Figura 3), la concentrazione cellulare media potrebbe non essere un parametro rilevante per descrivere la fenomeno di esposizione delle particelle. Questo è particolarmente vero quando un effetto di soglia dovrebbe aver luogo perché disomogenea dose esposizione potrebbe portare alle osservazioni contraddittorie. Poiché la natura frazionata delle nanoparticelle appare chiaramente a livello cellulare, questo studio pertanto pone nuovamente la questione della rilevanza dei metodi basati sull'analisi di variabili globali in questioni intorno il comportamento delle cellule esposte a dosi non omogenee di contaminanti.
Come illustrato nel caso studiato qui, osservazione e quantificazione di NPs all'interno di singole celle ci permettono di comprendere meglio il bioaccumulo di elementi endogeni/esogeni come ossido di metallo NPs. Si tratta di un'attività critica per ulteriori applicazioni di NPs in biomedicina, dove una scarsa comprensione del sottostante distribuzione NP in cellule potrebbe portare a risultati male interpretati.
Questo protocollo mette in evidenza l'idoneità dell'utilizzo della microsonda nucleare analisi con altre tecniche per valutazioni future delle interazioni di NP con campioni biologici. L'approccio quantitativo fornisce informazioni sull'impatto di tali criteri di rete in termini di rilevamento, identificazione, localizzazione e quantificazione a livello di una singola cella.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Serge Borderes per regia e montaggio del video. La French National Research Agency supporta il programma di ricerca Titani (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). Il CNRS e la Comunità europea come un'attività di integrazione fornito il "supporto di pubblico e industriale ricerca utilizzando Ion fascio tecnologia (spirito)" sotto il CE contratto n ° 227012. Quest'opera è stata sostenuta da azioni Marie Curie - reti di formazione iniziale (ITN) come un "integrando attività di supporto post-laurea ricerca con stages in industria e formazione d'eccellenza" (SPRITE, D1.3) sotto contratto CE n. 317169. C'NANO Grand Sud Ouest e la regione Aquitania supportano il programma di ricerca TOX-NANO (n ° 20111201003) e il programma di ricerca POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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