Summary
Vi beskriver en procedur för detektion av kemiska grundämnen närvarande i situ i mänskliga celler samt deras in vitro- kvantifiering. Metoden är väl lämpad att vilken celltyp och är särskilt användbart för kvantitativa kemiska analyser i enstaka celler efter i vitro metalloxid nanopartiklar exponering.
Abstract
Micro-analytiska tekniker baserat på grundämne imaging aktiverar lokalisering och kvantifiering av kemiska sammansättning på cellnivå. De erbjuder nya möjligheter för karakterisering av levande system och är särskilt lämplig för att upptäcka, lokalisera och kvantifiera förekomsten av metalloxid nanopartiklar både i biologiska prover och miljön. Faktiskt, dessa tekniker som alla uppfyller relevanta krav i fråga om (i) känslighet (från 1 upp till 10 µg.g-1 i torrvikt), (ii) mikrometer spänna rumsliga upplösningen och (iii) flera element upptäckt. Med tanke på dessa egenskaper, microbeam grundämne imaging kan kraftfullt komplettera rutinmässiga avbildningstekniker såsom optisk och fluorescensmikroskopi. Det här protokollet beskriver hur du utför en nukleär microprobe analys på odlade celler (U2OS) exponeras för nanopartiklar av titandioxid. Cellerna måste växa och exponeras direkt i en specialdesignad provhållaren som används på det optiska mikroskopet och i de nukleära microprobe analysis stadierna. Plunge-frysa kryogen fixering av proverna bevaras både cellulära organisationen och grundämne distribution. Samtidiga nukleära microprobe analys (skanning överföring ion mikroskopi, Rutherford backscattering spektrometri och partikel inducerad röntgenstrålning) utförs på prov ger information om cellulära densiteten, den lokala fördelningen av de kemiska grundämnena som cellulära innehållet av nanopartiklar. Det finns ett växande behov av sådana analytiska verktyg inom biologi, särskilt inom framväxande nanotoxikologi och nanomedicin som vår förståelse av samspelet mellan nanopartiklar och biologiska prover måste fördjupas. I synnerhet som nukleära microprobe analys inte kräver nanopartiklar märkas, är nanopartiklar sammansättning mätbara nivån i enskild cell i en cell befolkningen, oberoende av deras ytbehandla statligt.
Introduction
Cellulära homeostas bestäms av upptag kontroll, assimilering och intracellulära lokalisering av olika spårämnen (joner, metaller, exogena oorganiska föreningar). Dessa komponenter är ofta i form av spår, men ändå kan ha en betydande inverkan i systemet fysiologi. Studien av cell biokemi i både normala och patologiska/stressade situationer är således ett nyckel-steg mot en övergripande förståelse för cellulära metaboliska mekanismer. Utvecklingen av imaging och analytiska tekniker som gör det möjligt för utredning av intracellulära kemisk sammansättning, strukturella organisationen och deras relaterade metabola funktioner blir därför nödvändigt. Mycket få metoder kan ge en i situ kvantitativa bit av information rörande ett givet prov övergripande kemiska natur. Förutom metoder analysera prover i formuläret bulk, i situ analyser överväga biologiska prover i deras integrality utan att förlora vikt och strukturell information, därigenom bevara deras kemiska beståndsdelar (spårämnen och joner) och proteiner. Dessutom nanovetenskapen fortsätter att utveckla, kommer förbättrad bildhantering och analysmetoder för miljöövervakning på cellulär nivå att behöva iaktta och kvantifiera nano-objekt beteenden och interaktioner. 1
Nanopartiklar (NPs) har definierats som objekt som uppvisar minst en ansiktsbehandling dimension i intervallet 1 och 100 nm. 2 på grund av deras särskilt fysikalisk-kemiska egenskaper, NPs flitigt inom industrin. NPs är anställda i bio-applikationer och nanomedicin. 3 , 4 trots NPs talrika fysikalisk-kemiska egenskaper, kan de generera vissa risker för negativa effekter på människors hälsa och miljön. Dessa risker kan induceras av både långvarig och upprepad exponering vid olika koncentrationsnivåer och detta har ännu inte klart fastställts. 5 , 6 , 7 , 8 i synnerhet öde NPs inuti celler och de associerade cellulära svar är, hittills, inte fullständigt beskrivna. Detta beror delvis på brist på metoder som tillåter detektion och kvantifiering av internaliserade NPs i en enda cell. 9
De klassiska analytiska verktyg som används för att uppskatta den cellulära dosen av nanopartiklar är microscopies, masspektrometri (MS), kopplad induktivt plasma MS (ICP-MS)10,11 och vätskekromatografi MS (LC-MS), men de ger bara matnyttigt på makroskopiska skalan. Ingen av dem kan ge en noggrann utvärdering av subcellulär NPs innehållet heller NPs fördelningen utan användning av fraktionering metoder. En systematisk bedömning av dos-respons är således omöjligt med dessa metoder, i motsats till metoder baserade på atomspektroskopi såsom nukleära microprobe analysis12,13, synchrotron X-ray fluorescensmikroskopi14 , och sekundära Ion Mass Spectrometry (SIMS). 15 , 16 dessa metoder är särskilt intressant eftersom de kompletterar observationer gjorda med fluorescensmikroskopi, särskilt när NPs inte märkas med fluorescerande molekyler och därmed studeras i sitt ursprungliga tillstånd. I viss mån även när NPs ympas med fluorophores, förblir (i) kvantifiering svårt eftersom taggning per NP är okänd och (ii) kemisk modifiering av NP ytan kan ändra dess cellulära distribution.
I denna artikel, vi fokuserar på en metod som bygger på en kombination av nukleära microprobe tekniker syftar till att imaging av morfologi och elementärt sammansättning av biologiska prover i dur, moll, och spåra koncentrationer.
Nukleära microprobe analys visar sig vara särskilt lämpliga för mätning av kemiska spårämnen i biologisk vävnad. Både beam lateral upplösning (0,3 till 1 µm) och känslighet i grundämne upptäckt (från 1 till 10 µg.g-1 torr massa) är väl lämpade för studier på cellulär nivå. Nukleära microprobe tekniker baseras på partiklar upptäckt (fotoner, elektroner, joner) som släpps ut efter den ion beam (vanligtvis kör på MeV energier) interagerar med atomer i provet. Interaktioner som sker i cellerna är främst: 1) excitation/jonisering av atomer följt av ett utsläpp av fotoner efter atomer återvända till sitt grundläggande tillstånd; och 2) diffusion av inkommande partiklar som leder till förändring i deras energi och riktning. Mätning av utsläppta partikel energi allowsthe identifiering av atomer som är inblandad i interaktionen. För att utföra kartläggning av element, söks den ion microbeam upprepade gånger över provet ytan, ofta över ett område på ca 100 av 100 µm2 innehållande flera celler. Utsläppta partiklar upptäcks och deras energi registreras för varje balk position. Sortering av partiklar enligt balken position, är således identifiera strukturen som ansvarar för utsläpp av sådana partiklar syftet med data behandling. Här beskriver vi just en strategi baserad på fluorescensmikroskopi och nukleära microprobe analys att upptäcka samt att kvantifiera exogena NPs på de cellulära och sub cellulära skalorna, för att undersöka konsekvenserna av NP interaktioner med levande system. Vi ska särskilt fokusera på de möjligheter som erbjuds genom denna metod när det gäller i situ kvantifiering av titandioxid nanopartiklar (TiO2 NPs) aggregat på subcellulär nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. innehavaren provberedning
-
Urvalsmetod som innehavaren och förberedelse
- Tillverka en provhållare genom att borra ett 5 x 5 mm torg i en 1 mm tjock PEEK ram.
- Rengör genom att skölja med etanol 70% (v/v) och hålla i sterila plattor förrän du är klar att använda.
Observera. En provhållare som är lämpliga för cellodling och cell hantering krävs. Det måste utformas för cell odling, in vitro- observationer med optisk mikroskopi, och kärn microprobe analysis och imaging. Denna hållare är tillverkad av en PEEK ram13.
- Innehavaren provberedning
- Bered den Formvar genom upplösning 1 mg Formvar pulver i 100 mL kloroform.
- Stretch polykarbonat folien på en metallisk ram så att den presenterar inga vik.
- Använd en steril spets för att sprida Formvar lösningen runt provet innehavaren hålet.
- Lägg ner försiktigt provhållaren med lim på sträckt polykarbonat folien (en 5 x 5 mm Fyrkant).
- Upprepa föregående sekvensen för att förbereda en provhållare för varje replikat.
Observera. Polykarbonat (PC) filmen är biokompatibla, tillräckligt tjock och motståndskraftig mot de olika protokoll och analytiska begränsningar.
Försiktighet- kloroform är giftigt. Undvik inandning, förtäring eller kontakt med huden. Använd alltid en väl fungerande kemiska spiskåpa och lämpliga filter.
- Prov innehavaren sterilisering
- Placera monterade provhållaren i en konisk kolv med 50 mL etanol 70% (v/v) enligt agitation vid 180 rpm och + 37 ° C över natten, med en inkubator/agitator.
- Skölj innehavaren flera gånger i sterilt destillerat vatten.
- Luft torka dem i sterila förhållanden och utsätta dem för ultraviolett ljus (bakteriedödande lampa från biosäkerhet bänk, klass II) i 30 min på varje sida.
- Hålla proverna i sterila 12 brunnar (en provhållare per brunn) förrän du är klar att använda.
Obs: Flera innehavare av prov kan förvaras vid rumstemperatur i sterila och torr 12 brunnar förseglade med parafilm under flera dagar.
2. tillväxt av celler i lämpliga provhållaren.
Varning: Protokollet skall utföras i en biosäkerhet laminär bänk (klass II) att utesluta kontaminerande mikroorganismer. Hantera antibiotikummar (e.g. penicillin, streptomycin) med handskar. Respektera bästa praxis vid hantering av biologiskt material (cellinjer, genetiskt modifierade härlett mänskliga celler).
Kritisk: de cellinjer som används bör kontrolleras så att de inte är infekterade med Mycoplasma.
- Transfect U2OS cellinje med plasmiden bär Matrix-roGFP 17,18,19 med en transfection metod i enlighet med protokoll som fastställts av tillverkaren.
- Att bekräfta transfection med plasmid-biosensor och förhindra förlust av plasmid, markera och underhålla de transfekterade cellerna på det lämpligt odlingsmediet.
- Visualisera transfekterade celler genom fluorescensmikroskopi att säkerställa transfection har uppstått och att bekräfta uttrycket av fluorescensen och visning av en retikulära och tubulära mitokondriella nätverk19.
Pausa punkt: Celler kan frysas i flytande kväve under flera år. - Använda transfekterade cell befolkningen genom att odla cellerna i ett lämpligt medium för att erhålla sub konfluenta cellpopulationer. Odla cellerna vid 37 ° C, 5% (v/v) CO2 i en mättad vatten atmosfär.
- Utsäde celler i en koncentration, som de är på 80% confluence dagen för fixering. Vanligtvis, en koncentration av 500 celler per µL kunde användas. Skörda celler med 400 µL av Trypsin-EDTA 0,25% (v/v) och hålla i 3 minuter vid 37 ° C. Stoppa trypsin action 1 mL odlingsmedium. Pellet cellerna genom centrifugering för 5 min på 230 x g och + 4 ° C, sedan ta bort supernatanten och tillsätt önskad mängd färskt odlingssubstrat.
Not. Protokollet är tillämpligt för alla cellulära typer och antalet celler som seedade är beroende på Cellstorlek och cell fördubbling tid.
Varning: Undvik att utsätta trypsin, antibiotika och serum för upprepad frysning-tining cykler. Hålla dem sterila. Dela stamlösning i alikvoter och frysa dem vid −20 ° C. Lagra alikvoter tills utgångsdatumet. Skölj noggrant cellpelleten för att helt ta bort trypsin. Spår av kvarvarande trypsin kommer att försena och minska plätering effektivitet. - Räkna cellerna och utföra en utspädning med färska komplett odlingsmedium hålls vid 37 ° C för att få en cellsuspension med 500 celler per µL.
Obs: Koncentrationen av cellsuspensionen måste anpassas som en funktion av celltypen, för att platta en 40 µL droppe. - Plåt en 40 µL droppe på mitten av polykarbonat folien. Noggrant placera provet för 2 h vid + 37 ° C, 5% (v/v) CO2 på en mättad vatten atmosfär.
Kritisk: När provet placeras i ruvmaskinen, begränsa så mycket som möjligt någon mekanisk rörelse för att gynna snabba cell fastsättning. Enligt celltypen, kan det vara nödvändigt att Inkubera cellerna längre än 2 h för optimal platting effektivitet. Kontrollera mättad att inkubator atmosfären är väl för att förhindra droppar avdunstning. - Kontrollera att cellerna är väl fäst på polykarbonat folien med ett optiskt mikroskop. Försiktigt och tillsätt 2 mL av färska komplett medium och hålla för 24 h.
3. nanopartiklar förberedelse och exponering
Obs: Fluorescerande färgämne-modifierade TiO2 NPs var utformad, syntetiseras, och kemiskt modifierade med tetrametyl rodamin fluoresceinisothiocyanat (TRITC). 20 , 21 denna ytmodifiering kan nanopartiklar upptäckt, spårning och lokalisering i situ och i cellulo i både levande och fasta celler eller i flercelliga organismer. 12 , 13 , 18
Varning: Nanomaterial och nanopartiklar måste hanteras med försiktighet. Undvik inandning, förtäring eller kontakt med huden. För att förhindra spridning i luft, underhålls nanopartiklar i lösning (ultrarent vatten).
- Bered en suspension av 1 mg.mL−1 TiO2 NPs i ultrarent vatten. Skingra de TiO2 NPs använder intensiv 1-min ultraljudsbehandling pulser på RT (750 W, 20 kHz, amplitud: 30%) med hjälp av en ultra ljud generator och en dedikerad koniska microprobe.
- Späd TiO2 NPs på önskad koncentration i odlingsmediet för att få en exponering suspension av 4 µg.cm−2 (slutlig koncentration). Ersätta mediet med lämplig volym av medium innehållande NPs på celler och blanda försiktigt för homogen fördelning av TiO2 NPs. förbereda kontroll celler på samma sätt utan tillsats av TiO2 NPs.
- Inkubera av cellpopulationer för 24 h vid 37 ° C, 5% (v/v) CO2 och en mättad vatten atmosfär.
4. PARAFORMALDEHYD fixering och fluorescence mikroskopi.
- Bered en färsk PARAFORMALDEHYD lösning (PFA, 4% w/v) buffras i fosfat buffert saltlösning (PBS, pH 7,4).
- Lös 4 g av PFA pulver i 100 mL PBS. Värm lösningen till 65 ° C under omrörning med hjälp av en magnet och en magnetomrörare i dragskåp. Öka pH genom att tillsätta 1 M NaOH en droppe i taget tills lösningen klarnar. Kyl lösningen till rumstemperatur och justera pH till 7,4. Använd nyberedda lösningen omedelbart eller hålla vid + 4 ° C och skyddas från ljus.
Obs: Färdiga PFA lösningar kan användas emellertid en omedelbar beredning av PFA garanterar bättre fixering kvalitet och långsiktigt bevarande av de fasta proverna.
Varning: PFA är giftiga; Undvik inandning, förtäring eller kontakt med huden. Använd alltid en väl fungerande kemiska spiskåpa och lämpliga filter.
- Lös 4 g av PFA pulver i 100 mL PBS. Värm lösningen till 65 ° C under omrörning med hjälp av en magnet och en magnetomrörare i dragskåp. Öka pH genom att tillsätta 1 M NaOH en droppe i taget tills lösningen klarnar. Kyl lösningen till rumstemperatur och justera pH till 7,4. Använd nyberedda lösningen omedelbart eller hålla vid + 4 ° C och skyddas från ljus.
- En gång, inkubationstiden förflutit, ta bort den cellodlingsmedium som innehåller de TiO2 NPs. Skölj cellen befolkningen en gång med färska odlingsmedium och en gång med PBS (2 mL). Ta bort PBS, skölj snabbt med en alikvot av färska och kalla PFA (4% w/v, + 4 ° C).
- Lägg till PFA (2 mL, 4% w/v, + 4 ° C). Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Ta bort PFA, skölj cellerna med PBS (2 mL, 3 gånger, 5 min) under agitation.
Pausa punkt: Dessa kemiskt fasta prover kan användas för ”plunge-freeze” förfarandet efter fluorescens imaging (gå till steg 5) eller användas för fluorescens imaging (gå till steg 4,3).
- Fläcken kärnan med Hoechst33342 ruvning cellerna för 10 min i PBS. Hoescht33342 används med en slutlig koncentration av 500 nM. Efter inkubation bort lösningen och skölj med PBS.
Varning: Hoechst33342 är cell diffusionskoefficient och kan vara giftig. Undvik direkt kontakt och Använd handskar samtidigt förbereda och använda Hoechst33342.
Kritisk: säkerställa att den Hoechst33342 färgning lösning nymalen är beredd och upprätthålls i sterila förhållanden. - Processen fasta prover för in situ och enda cell bildåtergivning med fluorescensmikroskopi (figur 1).
5 "steget-frysning” fixering och uttorkning
- Förbereda en aluminiumplåt för överföring genom att kyla det i flytande kväve. Store plattan i en låda fylld med flytande kväve och upprätthålla den platta ytan ovanför vätskan i kalla kväve dunsten.
Obs: Överföring plattan kan göras av någon metallisk plattan (här, vi använde aluminium) som kunde kylas ned till flytande kväve temperatur och som kan ange den frystork provkammaren.
Kritisk: Rutan bör hållas stängda så mycket som möjligt för att förhindra vatten förångningsdeposition tryckytan kall tallrik. Provet förvaras på plattan under beredning bör inte omfattas av flytande kväve. - Skölj cellerna en gång i odlingsmedium och sedan två gånger mer, kort, i sterila och ultrarent vatten för att få bort några spår av återstående extracellulära salter.
Kritisk: Säkerställa att media nymalen är beredd och upprätthålls i sterila förhållanden. Värm alla medier vid 37 ° C innan de används. Sköljningen måste vara mycket kort (några sekunder) och överskottet av vätska på proverna tas bort så fort som möjligt. - Plunge-frysa cellerna på-150 ° C i flytande kväve-kylda 2-methylbutane under 30 s och plats överföra dem på aluminium plattan. Lagra prover här under utarbetandet av alla andra prover. När proven är alla cryofixed, överföra allt-i-gång genom att placera överföring plattan i en frystork.
Kritisk: Den övergripande cryofixation-processen bör inte pågå mer än 20 min för att förebygga strukturella ändringar att visas i prover som tillfälligt lagras i rutan överföring. - Kaseinbanden proverna med följande sekvenser: 1) utföra en primär uttorkning för 12 till 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) vid lågt tryck och låg temperatur, då 2) utföra en sekundär uttorkning fas för minst 24 h, öka plattan temperaturen till + 40 ° C samtidigt som trycket låg (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
Varning: Flytande kväve är extremt kallt och kan orsaka svåra köldskador eller ögat skador vid kontakt. Använd anpassade bänken övre behållare för transport och bära säkerhetsutrustning (kryogen handskar, skyddsglasögon och ansikte).
Försiktighet: 2-Methylbutane är extremt brandfarligt. En skadlig förorening av luften kan nås ganska snabbt på avdunstning av detta ämne vid + 20 ° C. Undvik inandning, förtäring eller kontakt med huden. Använda andning och skyddsglasögon och skyddshandskar. Använd alltid en väl fungerande kemiska spiskåpa. Kan förvaras vid + 4 ° C.
Kritisk: Använd en lämplig termometer (-150 ° C) att övervaka temperaturerna som 2-Methylbutane under ”Plunge-freeze” session. Den 2-methylbutane måste förvaras svalt i en flytande fas. Överföra cryofixed prover till den omgivande atmosfären kan orsaka cellskada beror på temperaturökning eller vattenånga kondenserande på prov ytan. Följaktligen överföringen bör göras så fort som möjligt (30 s)
Pausa punkt: Efter cryofixation, kan prov förvaras vid rumstemperatur i flera dagar i sterila och torra förhållanden (skyddad från damm och fukt). Noggrant hantera proverna med fin pincett och placera dem i en steril 12-well platta förseglade med parafilm. Torkmedel kan användas för att torka atmosfären.
6. nuclear Microprobe Analysis
Obs: Nuclear Microprobe analys genomfördes på raden microbeam i AIFIRA (ansökningar Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions sv Région Aquitaine) med hjälp av kompletterande ion beam analytiska tekniker partikel inducerad röntgenstrålning (µ- PIXE) och skanning överföring Ion mikroskopi (µ-STIM). Anläggningen är baserad på en 3,5 MV partikelaccelerator leverera ljus ion balkar i intervallet MeV energi. 22 , 23
Pausa punkt: AIFIRA är en ion beam anläggning värd av universitetet i Bordeaux som erbjuder tillgång till nationella och internationella lag efter vetenskaplig utvärdering av föreslagna experiment.
- Montera PEEK prov innehavare på ett s plattan med hjälp av dubbelhäftande tejp.
- Placera plattan stödja prov i ett vertikalplan som är vinkelrätt mot balken riktning.
- Stäng analys kammaren och vakuum analys kammaren.
- Scanning överföring Ion mikroskopi (µ-STIM)
Obs: STIM är används för att registrera ytdensitet kartor över celler efter konvertering av energiförluster till cellulära massa, att dra nytta av det faktum att energiförlusten är proportionell till provet areala tätheten (uttryckt i µg.cm-2).- Använd en 2 MeV Helium (han+) microbeam som en sond med en storlek i fokalplanet på cirka 300 nm i diameter och på låga flyt (2000 ions.s-1). Mäta energin av de överförda jonerna med en planar kisel detektor (PIPS detektor, 25 mm2, 11 keV energi resolution @ 5,4 MeV), placerad bakom provet i beam axel.
- Partikel inducerad röntgenstrålning (µ-PIXLAR) och Rutherford Backscattering spektrometri (µ-RBS).
Obs: µ-pixlar och µ-RBS analyser ger den rumsliga fördelningen och kvantifiering av kemiska grundämnen med en sub mikrometer upplösning.- Använd en 1,5 MeV proton (H+) microbeam (50-150 pA), fokus ner till en diameter på 1 µm och skanna över samma celler av intresse fläckig av STIM från 4 till 8 timmar och cirka 100 x 100 µm2.
- Samla induced X-ray fotoner som avges från atomer i provet (tyngre än Na) med en högupplöst Si(Li) solid-state detektor (145 eV energi upplösning, @Mn-Kα) placerad vid 45 ° från inkommande beam axel. Använd upptäckta fotonenergin för att identifiera vilken typ av sändare (t.ex. Z element) och röntgen intensitet för att bestämma element koncentrationen.
- Samtidigt samla bakåtspritt protoner-135 ° med en silicon detektor (delvis utarmat detektor, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) att mäta det totala antalet inkommande partiklar och att normalisera röntgen stödnivåer.
Kritisk: En samling av certifierad kalibrering standarder för atomic koncentration kvantifiering används för att kalibrera röntgen detektorns reaktion. Referensmaterial finns en samling av tunna Atom filmer deponeras på 6,3 µm tjock Mylar folier. Som avges röntgen energier intervallet 0,6 (Li, K line) till 20,2 keV (Rh, K line).
7. dataanalys
- Rekonstruera kemiska elementärt kartor använder IBA-J plugin för ImageJ. 24
Obs: Särskild programvara i form av en plugin för ImageJ har utvecklats för att bearbeta raw nukleära microprobe analysdata. RAW-data motsvarar en lista över händelser som härrör från partikelstråle interaktion med celler som registreras tillsammans med beam positionen som en kronologisk sekvens.- Använda IBA-J plugin för att sortera händelser beroende på typ: överförs ion energi (STIM), bakåtspritt ion energi (RBS) eller röntgen fotonenergi (PIXE). Bearbeta sedan, separat varje typ av data.
- Beräkna STIM området densitet karta
- Beräkna genomsnittlig röntgen photon energy spectra och definiera för varje grundämne av intresse ett energifönster för att hämta element rumslig distribution.
- Definiera områden av intresse (ROI) (t.ex. enskilda celler, tät struktur, aggregat, etc) och beräkna motsvarande röntgen spektra.
- Analysera motsvarande RBS spektra för att beräkna det totala antalet infallande partiklarna25.
- Passar röntgen spectra med den Gupix programvara26 för att bestämma element koncentration för varje ROI.
Obs: Typisk detektionsgräns (LOD) för metoden är i intervallet 1 till 10 µg.g-1 i torrvikt beroende på atomnummer element (LOD minskar med Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellodling och fluorescens avbildning av fluorescently märkt TiO 2 NPs
Vi har utformat en provhållare anpassad för cellodling, cell hantering samt multimodal analys. Bestämt var det viktigt att innehavaren tillåtna rutinmässiga optisk mikroskopi som väl som nukleära microprobe analys och imaging. Detta provhållaren är baserat på en 2 µm tjockt polykarbonat folie deponeras på en PEEK ram. Celler odlas direkt på polykarbonat, i sterila odlingsbetingelser i flera dagar och sedan används för olika experimentella inställningar, till exempel NPs exponering.
Den kemiska ytmodifiering med fluorophores (TRITC) tillåtet detektion av TiO2 NPs samt deras i situ och in vitro- lokalisering i levande eller PARAFORMALDEHYD fast celler med fluorescensmikroskopi. I cellkärnan och mitokondrier var målat med vitala-färgämnet Hoechst33342 (blå för kärnan) och de transfekterade Matrix-roGFP (grön för mitokondrier), respektive. Detta flera färgning tillåts den intracellulära lokaliseringen av de TRITC-TiO2 NPs (av dess röd avger fluorescens) 20 h efter exponering. NPs hittades endast i cytoplasman i utsatta celler med ingen upptäckt i kärnan. NPs var slumpmässigt lokaliserade i regionen perinukleära i cytoplasman och helt uteslutna från mitokondrierna (någon överlappning mellan TRITC och god Jordbrukarsed signaler).
Även om fluorescensmikroskopi är mycket användbara för att lokalisera NPs inuti exponerade cellerna, är det inte kunna bedöma det exakta antalet NPs per cell. Den största svårigheten av fluorescensmikroskopi om kvantifiering av NPs är kopplat till osäkerheten om (i) antalet fluorophores bifogas en given NP och valt fluorophore blekning stabilitet under observationen och (ii) aggregation tillstånd av NPS-servern inuti cellen.
Figur 1 : in vitro- och in situ fluorescens avbildning av U20S transgena celler som uttrycker Matrix-RoGFP och utsätts för TRITC-TiO 2 NPs. U2OS celler (överst) märkt med Hoechst33342 (blå), Matrix-roGFP (grön) utsätts för 4 µg.cm-2 TRITC-märkt TiO2 nanopartiklar (röd) för 20 h. observationer visar att TiO2 NPs samlade i celler i en perinukleära regionen. Skalstapeln: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Att övervinna dessa brister, nukleära microprobe analysis techniquesprovide en kompletterande strategi för den konventionella optisk mikroskopi på grund av sin känslighet för de nationella parlamenten som förbjuder användning av någon mellanliggande signal som fluorescens från en ympade Dye. Dessutom är de också fullt kvantitativa, som tillhandahåller data om a sub cellulära biokemiska innehåll som annars är okänd, och (ii) den intracellulära mängden NPs på enstaka cellnivå.
Cryofixation av celler efter levande imaging.
Den högsta begränsningen i utföra kärn microprobe analys är att arbeta under vakuum villkor. Vi har utvecklat ett cell fixering protokoll möjliggör bevarandet av den biologiska ultrastruktur och biokemiska integriteten av biologiska prover. Kemiska fixering är känt att ändra spårämnet sammansättningen av celler eftersom det kräver ersättning av deras cellulära medium av en polymer som används för att bevara den cellulära ultrastruktur. Dessutom släpper avlägsnande av vatten också fria joner och andra arter, som ändrar totalt prova sammansättning. Därför blir det obligatoriskt att ge prioritet åt en fysisk fixering metod, särskilt kryogen metoder. Dessa kryogen förfaranden inducera ett snabbt upphörande av cellulär aktivitet och detta, i millisekund tidsskalan.
Nukleära microprobe analysis mikroskopi och kvantifiering av NPs på en cellulär nivå.
Scanning överföring ion mikroskopi (µ-STIM) och partikel-induced X-ray emission (µ-PIXLAR) analys utfördes på prov efter cryofixation och uttorkning att få precisa kvantitativa uppgifter om deras elementär kemisk sammansättning.
µ-STIM bilder visade de lokala skillnaderna i densitet och tillåter detektion av cellstrukturer såsom kärnan och cytoplasman. Även om beam laterala upplösningen möjliggör observation av täta strukturer så smal som 300 nm bred, liknande tunn aggregat synliga här i cytoplasman, STIM metoderna inte kan diskriminera NP aggregat och andra täta cellulära strukturer. Detta beror på, liksom för transmissionselektronmikroskopi (TEM), den fysiska process som leder till variation i överförd energi är samspelet mellan inkommande jonen med Atom elektron molnet. Till skillnad från TEM analys dock förhindra eftersom volymen hela cellen analyseras, lokala tjocklek varianter diskriminering mellan hög-Z strukturer och en lokal ökning av cellulära densitet.
Figur 2 : Bilder av densitet och elementärt distribution erhålls genom µ-STIM och µ-PIXLAR på cryo-fast U2OS celler. U2OS kontroll celler (upp) jämfört med utsatt cryo-fast U2OS celler (utsätts för 4 µg.cm-2 TiO2 NPs ner) och observerade använder kärnkraft microprobe analysis/mikroskopi. STIM mikroskopi (vänster, gråskala kartor) avslöjade täta intra - eller extra - celler strukturer (nucleus, salt aggregat, nanopartiklar). Den rumsliga upplösningen (300 nm) är jämförbar med fluorescensmikroskopi och visar strukturer såsom NP aggregat i regionen perinukleära. Identifiering av strukturer som bygger endast på deras densitet kan ändå vara tvetydiga. µ-PIXE elementärt kartorna för K, P och Ti (termisk färgskala) är kompletterande till µ-STIM kartor. De kan användas för att säkerställa förekomst av NPs i celler. Varje cell kan analyseras individuellt när det gäller element koncentration (se figur 3). Skala barer: 10 µm. färgskalor sträcker sig från minimum (blå) till maximal intensitet (grå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som illustreras i figur 2, tillåter µ-STIM rendering erkännandet av enskilda celler inom både en befolkning och också intracellulära sub fack såsom nucleolus och kärnan. Tyvärr, och som nämnts tidigare, kunde NPs inte alltid identifieras med µ-STIM återuppbyggnad.
Partikel-induced X-ray emission (µ-PIXLAR) analys ger inte bara den kemiska sammansättningen av provet men också deras elementär mappning (figur 2). Under samspelet med spännande balken genomgå de kemiska grundämnena Atom excitation-de-magnetiseringen processer som så småningom leder till utsläpp av en foton som uppvisar karakteristiska energi av atomic antalet elementet upphetsad. En karakteristisk topp spektrum är byggd från summan av alla avgivna fotonen händelser och anses en kemisk signatur av provet.
Standard försöksuppställningar och detektorer används för µ-PIXE experiment tillåter samtidiga kvantifiering av alla grundämnen tyngre än Na med en 1 till 10 µg.g−1 torr massa detektionsgränsen. Noggrannhet i mätningen elementärt koncentrationer är vanligtvis begränsad till omkring 20% på grund av kostnad insamling och detektor effektivitetsvinster.
I denna studie är distributionen av element som kalium och fosfor och kvantifiera den intracellulära mängden TiO2 NPs med Titan kartläggning observeras av nukleära microprobe analysis. Grundämne kartor beräknas efter fotonerna sorteras enligt balken positionen vid tidpunkten för inspelningen och val av en energifönster centrerad kring ett specifikt element. Kartorna är representativa för antalet upptäckta händelser vid beam position och är kvantitativa. Både buller och bakgrunden är numeriskt simuleras och filtreras bort. Dessutom kan kemiska mappningen användas för att extrahera det lokala PIXE-spektrum som krävs för kvantifiering.
Som illustreras i figur 2, fosfor distribueras likartad i cellen med, som väntat, en mycket högre koncentration i det nukleära området. Kalium är homogent fördelade i cell volymen. Titan är beläget i regionen cytoplasmiska perinukleära i form av aggregat, som tidigare observerats med fluorescensmikroskopi (figur 1). NPs visas samma perinukleära lokaliseringen oavsett deras ytbehandla statligt: functionalized (figur 1) eller ursprungliga (figur 2). Samtidigt upptäcktes inga spår av Titan i kontroll celler bekräftar att Titan distributionen iakttas av µ-PIXE måste hänföras till TiO2 NPs, i samförstånd med våra tidigare analyser av fluorescensmikroskopi.
Som illustreras i figur 2, är det dessutom möjligt att extrahera intracellulära distribution av NPs och kvantitativa NPs koncentrationer från specifika regioner av intresse. Baserat på STIM kartor och i samband med den fosfor/kalium distributioner, är enda cell analys möjlig.
Figur 3 : Enda cell kvantitativ analys med µ-PIXE. Enskilda röntgen spectra beräknas för celler som visas i figur 2 kan monteras för att bestämma element koncentration på cellnivå. Den här funktionen är särskilt intressant för NP analys där cellulära koncentrationer brukar Visa starka variationer i samma population. Till exempel för samma innebära exponering, intervallet Ti koncentrationer från 0.2 upp till 1,8 µg.cm-2. Kontroller motsvarar obehandlad cellpopulationer. Exponeringsdos: 4 µg.cm-2. Boxplots representerar fördelningen av enskilda cellulära koncentrationer med medianvärdet (horisontell linje) och barer utökas mot lägsta och högsta uppmätta värden. Styra celler: N = 14; Utsatt celler: N = 16.
Därför har vi inte bara kvantifierade den genomsnittliga halten av Titan i en cell befolkningen men också visat Titan fördelningen per cell i en befolkning i ett visst experimentella villkor. Median innehållet i Titan mätt här är ganska låg (500 ng.cm-2) jämfört med 4 µg.cm-2 exponering dosen av cell befolkningen (figur 3) och variationen mellan celler är stor (Ti koncentrationer varierar från 0.2 upp till 1,8 µg.cm -2 enligt de analyserade cellerna). Vi har också märkt en ökning av intracellulära joner som kalium och kalcium i exponerade prover tyder på en cellulär ändring homeostas orsakas av förekomsten av TiO2 NPs, som tidigare beskrivits av flera författare. 21 , 27
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metod att ge användbar information utöver vad som är möjligt med andra avbildningstekniker, särskilt på subcellulär nivå. Förutom sin imaging förmåga erbjuder nukleära microprobe analysis också möjligheter för kvantifiering av kemiska beståndsdelar in i sammansättningen av ett biologiskt prov. I detta arbete, vi har studerat mänsklig cellpopulationer och fokuserar ner till analysen av ett valt område av intresse baserat på en enda cell utsätts för TiO2 NPs. Dess kombination med andra tekniker ger både morfologiska cellular imaging och precisa kvantitativa uppgifter om elementär kemisk sammansättning.
För att framgångsrikt använda nukleära microprobe analysis, är det obligatoriskt att respektera följande punkter för att undvika eventuella fallgropar. Först, är det absolut nödvändigt att använda en kryogen protokoll för cell fixering för att behålla dess ultrastruktur och dess biokemiska integritet. För det andra är det också obligatoriskt att utföra analys av tunn prover med tjocklek under 20 µm. Om det behövs, kunde snittning av cryofixed prov utföras. Prover bör absolut hållas frysta. För det tredje, det är också viktigt att komma ihåg att kärnkraft microprobe analys visar en tvådimensionell representation av biologiska prover. Således är grundämne distribution erhålls en tvådimensionell projektion som möjligen skulle kunna införa feltolkningar. Denna begränsning kommer att förbigås i framtiden genom användning av tomografiska förvärv.
Nukleära microprobe analys har också begränsningar. Det måste betonas att dess huvudsakliga begränsningen är behovet av att utföra analys under vakuum. Därför är det absolut nödvändigt att använda cell fixering protokollen som celler ultrastruktur och biokemiska integritet bevaras. Det är därför nödvändigt att testa motståndet av de biologiska proverna till förfarandet cryogenics (utan tillsats av kemiska harts). Detta kan begränsa användningen av kärnkraft microprobe analysis.
En annan begränsning är tillgängligheten till anläggningar för att utföra kärn microprobe analysis. De tilldela beam gånger begränsas därför ibland och detta är en ytterligare begränsning för denna typ av tidskrävande experiment. Ofta behövs flera timmar för ett förvärv.
Denna teknik skiljer sig från andra analysmetoder, inklusive mikroskopi, masspektrometri (MS), induktivt kopplad plasma MS (ICP-MS), vätskekromatografi MS (LC - MS), och radioaktiva isotopen. Det senare är verkligen används för att uppskatta den cellulära dosen av kemiska grundämnen men de är bara kunna lämna information på en makroskopisk skala dvs på en makroskopisk mängd prov. Ingen av dem kan ge tillgång, liksom nukleära microprobe analysis, till en exakt identifiering och kartläggning av en subcellulär dos av specifika kemiska grundämnen (joner, metall eller metall oxid NPs). Dessa data hjälper åtkomst till en ytterligare systematiska studier av dos-respons utvärdering.
Precisa uppskattningen av dos när man studerar internalisering av NPs i celler är avgörande både kvantitativa NP toxikologi och farmakologi synvinkel. Som föreslagits av den stora diskrepansen i observerade NP innehållet, som visar en 10-faldig skillnad mellan minimum och maximum observerade koncentrationer (figur 3), den genomsnittliga cellulära koncentrationen kanske inte en relevant parameter att beskriva den fenomen av partikel exponering. Detta gäller särskilt när en tröskel effekt är tänkt för att ske eftersom inhomogena dos exponering kan leda till motstridiga synpunkter. Eftersom den fraktionerade naturen av nanopartiklar visas tydligt på cellnivå, ställer denna studie därför igen frågan om betydelsen av metoder baserade på analysera globala variabler i att ta itu med frågor kring uppförandet av celler utsätts för inhomogena doser av föroreningar.
Som illustreras i de fall som studerats här, tillåter observation och kvantifiering av NPs inom enskilda celler oss att bättre förstå bioackumuleringen av endogena/exogena faktorer såsom metalloxid NPs. Detta är en kritisk aktivitet för ytterligare tillämpningar av NPs i biomedicin, där en dålig förståelse av de underliggande NP distribution i celler kan leda till misstolkas resultat.
Detta protokoll belyser lämplighet med nukleära microprobe analysis med andra tekniker för framtida bedömningar av NP interaktioner med biologiska prover. Den kvantitativa metoden ger information om effekterna av sådan NPs när det gäller upptäckt, identifiering, lokalisering och kvantifiering i nivå med en enda cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Serge Borderes för regi och redigering av video. Franska National Research Agency stöder forskningsprogrammet Titan (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). Även ”stöd av offentlig och industriell forskning med hjälp Ion Beam teknik (Anden)” enligt EG kontrakt n ° 227012 CNRS och Europeiska gemenskapen som att integrera verksamhet. Detta arbete har stötts av Marie Curie-åtgärder - Initial Training Networks (ITN) som en ”integrera verksamhet stödja forskarutbildning forskning med praktik i branschen och utbildning Excellence” (SPRITE, D1.3) kontrakterade EG nr 317169. Den C'NANO Grand Sud Ouest och den regionen Aquitaine stöder forskningsprogrammet TOX-NANO (n ° 20111201003) och forskningsprogrammet POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , Elsevier Ltd. (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
