Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

في الموقع الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

يصف لنا إجراء للكشف عن هذا الموقع في العناصر الكيميائية في الخلايا البشرية، فضلا عن تقديرها في المختبر . الطريقة مناسبة تماما لأي نوع من الخلايا ومفيد بشكل خاص للتحاليل الكيميائية الكمية في الخلايا المفردة التالية في المختبر أكسيد المعدن جسيمات نانوية التعرض.

Abstract

تمكين التقنيات التحليلية الدقيقة استناداً إلى تصوير عنصر كيميائي التعريب والتحديد الكمي للتركيب الكيميائي على المستوى الخلوي. أنها تتيح إمكانيات جديدة لتوصيف نظم المعيشة وهي مناسبة خاصة لكشف، وإضفاء الطابع المحلي والتحديد الكمي لوجود جسيمات نانوية أكسيد المعدن في العينات البيولوجية والبيئة على حد سواء. في الواقع، هذه التقنيات جميع المتطلبات ذات الصلة من حيث (ط) الحساسية (من 1 حتى 10 µg.g-1 من وزن جاف)، (ثانيا) ميكرومتر نطاق القرار المكانية، والكشف عن (ثالثا) متعددة العناصر. ونظرا لهذه الخصائص، ميكروبيم تصوير عنصر كيميائي يمكن قوة تكمل تقنيات التصوير الروتينية مثل بصري والفحص المجهري الأسفار. ويصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل ميكروبروبي نووية في الخلايا المستزرعة (U2OS) تتعرض لجسيمات نانوية ثاني أكسيد التيتانيوم. يجب أن تنمو خلايا ويتعرض مباشرة في حامل مصممة خصيصا عينة المستخدمة في المجهر الضوئي وفي مراحل التحليل ميكروبروبي النووية. يحفظ تثبيت العينات المبردة يغرق-تجميد المنظمة الخلوية وتوزيع العناصر الكيميائية. تحليل ميكروبروبي النووية المتزامنة (أيون مجهر مسح وقياس الطيف الكتلي backscattering رذرفورد والجسيمات الناجمة عن انبعاث الأشعة السينية) أجريت على العينة يوفر معلومات حول الكثافة الخلوية، توزيع محلية العناصر الكيميائية، فضلا عن محتوى جسيمات نانوية الهاتف الخلوي. وهناك حاجة متزايدة لهذه الأدوات التحليلية داخل الأحياء، ولا سيما في سياق الناشئة من نانوتوكسيكولوجي والتي يجب تعميق قدرتنا على الفهم للتفاعلات بين الجسيمات النانوية والعينات البيولوجية لطب النانوي. على وجه الخصوص، كما لا تتطلب تحليل ميكروبروبي النووية جسيمات نانوية أن يكون المسمى، وفرة نانوحبيبات قابلة للقياس وصولاً إلى مستوى الخلية الفردية في عدد سكان خلية، صرف النظر عن حالتها السطحية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتحدد التوازن الخلوية بمراقبة الامتصاص والاستيعاب، والتعريب داخل الخلايا لمختلف العناصر النزرة (أيونات، المعادن، والمركبات غير العضوية الخارجية). كثيرا ما تكون في شكل آثار هذه المكونات، ولكن مع ذلك قد يكون لها أثر كبير في الفسيولوجيا النظام. وهكذا، دراسة الكيمياء الحيوية في الخلية في الحالات العادية والمرضية/أكد مفتاح خطوة نحو فهم الآليات الأيضية الخلوية شاملة. ولذلك، يصبح من الضروري تطوير تقنيات التصوير والتحليل تمكن التحقيق من وفرة المواد الكيميائية داخل الخلايا، والهيكل التنظيمي ووظائفها الاستقلابية ذات الصلة. أساليب قليلة جداً قادرون على تقديم في الوضع الطبيعي كمية قطعة من المعلومات بشأن طبيعة المواد الكيميائية عموما لنموذج معين. وبصرف النظر عن أساليب تحليل العينات في شكل مجمع، النظر في الموقع تحليلات العينات البيولوجية في هذه التكاملية دون فقدان المعلومات الشامل والهيكلي، وبالتالي الحفاظ على هذه المواد الكيميائية المكونة لها (العناصر النزرة والايونات) و البروتينات. وعلاوة على ذلك، كما نانوسسينسيس مواصلة تطوير، تصوير محسنة والأساليب التحليلية للرصد البيئي على المستوى الخلوي ستكون اللازمة لمراقبة وقياس نانو-كائن السلوكيات والتفاعلات. 1

وقد حددت جسيمات نانوية (NPs) ككائنات العارضة البعد الوجه واحد على الأقل في مجموعة 1 و 100 نانومتر. 2 نظراً لخصائصها الفيزيائية خاصة، مصادر القدرة النووية تستخدم على نطاق واسع في الصناعة. وتستخدم مصادر القدرة النووية في التطبيقات الحيوية وفي لطب النانوي. 3 , 4 الخصائص الفيزيائية العديد من مصادر القدرة النووية، وعلى الرغم من أنها قد تولد بعض المخاطر من آثار ضارة على صحة الإنسان والبيئة. يمكن أن هذه المخاطر الناجمة عن التعرض لفترات طويلة ومتكررة على حد سواء التركيز على مختلف المستويات، وهذا قد لا بعد بوضوح. 5 , 6 , 7 , 8 على وجه الخصوص، مصير مصادر القدرة النووية داخل الخلايا والاستجابات الخلوية المرتبطة بها، حتى الآن، وصف غير كامل. وهذا جزئيا بسبب ندرة الأساليب التي تسمح الكشف والتحديد الكمي لمصادر القدرة النووية المدخلة في خلية واحدة. 9

إلى جانب الأدوات التحليلية الكلاسيكية المستخدمة لتقدير الجرعة الخلوية من جسيمات نانوية ميكروسكوبيس، الطيف الكتلي (مللي ثانية)، الحث البلازما مرض التصلب العصبي المتعدد (برنامج المقارنات الدولية-MS)10،11 واللوني السائل مرض التصلب العصبي المتعدد (LC-مرض التصلب العصبي المتعدد)، ولكنها لا توفر سوى الحصول على معلومات مفيدة في نطاق العيانية. أيا منها لا يمكن أن توفر إجراء تقييم دقيق لمحتوى NPs سوبسيلولار ولا توزيع مصادر الطاقة النووية دون الاستخدام أساليب تجزئة. تقييم منهجي للاستجابة للجرعة وبالتالي مستحيل مع هذه الأساليب، بدلاً من الأساليب استناداً إلى التحليل الطيفي الذري مثل ميكروبروبي النووية تحليل12،13، السنكروتروني الأشعة الفلورية مجهرية14 ، والثانوية أيون الطيف الكتلي (سيمز). 15 , 16 هذه الأساليب مثيرة للاهتمام خاصة كما أنها تكمل الملاحظات باستخدام مجهر الأسفار، ولا سيما عند مصادر القدرة النووية لا يمكن أن يكون المسمى مع جزيئات الفلورسنت وهكذا تدرس في دولته الأصلية. إلى حد ما، حتى عندما يتم المطعمة NPs مع فلوروفوريس، (ط) القياس الكمي لا تزال صعبة لأن مستوى العلامات الواحدة التي أرستها غير معروف ويجوز تعديل (ثانيا) تعديل المواد الكيميائية السطحية التي أرستها توزيعه الخلوية.

في هذه المقالة، نركز على أسلوب يقوم على مزيج من التقنيات النووية ميكروبروبي تهدف إلى تصوير مورفولوجيا وتكوين عنصري من العينات البيولوجية في الكبرى، ثانوية، وتتبع تركيزات.

تحليل ميكروبروبي النووية يثبت أن تكون ملائمة بصفة خاصة لقياس العناصر الكيميائية النزرة في الأنسجة البيولوجية. شعاع القرار الأفقي (0.3 إلى 1 ميكرومتر) وحساسية في الكشف عن العناصر الكيميائية (من 1 إلى 10 µg.g-1 وزن جاف) هي أيضا مناسبة للدراسات على المستوى الخلوي. وتستند التقنيات النووية ميكروبروبي كشف الجسيمات (الفوتونات والإلكترونات والايونات) ينبعث بعد شعاع أيون (عادة قيد التشغيل في الطاقات مليون إلكترون فولط) تتفاعل مع الذرات الموجودة في العينة. التفاعلات التي تحدث في الخلايا بشكل رئيسي: 1) الإثارة/تاين الذرات متبوعاً انبعاث الفوتونات بعد الذرات العودة إلى حالتها الأساسية؛ و 2) نشر جزيئات واردة مما يؤدي إلى تغيير في الطاقة والاتجاه. القياس لتحديد اللووسثي الطاقة الجسيمات المنبعثة من ذرات تشارك في التفاعل. للقيام بتعيين العناصر، microbeam أيون هو مرارا وتكرارا الممسوحة ضوئياً على سطح العينة، كثيرا ما على مساحة حوالي 100 من 100 ميكرومتر2 التي تحتوي على عدة خلايا. يتم الكشف عن الجسيمات المنبعثة واحتياجاتها من الطاقة يتم تسجيلها لكل موقف الحزم. الفرز من الجسيمات وفقا لموقف الحزم، وبالتالي تحديد هيكل المسؤولة عن انبعاث هذه الجزيئات هو هدف معالجة البيانات. هنا، نحن دقة وصف نهج قائم على الأسفار مجهرية وتحليل ميكروبروبي النووي للكشف عن، وكذلك قياس مصادر خارجية في جداول الخلوية والخلوية الفرعية، بغية التحقيق في آثار التفاعلات التي أرستها بالمعيشة نظم. ونحن خاصة تركز على الفرص التي يتيحها هذا الأسلوب من حيث الكمي في الموقع لثاني أكسيد التيتانيوم جسيمات نانوية (TiO2 NPs) المجاميع على مستوى سوبسيلولار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-نموذج إعداد حامل

  1. عينة صاحب تصميم وإعداد
    1. تصنيع حامل عينة من الحفر مربع 5 x 5 مم في إطار نظرة خاطفة سميكة 1 ملم.
    2. تنظيف قبل الشطف مع الإيثانول 70% (v/v) وتبقى في لوحات عقيمة حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة. مطلوب حامل عينة مناسبة لزراعة الخلايا والتعامل مع الخلية. أنه يحتاج إلى أن تكون مصممة للخلية استزراع، الملاحظات في المختبر بالمجهر الضوئي، وتحليل ميكروبروبي النووية والتصوير. هذا الحامل مصنوع من الإطار نظرة خاطفة13.
  2. نموذج إعداد حامل
    1. تحضير حل فورمفار بإذابة 1 ملغ مسحوق فورمفار في 100 مل كلوروفورم.
    2. تمتد رقائق البولي في إطار معدني حيث أن يعرض لا حظيرة.
    3. استخدام تلميح عقيمة لنشر الحل فورمفار حول الحفرة صاحب العينة.
    4. وضع حساسا صاحب العينة مع الغراء على إحباط البولي ممدد (مربع 5 x 5 مم).
    5. كرر التسلسل السابق لإعداد حامل عينة واحدة لكل تكرار.
      ملاحظة. فيلم البولي (PC) متوافق حيويا وسميكة ما يكفي ومقاومة لمختلف البروتوكولات والقيود التحليلية.
      تنبيه-كلوروفورم السامة. تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. دائماً استخدم غطاء الأبخرة كيميائية يعمل بشكل سليم وعوامل التصفية المناسبة.
  3. عينة حامل التعقيم
    1. مكان صاحب العينة المركبة في قارورة مخروطية الشكل مع 50 مل من الإيثانول 70% (v/v) في إطار التحريض على 180 لفة في الدقيقة و +37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، استخدام حاضنة/المحرض.
    2. شطف صاحب عدة مرات بالماء المقطر المعقم.
    3. الهواء الجاف منهم في ظروف معقمة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية (مصباح مبيد للجراثيم من مقعد السلامة الأحيائية، الدرجة الثانية) لمدة 30 دقيقة على كل جانب.
    4. الاحتفاظ بالعينات في لوحات 12-جيدا العقيمة (عينة واحدة حامل كل بئر) حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة: ويمكن تخزين متعددة أصحاب العينة في درجة حرارة الغرفة في لوحات 12-جيدا عقيمة وجافة مختومة مع بارافيلم لعدة أيام.

2-نمو الخلايا في حامل العينة المناسبة.

تنبيه: يجب أن تنفذ البروتوكول في مقعد السلامة الأحيائية الاندفاق الصفحي (الفئة الثاني) لاستبعاد تلويث المجهرية. التعامل مع المضادات الحيوية (مثل البنسلين، ستربتوميسين) مع القفازات. احترام أفضل الممارسات عند مناولة المواد البيولوجية (خطوط الخلايا، الكائنات المعدلة وراثيا المستمدة من الخلايا البشرية).

الحرجة: يجب التحقق من خطوط الخلايا المستخدمة للتأكد من أنها غير المصابين مفطورة.

  1. ترانسفيكت خط الخلية U2OS مع بلازميد تحمل 17،روجفب مصفوفة18،19 باستخدام أسلوب تعداء وفقا للبروتوكول التي حددتها الشركة المصنعة.
  2. للتأكد من تعداء مع بلازميد-حمل بيوسينسور ومنع فقدان بلازميد، حدد والحفاظ على transfected خلايا متوسطة الثقافة المناسبة.
  3. تصور transfected الخلايا بالأسفار الفحص المجهري للتأكد من تعداء حدث ولتأكيد التعبير عن الأسفار وعرض شبكة المتقدرية شبكي وانبوبي19.
    وقفه نقطة: يمكن تجميد الخلايا في النتروجين السائل لعدة سنوات.
  4. استخدام السكان الخلية transfected من استزراع الخلايا في وسيلة مناسبة من أجل الحصول على خلية شبه المتلاقية السكان. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% (v/v) CO2 في أجواء مياه مشبعة.
  5. خلايا البذور بتركيز، كما هي في التقاء 80% يوم التثبيت. عادة، يمكن أن يستخدم بتركيز الخلايا 500 كل ميليلتر. حصاد الخلايا باستخدام 400 ميليلتر التربسين-يدتا 0.25% (v/v)، وتبقى لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية. إيقاف عمل التربسين مع 1 مل من الثقافة المتوسطة. بيليه الخلايا بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 230 × ز و + 4 درجة مئوية، ثم إزالة المادة طافية، وإضافة وحدة التخزين المطلوبة من جديد الثقافة المتوسطة.
    ملاحظة. البروتوكول قابلاً للتطبيق لجميع أنواع الهاتف الخلوي وتعتمد على حجم الخلية والخلية مضاعفة الوقت عدد الخلايا في المصنف.
    تنبيه: تجنب تعريض التربسين، والمضادات الحيوية، والمصل لدورات تجميد أذاب المتكررة. تبقى لهم العقيمة. تقسيم الحل الأسهم إلى مختبرين وتجميدها في −20 درجة مئوية. تخزين في مختبرين حتى تاريخ انتهاء الصلاحية. شطف بيليه الخلية بعناية من أجل إزالة تماما التربسين. آثار التربسين المتبقية سيتم تأخير وتقليل كفاءة الطلاء.
  6. عد الخلايا وتؤدي تمييع مع الطازجة المتوسطة ثقافة كاملة أبقى على 37 درجة مئوية من أجل الحصول على تعليق خلية مع خلايا 500 كل ميليلتر.
    ملاحظة: تركيز خلية تعليق له لكي تلائم كدالة لنوع الخلية، من أجل لوحة قطره 40 ميليلتر.
  7. لوحة قطره 40 ميليلتر في وسط إحباط البولي. بعناية بوضع العينة ح 2 في +37 درجة مئوية و 5% (v/v) CO2 في أجواء مياه مشبعة.
    الحاسمة: حالما يتم وضع العينة في الحاضنة، الحد قدر الإمكان من أي حركة ميكانيكية لصالح مرفق خلية سريعة. وفقا لنوع الخلية، يمكن أن يكون من الضروري لاحتضان خلايا أطول من ح 2 لتحقيق الكفاءة المثلى في بلاتينج. تحقق أن الجو حاضنة جيدا مشبعة لمنع قطرات من التبخر.
  8. تحقق من صحة الخلايا المرفقة جيدا على رقائق البولي مجهر ضوئي باستخدام. بلطف إضافة 2 مل متوسطة كاملة جديدة والحفاظ على ح 24.

3-جسيمات نانوية إعداد والتعرض

ملاحظة: نيون تعديل صبغ TiO2 NPs صممت، وتوليفها، وتعديلها كيميائيا مع رباعي ميثيل والرودامين isothiocyanate (تريتك). 20 , 21 يسمح هذا التعديل السطحية نانوحبيبات الكشف والتعقب والتعريب في عين المكان و في سيلولو في الخلايا الحية سواء الثابتة أو في الكائنات الحية متعددة الخلايا. 12 , 13 , 18

تنبيه: يجب التعامل مع المواد النانوية وجسيمات نانوية بعناية. تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. لمنع نشر في الهواء، يتم الاحتفاظ بجسيمات نانوية في الحل (ماء عالي النقاوة).

  1. إعداد تعليق 1 mg.mL1 TiO2 NPs في الماء عالي النقاوة. تفريق NPs2 TiO استخدام نبضات مكثفة 1-مين سونيكيشن في الرايت (750 W، 20 كيلوهرتز، السعة: 30%) باستخدام مولد فائق صوت ومن ميكروبروبي مخروطية مخصصة.
  2. تمييع TiO2 NPs في تركيز المطلوبة على المديين المتوسط والثقافة بغية الحصول على وقف تعرض ل µg.cm 42 (تركيز النهائي). استبدال المتوسطة بحجم مناسب متوسطة NPs تحتوي على خلايا ومزيج بلطف لتوزيع متجانس TiO2 NPs. تحضير الخلايا التحكم وبالمثل دون إضافة TiO2 مصادر القدرة النووية.
  3. احتضان سكان الخلية ح 24 في 37 درجة مئوية و 5% (v/v) CO2 جو مياه مشبعة.

4-بارافورمالدهيد المجهري التثبيت والأسفار.

  1. تعد حلاً جديدة من بارافورمالدهيد الحل (منهاج عمل بيجين، 4% w/v) مخزنة في "المخزن المؤقت للفوسفات المالحة" (PBS، درجة الحموضة 7.4).
    1. إذابة 4 جم مسحوق منهاج عمل بيجين في 100 مل من برنامج تلفزيوني. الحرارة الحل إلى 65 درجة مئوية بينما التحريك باستخدام مغناطيس ومحرض مغناطيسية في غطاء دخان. زيادة درجة الحموضة بإضافة "هيدروكسيد الصوديوم م" 1 قطره واحدة في كل مرة حتى مسح الحل. بارد الحل لدرجة حرارة الغرفة وضبط ال pH إلى 7.4. استخدم الحل الطازجة مباشرة أو الإبقاء على + 4 درجة مئوية وحماية من الضوء.
      ملاحظة: ويمكن استخدام قبل اعتماد منهاج عمل بيجين الحلول لكن إعداد منهاج عمل بيجين استمت يضمن نوعية التثبيت أفضل وحفظ العينات ثابت طويل الأجل.
      تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة؛ تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. دائماً استخدم غطاء الأبخرة كيميائية يعمل بشكل سليم وعوامل التصفية المناسبة.
  2. مرة واحدة، قد انقضت فترة حضانة المرض، وإزالة مستنبت الخلية التي تحتوي على TiO2 NPs. شطف سكان الخلية مرة واحدة مع الطازجة الثقافة المتوسطة ومرة مع برنامج تلفزيوني (2 مل). إزالة برنامج تلفزيوني، الشطف بسرعة مع قاسمة تقييمه الطازجة والباردة (4% w/v، + 4 درجة مئوية).
    1. إضافة منهاج عمل بيجين (2 مل، 4% w/v، + 4 درجة مئوية). احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة منهاج عمل بيجين، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني (2 مل، 3 مرات، 5 دقيقة) تحت التحريض.
      وقفه نقطة: يمكن استخدام هذه ثابتة كيميائيا عينات لإجراء "يغرق-تجميد" بعد الأسفار التصوير (انتقل إلى الخطوة 5) أو يستخدم فقط للأسفار التصوير (انتقل إلى الخطوة 4، 3).
  3. وصمة عار النواة مع هويشت33342 تفرخ الخلايا لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني. يستخدم هويخست33342 بتركيز نهائي 500 نانومتر. وبعد الاحتضان إزالة الحل وشطف مع برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: هويشت33342 خلية بيرمينت وقد تكون سامة. تجنب الاتصال المباشر، واستخدام قفازات أثناء إعداد واستخدام هويشت33342.
    الحرجة: كفالة إعداد هويشت33342 تلطيخ الحل هو طازجة والاحتفاظ بها في ظروف معقمة.
  4. عملية إصلاح العينات في الموقع والتصوير خلية مفردة باستخدام مجهر الأسفار (الشكل 1).

5-"يغرق-تجميد" التثبيت والجفاف

  1. تحضير صفيحة نقل ألومنيوم بالتبريد فإنه في نيتروجين سائل. تخزين اللوحة إلى مربع مليئة بسائل النيتروجين والحفاظ على سطح لوحة أعلاه السائل في بخار النيتروجين البارد.
    ملاحظة: يمكن إجراء نقل لوحة لأية لوحة معدنية (هنا، يمكننا استخدام الألومنيوم) التي يمكن أن يبرد لدرجة حرارة النتروجين السائل، والتي يمكن أن تدخل قاعة عينة مجفف التجميد.
    الحاسمة: المربع ينبغي أن تظل مغلقة قدر الإمكان منعا لترسب بخار الماء على سطح لوحة الباردة. لا ينبغي أن يشملها العينة المخزنة على اللوحة خلال إعداد النتروجين السائل.
  2. شطف خلايا مرة واحدة في المتوسط الثقافة وثم مرتين أكثر، بإيجاز، في المياه المعقمة وعالي النقاوة للحصول على التخلص من أي أثر للاملاح المتبقية خارج الخلية.
    الحاسمة: التأكد من أن وسائل الإعلام تعد طازجة والاحتفاظ بها في ظروف معقمة. حرارة جميع وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية قبل استخدامها. يجب أن يكون الشطف قصيرة جداً (بضع ثوان) وإزالة فائض السائل على العينات في أسرع وقت ممكن.
  3. يغرق-تجميد الخلايا في-150 درجة مئوية في سائل النيتروجين مبردة 2-ميثيلبوتاني خلال 30 ثانية ومكان لهم على الألومنيوم نقل اللوحة. تخزين العينات هنا أثناء إعداد جميع العينات الأخرى. عند عينات من جميع كريوفيكسيد، نقل جميع-مرة واحدة عن طريق وضع لوحة نقل في تجميد مجفف.
    الحاسمة: عملية كريوفيكسيشن عموما ينبغي إلا تستغرق أكثر من 20 دقيقة من أجل منع إجراء تعديلات هيكلية تظهر في العينات المخزنة مؤقتاً في المربع نقل.
  4. فريزيدري العينات باستخدام التسلسل التالي: 1) أداء جفاف الأولية ح 12 إلى 24 (-99 درجة مئوية، 10-3 [مبر]) في ضغط منخفض ودرجة حرارة منخفضة، ثم 2) تنفيذ مرحلة جفاف ثانوية لمالا يقل عن 24 ساعة، زيادة درجة الحرارة إلى لوحة + 40 درجة مئوية، مع إبقاء الضغط المنخفض (40 درجة مئوية، 10-3 [مبر]).
    تنبيه: نيتروجين سائل بارد جداً ويمكن أن تسبب تلف العين أو قضمه الصقيع الشديد عند الاتصال. استخدام الحاويات أعلى مقاعد البدلاء تكييفها للنقل، وارتداء معدات السلامة (القفازات المبردة، وحماية العين والوجه).
    تنبيه: 2-ميثيلبوتاني سريعة الاشتعال للغاية. يمكن الوصول إلى ضارة تلوث الهواء بسرعة على التبخر من هذا المضمون في + 20 درجة مئوية. تجنب استنشاق، الابتلاع أو الاتصال مع الجلد. استخدام التنفس وحماية العين، وقفازات واقية. دائماً استخدم غطاء الأبخرة كيميائية يعمل بشكل سليم. قد تكون مخزنة في + 4 درجة مئوية.
    الحاسمة: استخدام حرارة مناسبة (-150 درجة مئوية) لرصد درجات الحرارة 2-ميثيلبوتاني أثناء الدورة "يغرق-تجميد". 2-ميثيلبوتاني يجب أن تبقى باردة في مرحلة سائل. نقل عينات كريوفيكسيد في الأجواء المحيطة قد يسبب الأضرار الخلوية بسبب ارتفاع درجة الحرارة أو بخار الماء التكثيف على سطح العينة. وبناء على ذلك، يجب أن يتم النقل أسرع وقت ممكن معقول (30 ثانية)
    وقفه نقطة: بعد كريوفيكسيشن، ويمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام في ظروف معقمة وجافة (محمية من الغبار والرطوبة). بدقة التعامل مع العينات بالملقط الجميلة ووضعها في لوحة 12-جيدا عقيمة مختومة مع بارافيلم. يمكن استخدام ديسيككانت لتجف في الجو.

6-النووية ميكروبروبي التحليل

ملاحظة: تحليل ميكروبروبي النووية أجريت في خط ميكروبيم أيفيرا (تطبيقات إينتيرديسسيبلينايريس des فايسسو d'Ions en آكيتين ضمور) استخدام تقنيات تحليلية شعاع مكملة أيون "الجسيمات الناجمة عن انبعاث الأشعة السينية" (μ- بيكسي) والمسح مجهر أيون (μ-STIM). ويستند المرفق معجل جسيمات MV 3.5 تسليم الحزم الأيونية الخفيفة في نطاق الطاقة مليون إلكترون فولط. 22 , 23

وقفه نقطة: أيفيرا هو منشأة شعاع أيون استضافته جامعة بوردو الذي يوفر وصول إلى الفرق الوطنية والدولية بعد التقييم العلمي للتجربة المقترحة.

  1. جبل أصحاب عينة نظرة خاطفة على صفيحة أبيرتوريد باستخدام الشريط على الوجهين.
  2. ضع لوحة دعم عينة في طائرة عمودية عمودي على اتجاه الشعاع.
  3. إغلاق دائرة التحليل وفراغ قاعة التحليل.
  4. المسح مجهر أيون (μ-STIM)
    ملاحظة: يتم استخدام STIM لتسجيل خرائط كثافة مساحية من الخلايا بعد تحويل فقدان الطاقة للكتلة الخلوية، الاستفادة من حقيقة أن فقدان الطاقة تتناسب مع كثافة مساحية عينة (معبراً عنه في µg.cm-2).
    1. استخدام microbeam هليوم (أنه+) 2 مليون إلكترون فولط كتحقيق مع حجم في المستوى البؤري لحوالي 300 نانومتر في القطر وفي منخفض الطلاقة (2000 ions.s-1). قياس الطاقة الأيونات المنقولة مع جهاز كشف سليكون مستو (كاشف نقطة، 25 مم2، 11 كيلوفولط الطاقة القرار @ 5.4 مليون إلكترون فولط)، وضعت وراء العينة في محور شعاع.
  5. الجسيمات التي يسببها انبعاث الأشعة السينية (μ-بيكسي) والطيف باكسكاتيرينج روثرفورد (μ-RBS).
    ملاحظة: تقديم تحليلات بيكسي μ μ-RBS في التوزيع المكاني والتحديد الكمي للعناصر الكيميائية مع قرار ميكرومتر الفرعية.
    1. استخدام microbeam بروتون (ح+) 1.5 مليون إلكترون فولط (pA 50-150)، ركزت وصولاً إلى قطره 1 ميكرومتر والمسح الضوئي عبر الخلايا نفس الاهتمام التي رصدت من قبل STIM من 4 إلى 8 ساعات وحوالي 100 × 100 ميكرومتر2.
    2. جمع المستحث بالأشعة السينية الفوتونات المنبعثة من الذرات الموجودة في العينة (أثقل من Na) من الاستبانة Si(Li) كاشف الحالة الصلبة (145 eV الطاقة القرار، @Mn-Kα) المتمركزة في 45 ° من محور الحزم الواردة. استخدام طاقة فوتون المكتشفة لتحديد طبيعة كثافة الأشعة السينية وبواعث (مثلاً Z عنصر) لتحديد تركيز العنصر.
    3. في نفس الوقت جمع البروتونات منتشرة في ظهره في درجة-135 مع جهاز كشف سليكون (كاشف المنضب جزئيا، 25 مم2، 11 كيلوفولط فوم @ 5.4 مليون إلكترون فولط) لقياس العدد الكلي للجزيئات الواردة وتطبيع كثافة الأشعة السينية.
      الحاسمة: يتم استخدام مجموعة من معايير المعايرة المعتمدة لتقدير تركيز الذري من أجل معايرة استجابة كاشف الأشعة السينية. مواد مرجعية عبارة عن مجموعة من أفلام الذري رقيقة المودعة في 6.3 ميكرومتر سميكة رقائق مايلر. تنبعث الأشعة السينية طاقات تتراوح بين 0.6 (لي، خط K) 20.2 كيلو إلكترون فولط (الصحة الإنجابية، ك خط).

7-بيانات التحليل

  1. إعادة بناء خرائط عنصري الكيميائية باستخدام البرنامج المساعد ي رابطة المحامين الدولية إيماجيج. 24
    ملاحظة: وضعت برامج مخصصة في شكل البرنامج المساعد إيماجيج لعملية تحليل البيانات الخام ميكروبروبي النووية. تتوافق مع البيانات الخام إلى قائمة أحداث الناجمة عن تفاعل شعاع الجسيمات مع الخلايا التي يتم تسجيلها جنبا إلى جنب مع موقف شعاع كتسلسل زمني.
    1. استخدام البرنامج المساعد إيبا-ي لفرز الأحداث وفقا للنوع: تنتقل الطاقة أيون (STIM)، المستطار أيون الطاقة (RBS) أو طاقة فوتون الأشعة السينية (بيكسي). ثم، عملية بشكل منفصل كل نوع من أنواع البيانات.
    2. حساب خريطة كثافة المنطقة STIM
    3. حساب متوسط أطياف الطاقة فوتون الأشعة السينية، وتعريف لكل عنصر كيميائي من اهتمام إطار الطاقة من أجل استرداد عنصر التوزيع المكاني.
    4. تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) (مثل الخلايا الفردية، بنية كثيفة، والمجاميع، إلخ.) وحساب أطياف الأشعة السينية المقابلة.
  2. تحليل الأطياف RBS المناظرة من أجل حساب العدد الكلي للجزيئات الحادث25.
  3. تناسب أطياف الأشعة السينية باستخدام البرمجيات جاب26 بغية تحديد تركيز عنصر لكل عائد الاستثمار.
    ملاحظة: حد نموذجي للكشف (اللد) للأسلوب في µg.g 1 إلى 10 نطاق-1 في الكتلة الجافة اعتماداً على العدد الذري للعناصر (اللد يتناقص مع Z).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

خلية ثقافة وتصوير الأسفار المسماة فلوريسسينتلي TiO 2 مصادر القدرة النووية

لقد قمنا بتصميم حامل عينة تكييفها لزراعة الخلايا والتعامل مع الخلية، فضلا عن التحليل المتعدد الوسائط. على وجه التحديد، من المهم أن يسمح صاحب المجهر الضوئي الروتينية جيدا النووية تحليل ميكروبروبي والتصوير. ويستند هذا الحامل عينة إحباط البولي سميكة 2 ميكرومتر المودعة في إطار نظرة خاطفة. الخلايا نمت مباشرة على البولي، في ظروف الثقافة العقيمة لعدة أيام وتستخدم بعد ذلك لظروف تجريبية مختلفة، مثل التعرض لمصادر القدرة النووية.

يسمح تعديل السطح الكيميائية مع فلوروفوريس (تريتك) كشف TiO2 NPs، فضلا عن تلك الترجمة في الموقع و في المختبر في المعيشة أو في بارافورمالدهيد الثابتة الخلايا باستخدام مجهر الأسفار. نواة الخلية والميتوكوندريا كانت ملطخة باستخدام حيوية صبغ هويشت33342 (الأزرق للنواة) والمصفوفة transfected-روجفب (أخضر الميتوكوندريا)، على التوالي. هذا تلطيخ متعددة يسمح توطين NPs2 TiO تريتك داخل الخلايا (بالأحمر انبعاث الأسفار) ح 20 بعد التعرض. تم العثور على مصادر القدرة النووية فقط في السيتوبلازم للخلايا المعرضة مع لا الكشف في النواة. مصادر القدرة النووية مترجمة عشوائياً في منطقة بيرينوكلير في السيتوبلازم واستبعادها تماما من الميتوكوندريا (لا تداخل بين تريتك وبروتينات فلورية خضراء إشارات).

على الرغم من أن الفحص المجهري fluorescence مفيد جداً لتعريب مصادر القدرة النووية داخل الخلايا المكشوفة، ليست قادرة على تقدير عدد مصادر القدرة النووية بدقة كل خلية. أن الصعوبة الرئيسية للفحص المجهري الأسفار المتعلقة بالتحديد الكمي لمصادر الطاقة النووية مرتبط بعدم اليقين حول (ط) عدد فلوروفوريس تعلق على NP معين واستقرار تبيض فلوروفوري الذي تم اختياره أثناء المراقبة و (الثاني) حالة التجميع من مصادر داخل الخلية.

Figure 1
الشكل 1 : في المختبر وفي الموقع الأسفار التصوير U20S الخلايا المحورة وراثيا معربا عن مصفوفة روجفب ويتعرضون تريتك-TiO 2 NPs. يتعرض U2OS الخلايا (أعلى) التي تحمل هويشت33342 (الأزرق)، مصفوفة-روجفب (الأخضر) µg.cm 4-2 المسمى تريتك TiO2 جسيمات نانوية (أحمر) حاء 20 تشير الملاحظات إلى أن TiO2 NPs التجميعية في الخلايا في منطقة بيرينوكلير. شريط الحجم: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

للتغلب على أوجه القصور هذه، تيتشنيقويسبروفيدي ميكروبروبي النووية تحليل نهج تكميلي للمجهر الضوئي التقليدية نظراً لحساسيتها لمصادر القدرة النووية مما يحول دون استخدام أي إشارة الوسيطة مثل الأسفار من المطعمة صبغ. وعلاوة على ذلك، فأيضا كامل الكمية، توفير بيانات حول (ط) محتوى الكيمياء الحيوية الخلوية الفرعية غير معروف، و (ثانيا) داخل الخلايا كمية مصادر الطاقة النووية على مستوى الخلية الواحدة.

كريوفيكسيشن الخلايا بعد التصوير مباشرة.

القيد العليا في إجراء تحليل ميكروبروبي النووية هو العمل في ظل ظروف الفراغ. قمنا بتطوير بروتوكول تثبيت خلية مما يتيح الحفاظ على أولتراستروكتوري البيولوجية والبيوكيميائية سلامة العينة البيولوجية. التثبيت الكيميائي المعروف لتعديل تكوين عنصر تتبع الخلايا لأنه يتطلب استبدال المتوسطة الخلوية على بوليمر المستخدمة للحفاظ على أولتراستروكتوري الخلوية. وعلاوة على ذلك، إزالة الماء أيضا النشرات الأيونات الحرة وغيرها من الأنواع، الذي يعدل الشاملة نموذج التكوين. ومن ثم، فإنه يصبح إلزامية إعطاء الأولوية لأسلوب تثبيت الفعلية، لا سيما أساليب المبردة. هذه الإجراءات المبردة الحث على وقف سريع للنشاط الخلوي، وهذا، في مقياس الوقت ميلي ثانية.

ميكروبروبي النووية التحليل المجهري والتحديد الكمي لمصادر القدرة النووية على المستوى الخلوي.

وأجريت على عينات بعد كريوفيكسيشن والجفاف الحصول على بيانات كمية دقيقة في تركيبتها الكيميائية عنصري المسح مجهر أيون (μ-STIM) وتحليل الانبعاثات (μ-بيكسي) الأشعة السينية المستحثة بالجسيمات.

كشف الاختلافات المحلية في كثافة الصور μ-STIM ويتيح الكشف عن الهياكل الخلية مثل النواة والسيتوبلازم. على الرغم من أن القرار شعاع الأفقي يتيح مراقبة كثيفة رقيقة هياكل ضيقة مثل 300 نانومتر واسعة، مثل المجاميع مرئية هنا في السيتوبلازم، وأساليب STIM لا تميز بين المجاميع التي أرستها وغيرها من الهياكل الخلوية كثيفة. هذا بسبب، مثل العملية المادية المؤدية إلى الاختلاف في الطاقة المنقولة مجهر إلكتروني (TEM)، هو تفاعل أيون الواردة مع سحابة الإلكترونات الذرية. خلافا لتحليل ال ومع ذلك، لأنه يتم تحليل حجم الخلية بأكملها، منع الاختلافات المحلية سمك التمييز بين الهياكل العليا زي وزيادة الكثافة الخلوية محلية.

Figure 2
الشكل 2 : الحصول على صور من الكثافة والتوزيع عنصري μ-STIM وبيكسي μ في البرد--الثابتة الخلايا U2OS- تعرض الخلايا U2OS البرد--ثابت (مكشوف على µg.cm 4-2 TiO2 مصادر القدرة النووية، أسفل) بالمقارنة مع الخلايا التحكم U2OS (أعلى) ومراقبتها باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية/الفحص المجهري. STIM مجهرية (يسار، خرائط درجات الرمادي) كشفت كثيفة داخل أو خارج الخلايا هياكل (نواة، والمجاميع الملح، وجسيمات نانوية). القرار المكانية (300 نانومتر) مشابه للفحص المجهري الأسفار ويبين هياكل مثل المجاميع التي أرستها في منطقة بيرينوكلير. ومع ذلك يمكن تحديد هياكل تستند فقط على كثافة غامضة. خرائط عنصري بيكسي μ ك، ف، ومنظمة الشفافية الدولية (مقياس اللون الحرارية) مكملة لخرائط μ-STIM. يمكن استخدامها لضمان وجود مصادر القدرة النووية في الخلايا. يمكن تحليل كل خلية على حدة من حيث تركيز العنصر (انظر الشكل 3). تغيير حجم أشرطة: 10 ميكرون. مقاييس الألوان تتراوح بين الحد الأدنى (أزرق) إلى حدة الأقصى (رمادي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كما هو مبين في الشكل 2، يسمح التقديم μ-STIM الاعتراف بالخلايا الفردية داخل كل مجموعة من سكان وأيضا الأقسام الفرعية داخل الخلايا مثل نوية ونواة. وللأسف، وكما ذكر سابقا، مصادر القدرة النووية لم دائماً يمكن كشفها باستخدام إعادة الإعمار μ-STIM.

ويوفر تحليل الانبعاثات (μ-بيكسي) الأشعة السينية المستحثة بالجسيمات ليس فقط أن التركيب الكيميائي للعينة ولكن أيضا على تعيين عنصري (الشكل 2). أثناء التفاعل مع شعاع مثيرة، تخضع العناصر الكيميائية الذرية عمليات الإثارة-دي-الإثارة التي تؤدي في نهاية المطاف إلى انبعاث الفوتون الذي يسلك الطاقة المميزة للعدد الذري لعنصر الإثارة. طيف ذروة مميزة بنيت من مجموع كافة الأحداث فوتون المنبعثة، ويعتبر توقيع كيميائية للعينة.

الأجهزة التجريبية الموحدة وكاشفات المستخدمة لتجارب بيكسي μ تسمح الكمي المتزامن لجميع عناصر أثقل من نا مع حد كشف شامل جافة1 µg.g 1 إلى 10. الدقة في قياس تركيزات عنصري يقتصر عادة على حوالي 20% بسبب رسوم جمع والكشف عن الكفاءة.

في هذه الدراسة، لوحظ توزيع العناصر مثل البوتاسيوم والفوسفور، وتحديد مقدار TiO2 NPs التيتانيوم ورسم الخرائط داخل الخلايا عن طريق التحليل ميكروبروبي النووية. خرائط عنصر كيميائي يتم حسابها بعد الفوتونات يتم فرزها وفقا لموقف الحزم إزاء التوقيت تسجيل واختيار إطار الطاقة تتمحور حول عنصر معين. خرائط هي الممثل للعدد الأحداث تم الكشف عنها في موقف الحزم والكمية. الضوضاء والخلفية محاكاة عددياً وتصفيتها. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الخرائط الكيميائية لاستخراج الطيف بيكسي المحلية المطلوبة للقياس الكمي.

كما هو مبين في الشكل 2، الفوسفور المتجانس توزع في الخلية التي تتضمن، كما هو متوقع، أعلى تركيز في المجال النووي. وتوزع البوتاسيوم البلوتينيوم في حجم الخلية. التيتانيوم يقع في منطقة بيرينوكلير هيولى في شكل مجاميع، كما سبق أن لاحظت استخدام مجهر الأسفار (الشكل 1). مصادر القدرة النووية عرض بيرينوكلير التعريب نفسه أيا كانت حالتها السطحية: فونكتيوناليزيد (الشكل 1) أو الأم (الشكل 2). وفي الوقت نفسه، تم الكشف عن أي أثر للتيتانيوم في مراقبة الخلايا مؤكدا أن توزيع التيتانيوم لاحظها بيكسي μ يجب أن يعزى إلى TiO2 مصادر القدرة النووية، باﻻتفاق مع تحليلاتنا السابقة بالفحص المجهري الأسفار.

وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو مبين في الشكل 2، فمن الممكن لاستخراج توزيع مصادر الطاقة النووية داخل الخلايا وكمية NPs تركيزات من مناطق محددة من الفائدة. استناداً إلى خرائط STIM وفي ترابط مع توزيعات الفوسفور/البوتاسيوم، من الممكن تحليل خلية مفردة.

Figure 3
الشكل 3 : تحليل كمي خلية مفردة باستخدام μ-بيكسي. يمكن تركيبها أطياف الأشعة السينية الفردية المحسوبة للخلايا هو مبين في الشكل 2 بغية تحديد تركيز عنصر على المستوى الخلوي. هذه الميزة غير مثيرة للاهتمام لا سيما لتحليل NP حيث تبين تركيزات الخلوية عادة اختلافات قوية داخل نفس السكان. على سبيل المثال، لنفسه يعني التعرض، وتتراوح تركيزات Ti من 0.2 حتى 1.8 µg.cm-2. ضوابط تتوافق مع السكان الخلايا غير المعالجة. جرعة التعرض: µg.cm 4-2. بوكسبلوتس تمثل توزيع الفردية تركيزات الخلوية مع القيمة الوسطية (خط أفقي) وقياس قضبان يمتد باتجاه أدنى وأعلى القيم. التحكم بالخلايا: N = 14؛ تعرض الخلايا: N = 16.

وبناء على ذلك، نحن ليس فقط كمياً متوسط المحتوى من التيتانيوم في عدد سكان خلية لكن أظهرت أيضا توزيع التيتانيوم كل خلية في أحد السكان في حالة تجريبية محددة. متوسط محتوى التيتانيوم تقاس هنا هو تماما منخفضة (500 ng.cm-2) مقارنة بجرعة التعرض 4 µg.cm-2 السكان الخلية (الشكل 3)، والاختلاف بين الخلايا الكبيرة (Ti تركيزات تتراوح من 0.2 حتى 1.8 µg.cm -2 ووفقا لتحليل الخلايا). كما لاحظنا زيادة الأيونات داخل الخلايا مثل البوتاسيوم والكالسيوم في عينات المكشوفة مما يوحي التوازن خلوية تعديلات الناجمة عن وجود TiO2 مصادر القدرة النووية، كما هو موضح سابقا بالعديد من المؤلفين. 21 , 27

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يصف لنا طريقة توفير معلومات مفيدة تتجاوز ما هو ممكن مع تقنيات التصوير الأخرى، لا سيما على مستوى سوبسيلولار. بالإضافة إلى قدرتها التصوير، يقدم التحليل ميكروبروبي النووية أيضا إمكانيات للتحديد الكمي للعناصر الكيميائية التي تدخل في تكوين عينة بيولوجية. في هذا العمل، نحن درس السكان الخلايا البشرية وركزت وصولاً إلى تحليل منطقة المختارة من الفائدة استناداً إلى خلية واحدة معرضة ل TiO2 مصادر القدرة النووية. يوفر المزيج مع غيرها من تقنيات تصوير الخلوية المورفولوجية وبيانات كمية دقيقة في التركيب الكيميائي عنصري.

لتطبيق التحليل ميكروبروبي النووية بنجاح، وملزمة لاحترام النقاط التالية لتجنب المزالق المحتملة. أولاً، من الضروري استخدام بروتوكول مبردة لتثبيت الخلية من أجل الاحتفاظ أولتراستروكتوري وسلامتها البيوكيميائية. وثانيا، كما أنها إلزامية القيام بتحليل العينات رقيقة بسمك أدناه 20 ميكرومتر. إذا لزم الأمر، يمكن إجراء تقطيع العينات كريوفيكسيد. عينات على الإطلاق ينبغي أن تظل مجمدة. ثالثا، من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن يكشف تحليل ميكروبروبي النووية تمثيل ثنائي الأبعاد للعينات البيولوجية. وبالتالي، توزيع العناصر الكيميائية التي تم الحصول عليها من إسقاط ثنائية الأبعاد التي يمكن أن إمكانية تقديم تفسيرات خاطئة. سيتم تجاوز هذا القيد في المستقبل باستخدام اقتناء تمجربهك.

تحليل ميكروبروبي النووية أيضا على القيود. فلا ينبغي التشديد على أن القيد الرئيسي لها هو الحاجة إلى إجراء تحليل تحت الفراغ. ولذلك، من الضروري استخدام بروتوكولات تثبيت الخلية يحافظ على الخلايا أولتراستروكتوري والسلامة الحيوية. ولذلك من الضروري اختبار مقاومة العينات البيولوجية للإجراء فيزياء درجات الحرارة المتدنية (دون إضافة الراتنج الكيميائية). وهذا يمكن أن يحد من استخدام التحليل ميكروبروبي النووية.

قيد آخر هو إمكانية الوصول إلى المرافق اللازمة للاضطلاع بتحليل ميكروبروبي النووية. أوقات الشعاع المعينة ولذلك تقتصر في بعض الأحيان، وهذا يشكل عقبة إضافية لهذا النوع من التجربة تستغرق وقتاً طويلاً. غالباً ما تحتاج عدة ساعات لاقتناء واحد.

يختلف هذا الأسلوب عن الأساليب التحليلية الأخرى، بما في ذلك الفحص المجهري، البلازما الكتلي (مللي ثانية)، إلى جانب الحث مللي ثانية (مللي ثانية-من برنامج المقارنات الدولية)، اللوني السائل مرض التصلب العصبي المتعدد (LC-MS)، والنظائر المشعة. هذا الأخير في الواقع تستخدم لتقدير الجرعة الخلوية للعناصر الكيميائية ولكن هم فقط قادرة على تقديم معلومات في العيانية مقياس أي على كمية عيانية من عينة. أيا منها لا يمكن أن تعطي الوصول، كما يفعل التحليل ميكروبروبي النووية، إلى كشف دقيق ورسم خرائط لجرعة سوبسيلولار من عناصر كيميائية محددة (أيونات، معدنية أو معدن أكسيد NPs). هذه البيانات تساعد على الوصول إلى مزيد من دراسة منهجية لتقييم الاستجابة للجرعة.

تقدير دقيق للجرعة عند دراسة استيعاب مصادر القدرة النووية في الخلايا حاسم من كل الكمية التي أرستها علم السموم وعلم الصيدلة وجهات النظر. كما اقترح بالتفاوت الكبير في محتويات NP الملحوظ، الذي يظهر فارق الوقت بين الحد الأدنى والحد الأقصى ولاحظ تركيزات (الشكل 3)، قد لا يكون متوسط تركيز الخلوية معلمة ذات صلة لوصف هذه ظاهرة تعرض للجسيمات. هذا صحيح بصفة خاصة عندما أثر عتبة من المفترض أن تجري لأنه يمكن أن يؤدي التعرض لجرعة متنافرة إلى الملاحظات المتناقضة. نظراً لطبيعة جسيمات نانوية هورمونات يظهر بوضوح على المستوى الخلوي، هذه الدراسة ولذلك يطرح مرة أخرى مسألة ملاءمة الأساليب استناداً إلى تحليل المتغيرات العالمية في التصدي للمسائل حول السلوك الخلايا المعرضة متنافرة من جرعات من الملوثات.

كما يتضح في حالة دراستها هنا، الملاحظة والتقدير الكمي لمصادر القدرة النووية داخل الخلايا الفردية تسمح لنا بفهم أفضل من عناصر داخلية/خارجية مثل أكسيد المعدن NPs التراكم الأحيائي. هذه مهمة حاسمة لطلبات أخرى من مصادر الطاقة النووية في الطب الحيوي، حيث فهم الفقراء الأساسية التوزيع التي أرستها في الخلايا يمكن أن تؤدي إلى نتائج يساء تفسيرها.

هذا البروتوكول يبرز مدى ملاءمة استخدام تحليل ميكروبروبي النووية مع تقنيات أخرى لتقييم التفاعلات التي أرستها مع العينات البيولوجية في المستقبل. النهج الكمي الذي يوفر معلومات عن الأثر هذه القدرة من حيث الكشف وتحديد والتعريب والقياس الكمي على مستوى خلية واحدة واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر "تفاوضي سيرج" لتوجيه وتحرير الفيديو. وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية تؤيد برنامج البحوث تيتانيومس (ANR CES 2010، جوان CESA 009 01). يزار والجماعة الأوروبية كنشاط إدماج توفير "الدعم من الجمهور والصناعية البحث استخدام أيون شعاع التكنولوجيا (روح)" إطار المفوضية الأوروبية عقد ° ن 227012. هذا العمل أيدته "ماري كوري الإجراءات"-شبكات التدريب الأولية (ITN) "إدماج النشاط دعم الدراسات العليا مع التدريب الداخلي في الصناعة والتدريب التميز البحثي" (العفريت، D1.3) وبموجب العقد رقم 317169 من المفوضية الأوروبية. الغرب سود الكبير C'NANO واكيتين المنطقة دعم برنامج أبحاث إزالة-نانو (رقم 20111201003) وبرنامج البحوث بوبرا (جوان 14006636-034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113, (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2, (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48, (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269, (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258, (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1, (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. Elsevier Ltd. (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105, (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8, (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86, (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89, (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75, (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107, (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5, (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269, (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268, (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. 1-17 (2015).
<em>في الموقع</em> الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter