Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Beschrijven we een procedure voor de opsporing van chemische elementen aanwezig in situ in menselijke cellen, alsmede hun kwantificering in vitro . De methode is geschikt voor elk celtype en is vooral nuttig voor de kwantitatieve chemische analyses in afzonderlijke cellen na in vitro metaaloxide nanodeeltjes blootstelling.

Abstract

Micro-analytische technieken gebaseerd op scheikundig element imaging inschakelen de lokalisatie en de kwantificering van chemische samenstelling op cellulair niveau. Ze bieden nieuwe mogelijkheden voor de karakterisatie van levende systemen en zijn met name geschikt voor het detecteren, lokaliseren en kwantificeren van de aanwezigheid van metaaloxide nanodeeltjes zowel in biologische monsters en het milieu. Inderdaad, deze technieken die alle voldoen aan desbetreffende eisen wat betreft (i) gevoeligheid (van 1 tot 10 µg.g-1 van droge massa), (ii) micrometer bereik ruimtelijke resolutie, en (iii) multi element detectie. Gegeven deze kenmerken, microbeam scheikundig element imaging kan krachtig aanvullen routine beeldvormingstechnieken zoals optische en fluorescentie microscopie. Dit protocol wordt beschreven hoe een nucleaire microprobe-analyses uit te voeren op gekweekte cellen (U2OS) blootgesteld aan titaandioxide nanodeeltjes. Cellen moeten groeien op en direct in een speciaal ontworpen monsterhouder gebruikt op de optische Microscoop en de nucleaire microprobe analyse fasen worden blootgesteld. Duik-freeze cryogene fixatie van de monsters behoudt de cellulaire organisatie zowel de chemische elementdistributie. Gelijktijdige nucleaire microprobe analyse (scanning transmissie ion microscopie, Rutherford backscattering spectrometrie en deeltje geïnduceerde X-ray emissie) uitgevoerd op het monster bevat informatie over de cellulaire dichtheid, de lokale distributie van de chemische elementen, evenals de cellulaire inhoud van nanodeeltjes. Er is een groeiende behoefte aan dergelijke analytische instrumenten binnen de biologie, met name in de nieuwe context van Nanotoxicologie en nanogeneeskunde waarvoor ons begrip van de interacties tussen nanodeeltjes en biologische monsters moet worden verdiept. In het bijzonder, zoals nucleaire microprobe analyse geen nanodeeltjes worden geëtiketteerd vereist, zijn nanoparticle abundanties kwantificeerbaar zodat ze tot op het niveau van de afzonderlijke cel in een celpopulatie, onafhankelijk van hun oppervlakte staat.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cellulaire homeostase wordt bepaald door de controle van de opname, assimilatie en intracellulaire lokalisatie van verschillende sporenelementen (ionen, metalen, exogene anorganische verbindingen). Deze onderdelen zijn vaak in de vorm van sporen, maar toch een aanzienlijke impact kunnen hebben in de Fysiologie van het systeem. De studie van biochemie van de cel in zowel normale als pathologische/benadrukt situaties is dus een sleutel-stap op weg naar een allesomvattend begrip van cellulaire metabole mechanismen. Daarom wordt de ontwikkeling van beeldvorming en analytische technieken waardoor het onderzoek van intracellulaire chemische abundanties, structurele organisatie en hun bijbehorende metabolische functies nodig. Er zijn zeer weinig methoden kunnen bieden van een in situ kwantitatieve stuk van gegevens betreffende de algemene chemische aard van een monster. Naast het analyseren van monsters in de vorm van bulk, analyses- in situ overwegen biologische monsters in hun volledigheid zonder verlies van massale en structurele informatie, waardoor het behoud van hun samenstellende chemische stoffen (sporenelementen en ionen) en eiwitten. Daarnaast, aangezien de nanowetenschappen ontwikkelen blijven, verbeterde beeldvorming en analysemethoden voor milieubewaking cellulaire duurzaame zullen nodig zijn om te observeren en te kwantificeren van nano-object gedrag en interacties. 1

Nanodeeltjes (NPs) zijn gedefinieerd als objecten tentoonstellen van ten minste één gezicht dimensie in het bereik 1 en 100 nm. 2 vanwege hun specifieke fysisch-chemische eigenschappen, NPs worden uitgebreid gebruikt in de industrie. NPs werkzaam zijn in de bio-toepassingen en in de nanogeneeskunde. 3 , 4 ondanks de talrijke fysisch-chemische eigenschappen van de NPs, kunnen ze genereren sommige risico's van nadelige effecten op de menselijke gezondheid en milieu. Deze risico's kunnen worden veroorzaakt door zowel langdurige en herhaalde blootstelling op verschillende concentratieniveaus en dit is nog niet duidelijk vastgesteld. 5 , 6 , 7 , 8 In het bijzonder, het lot van NPs binnen cellen en de bijbehorende cellulaire reacties zijn, tot op heden niet volledig beschreven. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de schaarste van methoden waarmee de opsporing en kwantificering van verinnerlijkte NPs in één cel. 9

De klassieke analytische instrumenten gebruikt om te schatten de cellulaire dosis van nanodeeltjes zijn microscopies, massaspectrometrie (MS), met inductief gekoppeld plasma (ICP-MS) MS10,11 en vloeistofchromatografie die MS (LC-MS), maar ze alleen bieden nuttige informatie op de macroscopische schaal. Geen enkel van hen kan een precieze evaluatie van de subcellular NPs-inhoud, noch de verdeling van de NPs zonder het gebruik van fractionering methoden aan. Een systematische evaluatie van de dosis-respons is dus onmogelijk met deze methoden, in tegenstelling tot methoden die gebaseerd zijn op atomaire spectroscopie zoals nucleaire microprobe analyse12,13, synchrotron Röntgen fluorescentie microscopie14 , en secundaire Ion massaspectrometrie (SIMS). 15 , 16 deze methoden zijn bijzonder interessant, aangezien ze als aanvulling op de opmerkingen die zijn gemaakt met behulp van fluorescentie microscopie, vooral wanneer NPs niet kunnen worden aangeduid met fluorescerende moleculen en dus in hun oorspronkelijke staat worden bestudeerd. Tot op zekere hoogte zelfs wanneer NPs zijn geënt met fluorophores, blijft (i) kwantificering moeilijk omdat de tagging niveau per NP onbekend is en (ii) de chemische modificatie van het oppervlak van NP de cellulaire verdeling kan wijzigen.

In dit artikel, we concentreren op een methode gebaseerd op een combinatie van nucleaire microprobe technieken die gericht zijn op de morfologie en de elementaire samenstelling van biologische monsters in majeur, mineur, imaging en concentraties te traceren.

Nucleaire microprobe analyse blijkt te zijn met name geschikt voor het meten van chemische sporenelementen in biologische weefsels. Zowel de lichtbundel laterale resolutie (0.3-1 µm) en de gevoeligheid in scheikundig element detectie (van 1 tot 10 µg.g-1 droge massa) zijn geschikt voor studies op cellulair niveau. Nucleaire microprobe technieken zijn gebaseerd op deeltjes detectie (fotonen, elektronen, ionen) uitgezonden nadat de ion beam (meestal uitgevoerd bij MeV energieën) met atomen aanwezig in het monster interageert. Het gaat hoofdzakelijk om interacties in cellen: 1) excitatie/ionisatie van atomen, gevolgd door een emissie van fotonen nadat atomen terug naar hun fundamentele staat; en 2) diffusie van inkomende deeltjes leiden tot veranderingen in hun energie en richting. De meting van allowsthe identificatie van de energie van de uitgestoten deeltjes van atomen betrokken bij de interactie. Voor het uitvoeren van elementen in kaart te brengen, is de ion-microbeam herhaaldelijk gescand over het monster oppervlak, vaak over een oppervlakte van ongeveer 100 per 100 µm-2 met verschillende cellen. Uitgestoten deeltjes worden gedetecteerd en hun energie wordt vastgelegd voor de positie van elke balk. Sorteren van de deeltjes volgens het standpunt van de bundel, is dus het identificeren van de structuur die verantwoordelijk is voor de uitstoot van deze deeltjes het doel van gegevensverwerking. Hier beschrijven we juist een aanpak op basis van fluorescentie microscopie en nucleaire microprobe analyse om te ontdekken, alsmede te kwantificeren van exogene NPs op de cellulaire en sub cellulaire schalen, om te onderzoeken van de gevolgen van NP interacties met levende systemen. We zullen met name richten op de mogelijkheden van deze methode in termen van in situ kwantificering van titaandioxide nanodeeltjes (TiO2 van NPs) aggregaten subcellular niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. houder monstervoorbereiding

  1. Monster houder ontwerp en voorbereiding
    1. Een monsterhouder vervaardigen door het boren van een 5 x 5 mm vierkant in een 1 mm dikke PEEK frame.
    2. Schoon door spoelen met ethanol 70% (v/v) en bewaar in steriele platen tot klaar voor gebruik.
      Opmerking. Een monsterhouder geschikt is voor de cultuur van de cel en de cel behandeling is vereist. Het moet worden ontworpen voor cel kweken, in vitro waarnemingen met optische microscopie, en nucleaire microprobe analyse en beeldvorming. Deze houder is gemaakt van een frame PEEK13.
  2. Bereiding van de houder van de monsters
    1. Bereid de oplossing van de Formvar door de ontbinding van 1 mg van Formvar poeder in 100 mL chloroform.
    2. Rekken de polycarbonaat folie op een metalen frame, zodat het geen vouwen presenteert.
    3. Een steriele tip gebruiken om de oplossing van de Formvar rond het monster houder gat.
    4. Fijn de monsterhouder met lijm op de uitgerekte polycarbonaat folie (een 5 x 5 mm vierkant) neergezet.
    5. Herhaal de vorige reeks een monsterhouder om voor te bereiden elke repliceren.
      Opmerking. De film van polycarbonaat (PC) is biocompatibel, dik genoeg en resistent zijn tegen de verschillende protocollen en analytische beperkingen.
      Let op- Chloroform is giftig. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast en passende filters.
  3. Monster houder sterilisatie
    1. Plaats het gemonteerde monsterhouder in een conische kolf van 50 mL ethanol 70% (v/v) bij agitatie bij 180 rpm en +37 ° C's nachts, met behulp van een incubator/roerder.
    2. Spoel de houder meerdere malen in steriel gedistilleerd water.
    3. Lucht droog ze onder steriele omstandigheden en hen blootstellen aan het ultraviolette licht (kiemdodende lamp van bioveiligheid Bank, klasse II) gedurende 30 minuten aan elke kant.
    4. Houd de monsters in steriele 12-Wells-platen (een monsterhouder per putje) tot klaar voor gebruik.
      Opmerking: Meerdere houders van de steekproef kunnen worden achtergelaten bij kamertemperatuur in steriele en droge 12-Wells-platen verzegeld met parafilm voor meerdere dagen.

2. groei van cellen in de passende monsterhouder.

Let op: Protocol moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid laminaire flow bankje (klasse II) uit te sluiten van contaminerende micro-organismen. Omgaan met antibiotica (bijvoorbeeld penicilline, streptomycine) met handschoenen. Respecteren van beste praktijken bij de verwerking van biologische materialen (cellijnen, genetisch gemodificeerde afgeleid menselijke cellen).

Kritische: de cellijnen die gebruikt moeten worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat zij niet zijn besmet met Mycoplasma.

  1. Transfect U2OS cellijn met plasmide rekening houdend met Matrix-roGFP 17,18,19 met behulp van een methode van de transfectie in overeenstemming met protocol vastgesteld door fabrikant.
  2. Om te bevestigen van transfectie met de plasmide-uitvoering de biosensor en plasmide om verlies te voorkomen, selecteer en handhaven van transfected cellen op de juiste voedingsbodem.
  3. Visualiseer transfected cellen door fluorescentie microscopie om ervoor te zorgen dat de transfectie is opgetreden en om de uitdrukking van de fluorescentie en de weergave van een netwerk van reticulaire en tubulaire mitochondriale19te bevestigen.
    Punt onderbreken: Cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof voor meerdere jaren.
  4. Gebruik de transfected celpopulatie door het kweken van de cellen in een geschikte voedingsbodem om sub confluente cel populaties. Het groeien van cellen bij 37 ° C, 5% (v/v) CO2 in de sfeer van een verzadigde water.
  5. Zaad cellen in een concentratie, zoals ze zijn aan 80% samenvloeiing de dag van fixatie. Typisch, kan een concentratie van 500 cellen per µL worden gebruikt. Oogsten van cellen met behulp van 400 µL trypsine-EDTA 0,25% (v/v) en houden gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Stop trypsine actie met 1 mL gestolde voedingsbodem. Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min op 230 x g en + 4 ° C, dan de bovendrijvende vloeistof verwijderen, en voeg de gewenste hoeveelheid verse kweekmedium.
    Opmerking. Het protocol is van toepassing op alle cellulaire typen en het aantal cellen die uitgezaaid is afhankelijk van de grootte van de cel en van cel tijd te verdubbelen.
    Let op: Vermijd onderwerpen trypsine, antibiotica en serum aan herhaalde bevriezen-ontdooien cycli. Houd ze steriel. De stockoplossing in aliquots verdelen en bevriezen ze bij −20 ° C. Bewaren de aliquots tot de vervaldatum. Spoel zorgvuldig de pellet cel om de trypsine volledig te verwijderen. Sporen van residuele trypsine zal vertragen en afname van de efficiëntie van de beplating.
  6. Cellen tellen en het uitvoeren van een verdunning met verse volledige kweekmedium bewaard bij 37 ° C om het verkrijgen van een celsuspensie met 500 cellen per µL.
    Opmerking: De concentratie van de celsuspensie moet worden aangepast als een functie van het celtype, om een daling van 40 µL plaat.
  7. Een daling van de 40 µL in het midden van de folie van polycarbonaat plaat. Breng de monsterhoeveelheid 2 h bij +37 ° C, 5% (v/v) CO2 zorgvuldig in de sfeer van een verzadigde water.
    Kritisch: Zodra het monster is geplaatst in de incubator, zo veel mogelijk mechanische beweging om het voordeel van snelle cel bijlage beperken. Volgens het celtype zou het nodig zijn om te broeden cellen langer dan 2 uur voor optimale platting efficiëntie. Controleer verzadigd dat de incubator sfeer goed is om te voorkomen dat druppels verdampen.
  8. Controleer of de cellen goed aangesloten op de folie van polycarbonaat met behulp van een optische Microscoop zijn. Zachtjes, voeg 2 mL verse compleet medium en houden gedurende 24 uur.

3. nanodeeltjes voorbereiding en blootstelling

Opmerking: Fluorescerende kleurstof gemodificeerde TiO2 NPs werden ontworpen, gesynthetiseerd en chemisch gewijzigd met tetramethyl rhodamine isothiocyanaat (TRITC). 20 , 21 deze oppervlakte wijziging kunt nanoparticle detectie, bijhouden en localisatie in situ en in gnudles in zowel bij levende als vaste cellen of in meercellige organismen. 12 , 13 , 18

Let op: Nanomaterialen en nanodeeltjes moeten met zorg worden behandeld. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Voorkom verspreiding in lucht en worden nanodeeltjes bijgehouden in de oplossing (ultrazuiver water).

  1. Maak een suspensie van 1 mg.mL−1 vanTiO2 NPs in ultrazuiver water. De TiO2 NPs met behulp van intensieve 1-min ultrasoonapparaat pulsen op RT verspreiden (750 W, 20 kHz, amplitude: 30%) met behulp van een ultra klankbron en een toegewijde conische microprobe.
  2. Verdun TiO2 NPs op de gewenste concentratie in het kweekmedium teneinde een opschorting van de blootstelling van de 4 µg.cm−2 (eindconcentratie). Medium vervangen door het juiste volume van middellange met NPs op cellen en meng zachtjes voor homogene verdeling van de TiO2 NPs. voorbereiden cellen ook zonder de toevoeging van TiO2 NPs.
  3. Incubeer de cel bevolking gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en de sfeer van een verzadigde water.

4. paraformaldehyde fixatie en fluorescentie microscopie.

  1. Bereid een verse oplossing van paraformaldehyde oplossing (PFA, 4% w/v) is gebufferd in fosfaat Buffer zoutoplossing (PBS, pH 7.4).
    1. Los 4 g PFA poeder in 100 mL PBS. Verwarm de oplossing tot 65 ° C tijdens het roeren met behulp van een magneet en een magneetroerder in een zuurkast. Het verhogen van de pH door toevoeging van 1 M NaOH één druppel tegelijk, totdat de oplossing heeft geleegd. Koel de oplossing tot kamertemperatuur en breng de pH op 7.4. De vers bereide oplossing direct gebruiken of bij + 4 ° C houden en beschermen tegen licht.
      Opmerking: Pre-en-klare PFA oplossingen kunnen worden gebruikt maar een vuist voorbereiding van PFA betere fixatie kwaliteit en instandhouding op lange termijn van de vaste monsters garandeert.
      Let op: PFA is giftig; Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast en passende filters.
  2. Eens, de incubatietijd is verstreken, verwijdert u de cel-kweekmedium dat de TiO2 NPs. Rinse de cel populaties eenmaal met verse kweekmedium en een keer met PBS (2 mL). Verwijderen van PBS, snel afspoelen met een aliquoot gedeelte van het vers en koud PFA (4% w/v, + 4 ° C).
    1. Voeg PFA (2 mL, 4% w/v, + 4 ° C). Laat 15 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
    2. Verwijder de PFA, spoel de cellen met PBS (2 mL 3 keer, 5 min) onder agitatie.
      Punt onderbreken: Deze chemisch vaste monsters kunnen worden gebruikt voor de "duik-freeze" procedure na fluorescentie imaging (go om stap 5) of alleen gebruikt voor fluorescentie imaging (go om stap 4.3).
  3. Vlek de kern met Hoechst33342 broeden de cellen gedurende 10 minuten in PBS. Hoescht33342 wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 500 nM. Na incubatie het verwijderen van de oplossing en spoel met PBS.
    Let op: Hoechst33342 cel permeant en kan worden giftig. Vermijd direct contact, en het gebruik van handschoenen tijdens het bereiden en gebruiken van Hoechst33342.
    Kritische: ervoor zorgen dat de Hoechst33342 kleurstofoplossing vers bereid en onder steriele omstandigheden onderhouden.
  4. Proces vaste monsters voor in situ en eencellige geschikt zijn met behulp van fluorescentie microscopie (Figuur 1).

5. "duik-bevriezing" fixatie en uitdroging

  1. Bereid een aluminiumplaat van de overdracht door het in vloeibare stikstof koeling. Winkel de plaat in een doos gevuld met vloeibare stikstof en handhaven van het oppervlak van de plaat boven de vloeistof in de koude stikstof damp.
    Opmerking: De overdracht plaat kan bestaan uit een metalen plaat (hier, wij gebruikten aluminium) dat kon worden afgekoeld tot de temperatuur van vloeibare stikstof, en die de freeze-dryer monsterkamer kunt invoeren.
    Kritisch: Het vak moet worden gehouden gesloten zo veel mogelijk om te voorkomen dat water vapor deposition op de koude plaat oppervlak. Het monster opgeslagen op de plaat tijdens de voorbereiding moet niet worden gedekt door de vloeibare stikstof.
  2. Spoel cellen eenmaal in cultuurmedium en vervolgens tweemaal meer, kort, in steriele en ultrazuiver water om ontdoen van elk spoor van resterende extracellulaire zouten.
    Kritisch: Ervoor zorgen dat de media vers bereid en onder steriele omstandigheden onderhouden. Alle media bij 37 ° C verhit voordat zij worden gebruikt. Het spoelen moet heel kort (enkele seconden) en de overmaat vloeistof op de monsters zo snel mogelijk verwijderd.
  3. Duik-freeze de cellen bij-150 ° C in vloeibare stikstof-gekoelde 2-methylbutane tijdens 30 s en plaats ze op de aluminium plaat overbrengen. Opslaan van monsters hier tijdens de voorbereiding van alle overige monsters. Wanneer monsters zijn alle cryofixed, transfer all-at-once door het plaatsen van de plaat van de overdracht in een freeze-droger.
    Kritisch: Het totale proces van de Cryofixatie moet niet meer dan 20 minuten duren om te voorkomen dat structurele wijzigingen in de monsters tijdelijk opgeslagen in het vak van de overdracht wordt weergegeven.
  4. Freeze-Dry van de monsters met behulp van de volgende reeksen: 1) het uitvoeren van een primaire uitdroging voor 12 tot 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) bij lage druk en lage temperatuur, dan 2) Voer een secundaire uitdroging fase gedurende ten minste 24 uur, verhoging van de temperatuur van de plaat aan + 40 ° C terwijl de lage druk (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
    Let op: Vloeibare stikstof is extreem koude en kan leiden tot ernstige bevriezing of oog schade bij contact. Gebruik aangepast Bank top containers voor vervoer en veiligheidsuitrusting (cryogene handschoenen, bescherming van ogen en gezicht) dragen.
    Let op: 2-Methylbutane is zeer licht ontvlambaar. Een schadelijke vervuiling van de lucht kan vrij snel worden bereikt over de verdamping van deze stof bij + 20 ° C. Vermijd inademing, inslikken of aanraking met de huid. Ademhaling en oogbescherming en beschermende handschoenen gebruiken. Gebruik altijd een goed functionerende chemische zuurkast. Kunnen worden opgeslagen bij + 4 ° C.
    Kritisch: Gebruik een geschikte thermometer (-150 ° C) om te controleren de 2-Methylbutane temperaturen tijdens de "Duik-freeze"-sessie. De 2-methylbutane moet cool in een vloeibare fase worden bewaard. Overdracht van cryofixed monsters naar de omringende atmosfeer kan veroorzaken cellulaire schade als gevolg van de temperatuurstijging of waterdamp condenserend op het oppervlak van de steekproef. Bijgevolg moet worden overgeboekt zo snel als redelijkerwijs mogelijk (30 s)
    Punt onderbreken: Na Cryofixatie, kunnen de monsters bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor meerdere dagen in steriele en droge omstandigheden (beschermd tegen stof en vocht). Zorgvuldig omgaan met de monsters met een fijne Tang en plaats ze in een steriele 12-well plaat verzegeld met parafilm. Droogmiddel kan worden gebruikt voor het drogen van de atmosfeer.

6. nucleaire Microprobe analyse

Opmerking: Nucleaire Microprobe-analyse werd uitgevoerd op de lijn van de microbeam van AIFIRA (toepassingen Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions nl Région Aquitaine) via de aanvullende ion beam analytische technieken Particle geïnduceerde X-ray emissie (µ- PIXE) en Scanning transmissie Ion microscopie (µ-STIM). De faciliteit is gebaseerd op een 3,5 MV deeltjesversneller lichte ion balken leveren in het energiebereik MeV. 22 , 23

Punt onderbreken: AIFIRA is een ion beam faciliteit gehost door de Universiteit van Bordeaux, dat een toegang tot nationale en internationale teams na wetenschappelijke evaluatie van het voorgestelde experiment biedt.

  1. Monteer de PEEK monster houders op een apertured plaat met behulp van dubbelzijdige tape.
  2. Plaats de plaat ter ondersteuning van monster in een verticaal vlak loodrecht op de richting van de lichtbundel.
  3. Sluit de analyse kamer en Stofzuig de kamer van de analyse.
  4. Scanning transmissie Ion microscopie (µ-STIM)
    Opmerking: STIM wordt gebruikt voor het opnemen van oppervlaktedichtheid kaarten van cellen na de conversie van energieverlies tot cellulaire massa, profiteren van het feit dat het energieverlies evenredig aan de oppervlaktedichtheid van monster is (uitgedrukt in µg.cm-2).
    1. Gebruik een 2 MeV Helium (He+) microbeam als een sonde met een grootte in het brandvlak van rond 300 nm in diameter en bij lage spreekvaardigheid (2000 ions.s-1). Maatregel de energie van de verzonden ionen met een vlakke silicium-detector (pitten detector, 25 mm2, 11 keV energie resolutie @ 5.4 MeV), achter het monster in de as van de lichtbundel is geplaatst.
  5. Deeltje geïnduceerde X-ray emissie (µ-PIXE) en Rutherford Backscattering spectrometrie (µ-RBS).
    Opmerking: µ-Pixe en µ-RBS analyses bieden de ruimtelijke verdeling en kwantificering van chemische elementen met een resolutie van sub micrometer.
    1. Gebruik een 1.5 MeV proton (H+) microbeam (50-150 pA), gericht tot een diameter van 1 µm en scan over dezelfde cellen van belang gespot door STIM van 4 tot 8 uur en ongeveer 100 x 100 µm2.
    2. Geïnduceerde X-ray fotonen uitgezonden van atomen aanwezig in het monster (zwaarder dan nb) door een hoge resolutie Si(Li) solid-state detector (145 eV energie resolutie, @Mn-Kα) geplaatst op 45 ° uit de inkomende as van de lichtbundel te verzamelen. Gebruik de gedetecteerde foton-energie om de aard van de vervuilers (bijvoorbeeld Z van element) en X-ray intensiteit te bepalen van de concentratie van het element te identificeren.
    3. Achterwaarts-verstrooid protonen bij-135 ° gelijktijdig te verzamelen met een silicium-detector (gedeeltelijk verarmd detector, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5.4 MeV) voor het meten van het totale aantal inkomende deeltjes en om te normaliseren X-ray intensiteiten.
      Kritisch: Een collectie van gecertificeerde kalibratie normen voor de kwantificering van de atomaire concentratie wordt gebruikt om het kalibreren van de detectorresponsie X-ray. Referentiematerialen zijn een collectie van dun atomaire films gestort op 6.3 µm dik Mylar-folie. X-Ray energieën variëren van 0.6 (Li, K line) tot 20,2 uitgestoten keV (Rh, K-lijn).

7. de gegevensanalyse

  1. Chemische elemental kaarten met behulp van de IBA-J-plugin voor ImageJreconstrueren. 24
    Opmerking: Speciale software in de vorm van een plugin voor ImageJ is ontwikkeld om ruwe nucleaire microprobe analysegegevens te verwerken. Ruwe gegevens komen overeen met een lijst van evenementen die voortvloeien uit de particle beam interactie met cellen die samen met de positie van de bundel als een chronologische volgorde zijn opgenomen.
    1. Gebruik de IBA-J plugin om gebeurtenissen volgens hun type sorteren: ion energie (STIM) overgebracht, terugverstrooide ion energie (RBS) of X-ray foton-energie (PIXE). Vervolgens verwerken afzonderlijk elk type gegevens.
    2. Berekenen van de dichtheid van de STIM selecteur
    3. Berekent gemiddelde X-ray foton energie spectra en definiëren voor elk scheikundig element van belang een energie-venster om op te halen van de ruimtelijke elementdistributie.
    4. Definiëren van de regio's van belang (ROI) (bijvoorbeeld afzonderlijke cellen, dichte structuur, aggregaten, enz.) en bereken de bijbehorende x-ray spectra.
  2. De overeenkomstige RBS spectra analyseren om te berekenen van het totale aantal incident deeltjes25.
  3. Passen X-ray spectra met behulp van de Gupix software26 om te bepalen van de concentratie van het element voor elke ROI.
    Opmerking: Typische detectiegrens (LOD) voor de methode is in het bereik 1 tot en met 10 µg.g-1 in drooggewicht afhankelijk van het atoomnummer van elementen (LOD afneemt met Z).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Celkweek en fluorescentie beeldvorming van fluorescently geëtiketteerde TiO 2 NPs

We ontwierpen een monsterhouder aangepast voor cultuur van de cel, cel behandeling alsmede multimodale analyse. Het was in het bijzonder belangrijk dat de houder routine optische microscopie toegestaan als goed als nucleaire microprobe analyse en beeldvorming. Deze monsterhouder is gebaseerd op een 2-µm dik polycarbonaat folie gestort op een frame PEEK. Cellen zijn direct geteeld op polycarbonaat, in steriele kweekomstandigheden voor meerdere dagen en vervolgens gebruikt voor verschillende experimentele instellingen, zoals NPs blootstelling.

De chemische oppervlakte wijziging met fluorophores (TRITC) toegestaan de detectie van de TiO2 NPs alsmede hun lokalisatie in situ en in vitro in levende of paraformaldehyde vaste cellen met behulp van fluorescentie microscopie. De celkern- en mitochondriën werden gekleurd met behulp van de vitale kleurstof Hoechst33342 (blauwe voor de kern) en de transfected Matrix-roGFP (groen voor mitochondria), respectievelijk. Dit meerdere kleuring toegestaan de intracellulaire lokalisatie van de TRITC-TiO2 NPs (door haar rood uitstoten fluorescentie) 20 h na blootstelling. NPs alleen gevonden in het cytoplasma van blootgestelde cellen met geen detectie in de kern. NPs werden willekeurig gelokaliseerd in de regio van de perinuclear van het cytoplasma en volledig uitgesloten van de mitochondriën (geen overlapping zijn tussen TRITC en GFP signalen).

Hoewel de fluorescentie microscopie is erg handig voor het lokaliseren van NPs binnen blootgestelde cellen, is het niet kunnen beoordelen van het exacte aantal NPs per cel. Het grootste probleem van fluorescentie microscopie betreffende op de kwantificering van NPs is gekoppeld aan de onzekerheid over (i) het aantal fluorophores gekoppeld aan een bepaald NP en de bleken stabiliteit van de gekozen fluorophore tijdens de observatie en (ii) de de status van de aggregatie van de NPs in de cel.

Figure 1
Figuur 1 : in vitro en in situ fluorescentie van transgene cellen U20S uiten van Matrix-RoGFP imaging en blootgesteld aan TRITC-TiO 2 NPs. U2OS cellen (boven) die zijn gemarkeerd met Hoechst33342 (blauw), Matrix-roGFP (groen) worden blootgesteld aan 4 µg.cm-2 TRITC-geëtiketteerden TiO2 nanodeeltjes (rood) voor 20 h. opmerkingen aangeven dat TiO2 NPs statistische in cellen in een perinuclear regio. Schaal bar: 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Om deze tekortkomingen te verhelpen, zoals nucleaire microprobe analyse techniquesprovide een complementaire benadering van de conventionele optische microscopie als gevolg van hun gevoeligheid voor de NPs waardoor het gebruik van elke tussenliggende signaal fluorescentie van een geënte kleurstof. Bovendien zijn ze ook volledig kwantitatieve gegevens over (i) de sub cellulaire biochemisch inhoud die anders onbekend is, en (ii) de intracellulaire hoeveelheid NPs op de eencellige niveau te verstrekken.

Cryofixatie van cellen na levende imaging.

De hoogste beperking bij het uitvoeren van nucleaire microprobe-analyse is te werken onder vacuüm voorwaarden. We hebben een cel fixatie protocol waardoor het behoud van de biologische ultrastructuur en de biochemische integriteit van het biologische model ontwikkeld. Chemische fixatie heet het spoorelement samenstelling van cellen wijzigen, omdat het vereist de vervanging van hun cellulaire medium door een polymeer dat wordt gebruikt voor het behoud van de cellulaire ultrastructuur. Bovendien, het verwijderen van water ook releases vrije ionen en andere soorten, die Hiermee wijzigt u de algehele samenstelling proeven. Vandaar, wordt het verplicht prioriteit te geven aan een fysieke fixatie methode, met name cryogene methoden. Deze cryogene procedures veroorzaken een snelle beëindiging van de cellulaire activiteit en dit in de tijdschaal milliseconde.

Microscopie van nucleaire microprobe analyse en kwantificering van NPs op de cellulaire schaal.

Scanning transmissie ion microscopie (µ-STIM) en Particle-geïnduceerde X-ray emissie (µ-PIXE) analyse werden uitgevoerd op monsters na Cryofixatie en uitdroging te verkrijgen van nauwkeurige kwantitatieve gegevens over hun elementaire chemische samenstelling.

µ-STIM beelden bleek de lokale verschillen in dichtheid en maakt de de ontdekking van cel structuren zoals de celkern en het cytoplasma. Hoewel de lichtbundel laterale resolutie mogelijk de waarneming van dichte structuren zo smal als 300 nm groot, zoals dun aggregaten zichtbaar hier in het cytoplasma, de STIM methoden kunnen niet discrimineren tussen NP aggregaten en andere dichte cellulaire structuren. Dit is omdat, zoals voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), het fysieke proces dat leidt tot variatie in de uitgezonden energie is de interactie van de binnenkomende ion met de atomaire elektronen-wolk. In tegenstelling tot TEM analyse echter omdat het volume van de gehele cel wordt geanalyseerd, de dikte van de lokale variaties voorkomen dat discriminatie tussen high-Z structuren en een lokale verhoging van cellulaire dichtheid.

Figure 2
Figuur 2 : Beelden van de dichtheid en elementaire verdeling verkregen door µ-STIM en µ-PIXE op cryo-vaste U2OS cellen. U2OS cellen (omhoog) zijn vergeleken met de cryo-vaste U2OS cellen (blootgesteld aan 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, beneden) blootgesteld en waargenomen met behulp van nucleaire microprobe analyse/microscopie. STIM microscopie (links, grijswaarden kaarten) geopenbaard dichte intra - of extra - cellular structuren (nucleus, zout aggregaten, nanodeeltjes). De ruimtelijke resolutie (300 nm) is vergelijkbaar met fluorescentie microscopie en structuren zoals NP aggregaten toont in de perinuclear-regio. Identificatie van structuren op basis van hun dichtheid kan toch dubbelzinnig worden. De µ-PIXE elemental kaarten van K, P en Ti (thermische kleurenschaal) zijn een aanvulling op de µ-STIM kaarten. Ze kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van NPs in cellen. Elke cel kan afzonderlijk worden geanalyseerd in termen van de concentratie van het element (Zie Figuur 3). Schaal bars: 10 µm. kleurenschalen variëren van minimum (blauw) tot maximale intensiteit (grijs). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Zoals geïllustreerd in Figuur 2, kan de µ-STIM weergave de erkenning van de individuele cellen binnen een populatie én ook intracellulaire sub compartimenten zoals de nucleolus en kern. Helaas, en zoals eerder vermeld kunnen NPs niet altijd worden gedetecteerd met behulp van µ-STIM wederopbouw.

Deeltje-geïnduceerde X-ray emissie (µ-PIXE) analyse biedt niet alleen de chemische samenstelling van het monster, maar ook hun elementaire toewijzing (Figuur 2). Tijdens de interactie met de spannende bundel ondergaan de chemische elementen atomaire excitatie-de-excitatie-processen die uiteindelijk leiden tot de emissie van een foton dat de karakteristieke energie van het atoomnummer van het element opgewonden vertoont. Een karakteristieke piek-spectrum is opgebouwd uit de som van alle uitgestoten foton gebeurtenissen en wordt beschouwd als een chemische handtekening van het monster.

Standaard experimentele opstellingen en detectoren gebruikt voor µ-PIXE experimenten mogelijk gelijktijdige kwantificering van alle elementen zwaarder dan Na met een µg.g van 1 tot en met 10−1 droge massa detectiegrens. Nauwkeurigheid bij de waardering elementale concentraties is meestal beperkt tot ongeveer 20% als gevolg van gratis collectie en detector-efficiëntie.

In deze studie, wordt de verdeling van de elementen zoals kalium en fosfor en te kwantificeren van de intracellulaire hoeveelheid TiO2 NPs met titanium toewijzing waargenomen door nucleaire microprobe analyse. Scheikundig element kaarten wordt berekend nadat de fotonen worden gesorteerd volgens de positie van de lichtbundel op de timing van de opname en de selectie van een energie-venster dat is gecentreerd rond een specifiek element. Kaarten zijn representatief voor het aantal gedetecteerde gebeurtenissen op de positie van de lichtbundel en zijn kwantitatieve. Zowel lawaai als achtergrond zijn numeriek gesimuleerd en uitgefilterd. Bovendien, chemische toewijzing kan worden gebruikt om op te halen van de lokale PIXE spectrum nodig zijn voor de kwantificering.

Zoals geïllustreerd in Figuur 2, fosfor wordt homogeen verspreid in de cel met, zoals verwacht, een veel hogere concentratie in nucleair gebied. Kalium is homogeen verdeeld in het volume van de cel. Titanium is gelegen in de regio van de cytoplasmatische perinuclear in de vorm van aggregaten, zoals eerder waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie (Figuur 1). NPs weergegeven de dezelfde perinuclear lokalisatie ongeacht hun oppervlakte staat: matiemaatschappij (Figuur 1) of native modus (Figuur 2). Ondertussen, geen spoor van titanium is opgetreden in de cellen waarin wordt bevestigd dat de verdeling van de titanium waargenomen door µ-PIXE moet worden toegeschreven aan de TiO2 NPs, in overeenstemming met onze eerdere analyses door fluorescentie microscopie.

Daarnaast, zoals geïllustreerd in Figuur 2, is het mogelijk om de intracellulaire verdeling van NPs en kwantitatieve NPs concentraties van specifieke regio's van belang. Gebaseerd op de STIM-kaarten en in correlatie met de fosfor/kalium distributies, is eencellige analyse mogelijk.

Figure 3
Figuur 3 : Één cel kwantitatieve analyse met behulp van µ-PIXE. Individuele X-ray spectra berekend voor cellen afgebeeld in Figuur 2 kunnen worden aangebracht om te bepalen van de concentratie van het element op cellulair niveau. Deze functie is met name interessant voor NP analyse waar de cellulaire concentraties meestal sterke variaties binnen dezelfde populatie tonen. Bijvoorbeeld, voor hetzelfde betekenen belichting, de Ti concentraties variëren van 0.2 tot 1.8 µg.cm-2. Besturingselementen corresponderen met onbehandelde cel populaties. Blootstelling dosis: 4 µg.cm-2. Boxplots vertegenwoordigen de distributie van individuele cellulaire concentraties met een mediane waarde (horizontale lijn) en bars uitbreiding naar laagste en hoogste gemeten waarden. Controle van cellen: N = 14; Blootgesteld cellen: N = 16.

Daarom hebben we niet alleen het gemiddelde gehalte aan van titanium in een celpopulatie gekwantificeerd maar ook de titanium verdeling per cel in een bevolking in een bepaalde experimentele voorwaarde weergegeven. De mediane inhoud van titanium gemeten hier is vrij laag (500 ng.cm-2) ten opzichte van de 4 µg.cm-2 blootstelling dosis de celpopulatie (Figuur 3) en variatie tussen cellen is groot (Ti concentraties bereik van 0,2 tot 1.8 µg.cm -2 volgens de geanalyseerde cellen). We merkten ook een verhoging van de intracellulaire ionen, zoals kalium en calcium in blootgestelde monsters suggereren een cellulaire wijziging homeostase geïnduceerd door de aanwezigheid van TiO2 NPs, zoals eerder is beschreven door verschillende auteurs. 21 , 27

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beschrijven we een methode verstrekken van nuttige informatie dan wat mogelijk met andere beeldvormingstechnieken, met name op de subcellular niveau is. Naast haar imaging vermogen biedt nucleaire microprobe analyse ook mogelijkheden voor kwantificering van chemische elementen in te voeren in de samenstelling van een biologische steekproef. In het huidige werk, we onderzocht menselijke cel populaties en gericht tot de analyse van een gekozen gebied van belang op basis van een enkele cel blootgesteld aan TiO2 NPs. De combinatie met andere technieken biedt zowel morfologische cellulaire beeldvorming en nauwkeurige kwantitatieve gegevens over de elementaire chemische samenstelling.

Als u met succes toepassen nucleaire microprobe analyse, is het verplicht te respecteren van de volgende punten om potentiële valkuilen te vermijden. Ten eerste is het noodzakelijk een cryogene protocol voor de fixatie van de cel gebruiken om te behouden zijn ultrastructuur en de biochemische integriteit. Ten tweede, het is ook verplicht voor het uitvoeren van analyse van dunne monsters met dikte onder 20 µm. Indien nodig, kon afdelen van cryofixed monsters worden uitgevoerd. Monsters moeten absoluut bevroren worden gehouden. Ten derde, het is ook belangrijk om te onthouden dat nucleaire microprobe analyse een tweedimensionale weergave van biologische monsters blijkt. De verdeling van de scheikundig element verkregen is dus een tweedimensionale projectie die eventueel tot verkeerde interpretaties leiden kan. Deze beperking zal in de toekomst worden omzeild door het gebruik van tomografische acquisitie.

Nucleaire microprobe analyse kent ook beperkingen. Het moet worden benadrukt dat de belangrijkste beperking de noodzaak is om onder drukverminderinganalyses uit te voeren. Daarom is het noodzakelijk gebruik van de protocollen van de fixatie van de cel die cellen ultrastructuur en biochemische integriteit behouden blijven. Daarom is het nodig om te testen van de weerstand van de biologische monsters naar de cryogenics procedure (zonder toevoeging van chemische hars). Dit kon beperken het gebruik van nucleaire microprobe analyse.

Een andere beperking is de toegankelijkheid van de voorzieningen voor nucleaire microprobe analyse uit te voeren. De toegewezen lichtbundel tijden zijn daarom soms beperkt, en dit is een extra beperking voor dit soort tijdrovende experiment. Enkele uren zijn vaak nodig voor een overname.

Deze techniek verschilt van andere analysemethoden, met inbegrip van microscopie, (MS), massaspectrometrie met inductief gekoppeld plasma MS (ICP-MS), vloeistofchromatografie (LC - MS), MS en radioactieve isotoop. De laatste zijn inderdaad gebruikt om te schatten van de cellulaire dosis van chemische elementen, maar ze zijn alleen in staat is te informeren bij een macroscopische schaal d.w.z. op een macroscopische bedrag van een steekproef. Geen van hen kunt krijgen, evenals nucleaire microprobe analyse, een nauwkeurige detectie en de toewijzing van een subcellular dosis van specifieke chemische elementen (ionen, metaal of metal oxide NPs). Deze gegevens helpen toegang tot een meer systematische studie van de evaluatie van de dosis-respons.

De precieze schatting van de dosis bij de studie van de internalisering van de NPs in cellen is cruciaal vanuit zowel kwantitatieve NP toxicologie en farmacologie gezichtspunten. Zoals voorgesteld door de grote discrepantie in de waargenomen NP inhoud, waaruit blijkt een 10-fold verschil tussen het minimum en maximum waargenomen concentraties (Figuur 3), de gemiddelde cellulaire concentratie niet mogelijk een relevante parameter om te beschrijven de fenomeen van deeltje blootstelling. Dit geldt met name wanneer een drempel effect wordt verondersteld worden gehouden omdat inhomogene dosis blootstelling tot tegenstrijdige opmerkingen leiden kan. Aangezien de gefractioneerde aard van nanodeeltjes duidelijk op het cellulaire niveau lijkt, stelt deze studie daarom opnieuw de vraag van de relevantie van de methoden die zijn gebaseerd op het analyseren van globale variabelen in aanpak vragen rond de werking van cellen die zijn blootgesteld aan inhomogene doses van verontreinigingen.

Zoals geïllustreerd in het geval hier studeerde, laten observatie en kwantificering van NPs binnen afzonderlijke cellen toe om beter te begrijpen de bioaccumulatie van endogene en exogene elementen zoals metaaloxide NPs. Dit is een kritieke taak voor verdere toepassingen van NPs in biogeneeskunde, waar een gebrekkig begrip van de onderliggende NP distributie in cellen kan leiden tot verkeerd resultaten.

Dit protocol onderstreept de geschiktheid van het gebruik van nucleaire microprobe analyse met andere technieken voor toekomstige evaluaties van NP interacties met biologische monsters. De kwantitatieve benadering biedt informatie over de gevolgen van zo'n NPs op het gebied van opsporing, identificatie, lokalisatie, en kwantificering op het niveau van één enkele cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Serge Borderes voor regie en bewerken van de video. Van het Franse nationale agentschap onderzoek ondersteunt het onderzoeksprogramma TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). Het CNRS en de Europese Gemeenschap als een activiteit gericht op het integreren verstrekt de "steun voor openbare en industriële onderzoek met behulp van Ion Beam technologie (SPIRIT)" onder de EG contract n ° 227012. Dit werk werd ondersteund door Marie Curie-acties - Initial Training Networks (ITN) als een "integratie van activiteiten ter ondersteuning van postdoctorale onderzoek met stages in industrie en opleiding Excellence" (SPRITE, D1.3) onder EG contract nr. 317169. De C'NANO Grand Sud Ouest en de regio Aquitaine ondersteunen het onderzoeksprogramma TOX-NANO (n ° 20111201003) en het onderzoeksprogramma POPRA (n ° 14006636-034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113, (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2, (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48, (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269, (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258, (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1, (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. Elsevier Ltd. (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105, (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8, (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86, (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89, (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75, (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107, (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5, (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269, (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268, (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. 1-17 (2015).
<em>In Situ</em> Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter