Summary
Nous décrivons une procédure pour la détection des éléments chimiques présents in situ dans les cellules humaines, mais aussi leur quantification in vitro . La méthode est bien adaptée à tout type de cellule et est particulièrement utile pour des analyses chimiques quantitatives dans des cellules individuelles après in vitro l’exposition nanoparticules d’oxyde métallique.
Abstract
Micro-analytical techniques basées sur l’imagerie de l’élément chimique permettent la localisation et quantification de composition chimique au niveau cellulaire. Ils offrent de nouvelles possibilités pour la caractérisation des systèmes vivants et sont particulièrement adaptés pour détecter, localiser et quantifier la présence de nanoparticules d’oxyde METALLIQUE en spécimens biologiques et l’environnement. En effet, ces techniques de toutes les exigences correspondantes en matière de (i) la sensibilité (de 1 à 10 µg.g-1 de masse sèche), résolution spatiale de gamme micromètre (ii) et (iii) multi-éléments détection. Compte tenu de ces caractéristiques, imagerie élément chimique microfaisceaux peut puissamment compléter les techniques d’imagerie courants tels qu’optique et microscopie de fluorescence. Ce protocole décrit comment effectuer une analyse par microsonde nucléaire sur des cellules cultivées (U2OS) exposés à des nanoparticules de dioxyde de titane. Les cellules doivent grandir et être exposés directement dans un porte-échantillon spécialement conçu pour utiliser le microscope optique et dans les étapes de l’analyse par microsonde nucléaire. Plongée-gel fixation cryogénique des échantillons conserve l’organisation cellulaire et la distribution des éléments chimiques. Analyse simultanée microsonde nucléaire (microscopie ionique de transmission, de rétrodiffusion de Rutherford et de particule induite par émission de rayons x) effectuée sur l’échantillon fournit des informations sur la densité cellulaire, la distribution locale des les éléments chimiques, ainsi que le contenu cellulaire des nanoparticules. Il y a un besoin croissant de ces outils analytiques au sein de la biologie, en particulier dans le contexte émergent Nanotoxicologie et nanomédecine pour lesquels notre compréhension des interactions entre les nanoparticules et les échantillons biologiques doit être approfondie. En particulier, comme l’analyse par microsonde nucléaire ne nécessite pas de nanoparticules d’être étiquetés, abondance de nanoparticules est quantifiables jusqu’au niveau des cellules individuelles dans une population de cellules, indépendamment de leur état de surface.
Introduction
Homéostasie cellulaire est déterminée par le contrôle de l’absorption, l’assimilation et la localisation intracellulaire de différents oligo-éléments (ions, métaux, composés inorganiques exogènes). Ces composants sont souvent sous forme de traces, mais néanmoins, peuvent avoir un impact considérable dans la physiologie du système. Ainsi, l’étude de la biochimie cellulaire dans des situations normales et pathologiques/a souligné est une étape-clé vers une compréhension globale des mécanismes métaboliques cellulaires. Par conséquent, le développement des techniques d’imagerie et d’analyses permettant à l’enquête d’abondances chimiques intracellulaires, organisation structurale et leurs fonctions métaboliques associées devient nécessaire. Méthodes très peu sont en mesure de fournir un élément quantitative in situ d’information concernant la nature dans l’ensemble chimique d’un échantillon donné. En dehors des méthodes d’analyse d’échantillons sous la forme de vrac, in situ analyses examiner des échantillons biologiques dans leur intégralité sans perte d’informations de massives et structurelles, afin de préserver leurs composants chimiques (oligo-éléments et ions) et protéines. En outre, comme les nanosciences continuent de développer, imagerie améliorée et les méthodes d’analyse pour la surveillance environnementale à l’échelle cellulaire devra observer et quantifier les interactions et les comportements de nano-objet. 1
Nanoparticles (NPs) ont été définis en tant qu’objets présentant au moins une dimension du visage dans la gamme 1 et 100 nm. 2 en raison de leurs propriétés physicochimiques particulières, NPs sont largement utilisés dans l’industrie. NPs sont employés dans les bio-applications et en nanomédecine. 3 , 4 malgré les nombreuses caractéristiques physico-chimiques du NPs, ils peuvent générer des risques d’effets nocifs sur la santé humaine et l’environnement. Ces risques peuvent être induites par l’exposition prolongée et répétée à divers niveaux de concentration et cela n’a pas encore été clairement établie. 5 , 6 , 7 , 8 en particulier, le sort de NPs à l’intérieur des cellules et les réponses cellulaires associées sont, à ce jour, pas entièrement décrit. C’est en partie en raison de la rareté des méthodes qui permettent la détection et la quantification du NPs intériorisées dans une seule cellule. 9
Les outils analytiques classiques utilisées pour estimer la dose cellulaire des nanoparticules sont microscopies, spectrométrie de masse (MS), couplage inductif plasma MS (ICP-MS)10,11 et la chromatographie en phase liquide que MS (LC-MS), mais ils ne donnent informations utiles à l’échelle macroscopique. Aucun d’eux ne peut fournir une évaluation précise de la teneur de NPs subcellulaire ni la distribution de NPs sans avoir recours à des méthodes de fractionnement. Une évaluation systématique de la relation dose-effet est donc impossible avec ces méthodes, par opposition aux méthodes basées sur la spectroscopie atomique comme microsonde nucléaire analyse12,13, microscopie de fluorescence de rayons x synchrotron14 et spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS). 15 , 16 ces méthodes sont particulièrement intéressants car ils complètent les observations faites à l’aide de la microscopie en fluorescence, surtout lorsque NPs ne peut pas être étiquetés avec des molécules fluorescentes et sont ainsi étudiés dans leur état natif. Dans une certaine mesure, même lorsque NPs sont greffés avec des fluorophores, (i) quantification reste difficile parce que ne connaît pas le niveau de marquage par NP et (ii) la modification chimique de la surface de la NP peut modifier sa distribution cellulaire.
Dans cet article, nous nous concentrons sur une méthode basée sur une combinaison de techniques de microsonde nucléaire visant à l’imagerie de la morphologie et la composition élémentaire des spécimens biologiques en majeur, mineur et tracer les concentrations.
Analyse par microsonde nucléaire s’avère particulièrement adapté pour la mesure des éléments chimiques dans les tissus biologiques. La résolution latérale de faisceau (0,3 à 1 µm) et la sensibilité dans la détection de l’élément chimique (de 1 à 10 µg.g poids sec-1 ) sont bien adaptés pour des études au niveau cellulaire. Microsonde nucléaire techniques sont basées sur la détection de particules (photons, électrons, ions) émise après que le faisceau d’ions (en général fonctionnant aux énergies MeV) interagit avec les atomes présents dans l’échantillon. Les interactions qui se produisent dans les cellules sont principalement : 1) excitation/ionisation des atomes, suivie d’une émission de photons après atomes retournent à leur état fondamental ; et 2) diffusion des particules incidentes conduisant au changement dans l’énergie et de la direction. La mesure de la particule émise énergie allowsthe identification des atomes impliqués dans l’interaction. Pour effectuer le mappage des éléments, le microfaisceaux d’ions est à plusieurs reprises analysé sur la surface de l’échantillon, souvent sur une superficie d’environ 100 par 100 µm2 contenant plusieurs cellules. Particules émises sont détectés et leur énergie est enregistré pour chaque position du faisceau. Tri des particules selon la position du faisceau, identifiant ainsi la structure responsable de l’émission de ces particules est le but du traitement des données. Nous décrivons ici précisément une approche basée sur la microscopie par fluorescence et analyse par microsonde nucléaire pour détecter mais aussi de quantifier NPs exogènes à l’échelle cellulaire et subcellulaire, afin d’enquêter sur les conséquences des interactions NP avec la vie systèmes. Nous nous concentrerons particulièrement sur les possibilités offertes par cette méthode en termes in situ la quantification des rejets de dioxyde de titane (TiO2 NPs) des nanoparticules agrégats au niveau subcellulaire.
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Protocol
1. préparation titulaire
-
Préparation et conception du titulaire de l’échantillon
- Fabriquer un porte-échantillon en perçant un carré de 5 x 5 mm dans un cadre PEEK épaisseur 1 mm.
- Nettoyer en rinçant avec de l’éthanol 70 % (v/v) et gardez en plaques stériles jusqu'à utilisation.
Roman Un porte-échantillon approprié pour la culture cellulaire et de la manipulation de la cellule est nécessaire. Il doit être conçu pour cell culture, in vitro des observations par microscopie optique et analyse par microsonde nucléaire et d’imagerie. Ce support est constitué d’un coup d’oeil cadre13.
- Préparation des échantillons titulaire
- Préparer la solution de Formvar en dissolvant 1 mg de poudre de Formvar dans 100 mL de chloroforme.
- Étirer la feuille en polycarbonate sur une ossature métallique afin qu’elle ne présente aucun pli.
- Utiliser un embout stérile pour répandre la solution Formvar autour du trou de porte échantillon.
- Posez délicatement le porte-échantillon avec de la colle sur la feuille de polycarbonate étiré (un carré de 5 x 5 mm).
- Répétez la séquence précédente pour préparer un porte-échantillon pour chaque répétition.
Roman Le film en polycarbonate (PC) est biocompatible, assez épais et résistant aux différents protocoles et contraintes analytiques.
Attention- chloroforme est toxique. Éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Toujours utiliser une hotte de laboratoire chimique fonctionnant correctement et de filtres appropriés.
- Stérilisation de porte échantillon
- Placez le porte-échantillon monté dans une fiole conique avec 50 mL d’éthanol à 70 % (v/v) sous agitation à 180 tr/min et + 37 ° C pendant la nuit, à l’aide d’un incubateur/agitateur.
- Rincez le titulaire plusieurs fois dans l’eau distillée stérile.
- Air sécher dans des conditions stériles et de les exposer aux rayons ultraviolets (Lampe germicide de biosécurité banc, classe II) pendant 30 min de chaque côté.
- Conserver les échantillons dans des plats de 12 puits stériles (titulaire d’un seul échantillon par puits) jusqu’au moment d’utiliser.
Remarque : Plusieurs détenteurs de l’échantillon peuvent être conservés à température ambiante en plaques de 12 puits secs et stériles scellé avec du parafilm pendant plusieurs jours.
2. la croissance des cellules dans le porte-échantillon approprié.
Mise en garde : Protocole doit être effectué dans un banc de flux laminaire de biosécurité (classe II) à exclure les micro-organismes contaminants. Gérer les antibiotiques (p. ex. pénicilline, streptomycine) avec des gants. Respecter les meilleures pratiques lors de la manipulation de matériel biologique (lignées cellulaires, génétiquement modifiées dérivées des cellules humaines).
Critique: des lignées cellulaires utilisées doivent être vérifiées pour s’assurer qu’ils ne sont pas infectés par Mycoplasma.
- Transfecter lignée cellulaire U2OS avec plasmide portant Matrix-roGFP 17,18,19 , à l’aide d’une méthode de transfection conformément au protocole établi par le fabricant.
- Pour confirmer la transfection avec le plasmide porteur le biocapteur et pour éviter toute perte de plasmide, sélectionner et conserver les cellules transfectées sur le milieu de culture approprié.
- Visualiser les cellules transfectées par microscopie de fluorescence a subi de la transfection et de confirmer l’expression de la fluorescence et l’affichage d’un réseau mitochondrial réticulaire et tubulaire19.
Pause point : Les cellules peuvent être congelés dans l’azote liquide pendant plusieurs années. - Utilisez la population de cellules transfectées en cultivant des cellules dans un milieu approprié afin d’obtenir des populations de cellules sub confluentes. La croissance de cellules à 37 ° C, 5 % (v/v) de CO2 dans une atmosphère saturée d’eau.
- Graine de cellules à une concentration, telles qu’elles sont à la confluence de 80 % le jour de la fixation. En règle générale, une concentration de 500 cellules / µL pourrait être utilisée. Récolter les cellules à l’aide de 400 µL de trypsine-EDTA 0,25 % (v/v) et maintenir pendant 3 min à 37 ° C. Arrêter l’action de la trypsine avec 1 mL de milieu de culture. Les cellules de granule par centrifugation pendant 5 min à 230 x g et + 4 ° C, puis enlever le surnageant et ajouter le volume souhaité de milieu de culture frais.
Remarque. Le protocole s’applique à tous les types cellulaires et le nombre de cellules ensemencées dépend de la taille de la cellule et sur le temps de doublement cellulaire.
Mise en garde : Éviter de soumettre la trypsine, antibiotiques et sérum aux cycles de gel-dégel répétés. Gardez-les stérile. Diviser la solution en aliquotes et congelez-les à −20 ° C. Stocker les aliquotes jusqu'à la date d’expiration. Rincez soigneusement le culot cellulaire afin de supprimer complètement la trypsine. Traces de trypsine résiduelle vont retarder et diminuer l’efficacité de l’électrodéposition. - Compter les cellules et effectuer une dilution avec milieu de culture complet frais maintenu à 37 ° C afin d’obtenir une suspension de cellules avec 500 cellules / µL.
Remarque : La concentration de la suspension cellulaire doit être adaptée en fonction du type cellulaire, pour une baisse de 40 µL sur plaque. - Plaque d’une baisse de 40 µL vers le centre de la feuille de polycarbonate. Placer soigneusement l’échantillon de 2 h à + 37 ° C, 5 % (v/v) de CO2 dans une atmosphère saturée d’eau.
Critique: Une fois que l’échantillon est placé dans un incubateur, limiter autant que possible tout mouvement mécanique afin de favoriser la fixation des cellules rapide. Selon le type de cellule, il pourrait être nécessaire d’incuber les cellules plus de 2 h pour une efficacité optimale platting. Vérifiez que l’atmosphère de la couveuse est bien saturé pour empêcher l’évaporation des gouttes. - Vérifiez que les cellules sont bien attachés sur la feuille en polycarbonate à l’aide d’un microscope optique. Doucement, ajouter 2 mL de milieu complet frais et garder pendant 24 h.
3. nanoparticules préparation et exposition
NOTE : Fluorescent modifiés colorant TiO2 NPs ont été conçues, synthétisé et chimiquement modifiées à l’isothiocyanate de tétraméthyl rhodamine (TRITC). 20 , 21 cette modification de surface permet de nanoparticules détection, suivi et localisation in situ et en cellulo dans les cellules vivants ou fixes ou dans les organismes multicellulaires. 12 , 13 , 18
Mise en garde : Nanomatériaux et nanoparticules doivent être manipulés avec soin. Éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Pour empêcher la diffusion dans l’air, nanoparticules sont maintenues dans la solution (eau ultrapure).
- Préparer une suspension de 1 mg.mL−1 deTiO2 NPs dans de l’eau ultrapure. Disperse les TiO2 NPs utilisant des impulsions intenses 1 min sonication à ta (750 W, 20kHz, amplitude : 30 %) à l’aide d’un générateur d’ultrasons et une microsonde conique dédiée.
- Diluer TiO2 NPs à la concentration voulue dans le milieu de culture afin d’obtenir une suspension de l’exposition de 4 µg.cm−2 (concentration finale). Remplacer le moyen avec le volume approprié de moyennes NPs contenant des cellules et mélanger doucement pour une répartition homogène de la TiO2 NPs. Prepare cellules témoins de même sans l’ajout de TiO2 NPs.
- Incuber les populations de cellules pendant 24 h à 37 ° C, 5 % (v/v) de CO2 et une atmosphère saturée d’eau.
4. microscopie de fluorescence et de fixation paraformaldéhyde.
- Préparer une solution fraîche de paraformaldéhyde (PFA, 4 % p/v) stockées dans la Saline de tampon Phosphate (PBS, pH 7,4).
- Dissoudre 4 g de poudre PFA dans 100 mL de PBS. Chauffer la solution à 65 ° C en remuant à l’aide d’un aimant et un agitateur magnétique dans une hotte de laboratoire. Augmenter le pH en ajoutant 1 M NaOH une goutte à la fois jusqu'à ce que la solution efface. Laisser refroidir la solution à température ambiante et ajuster le pH à 7,4. Utiliser la solution fraîchement préparée immédiatement ou conserver à + 4 ° C et protéger de la lumière.
Remarque : Des solutions PFA pré-faites pourraient être utilisées mais une préparation extemporanée de l’IFP garantit la meilleure qualité de fixation et de conservation à long terme des échantillons fixes.
Mise en garde : PFA est toxique ; éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Toujours utiliser une hotte de laboratoire chimique fonctionnant correctement et de filtres appropriés.
- Dissoudre 4 g de poudre PFA dans 100 mL de PBS. Chauffer la solution à 65 ° C en remuant à l’aide d’un aimant et un agitateur magnétique dans une hotte de laboratoire. Augmenter le pH en ajoutant 1 M NaOH une goutte à la fois jusqu'à ce que la solution efface. Laisser refroidir la solution à température ambiante et ajuster le pH à 7,4. Utiliser la solution fraîchement préparée immédiatement ou conserver à + 4 ° C et protéger de la lumière.
- Une fois, le temps d’incubation est écoulé, retirez le milieu de culture cellulaire contenant le TiO2 NPs. Rincer les populations de cellules une fois avec le milieu de culture frais et une fois avec du PBS (2 mL). Retirer les PBS, rincer rapidement à une partie aliquote de l’IFP fraîche et froide (4 % p/v, + 4 ° C).
- Ajouter PFA (2 mL, 4 % p/v, + 4 ° C). Incuber 15 min à température ambiante.
- Retirer la PFA, rincer les cellules avec du PBS (2 mL, 3 fois, 5 min) sous agitation.
Pause point : Ces fixes chimiquement des échantillons peuvent être utilisés pour la procédure de « plongeon-gel » après la fluorescence imaging (passez à l’étape 5) ou utilisés uniquement pour la fluorescence imaging (passez à l’étape 4.3).
- Colorent le noyau avec Hoechst33342 en incubant les cellules pendant 10 min dans du PBS. Hoescht33342 est utilisé à une concentration finale de 500 nM. Après incubation, enlever la solution et rincer avec du PBS.
Mise en garde : Hoechst33342 est perméant cellule et peuvent être toxiques. Eviter le contact direct et utilisez des gants lors de préparation et d’utilisation de Hoechst33342.
Critique: veiller à ce que le Hoechst33342 solution de coloration est fraîchement préparés et maintenus dans des conditions stériles. - Processus de correction d’échantillons pour in situ et imagerie cellulaire unique à l’aide de la microscopie de fluorescence (Figure 1).
5 « déshydratation et Fixation plongée-gel »
- Préparer une plaque de transfert en aluminium en refroidissant dans l’azote liquide. Magasin la plaque dans une boîte remplie d’azote liquide et maintenir la surface de la plaque au-dessus du liquide dans la vapeur d’azote.
Remarque : La plaque de transfert peut être faite de toute pièce métallique (ici, nous avons utilisé en aluminium) qui peut être refroidi à la température de l’azote liquide, et qui peut entrer dans le compartiment de mesure lyophilisateur.
Critique: La boîte doit être fermée autant que possible afin d’éviter le dépôt de vapeur d’eau sur la surface de la plaque froide. L’exemple stockée sur la plaque lors de la préparation ne devrait pas être couvertes par l’azote liquide. - Rincer les cellules une fois dans le milieu de culture et ensuite deux fois plus, brièvement, dans l’eau stérile et ultra-pure pour obtenir débarrasser de toute trace d’autres sels extracellulaires.
Critique: Veiller à ce que les médias sont fraîchement préparés et maintenus dans des conditions stériles. Faire chauffer tous les médias à 37 ° C avant d’être utilisé. Le rinçage doit être très brève (quelques secondes) et l’excès de liquide sur les échantillons retiré aussi rapidement que possible. - Plongée-gel les cellules à-150 ° C dans le liquide refroidi à l’azote 2-Méthylbutane pendant 30 s et le lieu sur l’aluminium plaque de transfert. Conserver les échantillons ici lors de la préparation de tous les autres échantillons. Lorsque les échantillons sont tous cryofixés, transférer tout-at-once en plaçant la plaque de transfert dans un lyophilisateur.
Critique: Le processus global de la cryofixation ne devraient pas durer plus de 20 min afin d’éviter des modifications structurelles pour apparaître dans les échantillons stockés temporairement dans la boîte de transfert. - Lyophiliser les échantillons en utilisant les séquences suivantes : 1) effectuer une dessiccation primaire pendant 12 à 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) à basse pression et basse température, puis 2) effectuer une phase de dessiccation secondaire pendant au moins 24 h, augmentant la température de la plaque à + 40 ° C, tout en gardant la pression basse (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
Mise en garde : Azote liquide est très froid et peut endommager gravement engelures ou œil au contact. Utiliser des contenants à banc adapté pour le transport et porter un équipement de sécurité (gants cryogéniques, protection oculaire et faciale).
Attention : 2-Méthylbutane est extrêmement inflammable. Une contamination nocive de l’air peut être atteint assez rapidement sur l’évaporation de cette substance à + 20 ° C. Éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Utilisez la respiration et lunettes de protection et des gants de protection. Toujours utiliser une hotte de laboratoire chimique fonctionne correctement. Peut être conservé à + 4 ° C.
Critique: Utiliser un thermomètre approprié (-150 ° C) pour surveiller les températures 2-Méthylbutane lors de la session « Plongeon-gel ». Le 2-Méthylbutane doit être conservé au frais dans une phase liquide. Transférant cryofixés échantillons à l’atmosphère ambiante peut provoquer des dommages cellulaires en raison de l’augmentation de température ou de la vapeur d’eau de condensation sur la surface de l’échantillon. En conséquence, le transfert doit se faire aussi vite que possible (30 s)
Pause point : Après la cryofixation, les échantillons peuvent être conservés à température ambiante pendant plusieurs jours dans des conditions stériles et secs (protégées contre la poussière et l’humidité). Soigneusement gérer les échantillons avec une pince fine et placez-les dans une assiette de 12 puits stérile scellée avec du parafilm. Déshydratant peut être utilisé pour sécher l’atmosphère.
6. nucléaire analyse par microsonde
Remarque : L’analyse par microsonde nucléaire a été réalisée sur la ligne de microfaisceaux de AIFIRA (Applications Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine) en utilisant des techniques d’analyses complémentaires ion beam émission de rayons x induite par particules (µ- PIXE) et microscopie ionique Transmission (µ-STIM). L’installation est issue d’un accélérateur de particules 3,5 MV offrant des faisceaux d’ions légers dans la gamme d’énergie de MeV. 22 , 23
Pause point : AIFIRA est une installation de faisceau d’ions hébergée par l’Université de Bordeaux qui offre un accès aux équipes nationales et internationales après évaluation scientifique de l’expérience proposée.
- Monter les détenteurs d’échantillon coup d’oeil sur une plaque ajourée à l’aide de ruban adhésif double-face.
- Placer la plaque à l’échantillonnage dans un plan vertical perpendiculaire à la direction du faisceau.
- Fermer la chambre d’analyse et vide la chambre d’analyse.
- Microscopie ionique Transmission (µ-STIM)
NOTE : STIM est utilisé pour enregistrer des cartes de densité des cellules après conversion en masse cellulaire, de perte d’énergie en profitant du fait que la perte d’énergie est proportionnelle à la densité surfacique de sample (exprimée en µg.cm-2).- Utiliser un microfaisceaux d’hélium (He+) de 2 MeV comme une sonde avec une taille dans le plan focal d’environ 300 nm de diamètre et à la faible maîtrise (2000 ions.s-1). Mesure l’énergie des ions transmises avec un détecteur silicium planaire (détecteur de PIPS, 25 mm2, 11 résolution d’énergie de keV @ 5,4 MeV), placé derrière l’échantillon dans l’axe du faisceau.
- Particule induit par les émissions de rayons x (µ-PIXE) et de la rétrodiffusion de Rutherford (µ-RBS).
Nota : µ-Pixe et µ-RBS analyses donnent la répartition spatiale et la quantification des éléments chimiques avec une résolution de micromètre subsidiaire.- Utilisez un microfaisceaux de proton (H+) 1,5 MeV (50-150 pA), porté vers le bas pour un diamètre de 1 µm et analyse sur les mêmes cellules d’intérêt repéré par STIM de 4 à 8 heures et environ 100 x 100 µm2.
- Recueillir induites photons des rayons x émis par les atomes présents dans l’échantillon (plus lourd que Na) par un détecteur à semi-conducteurs si (Li) à haute résolution (résolution en énergie eV 145, @Mn-Kα) positionnés à 45 ° de l’axe du faisceau entrant. L’énergie des photons détectés permet d’identifier la nature des émetteurs (Z de l’élément, par exemple) et l’intensité des rayons x pour déterminer la concentration de l’élément.
- Collecter simultanément éparpillés à l’arrière des protons à-135 ° avec un détecteur silicium (détecteur partiellement appauvri, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) pour mesurer le nombre total de particules incidentes et de normaliser les intensités des rayons x.
Critique: Une collection de normes d’étalonnage certifié pour la quantification de la concentration atomique est utilisée pour calibrer la réponse du détecteur rayons-x. Matériaux de référence sont une collection de couches minces atomiques déposés sur 6,3 µm épaisses feuilles de Mylar. Émis vont d’énergies des rayons x de 0,6 (Li, K line) à 20,2 keV (Rh, K line).
7. analyse de données
- Reconstruire les cartes élémentaires chimiques en utilisant le plugin de IBA-J pour ImageJ. 24
Remarque : Un logiciel dédié sous la forme d’un plugin d’ImageJ a été développé pour traiter les données d’analyse brute microsonde nucléaire. Données brutes correspondent à une liste d’événements provenant de faisceau de particules interaction avec les cellules qui y sont enregistrées ainsi que la position du faisceau comme une séquence chronologique.- Utiliser le plugin IBA-J pour trier les événements selon leur type : transmis énergie ionique (STIM), rétrodiffusé énergie ionique (RBS) ou l’énergie des photons des rayons x (PIXE). Ensuite, traiter séparément chaque type de données.
- Calculer la carte STIM de la densité de la zone
- Calculer la moyennes spectres d’énergie de photons des rayons x et définir pour chaque élément chimique d’intérêt une fenêtre d’énergie afin de récupérer la distribution spatiale de l’élément.
- Définir des zones d’intérêt (ROI) (p. ex. les cellules individuelles, structure dense, agrégats, etc..) et calculer les spectres de rayons x correspondants.
- Analyser les spectres correspondants de RBS afin de calculer le nombre total de particules incident25.
- Ajustement des spectres de rayons x à l’aide du logiciel de Gupix26 afin de déterminer la concentration de l’élément pour chaque ROI.
Remarque : Limite de détection (LD) pour la méthode est dans la gamme 1 à 10 µg.g-1 en masse sèche selon le numéro atomique des éléments (LOD diminue avec Z).
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Representative Results
Culture cellulaire et imagerie de fluorescence de TiO fluorescent étiqueté 2 NPs
Nous avons conçu un porte-échantillon adapté à la culture de cellules, cellules de manutention ainsi qu’analyse multimodale. Plus précisément, il était important que le titulaire autorisé microscopie optique systématique comme bien comme nucléaire imagerie et analyse par microsonde. Ce porte-échantillon est basé sur une feuille de polycarbonate épaisseur 2 µm déposée sur un châssis PEEK. Cellules sont cultivées directement sur polycarbonate, dans les conditions de culture stérile pendant plusieurs jours et ensuite utilisés pour les différents paramètres expérimentaux, tels que l’exposition de NPs.
La modification chimique de la surface avec des fluorophores (TRITC) a permis de détecter les TiO2 NPs ainsi que leur localisation in situ et in vitro en vie ou en paraformaldéhyde fixé à l’aide de la microscopie de fluorescence des cellules. Le noyau de la cellule et les mitochondries ont été colorés avec du colorant vital Hoechst33342 (bleu pour le noyau) et la matrice transfectée-roGFP (vert pour les mitochondries), respectivement. Cette coloration multiple a permis de la localisation intracellulaire des TRITC-TiO2 NPs (par son rouge émettant de fluorescence) 20 h après l’exposition. SNP ont été observées que dans le cytoplasme des cellules exposées avec aucune détection dans le noyau. NPs étaient localisées au hasard dans la région périnucléaire du cytoplasme et totalement exclus de la mitochondrie (pas de chevauchement entre TRITC et GFP signaux).
Bien que la microscopie de fluorescence est très utile pour localiser le serveur NPs à l’intérieur des cellules exposées, il n’est pas en mesure d’évaluer le nombre exact de NPs par cellule. La principale difficulté de la microscopie de fluorescence concernant la quantification du NPs est liée à l’incertitude au sujet de (i) le nombre des fluorophores attachés à un NP donné et la stabilité de blanchiment du fluorophore choisie lors de l’observation et (ii) la État d’agrégation du SNM à l’intérieur de la cellule.
Figure 1 : in vitro et in situ fluorescence imaging de U20S cellules transgéniques exprimant la matrice-RoGFP et exposés à TRITC-TiO 2 NPs. U2OS de cellules (en haut) marqués avec Hoechst33342 (bleu), matrice-roGFP (vert) sont exposées à des nanoparticules-2 TiO TRITC marqué2 µg.cm 4 (rouge) pour 20 h. Observations indiquent que TiO2 NPs globales dans les cellules dans une région périnucléaire. Barre d’échelle : 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Pour combler ces lacunes, microsonde nucléaire analyse techniquesprovide une approche complémentaire à la microscopie optique conventionnelle en raison de leur sensibilité à la SNPP qui empêche l’utilisation de n’importe quel signal intermédiaire comme la fluorescence d’un greffé colorant. De plus, ils sont entièrement quantitatives, fournissant des données sur (i) le contenu biochimique subcellulaire qui est par ailleurs inconnu et (ii) la quantité intracellulaire de NPs au niveau de la cellule unique.
Cryofixation des cellules après imagerie live.
La plus forte contrainte en effectuant l’analyse par microsonde nucléaire consiste à travailler dans des conditions de vide. Nous avons développé un protocole de fixation cellulaire permettant la préservation de l’ultrastructure biologique et l’intégrité biochimique de l’échantillon biologique. Fixation chimique est connue pour modifier la composition en éléments traces des cellules car elle nécessite le remplacement de leur milieu cellulaire par un polymère utilisé pour conserver l’ultrastructure cellulaire. En outre, le prélèvement d’eau libère également les ions libres et autres espèces, ce qui modifie l’ensemble composition de l’échantillon. Par conséquent, il devient obligatoire de donner la priorité à une méthode de fixation physique, notamment les méthodes cryogéniques. Ces procédures cryogéniques induisent une cessation rapide de l’activité cellulaire et ce, à l’échelle de temps de milliseconde.
Microsonde nucléaire analyse microscopie et quantification des rejets de serveur NPs à l’échelle cellulaire.
Microscopie ionique transmission (µ-STIM) et analyse des émissions (µ-PIXE) provoquées par les particules des rayons x ont été effectuées sur des échantillons après la cryofixation et déshydratation à obtenir des données quantitatives précises sur leur composition chimique élémentaire.
Images de µ-STIM a révélé des différences locales de densité et permet la détection des structures cellulaires tels que le noyau et le cytoplasme. Bien que la résolution latérale du faisceau permet l’observation de dense structures aussi étroite comme 300 nm large, mince agrégats visibles ici dans le cytoplasme, les méthodes STIM ne peuvent pas distinguer entre les agrégats de NP et d’autres structures cellulaires denses. C’est parce que, comme pour la microscopie électronique à transmission (TEM), le processus physique conduisant à la variation de l’énergie transmise est l’interaction de l’ion entrante avec les nuages d’électrons atomiques. Contrairement à l’analyse TEM cependant, parce que le volume de la cellule entière est analysé, variations d’épaisseur locale prévenir la discrimination entre les structures de Z élevé et une augmentation locale de la densité cellulaire.
Figure 2 : Images de densité et de la distribution élémentaire obtient par µ-STIM et µ-PIXE sur cellules U2OS cryo-fixes. U2OS hématies (vers le haut) sont comparés aux exposés cryo-correction U2OS cellules (exposés à 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, vers le bas) et observés à l’aide d’une microsonde nucléaire analyse/microscopie. Microscopie STIM (à gauche, cartes en niveaux de gris) ont révélé des structures denses aux intra - ou extra-cellulaires (noyau, sels agrégats, nanoparticules). La résolution spatiale (300 nm) est comparable à la microscopie en fluorescence et montre des structures telles que les agrégats de NP dans la région périnucléaire. Identification des structures basées seulement sur leur densité peut néanmoins être ambiguë. Les cartes élémentaire µ-PIXE K, P et Ti (échelle de couleurs thermique) sont complémentaires aux cartes µ-STIM. Il peuvent être utilisés pour s’assurer de la présence de NPs dans les cellules. Chaque cellule peut être analysé individuellement en fonction de la concentration de l’élément (voir Figure 3). Barreaux de l’échelle : 10 µm. échelles de couleur allant de minimum (bleu) à intensité maximale (gris). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tel qu’illustré à la Figure 2, le rendu de µ-STIM permet la reconnaissance des cellules individuelles dans une population et également des compartiments intracellulaires secondaires telles que le nucléole et le noyau. Malheureusement et comme mentionné précédemment, NPs ne peuvent pas toujours être détectés à l’aide de reconstruction µ-STIM.
Provoquées par les particules de diffraction d’émission (µ-PIXE) fournit non seulement la composition chimique de l’échantillon, mais aussi leur mappage élémentaire (Figure 2). Au cours de l’interaction avec le faisceau excitant, les éléments chimiques subissent des processus de l’excitation-excitation atomiques qui éventuellement conduisent à l’émission d’un photon qui présente l’énergie caractéristique du nombre atomique de l’élément excité. Un éventail de caractéristiques de pointe est construit à partir de la somme de tous les événements de photons émis et est considéré comme une signature chimique de l’échantillon.
Configurations expérimentales standard et détecteurs utilisés pour des expériences de µ-PIXE permettent la quantification simultanée de tous les éléments plus lourds que Na avec une limite de détection de masse sèche de−1 de 1 à 10 µg.g. Précision en mesurant les concentrations élémentaires est généralement limitée à environ 20 % en raison de l’efficacité de collection et détecteur de charge.
Dans cette étude, la distribution d’éléments comme le potassium et le phosphore et de quantifier le montant intracellulaire du TiO2 NPs avec le mappage de titane est observée par analyse par microsonde nucléaire. Cartes de l’élément chimique sont calculés après que les photons sont triées d’après la position du faisceau au moment de l’enregistrement et la sélection d’une fenêtre d’énergie centrée autour d’un élément spécifique. Cartes sont représentant le nombre d’événements détectés à la position du faisceau et quantitatives. Tant de bruit et de fond sont numériquement simulées et filtrés. En outre, cartographie chimique peut être utilisée pour extraire le spectre PIXE locaux requis pour la quantification.
Tel qu’illustré à la Figure 2, phosphore homogène distribué dans la cellule avec, comme prévu, une concentration beaucoup plus élevée dans le domaine nucléaire. Potassium est distribuée de façon homogène dans le volume de la cellule. Titane est situé dans la région périnucléaire cytoplasmique, sous forme d’agrégats, comme déjà observé à l’aide de la microscopie de fluorescence (Figure 1). NPs a affiché la même localisation de périnucléaire quelle que soit leur état de surface : fonctionnalisés (Figure 1) ou natif (Figure 2). Pendant ce temps, aucune trace de titane a été détecté dans les cellules de contrôle confirmant que la distribution de titane observée par µ-PIXE doit être attribuée à la TiO2 NPs, en accord avec nos précédentes analyses par microscopie à fluorescence.
En outre, tel qu’illustré à la Figure 2, il est possible d’extraire la distribution intracellulaire des infirmières praticiennes et des concentrations de NPs quantitatives provenant de régions spécifiques d’intérêt. Basé sur les cartes STIM et en corrélation avec les distributions de phosphore/potassium, analyse de la cellule unique est possible.
Figure 3 : Analyse quantitative unicellulaire µ-PIXE. Les spectres de rayons x individuels calculés pour cellules illustrés à la Figure 2 peuvent être adaptés afin de déterminer la concentration de l’élément au niveau cellulaire. Cette fonctionnalité est particulièrement intéressante pour l’analyse de NP où les concentrations cellulaires montrent généralement fortes variations à l’intérieur de la même population. Par exemple, pour la même exposition, la gamme de concentrations de Ti de 0,2 jusqu'à 1,8 µg.cm-2de moyenne. Les contrôles correspondent aux populations de cellules non traitées. Dose d’exposition : 4 µg.cm-2. Boîtes représentent la distribution des concentrations cellulaires individuelles avec une valeur médiane (ligne horizontale) et de bars qui s’étend vers le plus bas et le plus élevé mesuré les valeurs. Contrôler les cellules : N = 14 ; Exposés des cellules : N = 16.
En conséquence, nous avons non seulement quantifié la teneur moyenne de titane dans une population de cellules mais également montré la distribution de titane par cellule chez une population dans des conditions expérimentales spécifiques. La teneur médiane en titane mesuré ici est très faible (500 ng.cm-2) par rapport à la dose d’exposition-2 4 µg.cm de la population cellulaire (Figure 3) et la variation entre les cellules est grande (Ti les concentrations vont de 0,2 jusqu'à 1,8 µg.cm -2 selon les cellules analysées). Nous avons également remarqué une augmentation des ions intracellulaires tels que le potassium et le calcium dans les échantillons exposés, suggérant une homéostasie d’altération cellulaire induite par la présence de TiO2 NPs, comme précédemment décrit par plusieurs auteurs. 21 , 27
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Discussion
Les auteurs décrivent une méthode fournissant des informations utiles au-delà de ce qui est possible avec d’autres techniques d’imagerie, notamment au niveau subcellulaire. Outre sa capacité d’imagerie, analyse par microsonde nucléaire offre aussi des possibilités de dosage d’éléments chimiques entrant dans la composition d’un échantillon biologique. Dans le présent travail, nous avons étudié des populations de cellules humaines et axé vers le bas pour l’analyse d’une région choisie d’intérêt basé sur une seule cellule exposée à TiO2 NPs. Sa combinaison avec d’autres techniques fournit morphologique imagerie cellulaire et les données quantitatives précises sur la composition chimique élémentaire.
Pour appliquer avec succès l’analyse par microsonde nucléaire, il est important de respecter les points suivants afin d’éviter les écueils potentiels. Tout d’abord, il est impératif d’utiliser un protocole cryogénique pour la fixation de la cellule pour retenir son ultrastructure et son intégrité biochimique. Deuxièmement, il est également obligatoire d’effectuer l’analyse des échantillons minces d’épaisseur inférieure à 20 µm. Si nécessaire, découpe des échantillons cryofixés pourrait être effectué. Échantillon devra absolument être conservé congelé. En troisième lieu, il est également important de garder à l’esprit que l’analyse par microsonde nucléaire révèle une représentation bidimensionnelle d’échantillons biologiques. Ainsi, la distribution de l’élément chimique obtenue est une projection bidimensionnelle qui pourrait introduire éventuellement de mauvaises interprétations. Cette limitation sera ignorée dans l’avenir par l’utilisation d’acquisition tomographique.
Analyse par microsonde nucléaire a aussi ses limites. Il faut souligner que sa principale contrainte est qu’il fallait effectuer une analyse sous vide. Par conséquent, il est impératif d’utilisent des protocoles de fixation cellulaire qui préserve l’ultrastructure des cellules et l’intégrité biochimique. Il est donc nécessaire de tester la résistance des échantillons biologiques à la procédure de cryogénie (sans ajout de résine chimique). Cela pourrait limiter l’utilisation de l’analyse par microsonde nucléaire.
Une autre limitation est l’accessibilité aux installations pour mener à bien l’analyse par microsonde nucléaire. Les temps de faisceau attribuées sont donc parfois limitées, et il s’agit d’une contrainte supplémentaire pour ce genre d’expérience chronophage. Il faut souvent plusieurs heures pour une acquisition.
Cette technique diffère des autres méthodes d’analyse, y compris la microscopie, plasma de spectrométrie de masse à couplage inductif (MS), MS (ICP-MS), chromatographie en phase liquide MS (LC - MS) et des isotopes radioactifs. Ces derniers sont en effet utilisées pour estimer la dose cellulaire des éléments chimiques, mais ils ne sont plus en mesure de fournir des informations à un macroscopique balance c'est-à-dire sur une quantité macroscopique d’un échantillon. Aucun d’eux ne peut donner accès, tout comme l’analyse par microsonde nucléaire, pour une détection précise et le mappage d’une dose de subcellulaire des éléments chimiques spécifiques (ions, en métal ou métal oxyde NPs). Ces données aident à accéder à une étude de plus systématique de l’évaluation de la relation dose-effet.
L’estimation précise de la dose lorsque l'on étudie l’internalisation du NPs dans les cellules est essentielle tant quantitatives NP toxicologie et pharmacologie points de vue. Tel que suggéré par l’écart important entre le contenu de NP observé, qui montre une différence de 10 fois entre le minimum et le maximum observé des concentrations (Figure 3), la concentration cellulaire moyenne pourrait ne pas être un paramètre pertinent pour décrire les phénomène d’exposition de la particule. Cela est particulièrement vrai lorsqu’un effet de seuil est censé pour avoir lieu parce que les observations contradictoires pourrait entraîner une exposition à des doses non homogènes. Puisque la nature fractionnée des nanoparticules apparaît clairement au niveau cellulaire, cette étude constitue par conséquent à nouveau la question de la pertinence des méthodes basées sur l’analyse des variables globales à répondre aux questions sur le comportement des cellules exposées au inhomogènes doses de contaminants.
Comme illustré dans le cas étudié ici, observation et quantification du SNP au sein de cellules individuelles permettent de mieux comprendre la bioaccumulation d’éléments endogènes/exogènes comme l’oxyde métallique NPs. Il s’agit d’une tâche critique pour les autres demandes de NPs en biomédecine, où une mauvaise compréhension du sous-jacent distribution de NP dans les cellules pourrait conduire à des résultats mal interprétés.
Ce protocole met en évidence la possibilité d’utiliser l’analyse par microsonde nucléaire avec d’autres techniques pour les évaluations futures des interactions NP avec des spécimens biologiques. L’approche quantitative fournit des informations sur l’impact de ces NPs en termes de détection, d’identification, de localisation et quantification au niveau d’une seule cellule.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Serge Borderes pour réalisation et montage de la vidéo. L’Agence nationale de recherche Français prend en charge le programme de recherche Titanes (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). Le CNRS et la Communauté européenne comme une activité d’intégration fourni le « soutien du Public et recherche utilisant Ion faisceau technologie (esprit industriel) » en vertu de ce contrat n ° 227012. Ce travail a été soutenu par Actions Marie Curie - réseaux de formation initiale (ITN) comme un « intégrant activité soutenant Postgraduate avec stages en industrie et formation Excellence en recherche » (SPRITE, D1.3) sous contrat EC No 317169. Le C'NANO Grand Sud Ouest et la région Aquitaine prend en charge le programme de recherche TOX-NANO (n ° 20111201003) et le programme de recherche POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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