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Chemistry

In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben Sie ein Verfahren zur Detektion von chemischen Elementen vorhanden in Situ in menschlichen Zellen sowie deren Quantifizierung in Vitro . Die Methode eignet sich gut für jeden Zelltyp und eignet sich besonders zur quantitativen chemischen Analyse in einzelnen Zellen nach in-vitro- Metall-Oxid-Nanopartikel-Exposition.

Abstract

Mikro-analytischen Techniken, basierend auf chemischen Elements Bildgebung ermöglichen die Lokalisierung und Quantifizierung der chemischen Zusammensetzung auf zellulärer Ebene. Sie bieten neue Möglichkeiten zur Charakterisierung von lebenden Systemen und eignen sich besonders für die Erkennung, Lokalisierung und das Vorhandensein von Metall-Nanopartikeln in biologischen Proben und die Umwelt zu quantifizieren. In der Tat erfüllen diese Techniken alle relevante Anforderungen im Hinblick auf (i) Empfindlichkeit (von 1 bis 10 µg.g-1 Trockenmasse), (Ii) Mikrometer Bereich Ortsauflösung und (Iii) Multi-Element-Erkennung. Angesichts dieser Merkmale, Microbeam Chemisches Element Bildgebung kann kraftvoll ergänzen routinemäßige bildgebende Verfahren wie z. B. optische und Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine nukleare Mikrosonde Analysen auf kultivierten Zellen (U2OS), Titandioxid-Nanopartikeln ausgesetzt. Zellen müssen wachsen auf und direkt in eine speziell entwickelte Probenhalter auf das optische Mikroskop verwendet und in der nuklearen Mikrosonde Analyse ausgesetzt werden. Sprung-Freeze kryogenen Fixierung der Proben bewahrt die zelluläre Organisation und den chemischen Elementeverteilung. Gleichzeitige nuklearen Mikrosonde (Scan Transmissions-Ion-Mikroskopie, Rutherford backscattering Spectrometry und Partikel induzierte Röntgenemission) durchgeführte Analyse auf die Probe enthält Informationen über die zelluläre Dichte, die räumliche Verteilung von die chemischen Elemente, als auch die zelluläre Inhalt von Nanopartikeln. Es gibt ein wachsender Bedarf für solche analytischen Werkzeuge innerhalb der Biologie, insbesondere der aufstrebenden Nanotoxikologie und Nanomedizin, wofür unser Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und biologischen Proben vertieft werden muss. Insbesondere, wie nukleare Mikrosonde Analysen keine Nanopartikel gekennzeichnet zu werden erfordert, sind Nanopartikel Häufigkeiten quantifizierbare bis auf die einzelne Zellenebene in einer Zellpopulation, unabhängig von ihrer Oberflächenzustand.

Introduction

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Zelluläre Homöostase richtet sich nach der Aufnahme kontrollieren, Assimilation und intrazelluläre Lokalisation der verschiedenen Spurenelementen (Ionen, Metalle, exogene anorganischen Verbindungen). Diese Komponenten sind häufig in Form von Spuren, aber dennoch möglicherweise erhebliche Auswirkungen in der System-Physiologie. Somit ist die Studie der Zellbiochemie in normalen und pathologischen/betonte Situationen ein Schlüssel-Schritt, ein allgemeines Verständnis der zellulären metabolischen Mechanismen. Daher wird die Entwicklung der Bildgebung und analytische Techniken ermöglichen die Untersuchung der intrazellulären chemischen Häufigkeiten, Aufbauorganisation und ihre damit verbundenen Stoffwechselfunktionen erforderlich. Sehr wenige Methoden sind in der Lage, eine in Situ quantitative Stück von Informationen über die insgesamt chemische Natur von einer Probe. Neben Methoden analysieren Proben in loser Form, in Situ Analysen betrachten biologische Proben in ihrer Vollständigkeit ohne Masse und strukturellen Informationen und bewahrt somit ihre konstituierenden Chemikalien (Spurenelemente und Ionen) und Proteine. Darüber hinaus wie die Nanowissenschaften ständig weiterentwickeln, werden verbesserte Bildgebung und analytischen Methoden zur Überwachung der Umwelt auf der zellulären Ebene notwendig sein, zu beobachten und zu quantifizieren, Nano-Objekt Verhalten und Interaktionen. 1

Nanopartikeln (NPs) wurden als Objekte ausstellen mindestens eine Gesichts Dimension im Bereich 1 und 100 nm definiert. 2 aufgrund ihrer besonderen physikalisch-chemischen Eigenschaften NPs ausgiebig in der Industrie verwendet werden. NPs sind in Bio-Anwendungen und Nanomedizin beschäftigt. 3 , 4 trotz der zahlreichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von NPs, können sie einige Risiken von Nebenwirkungen auf die menschliche Gesundheit und Umwelt erzeugen. Diese Risiken können durch längere und wiederholte Exposition mit verschiedenen Konzentrationen induziert werden, und dies ist noch nicht eindeutig geklärt. 5 , 6 , 7 , 8 vor allem das Schicksal des NPs im Inneren der Zellen und der damit verbundenen zellulären Antworten sind bis heute nicht vollständig beschrieben. Dies ist zum Teil aufgrund der Knappheit der Methoden, mit denen die Erkennung und Quantifizierung von verinnerlichten NPs in einer einzelnen Zelle. 9

Die klassischen analytischen Werkzeuge zur Schätzung die zelluläre Dosis von Nanopartikeln sind Microscopies, Massenspektrometrie (MS), gekoppelt induktiv Plasma MS (ICP-MS)10,11 und Flüssigchromatographie bieten MS (LC-MS), sondern sie nur nützliche Informationen auf der makroskopischen Skala. Keiner von ihnen kann eine genaue Auswertung der subzellulären NPs-Inhalt noch die NPs-Verteilung ohne den Einsatz der Fraktionierung Methoden bereitstellen. Eine systematische Bewertung der Dosis-Wirkungs-ist somit unmöglich mit diesen Methoden, im Gegensatz zu Methoden der Atomspektroskopie wie nukleare Mikrosonde Analyse12,13, Synchrotron-Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie14 , und sekundären Ionen-Massenspektrometrie (SIMS). 15 , 16 diese Methoden sind besonders interessant, da sie Beobachtungen mit Fluoreszenz-Mikroskopie ergänzen, insbesondere wenn NPs können nicht mit fluoreszierenden Molekülen gekennzeichnet werden und sind somit in ihrem nativen Zustand untersucht. Zu einem gewissen Grad auch bei NPs mit Fluorophore, gepfropft sind bleibt (i) Quantifizierung schwierig weil das tagging Niveau pro NP unbekannt ist und (Ii) die chemische Modifizierung der Oberfläche NP kann die zelluläre Verteilung ändern.

In diesem Artikel wir konzentrieren uns auf eine Methode basiert auf einer Kombination von nuklearen Mikrosonde Techniken mit dem Ziel die Morphologie und die elementare Zusammensetzung von biologischen Proben in Dur, Moll, imaging und Konzentrationen zu verfolgen.

Nukleare Mikrosonde Analyse erweist sich als besonders geeignet für die Messung von chemischen Spurenelementen in biologischen Geweben. Der Strahl laterale Auflösung (0,3 bis 1 µm) und die Empfindlichkeit in Chemisches Element Erkennung (von 1 bis 10 µg.g-1 Trockenmasse) eignen sich gut für Studien auf zellulärer Ebene. Nukleare Mikrosonde Techniken basieren auf Partikel Detektion (Photonen, Elektronen, Ionen) ausgegeben, nachdem der Ionenstrahl (in der Regel läuft bei MeV Energien) Atome in der Probe vorhanden interagiert. Interaktionen, die in Zellen sind vor allem: 1) Anregung/Ionisation von Atomen, gefolgt von einer Emission von Photonen nach Rückkehr Atome in ihren grundlegenden Zustand; und 2) Diffusion von eingehenden Teilchen führt, um in ihrer Energie und Richtung zu ändern. Die Messung der emittierten Teilchen Energie Allowsthe Identifikation von Atomen an der Interaktion beteiligten. Um die Zuordnung der Elemente ausführen, wird die Ionen-Microbeam wiederholt über die Probenoberfläche oft auf einer Fläche von ca. 100 x 100 µm2 mit mehreren Zellen gescannt. Emittierten Partikel werden erkannt und ihre Energie für jede Strahllage aufgezeichnet. Sortierung der Partikel nach der Strahllage, ist identifiziert die Struktur verantwortlich für die Emission solcher Partikel das Ziel der Datenverarbeitung. Hier beschreiben wir präzise Umsetzung beruht auf Fluoreszenz-Mikroskopie und nukleare Mikrosonde Analysen zu erkennen sowie exogene NPs bei der zellulären und subzellulären Maßstäben zu quantifizieren, um die Folgen der NP Interaktionen mit lebendigen untersuchen Systeme. Wir sind besonders auf die Möglichkeiten dieser Methode in Bezug auf in Situ Quantifizierung von Titandioxid-Nanopartikeln (TiO2 NPs) Aggregaten auf der subzellulären Ebene konzentrieren.

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Protocol

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(1) Inhaber der Probenvorbereitung

  1. Sample-Halter-Design und Vorbereitung
    1. Fertigen Sie einen Probenhalter durch ein 5 x 5 mm Quadrat in einem 1 mm dicken PEEK Rahmen bohren.
    2. Reinigen durch Spülen mit Ethanol 70 % (V/V) und halten in sterilen Platten bis zum Gebrauch.
      Roman Ein Probenhalter für Zellkultur und Zelle Handhabung geeignet ist erforderlich. Es muss für Zelle Kultivierung, in-vitro- Beobachtungen mit optischen Mikroskopie und nukleare Mikrosonde Analysen und Bildgebung entwickelt werden. Dieser Halter ist ein PEEK Frame13gemacht.
  2. Probenvorbereitung-Halter
    1. Bereiten Sie die Formvar-Lösung von 1 mg Formvar Pulver in 100 mL Chloroform auflöst.
    2. Stretchfolie das Polycarbonat auf einem Metallrahmen, dass es keine Falte präsentiert.
    3. Verwenden Sie eine sterile Spitze Formvar Lösung um das Probe-Halter-Loch zu verbreiten.
    4. Legen Sie zart der Probenhalter mit Leim auf die gestreckte Polycarbonat-Folie (ein Quadrat von 5 x 5 mm).
    5. Wiederholen Sie die vorherige Sequenz um einen Probenhalter für jedes Replicate vorzubereiten.
      Roman Polycarbonat (PC) Film ist biokompatibel, dick genug und resistent gegen verschiedene Protokolle und analytische Einschränkungen.
      Vorsicht- Chloroform ist giftig. Nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Verwenden Sie immer eine gut funktionierende chemische Dampfhaube und entsprechenden Filtern.
  3. Probe-Halter-Sterilisation
    1. Legen Sie die montierten Probenhalter in eine konische Flasche mit 50 mL Ethanol 70 % (V/V) unter Unruhe bei 180 u/min und + 37 ° C über Nacht mit einem Inkubator/Rührwerk.
    2. Spülen Sie den Inhaber in sterilem destilliertem Wasser mehrmals.
    3. Luft trocknen unter sterilen Bedingungen und setzen sie mit UV-Licht (keimtötende Lampe von Biosafety Bank, Klasse II) für 30 min auf jeder Seite.
    4. Halten Sie die Proben in sterilen 12-Well-Platten (eine Probenaufnahme pro Well) erst unmittelbar vor Gebrauch.
      Hinweis: Mehreren Probenhalter können in sterilen und trocken 12-Well-Platten mit Parafilm versiegelt für mehrere Tage bei Zimmertemperatur gespeichert werden.

2. Wachstum von Zellen in der geeigneten Probenhalter.

Vorsicht: Protokoll muss in einer Biosafety Laminar-Flow Bank (Klasse II) auszuschließende kontaminierende Mikroorganismen durchgeführt werden. Antibiotika (z.B. Penicillin, Streptomycin) mit Handschuhen zu behandeln. Respektieren Sie bewährte Methoden beim Umgang mit biologischer Materials (Zell-Linien, genetisch veränderte abgeleitete menschliche Zellen).

Kritisch: die Zelllinien verwendet sollte überprüft werden, um sicherzustellen, dass sie nicht mit Mykoplasmeninfiziert sind.

  1. Transfizieren Sie U2OS-Zell-Linie mit Plasmid mit Matrix-RoGFP 17,18,19 mit einer Transfektion Methode gemäß Protokoll vom Hersteller festgelegten.
  2. Zur Transfektion mit dem Plasmid-Bestätigung der Biosensor und um Plasmid Verlust zu verhindern, wählen Sie und pflegen die transfizierten Zellen auf die geeigneten Nährmedium.
  3. Visualisieren Sie transfizierte Zellen durch Fluoreszenz-Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Transfektion aufgetreten ist und der Ausdruck der Fluoreszenz und die Anzeige von einem retikuläre und röhrenförmigen mitochondriale Netzwerk19zu bestätigen.
    Pause Punkt: Seit mehreren Jahren können Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.
  4. Verwenden Sie die transfizierten Zellpopulation durch Kultivierung der Zellen in einem geeigneten Medium um Sub konfluierende Zellpopulationen zu erhalten. Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % (V/V) CO2 in einer gesättigten Wasser Atmosphäre.
  5. Samen Zellen in einer Konzentration, wie sie am Zusammenfluss von 80 % am Tag der Fixierung. In der Regel kann eine Konzentration von 500 Zellen pro Mikroliter verwendet werden. Ernten von Zellen mit 400 µL Trypsin-EDTA 0,25 % (V/V) und halten Sie für 3 min bei 37 ° C. Beenden Sie Trypsin-Aktion mit 1 mL Kulturmedium. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 230 x g und + 4 ° C, überstand zu entfernen, und fügen Sie die gewünschte Lautstärke von frischem Nährmedium.
    Hinweis. Das Protokoll gilt für alle zellulären Arten und die Anzahl der Zellen ausgesät ist abhängig von der Zellengröße und Zelle Verdopplungszeit.
    Vorsicht: Vermeidung von Trypsin, Antibiotika und Serum wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu unterwerfen. Halten sie steril. Vorratslösung in Aliquote aufteilen und Einfrieren bei −20 ° C. Speichern Sie die Aliquote bis zum Ablaufdatum. Spülen Sie sorgfältig die Zelle Pellet um die Trypsin vollständig zu entfernen. Spuren der verbleibenden Trypsin werden verzögert und die Beschichtung Effizienz zu verringern.
  6. Zählen der Zellen und führen eine Verdünnung mit frischen komplette Nährmedium bei 37 ° C gehalten, um eine Zellsuspension mit 500 Zellen pro Mikroliter zu erhalten.
    Hinweis: Die Konzentration der Zellsuspension muss als eine Funktion des Zelltyps, angepasst werden, um einen Tropfen 40 µL Platte.
  7. Einen 40 µL Tropfen auf die Mitte der Folie Polycarbonat-Platte. Legen Sie die Probe für 2 h bei + 37 ° C, 5 % (V/V) CO2 sorgfältig in einer gesättigten Wasser Atmosphäre.
    Kritische: Sobald die Probe in den Inkubator platziert wird, begrenzen Sie so weit wie möglich jede mechanische Bewegung um schnelle Zellhaftung zu begünstigen. Je nach Zelltyp könnte es Zellen länger als 2 h für optimale Effizienz Plattierung inkubieren erforderlich. Überprüfen Sie, dass die Inkubator Atmosphäre gut gesättigt um zu verhindern, dass Tropfen verdampfen.
  8. Überprüfen Sie, dass Zellen auf dem Polycarbonat-Folie mit einem optischen Mikroskop gut verbunden sind. Sanft fügen Sie 2 mL frisches komplette Medium und halten Sie für 24 h.

(3) Nanopartikel Vorbereitung und Exposition

Hinweis: Fluoreszierenden Farbstoff modifiziert TiO2 NPs wurden entworfen, synthetisiert und chemisch modifiziert mit Tetramethyl Rhodamin erfolgt (TRITC). 20 , 21 diese Oberflächenmodifizierung kann Nanopartikel-Erkennung, Überwachung und Lokalisierung in Situ und in Cellulo in Wohn- und festen Zellen oder in mehrzelligen Organismen. 12 , 13 , 18

Vorsicht: Nanomaterialien und Nanopartikel müssen pfleglich behandelt werden. Nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Um die Verbreitung in der Luft zu verhindern, sind Nanopartikel in Lösung (Reinstwasser) gepflegt.

  1. Bereiten Sie eine Aussetzung der 1 mg.mL−1 TiO2 NPs Reinstwasser. Verteilen der TiO2 NPs mit intensiven 1-min-Beschallung Impulse bei RT (750 W, 20 kHz Amplitude: 30 %) mit Ultraschall-Generator und eine spezielle konische Mikrosonde.
  2. Verdünnen Sie TiO2 NPs in der gewünschten Konzentration in das Kulturmedium, um eine Exposition Aussetzung der 4 µg.cm−2 (Endkonzentration) zu erhalten. Medium durch das entsprechende Volumen der mittlere mit NPs auf Zellen ersetzen und für die homogene Verteilung des TiO2 NPs. Prepare Kontrollzellen ebenso ohne Zusatz von TiO2 NPs vorsichtig mischen.
  3. Inkubieren Sie die Zell-Populationen für 24 h bei 37 ° C, 5 % (V/V) CO2 und Wasser gesättigte Atmosphäre.

(4) Paraformaldehyd Fixierung und Fluoreszenz-Mikroskopie.

  1. Bereiten Sie eine frische Lösung von Paraformaldehyd Lösung (PFA, 4 % w/V) im Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gepuffert.
    1. 4 g PFA-Pulver in 100 mL PBS auflösen. Erhitzen Sie die Lösung auf 65 ° C unter Rühren mit einem Magneten und einem Magnetrührer unter einem Abzug. Erhöhen Sie den pH-Wert durch Zugabe von 1 M NaOH einen Tropfen nacheinander, bis die Lösung löscht. Kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur ab und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4. Die frisch zubereitete Lösung sofort einsetzen oder bei + 4 ° C zu halten und vor Licht schützen.
      Hinweis: Vorgefertigte PFA Lösungen könnten verwendet werden, jedoch eine Magistralrezeptur PFA bessere Fixierung Qualität und langfristige Erhaltung der feste Proben garantiert.
      Vorsicht: PFA ist giftig; nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Verwenden Sie immer eine gut funktionierende chemische Dampfhaube und entsprechenden Filtern.
  2. Einmal die Inkubationszeit abgelaufen, entfernen Sie das Zellkulturmedium, TiO2 NPs. Spülen Zellpopulationen einmal mit frischem Nährmedium und einmal mit PBS (2 mL) enthält. Entfernen Sie PBS zu, spülen Sie schnell mit einem aliquoten frisch und kalt PFA (4 % w/V, + 4 ° C).
    1. Fügen Sie PFA (2 mL, 4 % w/V, + 4 ° C). Inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie der PFA zu, spülen Sie die Zellen mit PBS (2 mL, 3 Mal, 5 min) unter Rühren.
      Pause Punkt: Diese chemisch festen Proben für den "Sprung-Freeze" Verfahren nach Fluoreszenz imaging (gehen Sie zu Schritt 5) verwendet werden können oder nur für Fluoreszenz-imaging (gehen Sie zu Schritt 4.3) verwendet.
  3. Färben Sie den Kern mit Hoechst33342 Inkubation der Zellen für 10 min in PBS. Hoechst33342 wird verwendet, um eine Endkonzentration von 500 nM. Nach der Inkubation die Lösung entfernen und Spülen mit PBS.
    Vorsicht: Hoechst33342 ist Zelle permeationsfähigen und kann giftig sein. Vermeiden Sie direkten Kontakt, und benutzen Sie Handschuhe während der Vorbereitung und Verwendung von Hoechst33342.
    Kritisch: sorgen dafür, dass die Hoechst33342 Färbelösung ist frisch zubereitet und in sterilen Bedingungen beibehalten.
  4. Prozess feste Proben für in Situ und einzelne Zelle Imaging mit Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1).

5. "Sprung-Einfrieren" Fixierung und Austrocknung

  1. Bereiten Sie eine Aluminiumplatte Übertragung durch Abkühlung in flüssigem Stickstoff. Store die Platte in einen Kasten mit flüssigem Stickstoff gefüllt und die Plattenoberfläche oberhalb der Flüssigkeit im kalten Stickstoff Dampf zu erhalten.
    Hinweis: Die Transferplatte kann jede metallische Platte gemacht werden (hier, wir haben Aluminium verwendet), die Temperatur von flüssigem Stickstoff abgekühlt werden könnte, und das können die Freeze-Trockner Probenkammer eingeben.
    Kritische: Die Box sollte geschlossen so weit wie möglich gehalten werden um zu verhindern, dass Wasser Aufdampfen auf die kalte Plattenoberfläche. Die Probe während der Vorbereitung auf die Platte gespeichert sollten nicht von Flüssigstickstoff erfasst werden.
  2. Spülen Sie Zellen einmal im Kulturmedium und dann zweimal mehr, kurz, in sterilen und hochreines Wasser zu bekommen loszuwerden Sie jede Spur von restlichen extrazellulären Salze.
    Kritische: Sicherstellen Sie, dass die Medien sind frisch zubereitet und in sterilen Bedingungen beibehalten. Erhitzen Sie die Medien bei 37 ° C, vor der Verwendung. Die Spülung muss sehr kurz (wenige Sekunden) und die überschüssige Flüssigkeit auf die Proben so schnell wie möglich entfernt.
  3. Sprung-Einfrieren der Zellen bei-150 ° C in flüssigem Stickstoff gekühlt 2-Methylbutane während 30 s und Ort übertragen sie auf das Aluminium Platte. Speichern Sie hier Proben während der Vorbereitung aller anderen Proben. Wenn Proben sind alle Cryofixed, All at Once, indem man die Transferplatte in einem Freeze-Trockner zu übertragen.
    Kritische: Der Gesamtprozess Hochdruckgefrierfixierung sollte nicht mehr als 20 Minuten dauern, um zu verhindern, dass strukturelle Änderungen erscheinen in Proben in das Verteilergetriebe zwischengelagert.
  4. Die Proben unter Verwendung der folgenden Sequenzen Gefriertrocknen: (1) führen Sie eine primäre Austrocknung für 12 bis 24 h (-99 ° C, 10-3 Mbar) bei niedrigem Druck und niedriger Temperatur, dann 2) führen Sie eine sekundäre Austrocknung Phase für mindestens 24 h, Erhöhung der Temperatur der Platte zu + 40 ° C unter Beibehaltung des niedrigen Drucks (+ 40 ° C, 10-3 Mbar).
    Vorsicht: Flüssiger Stickstoff ist extrem kalt und kann dazu führen, dass schwere Erfrierungen oder Auge Schäden bei Berührung. Verwenden Sie angepasste Sitzbank Top Container für den Transport und tragen Sie Sicherheitsausrüstung (Kryo-Handschuhe, Augen-und Gesichtsschutz).
    Vorsicht: 2-Methylbutane ist hochentzündlich. Eine schädliche Verunreinigungen der Luft erreichen Sie ziemlich schnell verdampfen dieser Substanz bei + 20 ° C. Nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Verwenden Sie Atmung und Schutzbrille und Schutzhandschuhe. Verwenden Sie immer eine gut funktionierende chemische Dampfhaube. Kann bei + 4 ° c gelagert werden
    Kritische: Verwenden Sie eine geeignete Thermometer (-150 ° C) 2-Methylbutane Temperaturen während der "Sprung-Freeze" Sitzung überwachen. Die 2-Methylbutane muss in einer flüssigen Phase kühl gehalten werden. Übertragung von Cryofixed Proben auf der Umgebungsatmosphäre verursachen Zellschäden durch Temperaturerhöhung oder Wasserdampf kondensiert auf der Probenoberfläche. Dementsprechend sollte die Überweisung so schnell wie möglich (30 s)
    Pause Punkt: Nach Hochdruckgefrierfixierung können Proben für mehrere Tage in sterilen und trockenen Bedingungen (geschützt vor Staub und Feuchtigkeit) bei Raumtemperatur gelagert werden. Vorsichtig behandeln Sie die Proben mit feinen Zangen und legen Sie sie in eine sterile 12-Well-Platte mit Parafilm versiegelt. Trockenmittel kann verwendet werden, um die Atmosphäre zu trocknen.

(6) nukleare Mikrosonde Analysen

Hinweis: Nukleare Mikrosonde Analysen der Microbeam Linie der AIFIRA (Anwendungen Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions de Région Aquitaine) mit den ergänzenden Ionen-Strahl analytische Techniken Partikel induzierte Röntgenemission (µ-erfolgte zu PIXE) und Übertragung Ion Rasterelektronenmikroskopie (µ-STIM). Die Anlage basiert auf einer 3,5 MV Teilchenbeschleuniger leichte Ionenstrahlen im Bereich MeV Energie zu liefern. 22 , 23

Pause Punkt: AIFIRA ist ein Ion Beam veranstaltet von der Universität von Bordeaux, die einen Zugang zu nationalen und internationalen Teams nach wissenschaftliche Bewertung des vorgeschlagenen Versuchs bietet.

  1. Befestigen Sie die PEEK-Probenhalter auf eine gelochte Platte mit doppelseitigem Klebeband.
  2. Platzieren Sie die Platte, die Probe in einer vertikalen Ebene senkrecht zur Strahlrichtung zu unterstützen.
  3. Schließen Sie die Analyse-Kammer und die Analyse Kammer Vakuum.
  4. Übertragung Ion Rasterelektronenmikroskopie (µ-STIM)
    Hinweis: STIM dient zum Aufzeichnen Flächendichte Karten von Zellen nach der Umwandlung der Energieverlust in Zellmasse, unter Ausnutzung der Tatsache, dass die Energieverluste proportional zu der Probe Flächendichte (ausgedrückt in µg.cm-2).
    1. Verwenden Sie eine 2 MeV Helium (He+) Microbeam als eine Sonde mit einer Größe in der Brennebene des rund 300 nm im Durchmesser und niedriger Geläufigkeit (2000 ions.s-1). Kennzahl der Energie der übertragenen Ionen mit einem planaren Silizium-Detektor (PIPS-Detektor, 25 mm2, 11 keV Energieauflösung @ 5,4 MeV), angeordnet hinter der Probe in der Strahlachse.
  5. Teilchen induzierte Röntgenemission (µ-PIXE) und Rutherford Backscattering Spectrometry (µ-RBS).
    Hinweis: µ-Pixe und µ-RBS-Analysen bieten die räumliche Verteilung und Quantifizierung der chemischen Elemente mit einer Sub-Mikrometer-Auflösung.
    1. Verwenden Sie einen 1,5 MeV Protonen (H+) Microbeam (50-150 pA), konzentrierte sich bis zu einem Durchmesser von 1 µm und Scan über die gleichen Zellen des Interesses von STIM von 4 bis 8 Stunden und rund 100 x 100 µm2entdeckt.
    2. Sammeln Sie induzierte Röntgen-Photonen von Atome in der Probe (schwerer als Na) von einem hochauflösenden Si(Li) Solid-State-Detektor (145 eV Energieauflösung, @Mn-Kα) bei 45 ° von eingehenden Strahlachse positioniert. Verwenden Sie die erkannten Photonenenergie um zu identifizieren, die Art der Strahler (z.B. Z des Elements) und Röntgen-Intensität die Element-Konzentration zu bestimmen.
    3. Gleichzeitig sammeln zurückgestreute Protonen bei-135 ° mit einem Silizium-Detektor (teilweise erschöpften Detektor, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV), die Gesamtzahl der eingehenden Teilchen zu messen und Röntgen-Intensitäten zu normalisieren.
      Kritische: Eine Sammlung von zertifizierten Kalibrierstandards für atomare Konzentration Quantifizierung wird verwendet, um die x-ray Detektor Antwort zu kalibrieren. Referenzmaterialien sind eine Ansammlung von atomaren Dünnschichten auf 6,3 µm Dicke Mylar Folien abgeschieden. Emittiert Energien Röntgenbereich von 0,6 (Li, K-Linie), 20,2 keV (Rh, K-Linie).

7. die Datenanalyse

  1. Chemische Elemente Karten mit dem IBA-J-Plugin für ImageJzu rekonstruieren. 24
    Hinweis: Spezielle Software in Form eines Plugins für ImageJ wurde entwickelt, um rohe nuklearen Mikrosonde Analysedaten zu verarbeiten. RAW-Daten entsprechen, eine Liste der Ereignisse aus Teilchenstrahl Interaktion mit Zellen, die zusammen mit Strahllage als ein chronologischer Reihenfolge aufgezeichnet werden.
    1. Das IBA-J-Plugin verwenden, um Ereignisse nach Typ sortieren: Ionenenergie (STIM) übertragen, zurückgestreuten Ionenenergie (RBS) oder Röntgen-Photonen-Energie (PIXE). Dann verarbeiten Sie separat jede Art von Daten.
    2. STIM Lageplan Dichte zu berechnen
    3. Durchschnittliche x-ray Photon Energie Spektren zu berechnen und definieren für jedes chemische Element von Interesse ein Energie-Fenster, um die räumliche Verteilung von Element abzurufen.
    4. Regionen von Interesse (ROI) (z. B. einzelne Zellen, dichte Struktur, Aggregate, etc.) zu definieren und die entsprechenden x-ray Spektren zu berechnen.
  2. Die entsprechenden RBS Spektren zu analysieren, um die Gesamtzahl der einfallenden Teilchen25berechnen.
  3. Passen Sie Röntgen-Spektren der Gupix Software26 zur Bestimmung der Konzentration von Element für jede ROI.
    Hinweis: Typische Begrenzung der Nachweisgrenze (LOD) für die Methode ist in der Reihe 1 bis 10 µg.g-1 in Trockenmasse je nach der Ordnungszahl der Elemente (LOD sinkt mit Z).

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Representative Results

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Zellkultur und Fluoreszenz-Bildgebung Eindringmittel beschrifteten tio 2 NPs

Wir entwarfen ein Probenhalter für Zellkultur, Zelle Handhabung sowie multimodale Analyse angepasst. Insbesondere war es wichtig, dass der Inhaber als auch nuklearen Mikrosonde Analysen und Bildgebung routinemäßigen Lichtmikroskopie berechtigt. Dieser Probenhalter basiert auf 2 µm dicken Polycarbonat Folie auf einen Blick-Rahmen hinterlegt. Zellen sind direkt auf Polycarbonat, in sterilen Kulturbedingungen für mehrere Tage angebaut und dann für verschiedene experimentelle Einstellungen wie NPs Belichtung verwendet.

Die chemische Oberflächenmodifikation mit Fluorophore (TRITC) erlaubt die Erkennung von TiO2 NPs sowie ihre in Situ und in-vitro- Lokalisierung in Wohn- oder Paraformaldehyd fixiert Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Der Zellkern und Mitochondrien waren voller Flecken, die mit der vital-Farbstoff Hoechst33342 (blau für den Kern) und den transfizierten Matrix-RoGFP (grün für Mitochondrien), beziehungsweise. Diese mehrfache Färbung erlaubt die intrazelluläre Lokalisation des TRITC-TiO2 NPs (durch seine rote Fluoreszenz Emission) 20 h nach Exposition. NPs fanden nur im Zytoplasma der exponierten Zellen mit keine Erkennung im Zellkern. NPs wurden nach dem Zufallsprinzip in der perinukleären Region des Zytoplasmas lokalisiert und völlig von den Mitochondrien (keine Überschneidungen zwischen TRITC und GFP Signale) ausgeschlossen.

Obwohl Fluoreszenz-Mikroskopie sehr nützlich ist, NPs in exponierten Zellen zu lokalisieren, ist es nicht in der Lage, die genaue Anzahl der NPs pro Zelle zu beurteilen. Die Hauptschwierigkeit der Fluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung der NPs ist verbunden mit der Unsicherheit über (i) die Anzahl der Fluorophore angebracht zu einem bestimmten NP und die bleichen Stabilität der gewählten Fluorophor bei der Beobachtung und (Ii) die Aggregatzustand des NPs im Inneren der Zelle.

Figure 1
Abbildung 1 : in vitro und in-situ Fluoreszenz imaging der transgenen Zellen U20S Matrix-RoGFP zum Ausdruck zu bringen und ans TRITC-TiO 2 NPs. U2OS Zellen (oben) gekennzeichnet mit Hoechst33342 (blau), Matrix-RoGFP (grün) 4 µg.cm-2 TRITC beschriftet TiO2 Nanopartikeln ausgesetzt sind (rot) für 20 h Beobachtungen weisen darauf hin, dass TiO2 NPs Aggregat in Zellen in einer perinukleären Region. Maßstab: 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diese Mängel, nukleare Mikrosonde Analysen Techniquesprovide einen komplementären Ansatz zu der konventionellen Lichtmikroskopie aufgrund ihrer Empfindlichkeit an den NPs zu überwinden, die die Verwendung von zwischen-Signal wie Fluoreszenz aus einem veredelten verhindert Farbstoff. Darüber hinaus sind sie auch vollständig quantitative, Bereitstellung von Daten über (i) der subzellulären biochemische Inhalte, die sonst nicht bekannt ist, und (Ii) die intrazellulären Menge der NPs auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Hochdruckgefrierfixierung der Zellen nach dem live-Imaging.

Die höchsten Einschränkung in nuklearen Mikrosonde Analysen ist unter Vakuum-Bedingungen zu arbeiten. Wir haben eine Zelle-Fixierung-Protokoll ermöglicht die Erhaltung der biologischen Ultrastruktur und die biochemische Integrität der biologischen Probe entwickelt. Chemische Fixierung ist bekanntermaßen ein Polymer verwendet, um die zellulären Ultrastruktur beizubehalten die Spurenelement Zusammensetzung der Zellen zu ändern, da es den Ersatz ihres zellulären Mediums erfordert. Darüber hinaus veröffentlicht die Entfernung von Wasser auch freie Ionen und andere Arten, die die gesamte ändert Zusammensetzung zu probieren. So wird es zwingend erforderlich, um eine physische Befestigungsmethode, insbesondere kryogene Verfahren Priorität einräumen. Diese kryogenen Verfahren veranlassen eine schnelle Einstellung der die Zellaktivität und dies in der Millisekunde Zeitskala.

Nukleare Mikrosonde Analysen Mikroskopie und Quantifizierung der NPs auf zellulärer Ebene.

Scan Transmissions-Ion-Mikroskopie (µ-STIM) und Partikel-induzierte Emission (µ-PIXE) Röntgenstrahlanalyse wurden nach Hochdruckgefrierfixierung und Austrocknung, präzise quantitative Daten über ihre elementare chemische Zusammensetzung an Proben durchgeführt.

µ-STIM Bilder offenbart die lokalen Unterschiede in der Dichte und ermöglicht die Erkennung von Zellstrukturen wie der Zellkern und Zytoplasma. Obwohl die Balken laterale Auflösung ermöglicht die Beobachtung des dichten Strukturen so schmal wie 300 nm breit, wie dünn Aggregate sichtbar hier im Zytoplasma, die STIM-Methoden können nicht unterscheiden, NP Aggregate und andere dichten Zellstrukturen. Ist nämlich, wie für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), der physikalischen Prozess zur Variation der Sendeenergie die Interaktion von eingehenden Ion mit der atomaren Elektronenwolke. Im Gegensatz zu TEM Analyse weil das gesamte Zellvolumen analysiert wird, verhindern jedoch lokale Dickenschwankungen Diskriminierung zwischen High-Z Strukturen und eine lokale Erhöhung der zellulären Dichte.

Figure 2
Abbildung 2 : Bilder von Dichte und elementare Verteilung durch µ-STIM und µ-PIXE Cryo-feste U2OS Zellen erhalten. U2OS Kontrollzellen (nach oben) sind im Vergleich zu Cryo-feste U2OS Zellen (, 4 µg.cm-2 TiO2 NPs, unten) ausgesetzt und mit nuklearen Mikrosonde Analysen/Mikroskopie beobachtet. STIM-Mikroskopie (links, Graustufen Karten) Dichte Intra oder extra zellulare Strukturen (Zellkern, Salz Aggregate, Nanopartikel) offenbart. Die räumliche Auflösung (300 nm) ist vergleichbar mit Fluoreszenz-Mikroskopie und zeigt Strukturen wie NP Aggregate in der perinukleären Region. Identifizierung von Strukturen, die nur aufgrund ihrer Dichte kann dennoch nicht eindeutig sein. Die µ-PIXE elementare Karten von K, P und Ti (thermische Farbskala) sind komplementär zu µ-STIM-Karten. Sie können verwendet werden, um das Vorhandensein von NPs in Zellen zu gewährleisten. Jede Zelle einzeln im Hinblick auf die Element-Konzentration analysiert werden kann (siehe Abbildung 3). Skalieren Sie Bars: 10 µm. Farbskalen zwischen Minimum (blau) und maximaler Intensität (grau). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Wie in Abbildung 2dargestellt, ermöglicht das µ-STIM-Rendering die Erkennung von einzelnen Zellen innerhalb einer Population und intrazellulären Sub Fächer wie der Nukleolus und Kern. Leider, und wie zuvor erwähnt könnte NPs nicht immer erkannt werden mit µ-STIM Wiederaufbau.

Partikel-induzierte Emission (µ-PIXE) Röntgenstrahlanalyse bietet nicht nur die chemische Zusammensetzung der Probe, sondern auch ihre elementare Zuordnung (Abbildung 2). Während der Interaktion mit dem spannenden Strahl unterziehen die chemischen Elemente atomaren Erregung-de-Erregung-Prozesse, die schließlich die Emission eines Photons führen, die die charakteristische Energie von der Ordnungszahl des Elements aufgeregt aufweist. Eine charakteristische Gipfel-Spektrum ist aus der Summe aller emittierten Photonen Ereignisse erbaut und gilt als eine chemische Signatur der Probe.

Standard Versuchsaufbauten und Detektoren für µ-PIXE Experimente ermöglichen gleichzeitige Quantifizierung aller Elemente schwerer als Na mit 1 bis 10 µg.g−1 trockene Masse Nachweisgrenze. Genauigkeit bei der Messung der elementarer Konzentration beschränkt sich normalerweise auf rund 20 % wegen kostenlos-Sammlung und Detektor-Effizienz.

In dieser Studie wird die Verteilung der Elemente wie Kalium und Phosphor und quantifizieren die intrazelluläre Menge an TiO2 NPs mit Titan-Mapping von nuklearen Mikrosonde Analysen beobachtet. Chemisches Element Karten werden berechnet, nachdem die Photonen entsprechend der Beam Position zum Zeitpunkt der Aufnahme und der Auswahl eines Energie-Fensters, um ein bestimmtes Element zentriert sortiert wurden. Karten sind repräsentativ für die Anzahl der erkannten Ereignisse an die Strahllage und sind quantitativ. Lärm und Hintergrund sind numerisch simuliert und herausgefiltert. Darüber hinaus kann chemische Zuordnung verwendet werden, um die lokalen PIXE Spektrum erforderlich für die Quantifizierung zu extrahieren.

Wie in Abbildung 2dargestellt, Phosphor ist homogen verteilt in der Zelle, wie erwartet, eine viel höhere Konzentration im nuklearen Bereich. Kalium ist in das Zellvolumen homogen verteilt. Titan befindet sich in der zytoplasmatischen perinukleären Region in Form von Aggregaten, wie zuvor mit Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1) beobachtet. NPs angezeigt der gleichen Perinukleäre Lokalisierung unabhängig ihre Oberflächenzustand: funktionalisierten (Abbildung 1) oder Native (Abbildung 2). Unterdessen war keine Spur von Titan erkannt in Kontrollzellen bestätigt wird, dass die Titan-Verteilung von µ-PIXE beobachtet die TiO2 NPs, in Übereinstimmung mit unseren früheren Analysen durch Fluoreszenzmikroskopie zugeschrieben werden muss.

Darüber hinaus, wie in Abbildung 2dargestellt, ist es möglich, die intrazelluläre Verteilung von NPs und quantitative NPs-Konzentrationen aus bestimmten Regionen von Interesse zu extrahieren. Basierend auf der STIM-Karten und im Zusammenhang mit der Phosphor/Kalium-Verteilungen, ist einzelne Zelle Analyse möglich.

Figure 3
Abbildung 3 : Einzelne Zelle Quantitative Analyse mit µ-PIXE. Einzelnen Röntgen-Spektren berechnet für Zellen, die in Abbildung 2 dargestellt können angebracht werden, um die Element-Konzentration auf zellulärer Ebene zu bestimmen. Diese Funktion ist besonders interessant für NP Analyse wo zelluläre Konzentrationen in der Regel starke Variationen innerhalb der gleichen Bevölkerung zeigen. Beispielsweise für die gleiche bedeuten Sie Belichtung, die Ti-Konzentrationen reichen von 0,2 bis 1,8 µg.cm-2. Steuerelementen entsprechen unbehandelten Zellpopulationen. Strahlendosis: 4 µg.cm-2. Boxplots repräsentieren die Verteilung der einzelnen zellulären Konzentrationen mit Medianwert (horizontale Linie) und Bars, die Ausdehnung in Richtung der niedrigsten und höchsten gemessenen Werte. Zellen zu steuern: N = 14; Zellen ausgesetzt: N = 16.

Dementsprechend haben wir nicht nur quantifiziert den durchschnittlichen Gehalt von Titan in einer Zellpopulation sondern auch die Titan-Verteilung pro Zelle in einer Population in einer bestimmten experimentellen Bedingungen angezeigt. Der Median Inhalt Titan gemessen hier ist ziemlich niedrig (500 ng.cm-2) im Vergleich zu den 4 µg.cm-2 Belichtungsdosis Zellpopulation (Abbildung 3) und Unterschiede zwischen den Zellen ist groß (Ti Konzentrationen reichen von 0,2 bis 1,8 µg.cm -2 nach der analysierten Zellen). Wir bemerkten auch eine Erhöhung der intrazellulären Ionen wie Kalium und Kalzium in exponierten Proben eine zelluläre Veränderung Homöostase induziert durch die Anwesenheit von TiO2 NPs, wie zuvor beschrieben, von verschiedenen Autoren vorgeschlagen. 21 , 27

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Discussion

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Wir beschreiben eine Methode, die nützliche Informationen über das hinaus, was mit anderen bildgebenden Verfahren, vor allem auf der subzellulären Ebene möglich. Nukleare Mikrosonde Analysen bietet neben seiner bildgebenden Fähigkeit Möglichkeiten der Quantifizierung der chemischen Elemente in der Zusammensetzung von einer biologischen Probe eingeben. In der vorliegenden Arbeit wir studierte menschliche Zell-Populationen und konzentrierte sich auf die Analyse von einer gewählten Region of Interest basierend auf einer einzelnen Zelle TiO2 NPs ausgesetzt. Die Kombination mit anderen Techniken bietet morphologische zelluläre Bildgebung und präzise quantitative Daten über die elementaren chemischen Zusammensetzung.

Um nukleare Mikrosonde Analysen erfolgreich anzuwenden, ist es zwingend erforderlich, folgende Punkte zur Vermeidung von möglichen Fallstricke zu achten. Erstens ist es zwingend notwendig, um ein Kryo Protokoll für die Zelle Fixierung verwenden, um die Ultrastruktur und biochemische Integrität zu bewahren. Zweitens ist es auch zwingend erforderlich, um dünne Proben mit einer Dicke unter 20 µm analysieren. Schneiden von Cryofixed Proben konnte bei Bedarf durchgeführt werden. Proben sollten unbedingt gefroren aufbewahrt werden. Drittens ist es auch wichtig, im Hinterkopf behalten, dass nukleare Mikrosonde Analyse eine zweidimensionale Darstellung von biologischen Proben zeigt. So ist die chemische Element-Verteilung erhalten eine zweidimensionale Projektion, die möglicherweise Fehlinterpretationen führen könnte. Diese Einschränkung wird in Zukunft durch den Einsatz von computertomographischen Erwerb umgangen werden.

Nukleare Mikrosonde Analyse hat auch Grenzen. Es muss betont werden, dass seine wesentliche Einschränkung der Analyse unter Vakuumdurchführen muss. Daher ist es zwingend erforderlich, verwenden Sie Zelle Fixierung Protokolle, die Ultrastruktur der Zellen und biochemischen Integrität bewahrt. Es ist daher notwendig, den Widerstand der biologischen Proben der Kryogenik-Verfahren (ohne Zusatz von chemischen Harz) zu testen. Dies könnte die Verwendung von nuklearen Mikrosonde Analysen einschränken.

Eine weitere Einschränkung ist die Zugänglichkeit zu den Einrichtungen für die Durchführung der nuklearen Mikrosonde Analysen. Die zugewiesenen Strahl-Zeiten sind daher manchmal begrenzt, und dies ist eine zusätzliche Einschränkung für diese Art von zeitraubenden Experiment. Für eine Übernahme werden oft mehrere Stunden benötigt.

Diese Technik unterscheidet sich von anderen analytischen Methoden, einschließlich Mikroskopie, Massenspektrometrie (MS), induktiv gekoppelten Plasma MS (ICP-MS), Flüssigchromatographie (LC - MS), MS und radioaktives Isotop. Letztere dienen in der Tat, die zelluläre Dosis der chemischen Elemente zu schätzen, aber sie sind nur Auskunft auf einer makroskopischen Skala d.h. auf eine makroskopische Menge einer Probe. Keiner von ihnen kann Zugang, zu geben, wie nukleare Mikrosonde Analysen, um eine präzise Erkennung und Zuordnung der subzellulären Dosis von bestimmten chemischen Elementen (Ionen, Metall oder Metall-Oxid NPs). Diese Daten helfen, den Zugriff auf eine weitere systematische Untersuchung des Dosis-Wirkungs-Bewertung.

Die genaue Abschätzung der Dosis bei der Internalisierung von NPs in Zellen zu studieren ist sowohl quantitative NP Toxikologie und Pharmakologie Hinsicht entscheidend. Wie vorgeschlagen, durch die große Diskrepanz in den beobachteten NP-Inhalt zeigt einen 10-divisibel Unterschied zwischen den minimalen und maximalen Konzentrationen (Abbildung 3) beobachtet, die mittlere zelluläre Konzentration möglicherweise keinen relevanten Parameter zur Beschreibung der Phänomen der Teilchen ausgesetzt. Dies gilt insbesondere, wenn ein Schwelleneffekt soll stattfinden, da inhomogene Dosis Exposition zu widersprüchlichen Beobachtungen führen könnte. Da die fraktionierte Natur von Nanopartikeln auf zellulärer Ebene klar erscheint, stellt diese Studie daher erneut die Frage nach der Relevanz der Methoden basierend auf der Analyse von globaler Variablen in Adressierung Fragen rund um das Verhalten von Zellen inhomogene Dosen von Verunreinigungen.

Wie in den hier untersuchten Fall dargestellt, erlauben Beobachtung und Quantifizierung der NPs innerhalb einzelner Zellen uns, besser zu verstehen, die Bioakkumulation von endogene/exogene Elementen wie Metall-Oxid-NPs. Dies ist eine kritische Aufgabe für weitere Anwendungen des NPs in der Biomedizin, wo ein schlechtes Verständnis der zugrunde liegenden NP Verteilung in den Zellen könnte zu falsch interpretiertes Ergebnissen führen.

Dieses Protokoll unterstreicht die Eignung der Verwendung von nuklearen Mikrosonde Analysen mit anderen Techniken für künftige Bewertungen NP Interaktionen mit biologischen Präparaten. Der quantitative Ansatz bietet Informationen über die Auswirkungen von solchen NPs in Bezug auf die Erkennung, Identifizierung, Lokalisierung und Quantifizierung auf Ebene einer einzelnen Zelle.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Serge Borderes für Regie und Schnitt des Videos. Die französische National Research Agency unterstützt das Forschungsprogramm TITANIUMS (ANR CES 2010 n ° CESA 009-01). CNRS und der Europäischen Gemeinschaft als Integration Tätigkeit zur Verfügung gestellt die "Unterstützung von öffentlichen und industriellen Forschung verwenden Ion Beam Technologie (Geist)" unter den EG-Vertrag Nr. 227012. Diese Arbeit wurde von Marie-Curie-Maßnahmen - Initial Training Networks (ITN) als eine "Integration Aktivität unterstützen Postgraduate Research mit Praktika in Industrie und Ausbildung Excellence" (SPRITE, D1.3) EG-Vertrag Nr. 317169 unterstützt. C'NANO Grand Sud Ouest und die Region Aquitaine unterstützen das Forschungsprogramm TOX-NANO (n ° 20111201003) und das Forschungsprogramm POPRA (n ° 14006636-034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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<em>In Situ</em> Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse
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Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

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