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Chemistry

सीटू में परमाणु Microprobe विश्लेषण का उपयोग करके मेटल ऑक्साइड नैनोकणों का पता लगाना और एकल सेल ठहराव

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

हम मानव कोशिकाओं में सीटू में मौजूद रासायनिक तत्वों का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन और साथ ही उनके इन विट्रो ठहराव. विधि किसी भी सेल प्रकार के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और विशेष रूप से एक कोशिकाओं में मात्रात्मक रासायनिक विश्लेषण के लिए उपयोगी है इन विट्रो धातु ऑक्साइड नैनोकणों जोखिम में निंनलिखित ।

Abstract

रासायनिक तत्व इमेजिंग पर आधारित सूक्ष्म विश्लेषणात्मक तकनीक स्थानीयकरण और सेलुलर स्तर पर रासायनिक संरचना के ठहराव सक्षम करें । वे प्रणालियों के लक्षण वर्णन के लिए नई संभावनाएं प्रदान करते है और पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं, स्थानीयकरण और धातु ऑक्साइड नैनोकणों की उपस्थिति दोनों जैविक नमूनों और वातावरण में बढ़ाता है । दरअसल, इन तकनीकों सभी (i) संवेदनशीलता के संदर्भ में प्रासंगिक आवश्यकताओं को पूरा (से 1 तक 10 µ जी के शुष्क जन के जी-1 ), (ii) माइक्रोमीटर रेंज स्थानिक संकल्प, और (iii) बहु तत्व का पता लगाने । इन विशेषताओं को देखते हुए, microbeam रासायनिक तत्व इमेजिंग शक्तिशाली ऐसे ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में नियमित इमेजिंग तकनीकों पूरक कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे करने के लिए एक परमाणु microprobe विश्लेषण पर कल्चरल सेल (U2OS) को उजागर टाइटेनियम डाइऑक्साइड नैनोकणों । कोशिकाओं पर बढ़ने और एक विशेष रूप से डिजाइन नमूना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर और परमाणु microprobe विश्लेषण चरणों में इस्तेमाल किया धारक में सीधे उजागर किया जाना चाहिए । डुबकी फ्रीज नमूने के क्रायोजेनिक निर्धारण सेलुलर संगठन और रासायनिक तत्व वितरण दोनों को बरकरार रखता है । एक साथ परमाणु microprobe विश्लेषण (स्कैनिंग ट्रांसमिशन आयन माइक्रोस्कोपी, रदरफोर्ड backscattering स्पेक्ट्रोमेट्री और कण प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन) नमूना पर प्रदर्शन सेलुलर घनत्व के बारे में जानकारी प्रदान करता है, के स्थानीय वितरण रासायनिक तत्व, साथ ही नैनोकणों के सेलुलर सामग्री । वहां जीव विज्ञान के भीतर इस तरह के विश्लेषणात्मक उपकरणों के लिए एक बढ़ती जरूरत है, विशेष रूप से Nanotoxicology और Nanomedicine के उभरते संदर्भ में जिसके लिए नैनोकणों और जैविक नमूनों के बीच बातचीत की हमारी समझ गहरा होना चाहिए । विशेष रूप से, के रूप में परमाणु microprobe विश्लेषण नैनोकणों लेबल की आवश्यकता नहीं है, nanoparticle बहुतायत एक कोशिका की आबादी में व्यक्तिगत कोशिका स्तर पर नीचे quantifiable हैं, स्वतंत्र रूप से उनकी सतह राज्य के ।

Introduction

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सेलुलर homeostasis नियंत्रण, आत्मसात, और विभिन्न ट्रेस तत्वों (आयनों, धातुओं, exogenous अकार्बनिक यौगिकों) के intracellular स्थानीयकरण द्वारा निर्धारित किया जाता है । इन घटकों अक्सर अंश के रूप में हैं, लेकिन फिर भी सिस्टम फिजियोलॉजी में काफी प्रभाव पड़ सकता है । इस प्रकार, दोनों सामांय और रोग/पर जोर दिया स्थितियों में सेल जैव रसायन का अध्ययन सेलुलर चयापचय तंत्र की एक समग्र समझ की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है । इसलिए, इमेजिंग और विश्लेषणात्मक intracellular रासायनिक बहुतायत, संरचनात्मक संगठन और उनके संबंधित चयापचय कार्यों की जांच को सक्षम करने की तकनीक के विकास के लिए आवश्यक हो जाता है । बहुत कुछ तरीके एक दिए गए नमूने के समग्र रासायनिक प्रकृति के विषय में जानकारी के एक सीटू में मात्रात्मक टुकड़ा प्रदान करने में सक्षम हैं । इसके अलावा थोक रूप में नमूनों का विश्लेषण तरीकों से, सीटू विश्लेषण में बड़े पैमाने पर और संरचनात्मक जानकारी खोने के बिना अपने अभिंनता में जैविक नमूनों पर विचार, जिससे उनके घटक रसायनों के संरक्षण (तत्वों और आयनों का पता लगाने) और प्रोटीन. इसके अलावा, nanosciences के रूप में विकसित करने के लिए जारी रखने के लिए, बेहतर इमेजिंग और विश्लेषणात्मक तरीके सेलुलर पैमाने पर पर्यावरण की निगरानी के लिए निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा और नैनो वस्तु व्यवहार और बातचीत को बढ़ाता है । 1

नैनोकणों (एनपीएस) को 1 और १०० एनएम रेंज में कम एक चेहरे आयाम प्रदर्शित वस्तुओं के रूप में परिभाषित किया गया है । 2 उनके विशेष भौतिक गुणों के कारण एनपीएस का बड़े पैमाने पर उद्योग में उपयोग किया जाता है । एनपीएस बायो-एप्लीकेशन में और nanomedicine में कार्यरत हैं । 3 , 4 एनपीएस की अनेक भौतिक विशेषताओं के बावजूद, वे मानव स्वास्थ्य और पर्यावरण पर प्रतिकूल प्रभाव के कुछ जोखिम उत्पन्न कर सकते हैं । इन खतरों विभिंन एकाग्रता के स्तर पर दोनों लंबे समय तक और दोहराए जोखिम से प्रेरित किया जा सकता है और यह अभी तक स्पष्ट रूप से स्थापित नहीं किया गया है । 5 , , 7 , 8 विशेष रूप से, कोशिकाओं और संबद्ध सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अंदर एनपीएस के भाग्य, तारीख को पूरी तरह से वर्णित नहीं हैं । यह एक सेल में आंतरिक एनपीएस का पता लगाने और ठहराव की अनुमति देने वाले तरीकों की किल्लत के कारण हिस्से में है । 9

शास्त्रीय विश्लेषणात्मक उपकरण नैनोकणों की सेलुलर खुराक का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया सूक्ष्मदर्शी हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), inductively युग्मित प्लाज्मा एमएस (आईसीपी-ms)10,11 और तरल क्रोमैटोग्राफी एमएस (LC-ms), लेकिन वे केवल प्रदान macroscopic पैमाने पर उपयोगी जानकारी । इनमें से कोई भी उपसेलुलर एनपीएस सामग्री का सटीक मूल्यांकन नहीं दे सकता और न ही एनपीएस के उपयोग के बिना वितरण की विधियां । खुराक का एक व्यवस्थित मूल्यांकन-प्रतिक्रिया इस प्रकार असंभव है इन तरीकों के साथ, के रूप में परमाणु स्पेक्ट्रोस्कोपी पर आधारित तरीकों का विरोध किया जैसे नाभिकीय microprobe विश्लेषण12,13, सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी14 , और द्वितीयक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सिम्स) । 15 , 16 इन तरीकों विशेष रूप से दिलचस्प है के रूप में वे टिप्पणियों पूरक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बनाया है, खासकर जब एनपीएस फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ लेबल नहीं किया जा सकता है और इस तरह अपने पैतृक राज्य में अध्ययन कर रहे हैं । कुछ हद तक, जब भी एनपीएस fluorophores के साथ भ्रष्टाचार कर रहे हैं, (i) ठहराव मुश्किल रहता है क्योंकि प्रति np टैगिंग स्तर अज्ञात है और (ii) एनपी की सतह के रासायनिक संशोधन अपने सेलुलर वितरण को संशोधित कर सकते हैं ।

इस अनुच्छेद में, हम इमेजिंग पर लक्ष्य परमाणु microprobe तकनीकों का एक संयोजन के आधार पर एक विधि पर ध्यान केंद्रित आकृति विज्ञान और प्रमुख, माइनर में जैविक नमूनों की मौलिक रचना, और ट्रेस सांद्रता ।

नाभिकीय microprobe विश्लेषण जैविक ऊतकों में रासायनिक तत्वों का पता लगाने की माप के लिए विशेष रूप से उपयुक्त साबित होता है । दोनों बीम पार्श्व संकल्प (०.३ 1 µm) और रासायनिक तत्व का पता लगाने में संवेदनशीलता (1 से 10 µ g. g-1 शुष्क मास) सेलुलर स्तर पर अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं । परमाणु microprobe तकनीक कणों का पता लगाने (फोटॉनों, इलेक्ट्रॉनों, आयनों) आयन बीम के बाद उत्सर्जित (आमतौर पर MeV ऊर्जा पर चलने) नमूने में मौजूद परमाणुओं के साथ बातचीत के आधार पर कर रहे हैं । कोशिकाओं में होने वाले इंटरैक्शन मुख्य रूप से हैं: 1) उत्तेजना/ionization परमाणुओं के बाद फोटॉनों के एक उत्सर्जन के बाद उनके मौलिक राज्य में लौटने; और 2) आने वाले कणों के प्रसार के लिए अपनी ऊर्जा और दिशा में परिवर्तन अग्रणी । उत्सर्जित कण ऊर्जा की माप allowsthe बातचीत में शामिल परमाणुओं की पहचान । तत्वों की मैपिंग प्रदर्शन करने के लिए, आयन microbeam बार नमूना सतह पर अक्सर स्कैन कर रहा है, के बारे में १०० के एक क्षेत्र से अधिक बार १०० µm2 कई कोशिकाओं से युक्त. उत्सर्जित कणों का पता लगाया है और उनकी ऊर्जा प्रत्येक बीम स्थिति के लिए दर्ज की गई है । बीम स्थिति के अनुसार कणों की छंटाई, इस प्रकार के कणों के उत्सर्जन के लिए जिंमेदार संरचना की पहचान डेटा उपचार का उद्देश्य है । यहां, हम ठीक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और परमाणु microprobe विश्लेषण पर आधारित का पता लगाने के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेलुलर और उप सेलुलर तराजू पर exogenous एनपीएस की जांच करने के लिए, के क्रम में रहने के साथ एनपी बातचीत के परिणामों की जाँच करने के लिए का वर्णन सिस्टम. हम विशेष रूप से सीटू ठहराव के टाइटेनियम डाइऑक्साइड नैनोकणों (TiO2 एनपीए) में उपसेलुलर स्तर पर समुच्चय के संदर्भ में इस पद्धति द्वारा पेश अवसरों पर ध्यान केंद्रित करेगा ।

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Protocol

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1. नमूना धारक तैयारी

  1. नमूना धारक डिजाइन और तैयारी
    1. एक 1 मिमी मोटी तिरछी नज़र फ्रेम में एक 5 मिमी x 5 मिमी वर्ग ड्रिलिंग द्वारा एक नमूना धारक का निर्माण ।
    2. इथेनॉल ७०% (वी/वी) के साथ धोने और उपयोग करने के लिए तैयार जब तक बाँझ प्लेट में रखने के द्वारा साफ ।
      नोट. सेल कल्चर और सेल हैंडलिंग के लिए उपयुक्त एक नमूना धारक की आवश्यकता है । यह सेल संवर्धन के लिए डिजाइन की जरूरत है, इन विट्रो में ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ टिप्पणियों, और परमाणु microprobe विश्लेषण और इमेजिंग । यह धारक एक तिरछी नज़र फ्रेम13से बना है ।
  2. नमूना धारक तैयारी
    1. क्लोरोफॉर्म के १०० मिलीलीटर में 1 मिलीग्राम Formvar चूर्ण को भंग करके Formvar घोल तैयार करें ।
    2. एक धातु फ्रेम पर पाली कार्बोनेट पंनी इतना है कि यह कोई गुना प्रस्तुत करता है ।
    3. नमूना धारक छेद के आसपास Formvar समाधान फैलाने के लिए एक बाँझ टिप का प्रयोग करें ।
    4. नीचे फैला (एक 5 मिमी x 5 मिमी वर्ग) तनी पाली कार्बोनेट पंनी पर गोंद के साथ नाजुक नमूना धारक रखो ।
    5. प्रत्येक दोहराने के लिए एक नमूना धारक तैयार करने के लिए पिछले अनुक्रम दोहराएँ ।
      नोट. पाली कार्बोनेट (पीसी) फिल्म है, संगत काफी मोटी है और विभिंन प्रोटोकॉल और विश्लेषणात्मक बाधाओं के लिए प्रतिरोधी ।
      सावधानी-क्लोरोफॉर्म विषाक्त है । सांस लेना, घूस या त्वचा के साथ संपर्क से बचें । हमेशा एक ठीक से काम कर रासायनिक धुएं हूड और उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करें ।
  3. नमूना धारक नसबंदी
    1. एक शंकु कुप्पी में ५० मिलीलीटर ७०% (v/v) १८० rpm और + ३७ ° c रातोंरात पर आंदोलन के तहत, एक मशीन का उपयोग कर के साथ घुड़सवार नमूना धारक प्लेस/
    2. धारक को बाँझ आसुत जल में कई बार कुल्ला ।
    3. हवा उंहें बाँझ परिस्थितियों में शुष्क और पराबैंगनी प्रकाश (प्रभावाधीन दीपक से एक तरफ के लिए 30 मिनट के लिए-सुरक्षा पीठ, कक्षा द्वितीय) के लिए उंहें बेनकाब ।
    4. बाँझ 12-अच्छी तरह से प्लेटें (एक नमूना धारक के प्रति अच्छी तरह से) के लिए तैयार उपयोग करने के लिए जब तक नमूने रखें ।
      नोट: कई नमूना धारकों बाँझ में कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और सूखी 12-अच्छी तरह से parafilm के साथ बंद कर दिया प्लेटों बहुत दिनों के लिए.

2. उपयुक्त नमूना धारक में कोशिकाओं की वृद्धि ।

सावधानी: प्रोटोकॉल बाहर एक सुरक्षा लामिना प्रवाह पीठ (वर्ग द्वितीय) में किया जाना चाहिए दूषित सूक्ष्म जीवों को बाहर करने के लिए । (जैसे पेनिसिलिन, streptomycin) दस्ताने के साथ एंटीबायोटिक दवाओं संभाल । सबसे अच्छा प्रथाओं का संमान जब जैविक सामग्री हैंडलिंग (सेल लाइनों, आनुवंशिक रूप से संशोधित मानव कोशिकाओं व्युत्पंन) ।

महत्वपूर्ण: उपयोग की जाने वाली कक्ष रेखाओं को यह सुनिश्चित करने के लिए चेक किया जाना चाहिए कि वे माइकोप्लाज्मासे संक्रमित नहीं हैं ।

  1. प्लाज्मिड असर मैट्रिक्स के साथ Transfect U2OS सेल लाइन-roGFP 17,18,19 निर्माता द्वारा स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार में एक अभिकर्मक विधि का उपयोग कर ।
  2. प्लाज्मिड के साथ अभिकर्मक की पुष्टि करने के लिए-ले जाने के लिए और प्लाज्मिड नुकसान को रोकने के लिए, का चयन करें और transfected कोशिकाओं को बनाए रखने के उपयुक्त संस्कृति माध्यम है ।
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा transfected कोशिकाओं visualize सुनिश्चित करने के लिए अभिकर्मक हुई है और प्रतिदीप्ति की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए और एक जालीदार और ट्यूबलर mitochondrial नेटवर्क19का प्रदर्शन ।
    बिंदु रोकें: कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में कई वर्षों के लिए जम सकता है ।
  4. उप-धाराप्रवाह कोशिका आबादी प्राप्त करने के लिए एक उचित माध्यम में कोशिकाओं संवर्धन द्वारा transfected सेल जनसंख्या का उपयोग करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित, 5% (v/v) सीओ2 एक संतृप्त पानी के माहौल में ।
  5. एक एकाग्रता में बीज कोशिकाओं, जैसे वे ८०% पर कर रहे हैं संगम निर्धारण के दिन. सामांयतया, µ l प्रति ५०० कक्षों की एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है । फसल Trypsin-EDTA ०.२५% (v/v) के ४०० µ एल का उपयोग कर कोशिकाओं और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए रखने के लिए । संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ trypsin कार्रवाई रोकें । २३० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली, तो supernatant हटाने के लिए, और ताजा संस्कृति के माध्यम की वांछित मात्रा में जोड़ें ।
    ध् यान दें. प्रोटोकॉल सभी सेलुलर प्रकार के लिए लागू है और बीज की कोशिकाओं की संख्या सेल आकार और सेल दोहरीकरण समय पर निर्भर है ।
    सावधानी: trypsin, एंटीबायोटिक दवाओं, और सीरम दोहराया रुक-गल चक्र को subjecting से बचें । उंहें बाँझ रखो । शेयर समाधान को aliquots में बांटें और उन्हें − 20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें । aliquots समय सीमा समाप्ति दिनांक तक संग्रहीत है । सावधानी से सेल गोली कुल्ला क्रम में पूरी तरह से trypsin को दूर करने के लिए । अवशिष्ट trypsin के निशान देरी और चढ़ाना दक्षता में कमी होगी ।
  6. कोशिकाओं की गणना और µ एल प्रति ५०० कोशिकाओं के साथ एक सेल निलंबन प्राप्त करने के क्रम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा ताजा पूरा संस्कृति माध्यम के साथ एक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन
    नोट: कोशिका निलंबन की एकाग्रता के लिए सेल प्रकार के एक समारोह के रूप में अनुकूलित किया जाना है, क्रम में एक ४० µ एल ड्रॉप थाली ।
  7. थाली एक ४० µ एल पाली कार्बोनेट पंनी के केंद्र पर ड्रॉप । सावधानी से 2 ज के लिए नमूना जगह पर + ३७ ° c, 5% (v/v) CO2 एक संतृप्त पानी के वातावरण में ।
    महत्वपूर्ण: एक बार नमूना मशीन में रखा गया है, जितना संभव हो किसी भी यांत्रिक आंदोलन तेजी से सेल लगाव एहसान करने के लिए सीमा । सेल प्रकार के अनुसार, यह इष्टतम platting दक्षता के लिए 2 घंटे से अधिक कोशिकाओं को गर्मी के लिए आवश्यक हो सकता है । जांच करें कि मशीन वातावरण अच्छी तरह से वाष्पीकरण से बूंदों को रोकने के संतृप्त है ।
  8. कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पाली कार्बोनेट पंनी पर संलग्न की जांच करें । धीरे ताजा पूरा मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 24 घंटे के लिए रखने के लिए ।

3. नैनोकणों तैयारी और एक्सपोजर

नोट: फ्लोरोसेंट डाई संशोधित TiO2 एनपीएस डिजाइन, संश्लेषित, और रासायनिक tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) के साथ संशोधित किया गया । 20 , 21 यह सतह संशोधन सीटू में nanoparticle डिटेक्शन, ट्रैकिंग और स्थानीयकरण की अनुमति देता है और cellulo में दोनों जीवित और स्थिर कोशिकाओं में या कोशिकीय जीवों में । 12 , 13 , 18

सावधानी: मैटीरियल्स और नैनोकणों देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए । सांस लेना, घूस या त्वचा के साथ संपर्क से बचें । वायु में प्रसार को रोकने के लिए, नैनोकणों समाधान (ultrapure water) में बनाए रखे जाते हैं ।

  1. ultrapure पानी मेंTiO2 एनपीएस के 1 mg.mL− 1 का सस्पेंशन तैयार करें । (७५० डब्ल्यू, 20 kHz, आयाम: 30%) एक अल्ट्रा ध्वनि जनरेटर और एक समर्पित शंकु microprobe का उपयोग करते हुए आरटी पर तीव्र 1-ंयूनतम sonication दालों का उपयोग TiO2 एनपीएस फैलाने ।
  2. संस्कृति माध्यम में वांछित एकाग्रता पर TiO2 एनपीएस पतला आदेश 4 µ जी cm− 2 (अंतिम एकाग्रता) के एक जोखिम निलंबन प्राप्त करने के लिए । मध्यम से कोशिकाओं पर एनपीए युक्त के उचित मात्रा के साथ बदलें और tio के सजातीय वितरण के लिए धीरे से मिश्रण2 एनपीएस । tio2 एनपीएस के अतिरिक्त के बिना इसी तरह नियंत्रण कोशिकाओं को तैयार ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेल आबादियों, 5% (v/v) CO2 और एक संतृप्त पानी वातावरण ।

४. Paraformaldehyde निर्धारण व प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी.

  1. paraformaldehyde समाधान (पीएफए, 4% w/वी) फास्फेट बफर खारा (पंजाब, पीएच ७.४) में बफर के एक ताजा समाधान तैयार करते हैं ।
    1. पंजाब के १०० मिलीलीटर में पीएफए पाउडर के 4 जी भंग । ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान गर्मी जबकि एक चुंबक और एक धुएं हुड में एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग सरगर्मी । एक बार में 1 M NaOH एक बूंद जोड़कर पीएच को बढ़ाने के समाधान साफ करता है जब तक । कमरे के तापमान के लिए समाधान शांत और ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें । नए सिरे से तैयार समाधान का तुरंत उपयोग करें या + 4 ° c पर रखें और प्रकाश से बचाएं ।
      नोट: पूर्व-निर्मित पीएफए समाधानों का उपयोग किया जा सकता है लेकिन पीएफए की एक अचिंतित तैयारी बेहतर निर्धारण गुणवत्ता और लंबी अवधि के संरक्षण के लिए निश्चित नमूनों की गारंटी देता है ।
      सावधानी: पीएफए विषाक्त है; सांस लेना, घूस या त्वचा के साथ संपर्क से बचें । हमेशा एक ठीक से काम कर रासायनिक धुएं हूड और उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करें ।
  2. एक बार, मशीन समय बीता है, सेल संस्कृति TiO2 एनपीए युक्त माध्यम को हटा दें । ताजा संस्कृति माध्यम के साथ एक बार सेल आबादी कुल्ला और पंजाबियों (2 मिलीलीटर) के साथ एक बार । पंजाबियों निकालें, ताजा और ठंडे पीएफए (4% डब्ल्यू/वी, + 4 डिग्री सेल्सियस) के एक aliquot के साथ जल्दी कुल्ला ।
    1. पीएफए जोड़ें (2 मिलीलीटर, 4% डब्ल्यू/वी, 4 डिग्री सेल्सियस) । कमरे के तापमान पर 15 मिनट की मशीन ।
    2. पीएफए निकालें, आंदोलन के तहत पंजाबियों (2 मिलीलीटर, 3 बार, 5 मिनट) के साथ कोशिकाओं कुल्ला ।
      बिंदु रोकें: इन रासायनिक निश्चित नमूनों प्रतिदीप्ति इमेजिंग के बाद "डुबकी-फ़्रीज़" कार्यविधि के लिए उपयोग किया जा सकता (चरण 5 पर जाएँ) या केवल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए उपयोग किया गया (चरण ४.३ पर जाएँ).
  3. Hoechst३३३४२ के साथ नाभिक दाग पंजाब में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । Hoescht३३३४२ ५०० एनएम के अंतिम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है । बाद मशीन समाधान हटाने और पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
    सावधानी: Hoechst३३३४२ सेल permeant है और विषाक्त हो सकता है । सीधे संपर्क से बचें, और तैयार करते समय दस्ताने का उपयोग करें और Hoechst३३३४२का उपयोग कर ।
    महत्वपूर्ण: सुनिश्चित करें कि Hoechst३३३४२ धुंधला समाधान हौसले से तैयार है और बाँझ स्थितियों में बनाए रखा है ।
  4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) का उपयोग सीटू और एकल सेल इमेजिंग में के लिए फिक्स्ड नमूनों की प्रक्रिया.

5. "डुबकी-ठंड" निर्धारण और निर्जलीकरण

  1. यह तरल नाइट्रोजन में ठंडा द्वारा एक एल्यूमीनियम हस्तांतरण प्लेट तैयार करें । एक तरल नाइट्रोजन से भरा बॉक्स में थाली की दुकान और ठंडी नाइट्रोजन भाप में तरल के ऊपर प्लेट की सतह को बनाए रखने ।
    नोट: हस्तांतरण प्लेट किसी भी धातु की थाली से बनाया जा सकता है (यहां, हम एल्यूमीनियम का इस्तेमाल किया) कि तरल नाइट्रोजन तापमान के लिए नीचे ठंडा किया जा सकता है, और है कि फ्रीज ड्रायर नमूना चैंबर में प्रवेश कर सकते हैं ।
    महत्वपूर्ण: बॉक्स के रूप में ज्यादा के रूप में संभव के रूप में बंद रखा जाना चाहिए ताकि ठंडी प्लेट की सतह पर पानी भाप जमाव को रोकने के लिए । तैयारी के दौरान प्लेट पर संग्रहित नमूना को लिक्विड नाइट्रोजन से ढका नहीं जाना चाहिए ।
  2. एक बार संस्कृति माध्यम में कुल्ला कोशिकाओं और फिर दो बार अधिक, संक्षेप में, बाँझ और ultrapure पानी में शेष extracellular लवण के किसी भी निशान से छुटकारा पाने के लिए.
    महत्वपूर्ण: सुनिश्चित करें कि मीडिया के हौसले से तैयार है और बाँझ स्थितियों में बनाए रखा । इस्तेमाल किया जा रहा से पहले ३७ ° c पर सभी मीडिया हीट । कुल्ला बहुत संक्षिप्त (कुछ सेकंड) और नमूने पर तरल की अधिक के रूप में तेजी से संभव के रूप में हटा दिया जाना चाहिए ।
  3. डुबकी-१५० ° c तरल में कोशिकाओं फ्रीज नाइट्रोजन-ठंडा 2-methylbutane के दौरान 30 एस और उंहें एल्यूमीनियम हस्तांतरण प्लेट पर जगह है । अन्य सभी नमूनों की तैयारी के दौरान यहां स्टोर के नमूने लिए । जब नमूने सभी cryofixed हैं, हस्तांतरण प्लेट एक फ्रीज-ड्रायर में रखकर सभी-पर एक बार स्थानांतरण ।
    महत्वपूर्ण: संरचनात्मक संशोधनों को अस्थाई रूप से स्थानांतरण बॉक्स में संग्रहीत नमूनों में दिखाई देने से रोकने के लिए समग्र cryofixation प्रक्रिया 20 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
  4. फ्रीज-निंनलिखित अनुक्रम का उपयोग कर नमूनों सूखी: 1) 12 से 24 घंटे के लिए एक प्राथमिक सुखाना प्रदर्शन (-९९ ° c, 10-3 mbar) कम दबाव और कम तापमान पर, तो 2) कम से 24 एच के लिए एक माध्यमिक सुखाना चरण प्रदर्शन, प्लेट तापमान में वृद्धि + ४० ° c जबकि दबाव कम रखते हुए (+ ४० ° c, 10-3 mbar) ।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन अत्यंत ठंडा है और संपर्क पर गंभीर शीतदंश या आंख नुकसान का कारण बन सकता है । परिवहन के लिए अनुकूलित बेंच शीर्ष कंटेनरों का प्रयोग करें और पहनने के सुरक्षा उपकरण (क्रायोजेनिक दस्ताने, आंख और चेहरा संरक्षण) ।
    सावधानी: 2-Methylbutane अत्यंत ज्वलनशील है । हवा का एक हानिकारक संक्रमण + 20 डिग्री सेल्सियस पर इस पदार्थ के वाष्पीकरण पर नहीं बल्कि जल्दी से पहुंचा जा सकता है । सांस लेना, घूस या त्वचा के साथ संपर्क से बचें । श्वास और नेत्र सुरक्षा, और सुरक्षात्मक दस्ताने का प्रयोग करें । हमेशा एक ठीक से काम कर रासायनिक धुएं हुड का उपयोग करें । + 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    महत्वपूर्ण: "डुबकी-फ्रीज" सत्र के दौरान 2-Methylbutane तापमान की निगरानी करने के लिए एक उपयुक्त थर्मामीटर (-१५० ° c) का उपयोग करें । 2-methylbutane एक तरल चरण में ठंडा रखा जाना चाहिए । परिवेशी वातावरण में cryofixed नमूनों को हस्तांतरित करने से तापमान में वृद्धि या नमूना सतह पर पानी की वाष्प संघनित्र के कारण सेलुलर क्षति हो सकती है । तदनुसार, हस्तांतरण के रूप में तेजी से किया जाना चाहिए यथोचित (30 एस)
    बिंदु रोकें: cryofixation के बाद, नमूनों बाँझ और शुष्क स्थितियों में कई दिनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है (धूल और नमी से सुरक्षित). ध्यान से ठीक संदंश के साथ नमूनों को संभाल और एक बाँझ 12-अच्छी तरह से parafilm के साथ बंद थाली में उन्हें जगह. जलशुष्कक वातावरण को शुष्क किया जा सकता है ।

6. नाभिकीय Microprobe विश्लेषण

नोट: नाभिकीय Microprobe विश्लेषण AIFIRA के microbeam लाइन में किया गया था (अनुप्रयोगों Interdisciplinaires डेस Faisceaux d'Ions en RégionAquitaine) का उपयोग पूरक आयन बीम विश्लेषणात्मक तकनीक कण प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (µ- PIXE) और स्कैनिंग ट्रांसमिशन आयन माइक्रोस्कोपी (µ-STIM). सुविधा एक ३.५ एमवी कण त्वरक MeV ऊर्जा रेंज में प्रकाश आयन मुस्कराते हुए देने पर आधारित है । 22 , 23

बिंदु रोकें: AIFIRA एक आयन बीम बोर्डो के विश्वविद्यालय द्वारा आयोजित की सुविधा है कि प्रस्तावित प्रयोग के वैज्ञानिक मूल्यांकन के बाद राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय टीमों के लिए एक का उपयोग प्रदान करता है ।

  1. एक छिद्रित प्लेट पर तिरछी नमूना धारकों डबल पक्षीय टेप का उपयोग कर माउंट ।
  2. बीम दिशा के लिए सीधा एक ऊर्ध्वाधर विमान में नमूना समर्थन प्लेट प्लेस ।
  3. विश्लेषण कक्ष को बंद करें और विश्लेषण कक्ष को वैक्यूम ।
  4. स्कैनिंग ट्रांसमिशन आयन माइक्रोस्कोपी (µ-STIM)
    नोट: STIM सेलुलर द्रव्यमान के लिए ऊर्जा हानि के रूपांतरण के बाद कोशिकाओं के आरईएल घनत्व नक्शे रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तथ्य यह है कि ऊर्जा नुकसान नमूना आरईएल घनत्व के लिए आनुपातिक है का लाभ ले (µ जी सेमी में व्यक्त-2) ।
    1. एक 2 MeV हीलियम का प्रयोग करें (वह+) व्यास में लगभग ३०० एनएम के फोकल विमान में एक आकार और कम प्रवाह (२००० आयनों. s-1) के साथ एक जांच के रूप में microbeam । एक planar सिलिकॉन डिटेक्टर के साथ संचारित आयनों की ऊर्जा उपाय (पिप डिटेक्टर, 25 मिमी2, 11 कीव ऊर्जा संकल्प @ ५.४ MeV), बीम अक्ष में नमूना के पीछे रखा.
  5. कण प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (µ-PIXE) और रदरफोर्ड Backscattering स्पेक्ट्रोमेट्री (µ-आरबीएस) ।
    नोट: µ-Pixe और µ-आरबीएस विश्लेषण एक उप माइक्रोमीटर संकल्प के साथ स्थानिक वितरण और रासायनिक तत्वों के ठहराव प्रदान करते हैं ।
    1. एक १.५ MeV प्रोटॉन का प्रयोग करें (एच+) microbeam (50-150 फिलीस्तीनी अथॉरिटी), 1 µm के एक व्यास को नीचे ध्यान केंद्रित और ब्याज की एक ही कोशिकाओं पर स्कैन 4 से 8 घंटे और लगभग १०० x १०० µm2से STIM द्वारा देखा ।
    2. एक उच्च संकल्प एसआई (ली) ठोस राज्य डिटेक्टर (१४५ eV ऊर्जा संकल्प, @Mn-Kα) ४५ ° से आने वाली बीम धुरी पर तैनात द्वारा नमूना (एनए से भारी) में मौजूद परमाणुओं से उत्सर्जित एक्स-रे फोटॉनों इकट्ठा । पता लगाया फोटॉन ऊर्जा का उपयोग करने के लिए उत्सर्जन की प्रकृति की पहचान (जैसे तत्व के जेड) और एक्स-रे तीव्रता तत्व एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए ।
    3. साथ-साथ एक सिलिकॉन डिटेक्टर (आंशिक रूप से घट डिटेक्टर, 25 मिमी2, 11 कीव FWHM @ ५.४ MeV) के साथ-१३५ डिग्री पर वापस बिखरे हुए प्रोटॉन इकट्ठा करने के लिए आने वाले कणों की कुल संख्या को मापने के लिए और एक्स-रे तीव्रता को सामान्य करने के लिए.
      महत्वपूर्ण: एक्स-रे डिटेक्टर प्रतिक्रिया जांच करने के क्रम में परमाणु एकाग्रता ठहराव के लिए प्रमाणित अंशांकन मानकों का एक संग्रह का उपयोग किया जाता है । संदर्भ सामग्री ६.३ µm मोटी Mylar पन्नियों पर जमा पतली परमाणु फिल्मों का एक संग्रह है । उत्सर्जित एक्स-रे ऊर्जा ०.६ से (ली, कश्मीर रेखा) से २०.२ कीव (आरएच, कश्मीर लाइन) ।

7. डेटा विश्लेषण

  1. ImageJके लिए आईबीए-जे प्लगइन का उपयोग कर रासायनिक तात्विक नक्शे का पुनर्निर्माण । 24
    नोट: ImageJ के लिए एक प्लगइन के रूप में समर्पित सॉफ्टवेयर कच्चे परमाणु microprobe विश्लेषण डेटा की प्रक्रिया के लिए विकसित किया गया है । रॉ डेटा कोशिकाओं है कि एक कालानुक्रमिक अनुक्रम के रूप में बीम स्थिति के साथ दर्ज कर रहे है के साथ कण बीम बातचीत से उत्पंन होने वाली घटनाओं की एक सूची के अनुरूप हैं ।
    1. अपने प्रकार के अनुसार घटनाओं को क्रमबद्ध करने के लिए आईबीए-जे प्लगइन का प्रयोग करें: संचरित आयन ऊर्जा (STIM), backscattered आयन ऊर्जा (आरबीएस) या एक्स-रे फोटॉन ऊर्जा (PIXE). उसके बाद, प्रत्येक प्रकार के डेटा को अलग से संसाधित करें ।
    2. गणना STIM क्षेत्र घनत्व मानचित्र
    3. औसत एक्स-रे फोटॉन ऊर्जा स्पेक्ट्रा की गणना और ब्याज की प्रत्येक रासायनिक तत्व के लिए परिभाषित एक ऊर्जा खिड़की के लिए तत्व स्थानिक वितरण पुनः प्राप्त करने के लिए ।
    4. ब्याज के क्षेत्रों (रॉय) (उदा व्यक्तिगत कोशिकाओं, घने संरचना, समुच्चय, आदि) को परिभाषित करने और इसी एक्स-रे स्पेक्ट्रा की गणना ।
  2. घटना कणों की कुल संख्या की गणना करने के क्रम में इसी आरबीएस स्पेक्ट्रा का विश्लेषण25.
  3. फिट एक्स-रे स्पेक्ट्रा प्रत्येक रॉय के लिए तत्व एकाग्रता का निर्धारण करने के क्रम में Gupix सॉफ्टवेयर26 का उपयोग कर.
    ध्यान दें: विधि के लिए पता लगाने की विशिष्ट सीमा (लोद) श्रेणी में है 1 से 10 µ g. g-1 शुष्क मास में तत्वों की परमाणु संख्या के आधार पर (लोद Z के साथ कम है) ।

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Representative Results

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सेल संस्कृति और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के फ्लोरोसेंट लेबल TiO 2 एनपीए

हम एक नमूना सेल संस्कृति के लिए अनुकूलित धारक, सेल हैंडलिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से multimodal विश्लेषण बनाया । विशेष रूप से, यह महत्वपूर्ण है कि धारक नियमित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परमाणु microprobe विश्लेषण और इमेजिंग की अनुमति दी थी । यह नमूना धारक एक तिरछी फ्रेम पर जमा एक 2-µm मोटी पालीं पंनी पर आधारित है । कोशिकाओं को सीधे पाली कार्बोनेट पर उगाया जाता है, कई दिनों के लिए बाँझ संस्कृति की स्थिति में और फिर ऐसे एनपीएस जोखिम के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स, के लिए इस्तेमाल किया.

fluorophores के साथ रासायनिक सतह संशोधन (TRITC) TiO2 एनपीएस का पता लगाने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी सीटू में और इन विट्रो में स्थानीयकरण रहने में या paraformaldehyde निश्चित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की अनुमति दी । सेल नाभिक और mitochondria महत्वपूर्ण-डाई Hoechst३३३४२ (नाभिक के लिए नीला) और transfected मैट्रिक्स-roGFP (mitochondria के लिए ग्रीन), क्रमशः का उपयोग दाग थे । यह एकाधिक दाग TRITC के intracellular स्थानीयकरण की अनुमति-TiO2 एनपीएस (अपनी लाल उत्सर्जन प्रतिदीप्ति द्वारा) 20 प्रदर्शन के बाद एच । एनपीए केवल नाभिक में कोई पता लगाने के साथ उजागर कोशिकाओं के कोशिका में पाए गए । एनपीएस कोशिका के perinuclear क्षेत्र में बेतरतीब ढंग से अनुवादित थे और पूरी तरह से mitochondria से बाहर रखा गया (TRITC और GFP संकेतों के बीच कोई अतिव्यापी).

हालांकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से उजागर कोशिकाओं के अंदर एनपीएस स्थानीयकृत करने के लिए बहुत उपयोगी है, यह प्रति कोशिका एनपीएस की सही संख्या का आकलन करने में सक्षम नहीं है । एनपीएस के ठहराव से संबंधित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की मुख्य कठिनाई के बारे में अनिश्चितता से जुड़ा हुआ है (i) अवलोकन के दौरान चुने गए fluorophore के किसी दिए गए एनपी और ब्लीचिंग स्थिरता से जुड़ी fluorophores की संख्या और (ii) सेल के अंदर एनपीएस की एग्रीगेट स्थिति ।

Figure 1
चित्र 1 : इन विट्रो में और सीटू में U20S ट्रांसजेनिक कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति इमेजिंग मैट्रिक्स-RoGFP और TRITC के संपर्क में व्यक्त-TiO 2 एनपीएस. U2OS कोशिकाओं (ऊपर) Hoechst के साथ चिह्नित३३३४२ (नीला), मैट्रिक्स-roGFP (हरा) करने के लिए उजागर कर रहे हैं 4 µ g. cm-2 TRITC-लेबल्ड tio2 नैनोकणों (लाल) के लिए 20 ज. टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि tio2 एनपीएस कुल में कोशिकाओं में एक perinuclear क्षेत्र । स्केल बार: 10 µm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

इन कमियों को दूर करने के लिए नाभिकीय microprobe विश्लेषण techniquesprovide की अपनी संवेदनशीलता के कारण परम्परागत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के प्रति पूरक दृष्टिकोण अपनाते हैं जो कि किसी भ्रष्टाचारी से प्रतिदीप्ति जैसे किसी मध्यवर्ती संकेत के प्रयोग को रोकता है डाई. इसके अलावा, वे भी पूरी तरह से मात्रात्मक हैं, (i) के बारे में डेटा उपलब्ध कराने के उप सेलुलर जैव रासायनिक सामग्री है कि अंयथा अज्ञात है, और (ii) एनपीएस की intracellular मात्रा एकल कोशिका स्तर पर ।

लाइव इमेजिंग के बाद कोशिकाओं की Cryofixation ।

परमाणु microprobe विश्लेषण प्रदर्शन में सबसे अधिक बाधा निर्वात शर्तों के तहत काम करने के लिए है । हम जैविक ultrastructure के संरक्षण और जैविक नमूना के जैव रासायनिक अखंडता को सक्षम करने के लिए एक सेल निर्धारण प्रोटोकॉल विकसित किया है । रासायनिक निर्धारण कोशिकाओं के ट्रेस तत्व संरचना को संशोधित करने के लिए जाना जाता है क्योंकि यह सेलुलर ultrastructure के संरक्षण के लिए इस्तेमाल एक बहुलक द्वारा अपने सेलुलर माध्यम के प्रतिस्थापन की आवश्यकता है । इसके अलावा, पानी की निकासी भी मुक्त आयनों और अंय प्रजातियों, जो समग्र नमूना संरचना को संशोधित विज्ञप्ति । इसलिए, यह एक शारीरिक निर्धारण पद्धति, विशेष रूप से क्रायोजेनिक तरीकों को प्राथमिकता देना अनिवार्य हो जाता है । इन क्रायोजेनिक प्रक्रियाओं सेलुलर गतिविधि की एक स्विफ्ट समाप्ति और मिलीसेकंड समय पैमाने में यह, प्रेरित ।

सेल्युलर स्केल पर एनपीएस की न्यूक्लियर microprobe एनालिसिस माइक्रोस्कोपी और ठहराव ।

स्कैनिंग ट्रांसमिशन आयन माइक्रोस्कोपी (µ-STIM) और कण प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (µ-PIXE) विश्लेषण cryofixation और निर्जलीकरण के बाद नमूनों पर उनके मौलिक रासायनिक संरचना पर सटीक मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया ।

µ-STIM छवियों घनत्व में स्थानीय मतभेदों का पता चला है और इस तरह के नाभिक और कोशिका के रूप में सेल संरचनाओं का पता लगाने की अनुमति देता है । हालांकि बीम पार्श्व संकल्प घने संरचनाओं के अवलोकन के रूप में संकीर्ण के रूप में ३०० एनएम चौड़ा, कोशिका में यहां दिखाई पतली समुच्चय की तरह सक्षम बनाता है, STIM तरीकों NP समुच्चय और अंय घने सेलुलर संरचनाओं के बीच भेदभाव नहीं कर सकते । इसका कारण यह है कि, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) के लिए की तरह, शारीरिक प्रक्रिया संचारित ऊर्जा में भिंनता के लिए अग्रणी परमाणु इलेक्ट्रॉन बादल के साथ आने वाली आयन की बातचीत है । उनि विश्लेषण के विपरीत तथापि, क्योंकि पूरे सेल मात्रा का विश्लेषण किया है, स्थानीय मोटाई विविधताओं उच्च Z संरचनाओं और सेलुलर घनत्व के एक स्थानीय वृद्धि के बीच भेदभाव को रोकने के ।

Figure 2
चित्र 2 : µ-STIM और µ-PIXE पर क्रायो-फिक्स्ड U2OS कोशिकाओं द्वारा प्राप्त घनत्व और तात्विक वितरण की छवियाँ. U2OS नियंत्रण कोशिकाओं (ऊपर) उजागर क्रायो-फिक्स्ड U2OS कोशिकाओं की तुलना कर रहे है (4 µ g. cm-2 TiO2 एनपीएस के संपर्क में, नीचे) और मनाया परमाणु microprobe विश्लेषण का उपयोग/ STIM माइक्रोस्कोपी (बाएं, ग्रेस्केल मानचित्र) सघन इंट्रा या अतिरिक्त सेलुलर संरचनाओं (नाभिक, नमक समुच्चय, नैनोकणों) का पता चला । स्थानिक संकल्प (३०० एनएम) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए तुलनीय है और perinuclear क्षेत्र में एनपी समुच्चय जैसे संरचनाओं से पता चलता है । केवल उनके घनत्व पर आधारित संरचनाओं की पहचान फिर भी अस्पष्ट हो सकती है । K, P और Ti (थर्मल कलर स्केल) के µ-PIXE तात्विक दृय µ-STIM नक्शों के पूरक हैं. इनका इस्तेमाल कोशिकाओं में एनपीएस की मौजूदगी को सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है । प्रत्येक कोशिका व्यक्तिगत रूप से तत्व एकाग्रता के संदर्भ में विश्लेषण किया जा सकता है ( चित्रा 3देखें). स्केल बार्स: 10 µm. रंग स्केल्स अधिकतम तीव्रता (धूसर) से ंयूनतम (नीला) से लेकर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

के रूप में चित्रा 2में सचित्र, µ-STIM प्रतिपादन दोनों एक जनसंख्या के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं की मांयता और भी nucleolus और नाभिक के रूप में उप डिब्बों intracellular की अनुमति देता है । दुर्भाग्य से, और जैसा कि पहले उल्लेख किया है, एनपीएस µ-STIM पुनर्निर्माण का प्रयोग हमेशा नहीं पाया जा सकता है ।

कण-प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (µ-PIXE) विश्लेषण न केवल नमूने की रासायनिक संरचना बल्कि उनके तात्विक मानचित्रण (चित्र 2) प्रदान करता है । रोमांचक बीम के साथ बातचीत के दौरान, रासायनिक तत्वों परमाणु उत्तेजना-de-उत्तेजना प्रक्रियाओं है कि अंततः एक फोटॉन जो उत्तेजित तत्व की परमाणु संख्या की विशेषता ऊर्जा प्रदर्शन के उत्सर्जन के लिए नेतृत्व से गुजरना । एक विशेषता पीक स्पेक्ट्रम सभी उत्सर्जित फोटॉन घटनाओं के योग से बनाया गया है और नमूने के एक रासायनिक हस्ताक्षर माना जाता है ।

µ-PIXE प्रयोगों के लिए प्रयुक्त मानक प्रयोगात्मक setups और डिटेक्टरों एक 1 से 10 µ g. g− 1 सूखी जन जांच सीमा के साथ ना से भारी सभी तत्वों की एक साथ ठहराव अनुमति देते हैं । मौलिक सांद्रता को मापने में सटीकता आमतौर पर संग्रह और डिटेक्टर क्षमता चार्ज करने के लिए कारण लगभग 20% तक सीमित है ।

इस अध्ययन में, पोटेशियम और फास्फोरस जैसे तत्वों का वितरण और टाइटेनियम मानचित्रण के साथ TiO2 एनपीएस की intracellular मात्रा को बढ़ाता है नाभिकीय microprobe विश्लेषण द्वारा मनाया जाता है । रासायनिक तत्व नक्शे की गणना कर रहे है के बाद फोटॉनों रिकॉर्डिंग के समय बीम की स्थिति के अनुसार हल कर रहे है और एक ऊर्जा एक विशिष्ट तत्व के आसपास केंद्रित खिड़की के चयन । मैप्स बीम स्थिति में पता लगाया घटनाओं की संख्या के प्रतिनिधि है और मात्रात्मक हैं । दोनों शोर और पृष्ठभूमि संख्यात्मक अनुकरण कर रहे हैं और बाहर फ़िल्टर्ड. इसके अलावा, रासायनिक मानचित्रण ठहराव के लिए आवश्यक स्थानीय PIXE स्पेक्ट्रम निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

के रूप में चित्रा 2में सचित्र, फास्फोरस homogenously के साथ सेल में वितरित किया जाता है, के रूप में उंमीद है, परमाणु क्षेत्र में एक बहुत अधिक एकाग्रता । पोटेशियम कोशिका की मात्रा में homogeneously वितरित किया जाता है । टाइटेनियम cytoplasmic perinuclear क्षेत्र में समुच्चय के रूप में स्थित है, के रूप में पहले प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) का उपयोग कर मनाया. एनपीएस ने वही perinuclear स्थानीयकरण प्रदर्शित किया जो उनकी सतह राज्य: कार्यात्मक (चित्रा 1) या देशी (चित्रा 2) । इस बीच, टाइटेनियम का कोई ट्रेस नियंत्रण कोशिकाओं में पता चला कि टाइटेनियम वितरण µ द्वारा मनाया-PIXE TiO2 एनपीएस के लिए, हमारे पिछले विश्लेषण के साथ समझौते में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जिंमेदार ठहराया जाना चाहिए की पुष्टि की थी ।

इसके अलावा, जैसा कि चित्रा 2में सचित्र है, ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों से एनपीएस और मात्रात्मक एनपीएस सांद्रता के intracellular वितरण को निकालने के लिए संभव है । STIM नक्शे के आधार पर और फास्फोरस के साथ संबंध में/पोटेशियम वितरण, एकल सेल विश्लेषण संभव है ।

Figure 3
चित्र 3 : µ-PIXE का उपयोग करके एकल कक्ष मात्रात्मक विश्लेषण. व्यक्तिगत एक्स-रे स्पेक्ट्रा चित्रा 2 में दिखाया कोशिकाओं के लिए गणना की क्रम में सेलुलर स्तर पर तत्व एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए फिट किया जा सकता है । यह सुविधा एनपी विश्लेषण के लिए विशेष रूप से दिलचस्प है जहां सेलुलर सांद्रता आम तौर पर एक ही आबादी के अंदर मजबूत बदलाव दिखा । उदाहरण के लिए, एक ही मतलब जोखिम के लिए, तिवारी सांद्रता ०.२ अप करने के लिए १.८ µ g. cm-2से लेकर । नियंत्रण अनुपचारित सेल आबादी के अनुरूप है । जोखिम खुराक: 4 µ g. cm-2। Boxplots औसत मूल्य (क्षैतिज रेखा) और सबसे कम और उच्चतम मापा मूल्यों की ओर विस्तार सलाखों के साथ व्यक्तिगत सेलुलर सांद्रता के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । नियंत्रण कक्ष: N = 14; उजागर कक्ष: N = 16 ।

तदनुसार, हम न केवल एक सेल जनसंख्या में टाइटेनियम की औसत सामग्री मात्रा है, लेकिन यह भी एक विशिष्ट प्रयोगात्मक हालत में सेल प्रति एक जनसंख्या में टाइटेनियम वितरण दिखाया । टाइटेनियम की औसत सामग्री यहां मापा काफी कम है (५०० ng.cm-2) के रूप में 4 µ जी की तुलना में । cm-2 सेल जनसंख्या (चित्रा 3) और कोशिकाओं के बीच भिन्नता की जोखिम खुराक बड़ी है (तिवारी सांद्रता ०.२ से लेकर १.८ µ g. cm तक -2 विश्लेषित कोशिकाओं के अनुसार). हम भी ऐसे पोटेशियम और कैल्शियम के रूप में उजागर नमूनों में intracellular आयनों की वृद्धि देखा एक सेलुलर परिवर्तन TiO2 एनपीएस की उपस्थिति से प्रेरित homeostasis का सुझाव, के रूप में पहले कई लेखकों द्वारा वर्णित है । 21 , 27

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Discussion

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हम विशेष रूप से उपसेलुलर स्तर पर, अंय इमेजिंग तकनीकों के साथ क्या संभव है परे उपयोगी जानकारी उपलब्ध कराने के एक विधि का वर्णन । इसके इमेजिंग क्षमता के अलावा, नाभिकीय microprobe विश्लेषण भी रासायनिक तत्वों के ठहराव की संभावनाओं को एक जैविक नमूना की संरचना में प्रवेश प्रदान करता है । वर्तमान काम में, हम मानव कोशिका आबादी का अध्ययन किया और एक एकल सेल TiO2 एनपीएस के संपर्क के आधार पर ब्याज की एक चुना क्षेत्र के विश्लेषण के लिए नीचे ध्यान केंद्रित । अंय तकनीकों के साथ इसका संयोजन दोनों रूपात्मक सेलुलर इमेजिंग और मौलिक रासायनिक संरचना पर सटीक मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है ।

परमाणु microprobe विश्लेषण को सफलतापूर्वक लागू करने के लिए, संभावित नुकसान से बचने के लिए निम्न बिंदुओं का सम्मान करना अनिवार्य है । सबसे पहले, यह आवश्यक है कि सेल निर्धारण के लिए एक क्रायोजेनिक प्रोटोकॉल का उपयोग करें ताकि उसकी ultrastructure और उसकी जैव रासायनिक अखंडता को बरकरार रखा जा सके । दूसरा, यह भी 20 µm नीचे मोटाई के साथ पतले नमूनों का विश्लेषण करने के लिए अनिवार्य है । यदि आवश्यक हो, cryofixed नमूनों की धारा प्रदर्शन किया जा सकता है । नमूनों को बिल्कुल जम कर रखना चाहिए. तीसरा, यह भी ध्यान में रखना है कि परमाणु microprobe विश्लेषण जैविक नमूनों की एक दो आयामी प्रतिनिधित्व पता चलता है महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, रासायनिक तत्व वितरण प्राप्त एक दो आयामी प्रक्षेपण कि संभवतः गलत व्याख्याओं को लागू कर सकता है । tomographic अधिग्रहण के उपयोग से भविष्य में इस परिसीमन को दरकिनार कर दिया जाएगा ।

न्यूक्लियर microprobe एनालिसिस की भी सीमाएं हैं । इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि इसकी मुख्य बाधा निर्वातके अंतर्गत विश्लेषण करने की आवश्यकता है । इसलिए कक्ष निर्धारण प्रोटोकॉल का उपयोग करना अनिवार्य है जो कोशिकाएं ultrastructure और जैव रासायनिक अखंडता को संरक्षित करता है । इसलिए यह (रासायनिक राल के अलावा बिना) क्रायोजेनिक्स प्रक्रिया करने के लिए जैविक नमूनों के प्रतिरोध का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है । यह परमाणु microprobe विश्लेषण के उपयोग को सीमित कर सकता है ।

एक और सीमा परमाणु microprobe विश्लेषण के लिए सुविधाओं के लिए पहुंच है । असाइन किया गया बीम बार इसलिए कई बार सीमित हैं, और यह समय लेने वाले प्रयोग के इस तरह के लिए एक अतिरिक्त बाधा है । कई घंटे अक्सर एक अधिग्रहण के लिए आवश्यक हैं ।

इस तकनीक से अलग है अंय विश्लेषणात्मक तरीके, माइक्रोस्कोपी सहित, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), inductively युग्मित प्लाज्मा एमएस (आईसीपी-ms), तरल क्रोमैटोग्राफी ms (नियंत्रण रेखा-ms), और रेडियोधर्मी आइसोटोप । बाद वास्तव में रासायनिक तत्वों की सेलुलर खुराक का अनुमान है, लेकिन वे केवल एक नमूना के एक macroscopic राशि पर एक macroscopic पैमाने पर अर्थात् जानकारी प्रदान करने में सक्षम है इस्तेमाल कर रहे हैं । उनमें से कोई भी पहुंच दे सकते हैं, के रूप में परमाणु microprobe विश्लेषण करता है, एक सटीक पता लगाने और विशिष्ट रासायनिक तत्वों (आयनों, धातु या धातु ऑक्साइड एनपीए) की एक सेलुलर खुराक का मानचित्रण के लिए । इन आंकड़ों के लिए खुराक की एक और व्यवस्थित अध्ययन-प्रतिक्रिया मूल्यांकन तक पहुंचने में मदद ।

कोशिकाओं में एनपीएस के internalization का अध्ययन करते समय खुराक का सटीक आकलन दोनों मात्रात्मक NP विषविज्ञान और औषध विज्ञान के अंक देखने से महत्वपूर्ण है. के रूप में मनाया NP सामग्री है, जो ंयूनतम और अधिकतम स्वीकार्य सांद्रता (चित्रा 3) के बीच एक 10 गुना अंतर से पता चलता है में बड़ी विसंगति द्वारा सुझाव दिया, मतलब सेलुलर एकाग्रता एक प्रासंगिक पैरामीटर का वर्णन नहीं हो सकता है कण जोखिम की घटना । यह विशेष रूप से सच है जब एक सीमा प्रभाव को जगह ले क्योंकि सजातीय खुराक जोखिम विरोधाभासी टिप्पणियों के लिए नेतृत्व कर सकता है माना जाता है । नैनोकणों के fractionated प्रकृति सेलुलर स्तर पर स्पष्ट रूप से प्रकट होता है के बाद से, इस अध्ययन इसलिए फिर से उजागर कोशिकाओं के व्यवहार के आसपास के सवालों के समाधान में वैश्विक चर विश्लेषण के आधार पर तरीकों की प्रासंगिकता का सवाल बन गया संदूषणों की सजातीय खुराक ।

जैसा कि इस मामले में सचित्र यहां अध्ययन किया, व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर एनपीएस के प्रेक्षण और ठहराव हमें धातु ऑक्साइड एनपीएस जैसे अंतर्जात/exogenous तत्वों के संचय को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देते हैं । यह एक महत्वपूर्ण कार्य है एनपीएस के आगे के अनुप्रयोगों के लिए, जहां एक गरीब समझ कोशिकाओं में अंतर्निहित NP वितरण का गलत व्याख्यात्मक परिणाम हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल जैविक नमूनों के साथ एनपी बातचीत के भविष्य के आकलन के लिए अंय तकनीकों के साथ परमाणु microprobe विश्लेषण का उपयोग करने की उपयुक्तता पर प्रकाश डाला गया । मात्रात्मक दृष्टिकोण एक एकल कोशिका के स्तर पर पता लगाने, पहचान, स्थानीयकरण और ठहराव के संदर्भ में ऐसे एनपीएस के प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम निर्देशन और वीडियो के संपादन के लिए Serge सीमा का शुक्र है । फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी अनुसंधान कार्यक्रम टाइटेनियम का समर्थन करता है (ANR CES २०१०, एन ° CESA ००९ ०१) । CNRS और यूरोपीय समुदाय के एक एकीकृत गतिविधि के रूप में सार्वजनिक और औद्योगिक आयन बीम प्रौद्योगिकी (आत्मा) का उपयोग कर अनुसंधान के समर्थन "चुनाव आयोग अनुबंध n ° २२७०१२ के तहत प्रदान की । यह काम मैरी क्यूरी क्रियाएं द्वारा समर्थित किया गया है-प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क (ITN) के रूप में एक "एकीकृत गतिविधि उद्योग और प्रशिक्षण उत्कृष्टता में इंटर्नशिप के साथ स्नातकोत्तर अनुसंधान का समर्थन" (प्रेत, डी 1.3) ईसी अनुबंध no. ३१७१६९ के तहत । C'NANO ग्रांड सूद Ouest और क्षेत्र Aquitaine अनुसंधान कार्यक्रम TOX-नैनो (n ° 20111201003) और अनुसंधान कार्यक्रम POPRA (n ° 14006636-034) का समर्थन है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

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References

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<em>सीटू में</em> परमाणु Microprobe विश्लेषण का उपयोग करके मेटल ऑक्साइड नैनोकणों का पता लगाना और एकल सेल ठहराव
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Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

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