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Chemistry

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

我々 は元素存在体外数量化と同様に、人間の細胞を検出するための手順について説明します。メソッドは、任意のセル型に適してし、単一細胞の in vitro金属酸化物ナノ粒子曝露における定量的化学分析に特に役立ちます。

Abstract

化学元素イメージングに基づく微量分析の手法では、ローカリゼーションと細胞レベルで化学組成の定量を有効にします。彼らは生きているシステムの特性評価のための新しい可能性を提供、検出、ローカライズおよび金属酸化物ナノ粒子の生物的標本と環境の両方の存在を定量化に特に適して。確かに、これらの技術すべては (1 から 10 µg.g-1乾燥質量の最大) 感度 (i)、(ii) マイクロ メートルの範囲の空間分解能は、および (iii) 複数要素の抽出で関連する要件を満たします。これらの特徴を考えると、マイクロビーム化学元素イメージング力強く補完できるルーチンのイメージング技術など光と蛍光顕微鏡。このプロトコルでは、二酸化チタンのナノ粒子にさらされる培養細胞 (U2OS) の核マイクロ プローブ分析を実行する方法について説明します。細胞に成長する必要があり、光学顕微鏡で使用される特別に設計されたサンプル ホルダーに直接および核マイクロ プローブ分析段階で公開されます。思い切って凍結サンプルの低温固定細胞組織と元素分布の両方を保持します。同時核マイクロ プローブ分析 (走査型イオン顕微鏡、ラザフォード後方散乱分光法と粒子励起 x 線放射) サンプルに対して細胞密度のローカルの配布に関する情報を提供しますナノ粒子の細胞の内容と同様、化学要素。生物学、特に乗り越えるとをナノ粒子と生体試料間の相互作用の私達の理解を深める必要がありますナノメディシンの新興のコンテキスト内でこのような分析ツールの成長の必要性があります。特に、核マイクロ プローブ分析ナノ粒子ラベルを必要としない、ナノ粒子組成、表面の状態とは関係なく、細胞集団の個々 のセル レベルまで定量。

Introduction

生体のホメオスタシス、取り込みコントロール、同化、および別の微量元素 (外因性の無機化合物、金属イオン) の細胞内局在性によって決まります。これらのコンポーネントは、トレースの形では多くの場合がそれにもかかわらずシステム生理学に大きな影響を持つ可能性があります。したがって、正常と病理/強調した状況での細胞生化学的研究は、細胞の代謝機構の全体的な理解を目指してキー手順です。そのため、細胞内の化学的組成、構造とその関連代謝機能の調査を有効にするイメージング ・分析技術の開発が必要になります。非常にいくつかの方法がある特定のサンプルの全体的な化学的性質に関する情報の場で定量的な作品を提供することができます。別にバルク試料の分析の方法、その場で解析検討生体試料の整合性の質量や構造については、その成分の化学物質 (微量元素とイオン) は保持を失うことがなく、蛋白質。さらに、ナノサイエンスが発展するのにつれ、改良されたイメージングと細胞のスケールの環境モニタリングのための分析方法必要があります観察し、ナノ オブジェクトの動作との相互作用を定量化します。1

ナノ粒子 (NPs) は、範囲 1 から 100 nm の少なくとも 1 つの顔ディメンションを示すオブジェクトとして定義されています。2特定の物理化学的性質のため業界では広く NPs が使用します。NPs は、ナノメディシン、バイオ アプリケーションでを使用しています。3,4 NPs の多数の物理化学的特性、にもかかわらずに、彼らは人間の健康や環境に及ぼす悪影響のいくつかのリスクを生成可能性があります。これらのリスクを様々 な濃度で長期反復的な露出によって誘起すること、これがまだ確立されていない明確に。5,6,7,8特に、細胞と関連付けられている細胞の応答内の NPs の運命は、日付、完全には説明されています。これは検出を許可するメソッドの希少性と単一のセルに内面化された NPs の定量化のための一部です。9

ナノ粒子の細胞投与量が質量分析法 (MS) 系を推定する古典的な分析道具誘導結合プラズマ MS (ICP-MS)10,11と液体クロマトグラフィー MS (LC-MS)、しかし、彼らのみを提供マクロ スケールでの有用な情報。それらのどれもは、細胞内の NPs コンテンツも分別方法使用せず NPs 分布の正確な評価を提供できます。用量反応の体系的な評価は、こうして核マイクロ プローブ分析12,13, 放射光蛍光 x 線顕微鏡14 など原子の分光に基づく方法ではなく、これらのメソッドでは不可能です。と二次イオン質量分析 (SIMS)。15,16彼らは蛍光顕微鏡を用いて観察を補完するために、NPs 蛍光分子と分類することはできません、したがって、自然な状態で研究されている場合は特に、これらのメソッド、特に興味深いものです。ある程度としても、fluorophores が付いている NPs に接木される (i) 定量化は難しい NP あたりタグのレベルは知られている、(ii) NP 表面の化学修飾はその細胞の分布を変更可能性がありますので。

この記事では、形態と元素組成のメジャー、マイナー、生体試料のイメージングを目指して核プローブ技術の組み合わせに基づく方法に焦点を当てるし、濃度をトレースします。

核マイクロ プローブ分析特に生体内微量元素の測定に適していることを証明します。梁の横方向分解能 (1 に 0.3 μ m) と元素の検出感度 (10 µg.g 1 から-1乾燥質量) 細胞レベルでの研究に適しています。核プローブ技術は、放出後、サンプルで現在の原子と相互作用 (MeV エネルギー通常実行して) イオンビーム粒子検出 (光子、電子、イオン) に基づいています。細胞に生じる相互作用は、主に: 1) その基本的な状態に戻ってから原子光子の放出が続く原子の励起・ イオン化・ 2) 彼らのエネルギーおよび方向の変更につながる受信粒子の拡散。相互作用に関与する原子の放出粒子エネルギー簡便同定の測定。要素のマッピングを実行するには、イオン マイクロビーム繰り返しスキャンのサンプル表面上頻度が約 100 μ m2を含むいくつかの細胞で 100 部以上。生成された粒子が検出され、各ビームの位置に彼らのエネルギーが記録されます。粒子ビーム位置に従って並べ替え、データ処理の目的は、そのような粒子の排出を担当の構造を識別する方法します。ここで、正確に蛍光顕微鏡と検出し、生活と NP の相互作用の結果を調査するために細胞と細胞内のスケールで外因性の NPs を定量化する核マイクロ プローブ分析に基づくを説明します。システム。我々 は、細胞レベルで酸化チタン (TiO2 NPs) ナノ粒子集合体の場で数量の面でこのメソッドによって提供される機会に特に集中しなければなりません。

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Protocol

1. 試料ホルダー

  1. サンプル ホルダーの設計と準備
    1. 1 mm 厚のピーク フレームで 5 mm × 5 mm 正方形の掘削試料ホルダーを製造します。
    2. エタノール 70% (v/v) と洗浄によってきれいにしおいてください滅菌プレートを使用する準備ができるまで。
      小説細胞培養と細胞処理に適したサンプル ホルダーが必要です。それは細胞培養、体外観察光学顕微鏡と核マイクロ プローブ分析法とイメージングのために設計する必要があります。このホルダーは、ピーク フレーム13製です。
  2. 試料ホルダー
    1. クロロホルム 100 ml ホルムバール粉末の 1 mg を溶解してホルムバール ソリューションを準備します。
    2. 倍示すないように金属製のフレームにポリカーボネート箔をストレッチします。
    3. サンプル ホルダー穴の周りホルムバール ソリューションを広げるため滅菌チップを使用します。
    4. 伸ばされたポリカーボネート製箔 (5 mm × 5 mm の正方形) に接着剤と試料ホルダー繊細な下に置きます。
    5. 各複製の 1 つのサンプル ホルダーを準備する前の手順を繰り返します。
      小説ポリカーボネート (PC) フィルムは生体適合性、十分な厚さとさまざまなプロトコルおよび分析の制約に耐性です。
      注意- クロロホルムは有毒であります。吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。常に適切に機能している化学発煙のフードと適切なフィルターを使用します。
  3. サンプル ホルダー滅菌
    1. インキュベーター/攪拌機を使用して一晩、180 rpm、37 ° C で撹拌下でエタノール 70% (v/v) の 50 mL の三角フラスコにマウントされた試料ホルダーを配置します。
    2. 滅菌蒸留水に数回ホルダーをすすいでください。
    3. 空気は無菌状態で乾燥し、それぞれの側に 30 分の紫外光 (クラス II、バイオ セーフティ ベンチから殺菌ランプ) にそれらを公開します。
    4. 使用する準備ができるまで滅菌 12 ウェル プレート (ウェルあたり 1 つのサンプル ホルダー) のサンプルを保ちます。
      注:複数の試料ホルダーは、滅菌と乾燥 12 ウェルのプレートが数日間パラフィルムでシールに室温で保存できます。

2. 適切な試料ホルダーの細胞の成長。

注意:プロトコルは、バイオ セーフティ層流ベンチ (クラス II) 汚染微生物を除外するために遂行されなければなりません。手袋と抗生物質 (例えばペニシリン、ストレプトマイシン) を処理します。生物学的材料 (細胞、遺伝子組み換え由来ひと細胞) を処理するときのベスト プラクティスを尊重します。

重要:使用細胞をチェックマイコ プラズマの感染にしていないことを確認する必要が。

  1. プラスミド ベアリング メーカーによって確立されたプロトコルに基づきトランスフェクション法を使用してマトリックス roGFP 17,18,19 U2OS セルラインを transfect します。
  2. プラスミド実施にトランスフェクションを確認するバイオ センサーとプラスミドの損失を防ぐためを選択し、適切な培地の transfected セルを維持します。
  3. 蛍光顕微鏡、トランスフェクションが発生したことを確認し、蛍光性の発現と網状と管状のミトコンドリア ネットワーク19の表示を確認して transfected セルを視覚化します。
    ポイントを一時停止:細胞は、数年間液体窒素で凍結することができます。
  4. サブ コンフルエントの細胞集団を得るために、適切な培地で細胞を培養して transfected セル人口を使用します。37 ° c、5% (v/v) CO2飽和水雰囲気の中で細胞を成長します。
  5. 種細胞濃度は, などは 80% の合流点で、固定の日。通常、μ L あたり 500 セルの濃度を使用可能性があります。0.25% トリプシン-EDTA の 400 μ L を使用してセル (v/v) を収穫し、37 ° C で 3 分間保持培養液の 1 ml のトリプシン アクションを停止します。230 x g と +4 ° C で 5 分間遠心分離によって細胞のペレット、培養上清を削除し、新鮮な培養液中の目的のボリュームを追加します。
    注意してください。プロトコルは、すべての細胞のタイプの適用と播種された細胞の数は、セル サイズと細胞倍加時間依存。
    注意:トリプシン、抗生物質や血清を凍結融解の繰り返しに服従させることを避けます。それらは滅菌してください。因数に原液を分割し、− 20 ° c. でそれらを凍結有効期限日まで採取を格納します。慎重にトリプシンを完全に除去するために細胞ペレットをすすいでください。残留トリプシンの痕跡は遅延し、めっき効率を減らします。
  6. セルをカウントし、新鮮な完全培地 μ L あたり 500 細胞と細胞懸濁液を得るために 37 ° C で保管と希釈を実行します。
    注:細胞懸濁液の濃度は 40 μ L のドロップをメッキするために携帯型の関数としてアレンジしています。
  7. ポリカーボネート箔の中心ドロップ 40 μ L をプレートします。37 ° C で 2 時間、5% (v/v) CO2のサンプルが、飽和水雰囲気慎重にします。
    重要な:インキュベーターのサンプルを配置すると後は、制限可能な限り高速細胞付着を支持するすべての機械式ムーブメントです。セルの種類に応じてセル編んで効率を最適化する 2 時間以上インキュベートする必要ことです。チェック滴が蒸発するを防ぐために飽和インキュベーター大気はよくあること。
  8. 細胞がよく光学顕微鏡を用いたポリカーボネートの箔に接続されていることを確認します。軽く新鮮な完全培地 2 mL を追加し、24 時間を維持します。

3. ナノ粒子作製と露出

注: 蛍光色素修飾 TiO2 NPs された設計、合成、およびテトラメチル ローダミン イソチオ シアン酸 (TRITC) で化学修飾しました。20,21この表面改質によりナノ粒子検出、追跡およびローカリゼーションの in situおよびcellulo の生活と固定の両方のセルまたは多細胞生物。12,13,18

注意:ナノ材料、ナノ粒子は、慎重に取り扱う必要があります。吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。エアコンの普及を防ぐためには、ナノ粒子は、ソリューション (純水) に保持されます。

  1. 1 mg.mL− 1 TiO2純水 NPs の懸濁液を準備します。RT で強烈な 1 分の超音波パルスを用いた TiO2 NPs を分散 (750 W、20 kHz 振幅: 30%) 超音源と専用円錐型のプローブを使用して。
  2. 4 µg.cm− 2 (最終濃度) の露出の懸濁液を得るために TiO2 NPs 培養培地に必要な濃度を希釈します。媒体を置き換えますセルの中含む NPs の適切なボリューム、均一に分布 TiO2 NPs。 準備の TiO2 NPs の添加せず同様に制御の細胞を軽く混ぜます。
  3. 37 ° C、5% (v/v) CO2と飽和水雰囲気で 24 時間のセル人口を孵化させなさい。

4. パラホルムアルデヒド固定、蛍光顕微鏡検査。

  1. パラホルムアルデヒド溶液 (PFA、4 w/v) リン酸バッファー生理食塩水 (PBS、pH 7.4) にバッファーの新鮮なソリューションを準備します。
    1. 100 mL の PBS で PFA 粉末 4 g を溶解します。ヒューム フードの磁石と磁性攪拌器を使用して攪拌しながら 65 ° C への解決策を加熱します。ソリューションを消去するまで、一度に 1 メートル naoh 水溶液 1 滴を追加することによって pH を高めます。部屋の温度にソリューションを冷却し、pH 7.4 に調整。作りたてのソリューションを使用して、すぐに +4 ° C で維持や光から保護します。
      注:良質の固定と固定サンプルの長期保全を保証して PFA の場しのぎの準備しかし、既製の PFA ソリューションを使用できます。
      注意:PFA は有毒である;吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。常に適切に機能している化学発煙のフードと適切なフィルターを使用します。
  2. 一度、インキュベーション時間が経過、TiO2 NPs。 リンス新鮮な培養液を一度と PBS (2 mL) のセル人口を含む培養液を削除します。PBS を削除、新鮮で冷たい PFA (4 %w/v, +4 ° C) の因数ですぐに洗い流してください。
    1. PFA (2 mL、4 %w/v, +4 ° C) を追加します。室温で 15 分間インキュベートします。
    2. PFA を取り出し、攪拌下の PBS (2 mL、3 回、5 分) でセルをすすいでください。
      ポイントを一時停止:蛍光イメージング (ステップ 5 に進む) 後「プランジ凍結"プロシージャこれらサンプルを化学的に固定使用できますまたは蛍光イメージング (4.3 ステップに進む) にのみ使用します。
  3. ヘキスト33342アドロイに PBS で 10 分間で核を染色します。Hoescht33342が 500 の最終的な集中で使用される nM。孵化後ソリューションを削除し、PBS で洗い。
    注意:ヘキスト33342セル側の透過物であり有害である可能性があります。直接接触を避けるし、準備し、ヘキスト33342を使用しながら手袋を使用します。
    重要:染色液ヘキスト33342は新鮮な準備、無菌状態で維持されることを確認します。
  4. プロセスは、その場で蛍光顕微鏡 (図 1) を用いた単一細胞イメージングのためのサンプルを修正しました。

5「凍結」固定・脱水

  1. 転送、アルミの板を準備するには、液体窒素で冷却します。ストア ボックスにプレートで液体窒素を充填、低温窒素の蒸気で液体上プレート表面を維持します。
    注:転送プレート作ることができる任意の金属板 (ここでは、私たちは、アルミニウムを使用) は液体窒素の温度に冷却できるし、凍結乾燥試料室を入力します。
    重要な:ボックス保管すべき閉鎖可能な限り水蒸気コールド プレート表面沈着を防ぐために。液体窒素で、準備中にプレートに格納されているサンプルは扱いません。
  2. 細胞培養液中に一度すすいで、2 回より、簡潔に、得るために生殖不能および超純水水で取り除く任意の残りの細胞外塩のトレース。
    重要な:メディアが新鮮な調製し、無菌状態で維持されることを確認します。37 ° C ですべてのメディアを使用する前に加熱します。リンスは非常に短い (数秒) する必要があります、サンプル液の過剰はできるだけ早く削除されます。
  3. 思い切って凍結細胞-150 ° c で液体窒素冷蔵 2-methylbutane 30 s と場所の間にアルミの上にそれらはプレートを転送します。他のすべてのサンプルの準備の間にここでのサンプルを格納します。サンプルはすべて cryofixed である場合は、凍結乾燥機で転送プレートを配置することによって一度ですべてを転送します。
    重要な:全体的な cryofixation プロセス転送ボックスに一時的に格納されているサンプルに表示されるための構造変更を防ぐために 20 分以上続くこと。
  4. 次のシーケンスを使用してサンプルを凍結乾燥: 1) 12 を 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar)、低圧・低温の一次乾燥を実行し、2) にプレート温度の上昇、少なくとも 24 時間の二次乾燥段階を実行+ 40 ° C (+40 ° C, 10-3 mbar) 低圧を維持しながら。
    注意:液体窒素は非常に寒いと接触すると凍傷または目の深刻な被害を引き起こす可能性が。輸送のため適応ベンチ トップ コンテナーを使用し、(低温手袋、眼と顔の保護)、安全具を着用します。
    注意: 2 Methylbutane は非常に可燃性です。空気の有害な汚染は +20 ° C でこの物質の蒸発でより迅速にアクセスできます。吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。呼吸と目の保護と手袋を使用します。常に適切に機能している化学発煙のフードを使用します。+4 ° C で保存されている可能性があります。
    重要な:「プランジ凍結」のセッション中に 2 Methylbutane 温度を監視する適切な温度計 (-150 ° C) を使用します。2 methylbutane は、液相で冷やしておかなければなりません。周囲の雰囲気に cryofixed のサンプルを転送する温度上昇または水蒸気サンプル表面に結露しないことによる細胞の損傷があります。転送が行われるに応じて、合理的に可能な限り高速 (30 s)
    ポイントを一時停止:Cryofixation 後、サンプルは、(ほこりや湿気から保護) 滅菌と乾燥条件で数日間常温保存できます。慎重に微細鉗子での検体、パラフィルムでシール滅菌 12 ウェル プレートにそれらを置きます。乾燥剤を使用して、雰囲気を乾燥できます。

6. 核マイクロ プローブ分析法

注: 核マイクロ プローブ分析を行った補完イオン粒子励起 x 線放出 (μ - ビーム分析技術を使用して AIFIRA (アプリケーション Interdisciplinaires デ Faisceaux d'Ions アン アキテーヌ地方) のマイクロビーム ラインでPIXE) と走査イオン顕微鏡 (μ-スティミュラス)。施設は、MeV エネルギー領域の光ビームを提供する 3.5 MV 粒子加速器に基づいています。22,23

ポイントを一時停止:AIFIRA は提案する実験の科学的な評価の後国内および国際的チームへのアクセスを提供するボルドー大学主催イオン ビーム施設です。

  1. 両面テープを使用して形状のプレートでピーク試料ホルダーをマウントします。
  2. 梁の方向に垂直な鉛直面内におけるサンプルのサポート プレートを配置します。
  3. 分析室を閉じて、分析室を掃除します。
  4. 走査型イオン顕微鏡 (μ-スティミュラス)
    注: スティミュラスをエネルギー損失 (µg.cm-2で表現) サンプルの密度に比例するという事実を利用して細胞質量エネルギー損失の変換後細胞の密度マップを記録する使用は。
    1. 約 300 の焦点面でサイズのプローブとして使用する 2 MeV ヘリウム (He+) マイクロビーム nm 径と低流暢 (2000 ions.s-1)。平面シリコン検出器 (検出器ピップ、25 mm2、5.4 MeV @ 11 keV エネルギー分解能) で送信されたイオンのエネルギー測定ビーム軸のサンプルの後ろに配置されます。
  5. 粒子励起 x 線放射 (μ PIXE) とラザフォード後方散乱分光法 (μ-RBS)。
    注: μ pixe 法と μ RBS 分析提供空間分布とサブミクロン分解能を持つ化学要素の定量化。
    1. 4 から 8 時間のスティミュラスと約 100 × 100 μ m2によって発見興味の同じセルで直径 1 μ m のスキャンに焦点を当てた 1.5 MeV プロトン (H+) マイクロビーム (50-150 pA) を使用します。
    2. 着信ビーム軸から 45 ° で配置されている高解像度 Si(Li) 固体検出器 (145 eV のエネルギー分解能, @Mn-Kα) によって (Na より重い) サンプルで現在の原子から放出される誘導 x 線光子を収集します。要素の濃度を決定するのにエミッタ (例えば要素の Z) と x 線強度の性質を識別するのに検出された光子のエネルギーを使用します。
    3. シリコン検出器を用いた-135 ° 後方散乱陽子を同時に収集 (部分的に劣化検出器、25 mm2、11 keV 5.4 MeV @ 半値幅) 受信の粒子数を測定して x 線強度を正規化します。
      重要な:認定された校正標準原子濃度分布の定量化のためのコレクションは、x 線検出器を校正するために使用されます。参考資料は、6.3 μ m 厚いマイラー箔の原子薄膜のコレクションです。20.2 0.6 (Li、K ライン) からの x 線エネルギー範囲を出力 keV (Rh、K 線)。

7. データ解析

  1. ImageJの IBA J プラグインを使用して化学元素マップを再構築します。24
    注: raw 核マイクロ プローブ分析データを処理する ImageJ のプラグインの形で専用ソフトをしました。Raw データは、時系列としてビーム位置と共に記録されているセルと粒子の相互作用から発生するイベントのリストに対応します。
    1. IBA J プラグインを使用の種類に応じてイベントを並べ替える: 後方散乱イオンのエネルギー (RBS) または x 線の光子のエネルギー (PIXE)、イオン エネルギー (スティミュラス) を送信します。その後、個別に各種類のデータを処理します。
    2. スティミュラス エリアマップの密度を計算します。
    3. X 線光子エネルギー スペクトルの平均を計算し、要素の空間分布を取得するために目的エネルギー ウィンドウの各化学要素の定義します。
    4. 領域 (ROI) (例えば個々 のセル、密集した構造、集計など)を定義し、対応する x 線スペクトルを計算します。
  2. 入射粒子25の合計数を計算するために対応する RBS スペクトルを分析します。
  3. X 線スペクトルの各 ROI の元素濃度を決定するために Gupix ソフトウェア26を使用してフィットします。
    注: メソッドの検出 (LOD) の典型的な制限範囲 1 に 10 µg.g-1 (LOD は Z と小さくなります) 要素の原子番号によって乾燥質量では。

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Representative Results

細胞培養と蛍光に分類されたティオの蛍光イメージング2NPs

マルチ モーダル分析と同様、細胞培養、細胞処理に適したサンプル ホルダーを考案しました。具体的には、ホルダーがよく原子マイクロ プローブ分析法とイメージング ルーチンの光学顕微鏡検査を許可することが重要だった。このサンプル ホルダーは、ピーク フレーム上に堆積 2 μ m 厚のポリカーボネート製箔に基づいています。セルがポリカーボネート、数日間培養条件の上に直接成長させたし、NPs 露出など、さまざまな実験的設定の使用します。

(TRITC) fluorophores が付いている化学的表面改質は、生活またはパラホルムアルデヒド固定蛍光顕微鏡を用いた細胞の in situ体外局在と同様、TiO2 NPs の検出を許可しました。細胞核とミトコンドリア染色 (核の青) 重要な染料ヘキスト33342と transfected マトリックス-roGFP (ミトコンドリアの緑) をそれぞれ使用します。この複数の染色を許可 TRITC TiO2 NPs の細胞内の局在 (その赤色蛍光を発光) 20 h 暴露後。NPs のみ露出している細胞の細胞質核検出なしで発見されました。NPs はランダムに細胞の核周囲の地域にローカライズされ、ミトコンドリア (ない重複する TRITC と GFP の信号) から完全に除外。

蛍光顕微鏡は露出した細胞内の NPs をローカライズするのには非常に便利ですが、セルごとの NPs の正確な数を把握することはないです。NPs の定量化に関する蛍光顕微鏡の主な難しさは、(i) fluorophores 観察中に与えられた NP と選択した蛍光漂白安定性に接続の数についての不確実性にリンクされている、(ii)セル内の NPs の集約状態。

Figure 1
図 1:in vitro および in situ蛍光2NPs 。U2OS 細胞 (top) ヘキスト33342 (青)、マトリックス roGFP (緑) が付いて 4 µg.cm-2 TRITC ラベル TiO2ナノ粒子にさらされている (赤) 20 のための観察を示す、TiO2のセルに集計 NPs、核周囲の領域。スケール バー: 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

これらの欠点を克服するために核マイクロ プローブ分析 techniquesprovide 中間信号使用できないようにする、NPs に彼らの感度のための従来の光学顕微鏡に補完的なアプローチのように、接木から蛍光染料。さらに、完全に定量的なそれ以外の場合は不明です (i) のサブ細胞生化学的な内容および (ii) NPs 単一細胞レベルでの細胞内の量に関するデータを提供することがあります。

ライブ イメージング後の細胞 Cryofixation。

核マイクロ プローブ分析に最高の制約は、真空条件下で働くことです。生物学的微細構造の保全と生物試料の生化学的整合性を有効にするセル固定のプロトコルを開発しました。化学固定法は、細胞の微細構造を維持するために使用されるポリマーによってその細胞の培地の交換が必要ですので、セルの微量元素組成を変更する知られています。また、水の除去をまた解放無料イオンと全体を変更する他の種組成をサンプルします。したがって、物理的な固定法、特に極低温メソッドを優先する必須になります。極低温手順は、ミリ秒のタイム スケールで、この細胞の活動の迅速な停止を誘発します。

核マイクロ プローブ分析顕微鏡、細胞規模で NPs の定量化。

走査型イオン顕微鏡 (μ-スティミュラス) と粒子線励起 x 線発光 (μ PIXE) 分析が cryofixation とその化学組成に正確な定量的データを取得する脱水後のサンプルに行った。

Μ スティミュラス画像密度の地域の違いを明らかにした、核と細胞質のようなセル構造の検出が可能します。梁の横方向分解能により、高密度の観測構造 300 nm、幅などの狭い薄い集計表示ここで細胞質に、スティミュラス メソッドことはできません NP 集計およびその他の密な細胞の構造を区別します。これは、ような透過型電子顕微鏡 (TEM)、送信されたエネルギーの変化につながる物理的なプロセスは原子の電子雲と着信のイオンの相互作用。TEM 分析とは異なりただし、セル全体ボリュームを分析すると、ローカルの厚み変動できないため高 Z の構造と細胞密度の局所的増加と差別。

Figure 2
図 2: 密度と元素分布の画像を用いて μ スティミュラスと U2OS 細胞の低温固定 μ PIXE 。(アップ) U2OS 制御の細胞はクライオ固定 U2OS セル (下 4 µg.cm-2 TiO2 NPs に公開) の公開を比較し、核マイクロ プローブ分析/顕微鏡を用いて観察。(左、グレースケール地図) スティミュラス顕微鏡密な内または極細胞構造 (核、塩凝集体, ナノ粒子) を明らかにしました。空間分解能 (300 nm)、蛍光顕微鏡に匹敵して雄で NP 集合体などの構造を示しています。その密度のみに基づく構造物の同定を含まなくてもあいまいなこと。K, P および Ti (熱カラー スケール) の μ PIXE 元素マップ、μ スティミュラス マップを補足。彼らは、NPs では、細胞の存在を確実に使用できます。要素濃度の面で各セルを個別に分析できます (図 3参照)。バーをスケール: 10 μ m カラー スケールの最大強度 (グレー) 範囲最小値 (青) から。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

図 2に示すように、μ スティミュラス レンダリングは、人口両方と核小体核などの細胞内のサブ コンパートメント内にある個々 の細胞の認識をことができます。残念ながら、前述のように、として NPs 検出できませんでした常に μ スティミュラス再構成。

粒子励起 x 線発光 (μ PIXE) 分析は、サンプルだけでなく、彼らの元素マッピング (図 2) の化学組成だけではなくを提供します。エキサイティングなビームとのやり取り、化学要素は最終的に興奮要素の原子番号の特徴的なエネルギーを表わす光子の放出につながる原子の励起・ デ ・励起過程を経る。特徴的なピーク スペクトルは放出される光子のすべてのイベントの合計から構築され、サンプルの化学署名と見なされます。

標準的な実験のセットアップと μ PIXE 実験用検出器によりすべての要素の同時定量、1 に 10 µg.g− 1乾燥質量検出限界と Na よりも重い。元素濃度を測定における測定精度は通常料金のコレクションと検出器の効率のための 20% 程度に限られています。

本研究では核マイクロ プローブ分析による TiO2チタン マッピング NPs の細胞内の量を定量化してカリウムやリンなどの元素の分布が観察されます。元素マップは、光子は、記録と特定の要素を中心としたエネルギー ウィンドウの選択のタイミングでビームの位置に従って並べ替え後に計算されます。マップはビーム位置検出イベント数の代表、定量的です。ノイズと背景等を数値シミュレーションし、除外。さらに、化学のマッピングは、定量化に必要なローカルの PIXE スペクトルを抽出する使用できます。

リンが、期待どおりに、セルで配布されてゆく図 2に示すように、核の面積で濃度が高い。カリウムは、細胞容積均一分散されます。チタンは、集計、蛍光顕微鏡 (図 1) を使用して以前に観察の形で細胞質核領域にあります。NPs 表示同じ核の局在に表示されるどのような表面の状態: 機能 (図 1) またはネイティブ (図 2)。一方、μ PIXE によるチタン分布する必要があります TiO2 NPs、蛍光顕微鏡による私たちの以前の分析との契約に起因することを確認するコントロール細胞内微量チタンが検出されましたないです。

さらに、図 2に示すように、関心の特定の領域から NPs の細胞内分布と定量的 NPs の濃度を抽出することです。スティミュラス マップとリン ・ カリウム分布との相関関係に基づいて、単一細胞解析が可能です。

Figure 3
図 3: 単一細胞定量解析 μ pixe 法による降下します。個々 の x 線スペクトルを図 2に示すようにセルの計算は、細胞レベルで要素の濃度を決定するために取り付けることができます。この機能は NP 分析の特に興味深い細胞濃度は通常同じ人口の中の強い変化を示します。たとえば、同じ露出、1.8 µg.cm-2まで 0.2 から Ti 濃度範囲を意味します。コントロールは、未処理細胞集団に対応します。被曝線量: 4 µg.cm-2。ひげが中央値 (水平線) を個々 の細胞濃度の分布を表し、バーの最小値と最大に向かって拡張測定値。細胞を制御: N = 14。細胞を公開: N = 16。

したがって、持っているだけでなくチタン セル人口の平均含有を定量化、また特定の実験条件の 1 つ人口のセルあたりチタン分布を示します。ここで測定したチタンの中央のコンテンツはかなり (500 ng.cm-2) を細胞集団 (図 3) の 4 µg.cm-2被曝線量と比較して低いし、セル間の変動が大きい (Ti 濃度範囲 1.8 µg.cm まで 0.2 から-2解析細胞によると)。また、カリウムや TiO2 NPs、何人かの著者によって上記のようの存在による細胞変化の恒常性を示唆している露出のサンプル中のカルシウムなど細胞内のイオンの増加に気づいた。21,27

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Discussion

特に細胞内のレベルで、他のイメージング技術で何ができるを超えて有用な情報を提供する手法を提案します。そのイメージングの能力に加えて、核マイクロ プローブ分析法は、生体試料の組成に入る化学要素の定量化の可能性を提供しています。本研究ではひと細胞集団と TiO2 NPs にさらされる単一のセルに基づいて選択した領域の解析に焦点を当てて.他の技術との組み合わせは、元素の組成形態細胞イメージングと正確な定量的データの両方を提供します。

核マイクロ プローブ分析を正常に適用するには、潜在的な落とし穴を避けるために次の点を考慮するは必須です。まず、その微細構造とその生化学的整合性を保持するために低温セル固定のプロトコルを使用することが不可欠です。第二に、厚さ 20 μ m 以下の薄膜試料の分析を実行する必要はも。必要な場合は、cryofixed のサンプルの断面が実行でした。サンプルは、絶対に冷凍保管すべき。第三に、それも核マイクロ プローブ分析が生体試料の二次元表現を明らかにすることを念頭に重要です。したがって、得られた元素分布は誤解を招く可能性があることができる二次元の投影です。この制限は、断層の取得の使用によって将来的にバイパスされます。

核マイクロ プローブ分析法には制限もあります。その主な制約が真空下で解析を実行する必要があることを強調する必要があります。したがって、細胞の微細構造および生化学的な整合性を保持するセル固定のプロトコルを使用することが不可欠です。したがって、(化学樹脂添加) なし・ クライオの手順を試料の抵抗をテストする必要は。これは核マイクロ プローブ分析の使用を制限可能性があります。

別の制限は、核マイクロ プローブ分析の実施のための施設へのアクセシビリティです。割り当てられたビーム回が時々 限られているため、このような時間のかかる実験に対する制約を追加。いくつかの時間は多くの場合、1 つの取得のため必要。

この技術は顕微鏡、質量分析法 (MS), 誘導結合プラズマ質量 (ICP-MS) 液体クロマトグラフィー (LC-MS)、MS を含む他の分析法とは異なると放射性同位体。後者は確かに元素の細胞線量を推定する使用が、彼らのみ、巨視的に情報を提供することができるすなわち巨視的試料量のスケールします。それらのどれもとして核マイクロ プローブ分析は、正確な検出と特定の化学要素の細胞レベル下の線量のマッピングにアクセスを与えることができる (イオン、金属または金属酸化物 NPs)。これらのデータは、線量応答評価のさらなる体系的な研究へのアクセスを助けます。

NPs では、細胞の内部を勉強するときの線量の正確な推定は両方定量的 NP 毒物学および薬理学の観点から重要です。最小および最大濃度 (図 3) を観察の 10 倍の違いを表わす観測 NP 内容の大きな違いによって提案されるように記述する関連するパラメーターに細胞濃度の平均値ができない、粒子の暴露の現象。しきい値エフェクトは不均一被曝が矛盾した観察をさせることができますので、場所を取ることになっている、これは特に当てはまります。ナノ粒子の粒径別の性質は、細胞レベルで明確に表示されます、のでこの研究したがってポーズ再び細胞の動作周りアドレス指定質問内のグローバル変数を分析に基づく手法の妥当性の問題汚染物質の不均一な用量。

ここで学んだケースに示すように、観察と個々 の細胞内の NPs の定量化が NPs 金属酸化物などの内因性・外因性要素の蓄積を理解する私たちを許可します。これは生物医学の NPs のそれ以上の適用の重要なタスク、NP 細胞分布が基になる貧しい理解誤解な結果をもたらします。

このプロトコルは、核マイクロ プローブ分析他の技術を用いた NP 相互作用と生物学的標本の将来の評価のための適合性を強調表示します。定量的な手法は、検出、識別、ローカリゼーション、および 1 つの単一セルのレベルで定量化の面でこのような NPs の影響についての情報を提供します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

演出ビデオの編集、セルジュ ・ Borderes に感謝します。フランス国立研究機関は、研究プログラム チタン (ANR CES 2010 年、n ° CESA 009 01) をサポートしています。CNRS との統合活動として欧州共同体は、「サポートの公共および産業研究を使用してイオン ビーム技術 (精神)」EC 契約 n ° 227012 下を提供。この作品は、EC 契約第 317169 の下でマリー キュリー アクション -、「統合活動支援大学院研究とインターンシップで業界とトレーニングの卓越性」(スプライト、D1.3) として初期研修ネットワーク (ITN) によってサポートされています。C'NANO グランド シュッド ウエストと地域アキテーヌ研究プログラム TOX ナノ (n ° 20111201003) と研究プログラム POPRA (n ° 14006636 034) をサポートします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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<em>その場で</em>検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量
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Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

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