Summary
Se describe un procedimiento para la detección de elementos químicos presentes in situ en células humanas, así como su cuantificación en vitro . El método es adecuado para cualquier tipo de células y es particularmente útil para los análisis químicos cuantitativos en las células siguiendo en vitro exposición de nanopartículas de óxido de metal.
Abstract
Micro-analítico técnicas basadas en la proyección de imagen de elementos químicos permiten la localización y cuantificación de la composición química a nivel celular. Ofrecen nuevas posibilidades para la caracterización de los sistemas vivos y son especialmente apropiados para detectar, localizar y cuantificar la presencia de nanopartículas de óxido de metal tanto en muestras biológicas y el medio ambiente. De hecho, estas técnicas todas necesidades relevantes en términos de sensibilidad (i) (de 1 hasta 10 μg.g-1 de masa seca), (ii) micrómetro gama resolución espacial y elemento (iii) detección. Dadas estas características, la proyección de imagen de elemento químico microhaz puede poderosamente complementar rutina técnicas de imagen tales como óptica y microscopía de fluorescencia. Este protocolo describe cómo realizar un análisis de microsonda nuclear en células cultivadas (U2OS) expuestas a las nanopartículas de dióxido de titanio. Las células deben crecer y ser expuestas directamente en un soporte de muestra especialmente diseñada en el microscopio óptico y en las etapas de análisis de microsonda nuclear. Inmersión de congelación criogénica fijación de las muestras conserva la organización celular y la distribución de elementos químicos. Análisis de microsonda nuclear simultánea (microscopía transmisión de iones, espectrometría de retrodispersión de Rutherford y partículas inducidas por emisión de rayos x) en la muestra proporciona información sobre la densidad celular, la distribución local de los elementos químicos, así como el contenido celular de nanopartículas. Hay una necesidad creciente de tales herramientas analíticas en biología, especialmente en el contexto emergente de la Nanotoxicología y la nanomedicina para que nuestra comprensión de las interacciones entre las nanopartículas y las muestras biológicas debe ser profundizado. En particular, como análisis de microsonda nuclear no requieren de nanopartículas que se etiqueten, abundancia de nanopartículas es cuantificable hasta el nivel de células individuales en una población celular, independientemente de su estado superficial.
Introduction
Homeostasis celular está determinada por el control de la absorción, asimilación y localización intracelular de diferentes oligoelementos (iones, metales, compuestos inorgánicos exógenos). Estos componentes son frecuentemente en forma de huellas, pero sin embargo pueden tener un impacto considerable en la fisiología del sistema. Así, el estudio de la Bioquímica celular en situaciones normales y patológica, destacó es un paso clave hacia una comprensión global de los mecanismos metabólicos celulares. Por lo tanto, hace necesario el desarrollo de técnicas de proyección de imagen y analíticas que permiten la investigación de abundancias químicas intracelulares, organización estructural y sus funciones metabólicas relacionadas. Muy pocos métodos son capaces de proporcionar una pieza cuantitativa en situ de la información relativa a la naturaleza en general química de una muestra. Aparte de métodos de análisis de muestras en forma masiva, análisis en situ consideran muestras biológicas en su integralidad sin perder información masiva y estructural, conservando así sus constituyentes químicos (iones y elementos traza) y proteínas. Además, como las nanociencias continúan desarrollándose, la proyección de imagen mejorada y métodos analíticos para la vigilancia del medio ambiente a escala celular será necesarios observar y cuantificar las interacciones y los comportamientos de nano-objeto. 1
Nanopartículas (NPs) han sido definidas como objetos de exhibir al menos una dimensión facial en el rango 1 y 100 nm. 2 debido a sus propiedades fisicoquímicas particulares, NPs son ampliamente utilizados en la industria. NPs se emplean en aplicaciones de bio y en nanomedicina. 3 , 4 a pesar de las numerosas características físico-químicas del NPs, que pueden generar riesgos de efectos adversos sobre la salud humana y el medio ambiente. Estos riesgos pueden ser inducidos por la exposición prolongada y repetitiva en varios niveles de concentración y esto no todavía se ha establecido claramente. 5 , 6 , 7 , 8 en particular, el destino de NPs dentro de las células y las respuestas celulares asociadas son, hasta la fecha, no se describe. Esto es en parte debido a la escasez de métodos que permiten la detección y cuantificación de NPs interiorizados en una sola celda. 9
Las herramientas analíticas clásicas utilizadas para estimar la dosis celular de nanopartículas son Microscopias, espectrometría de masas (MS), acoplado inductivamente a plasma MS (ICP-MS)10,11 y cromatografía líquida de que MS (LC-MS), pero sólo proporcionan información útil en la escala macroscópica. Ninguno de ellos puede proporcionar una evaluación precisa de los contenidos subcelulares de NPs ni la distribución de NPs sin el uso de métodos de fraccionamiento. Una evaluación sistemática de la dosis-respuesta por lo tanto es imposible con estos métodos, en comparación con métodos basados en la espectroscopia atómica como la microsonda nuclear análisis12,13, microscopía de fluorescencia de rayos x de sincrotrón14 y Spectrometry total de Ion secundario (SIMS). 15 , 16 estos métodos son particularmente interesantes como complemento de observaciones mediante microscopía de fluorescencia, sobre todo cuando NPs no pueden ser etiquetados con moléculas fluorescentes y así se estudiaron en su estado nativo. Hasta cierto punto, incluso cuando los NPs son injertados con fluoróforos, i cuantificación sigue siendo difícil porque se desconoce el nivel marcado por NP y (ii) la modificación química de la superficie de la NP puede modificar su distribución celular.
En este artículo, nos centramos en un método basado en una combinación de técnicas de microsonda nuclear con el objetivo de la morfología y composición elemental de muestras biológicas en mayor, menor, la proyección de imagen y seguimiento de las concentraciones.
Análisis de microsonda nuclear resulta particularmente adecuado para la medición de elementos químicos en los tejidos biológicos. La resolución lateral del haz (0.3 a 1 μm) y la sensibilidad en la detección de elementos químicos (de 1 a 10 μg.g-1 masa en seco) son ideales para estudios a nivel celular. Microsonda nuclear técnicas se basan en la detección de partículas (fotones, electrones, iones) emitida después de la viga de ion (típicamente funcionando a energías de MeV) interactúa con los átomos presentes en la muestra. Las interacciones que ocurren en las células son principalmente: 1) excitación/ionización de átomos seguido por una emisión de fotones después de átomos vuelven a su estado fundamental; y 2) difusión de las partículas entrantes hacia el cambio en su energía y dirección. La medida de la identificación de permita de energía emite partículas de átomos involucrados en la interacción. Para realizar el mapeo de elementos, el ion microhaz es repetidamente analizado sobre la superficie de la muestra, a menudo sobre un área de cerca de 100 por 100 μm2 que contiene varias células. Se detectan las partículas emitidas y su energía se registra para cada posición de la viga. Clasificación de partículas según la posición de la viga, identificando así la estructura responsable de la emisión de dichas partículas es el objetivo del tratamiento de datos. Aquí, describimos precisamente un enfoque basado en la microscopía de fluorescencia y análisis de microsonda nuclear para detectar como para cuantificar NPs exógenas en las escalas celulares y subcelular, con el fin de investigar las consecuencias de las interacciones NP con vida sistemas. Enfocará particularmente en las oportunidades ofrecidas por este método en términos de cuantificación en situ de dióxido de titanio nanopartículas (TiO2 NPs) agregados a nivel subcelular.
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Protocol
1. sostenedor de la preparación
-
Preparación y diseño de muestra
- Fabricación de un sostenedor de la muestra por un cuadrado de 5 x 5 mm en un marco PEEK grueso de 1 milímetro de la perforación.
- Limpieza por lavado con etanol 70% (v/v) y mantener en placas estériles hasta que esté listo para usar.
Tenga en cuenta. Un sostenedor de la muestra apropiado para cultivo celular y manejo de celular se requiere. Debe diseñarse para cultivo, en vitro observaciones con microscopía óptica y análisis de microsonda nuclear y la proyección de imagen de la célula. Este soporte se hace de una ojeada marco13.
- Preparación de soporte para la muestra
- Preparar la solución de Formvar disolviendo 1 mg de Formvar en polvo en 100 mL de cloroformo.
- Estirar la lámina de policarbonato en un marco metálico que no presenta doblez.
- Utilice una punta estéril para distribuir la solución de Formvar alrededor del agujero del soporte de muestra.
- Colocar delicadamente el portamuestras con pegamento sobre la lámina de policarbonato estirado (un cuadrado de 5 x 5 mm).
- Repetir la secuencia anterior para preparar un sostenedor de la muestra para cada repetición.
Tenga en cuenta. La película de policarbonato (PC) es biocompatible, suficientemente gruesa y resistente a los diferentes protocolos y limitaciones analíticas.
PRECAUCIÓN- cloroformo es tóxico. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente y filtros adecuados.
- Esterilización de sostenedor de la muestra
- Coloque el portamuestras montado en un erlenmeyer con 50 mL de etanol 70% (v/v) con agitación a 180 rpm y + 37 ° C durante la noche, utilizando un incubadora/agitador.
- Enjuague el titular varias veces en agua destilada estéril.
- El aire seco en condiciones estériles y exponerlos a la luz ultravioleta (lámpara germicida de banco de seguridad biológica, clase II) por 30 min en cada lado.
- Mantener las muestras en placas de pocillos 12 estériles (poseedor de una muestra por pozo) hasta que esté listo para usar.
Nota: Varios titulares de la muestra pueden almacenarse a temperatura ambiente en estériles y secas placas 12-bien sellado con parafilm durante varios días.
2. crecimiento de las células en el portamuestras apropiado.
PRECAUCIÓN: Protocolo debe realizarse en un banco de flujo laminar de seguridad biológica (clase II) para excluir los microorganismos contaminantes. Manejar antibióticos (e.g. penicilina, estreptomicina) con guantes. Respetar las mejores prácticas al manipular material biológico (líneas celulares genéticamente modificadas derivan de las células humanas).
Crítico: las líneas celulares usadas deben controlarse para asegurar que no están infectados con micoplasma.
- Transfectar U2OS línea de células con el plásmido roGFP matriz 17,18,19 usando un método de transfección de acuerdo al protocolo establecido por el fabricante del cojinete.
- Para confirmar la transfección con el plásmido-llevar el biosensor y para evitar la pérdida del plásmido, seleccionar y mantener las células transfected en el medio de cultivo apropiado.
- Visualizar células transfected por microscopía de fluorescencia para que la transfección ha ocurrido y para confirmar la expresión de la fluorescencia y el despliegue de una red mitocondrial reticular y tubular19.
Pausa punto: Las células pueden ser congeladas en nitrógeno líquido durante varios años. - Utilizar la población de células transfected las células en un medio adecuado de cultivo para obtener poblaciones celulares los confluentes. Crecen las células a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en un ambiente saturado de agua.
- Semilla de las células en una concentración, tal como son en el 80% de confluencia el día de la fijación. Por lo general, se podría utilizar una concentración de 500 células por μl. Células con 400 μL de tripsina-EDTA 0.25% (v/v) de la cosecha y mantener durante 3 minutos a 37 ° C. Detener la acción de la tripsina con 1 mL de medio de cultivo. Sedimenten las células por centrifugación durante 5 min a 230 x g y + 4 ° C, luego retirar el sobrenadante y añadir el volumen deseado de medio de cultivo fresco.
Nota. El protocolo es aplicable para todo tipo de celular y el número de células sembradas depende del tamaño de celda y en el tiempo de duplicación de la célula.
PRECAUCIÓN: Evitar someter a tripsina, antibióticos y suero a ciclos de congelación y descongelación repetida. Mantenerlos estériles. Dividir la solución en alícuotas y congelarse a −20 ° C. Almacenar las alícuotas hasta la fecha de caducidad. Enjuague cuidadosamente el precipitado de células con el fin de eliminar completamente la tripsina. Vestigios de tripsina residual serán retrasar y disminuir la eficacia de la galjanoplastia. - Contar las células y realizar una dilución con medio completo fresco de la cultura mantenido a 37 ° C para obtener una suspensión con 500 células por μl.
Nota: La concentración de la suspensión de células tiene que ser adaptado en función del tipo de la célula, para una caída de 40 μl de la placa. - Una gota de 40 μL en el centro de la hoja del policarbonato de la placa. Coloque con cuidado la muestra por 2 h a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en un ambiente saturado de agua.
Crítica: Una vez que la muestra se coloca en la incubadora, limitar tanto como sea posible cualquier movimiento mecánico para favorecer la fijación rápida de la célula. Según el tipo celular, podría ser necesario incubar las células de más de 2 h para una óptima eficiencia de baño. Compruebe que la atmósfera de la incubadora está bien saturado para impedir la evaporación de gotas. - Compruebe que las células estén bien conectadas en la hoja de policarbonato utilizando un microscopio óptico. Añadir 2 mL de medio completo fresco y mantenga durante 24 h.
3. nanopartículas preparación y exposición
Nota: Fluorescente tinte modificado TiO2 NPs fueron diseñado, sintetizados y modificados químicamente con tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC). 20 , 21 esta modificación superficial permite la detección de nanopartículas, rastreo y localización en situ y en cellulo en células vivas y fijadas o en los organismos multicelulares. 12 , 13 , 18
PRECAUCIÓN: Nanomateriales y nanopartículas deben manipularse con cuidado. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Para evitar la difusión en el aire, las nanopartículas se mantienen en solución (agua ultrapura).
- Preparar una suspensión de 1 mg.mL−1 deTiO2 NPs en agua ultrapura. Dispersar el TiO2 NPs usando pulsos de intensa sonicación de 1 min a temperatura ambiente (750 W, 20 kHz, amplitud: 30%) utilizando un generador de ultrasonidos y un dedicado microprobe cónico.
- Diluir el TiO2 NPs en la concentración deseada en el medio de cultivo para obtener una suspensión de la exposición de 4 μg.cm−2 (concentración final). Reemplazar el medio con el volumen adecuado de medio conteniendo NPs en células y mezclar suavemente para una distribución homogénea de TiO2 NPs. preparar células control igualmente sin la adición de TiO2 NPs.
- Incubar las poblaciones celulares por 24 h a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 y una atmósfera saturada de agua.
4. paraformaldehido fijación y fluorescencia microscopía.
- Preparar una solución fresca de solución paraformaldehido (PFA 4% p/v) en tampón de fosfato salino (PBS, pH 7,4).
- Disolver 4 g de polvo de la PFA en 100 mL de PBS. Calentar la solución a 65 ° C removiendo con un imán y un agitador magnético en una campana de humos. Aumentar el pH mediante la adición de una gota de 1 M de NaOH en un momento hasta que se aclare la solución. Enfriar la solución a temperatura ambiente y ajustar el pH a 7.4. Utilizar la solución recién preparada de inmediato o mantener a + 4 ° C y proteger de la luz.
Nota: Soluciones prefabricadas de PFA se podrían utilizar sin embargo una preparación extemporánea de PFA garantiza mejor calidad de fijación y conservación a largo plazo de las muestras fijas.
PRECAUCIÓN: PFA es tóxica; evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente y filtros adecuados.
- Disolver 4 g de polvo de la PFA en 100 mL de PBS. Calentar la solución a 65 ° C removiendo con un imán y un agitador magnético en una campana de humos. Aumentar el pH mediante la adición de una gota de 1 M de NaOH en un momento hasta que se aclare la solución. Enfriar la solución a temperatura ambiente y ajustar el pH a 7.4. Utilizar la solución recién preparada de inmediato o mantener a + 4 ° C y proteger de la luz.
- Una vez transcurrido el tiempo de incubación, retirar el medio de cultivo celular que contiene el TiO2 NPs. Enjuague las poblaciones celulares una vez con medio de cultivo fresco y una vez con PBS (2 mL). Quite el PBS, enjuague rápidamente con una alícuota de la PFA fresca y fría (4% w/v, + 4 ° C).
- Añadir PFA (mL 2, 4% w/v, + 4 ° C). Incubar 15 min a temperatura ambiente.
- Quite la PFA, lavar las células con PBS (2 mL, 3 veces, 5 minutos) bajo agitación.
Pausa punto: Estos fijos químicamente muestras pueden utilizarse para el procedimiento de "penetración-freeze" después de la proyección de imagen (ir al paso 5) la fluorescencia o utilizado sólo para (ir al paso 4.3) la proyección de imagen de la fluorescencia.
- Tiñen el núcleo con Hoechst33342 incubando las células durante 10 minutos en PBS. Hoescht33342 se utiliza a una concentración final de 500 nM. Después de la incubación retirar la solución y lavar con PBS.
PRECAUCIÓN: Hoechst33342 es florescente de la célula y puede ser tóxico. Evitar el contacto directo y use guantes mientras preparando y utilizando Hoechst33342.
Crítico: que el Hoechst33342 solución de tinción es recién preparado y mantenido en condiciones estériles. - Proceso de fijado muestras para in situ y la proyección de imagen de célula mediante microscopía de fluorescencia (figura 1).
5 "deshidratación y fijación de"congelación de inmersión
- Preparar una placa de aluminio de transferencia por el enfriamiento de nitrógeno líquido. La placa en una caja llena de nitrógeno líquido y mantener la superficie de la placa sobre el líquido en el vapor del nitrógeno frío.
Nota: La placa de transferencia se puede hacer de cualquier placa metálica (aquí hemos utilizado aluminio) que puede ser enfriado a temperatura de nitrógeno líquido, y que puede entrar en la cámara de muestra congelar-secador.
Crítica: La caja debe mantenerse cerrada tanto como sea posible para evitar la deposición de vapor de agua sobre la superficie de la placa fría. La muestra almacenada en la placa durante la preparación no debe ser cubierta por nitrógeno líquido. - Enjuague las células una vez en medio de cultivo y luego dos veces más, brevemente, en agua ultrapuro estéril para conseguir deshacerse de cualquier rastro de las restantes sales extracelulares.
Crítica: Asegúrese de que los medios de comunicación están recién preparados y mantenidos en condiciones estériles. Todos los medios a 37 ° C de calor antes de ser utilizados. El enjuague debe ser muy breve (pocos segundos) y el exceso de líquido en las muestras quitado tan rápido como sea posible. - Inmersión de congelación de las células a-150 ° C en líquido nitrógeno frío 2-Metilbutano durante 30 s y el lugar de ellos sobre el aluminio transfieren placa. Almacenar las muestras aquí durante la preparación del resto de las muestras. Cuando las muestras son cryofixed todos, todos-de una vez mediante la colocación de la placa de transferencia en un secador de congelación de la transferencia.
Crítica: El proceso general de criofijación no debería durar más de 20 minutos con el fin de evitar modificaciones estructurales para aparecer en las muestras almacenadas temporalmente en la caja de transferencia. - Liofilización de las muestras utilizando las siguientes secuencias: 1) efectuar una desecación primaria por 12 a 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) a baja presión y baja temperatura, luego 2) realizar una fase de desecación secundaria durante al menos 24 h, aumentando la temperatura de la placa a + 40 ° C, manteniendo la presión baja (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
PRECAUCIÓN: Nitrógeno líquido extremadamente frío y puede producir daños graves de congelación o los ojos al contacto. Utilice recipientes superior Banco adaptado para el transporte y usar equipo de seguridad (protección facial y ocular, Guantes criogénicos).
PRECAUCIÓN: 2-Metilbutano es extremadamente inflamable. Una perjudicial contaminación del aire se puede llegar bastante rápidamente en la evaporación de esta sustancia a 20 ° C. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Uso de respiración y protección ocular y guantes de protección. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente. Puede ser almacenado a + 4 ° C.
Crítica: Utilice un termómetro apropiado (-150 ° C) para monitorear las temperaturas de 2-Metilbutano durante la sesión de "Congelamiento de penetración". El 2-Metilbutano debe mantenerse fresco en una fase líquida. Transferencia de muestras de cryofixed a la atmósfera ambiente puede causar daño celular debido al aumento de la temperatura o vapor de agua de condensación en la superficie de la muestra. En consecuencia, la transferencia debe hacerse tan rápidamente como sea razonablemente posible (30 s)
Pausa punto: Después de criofijación, las muestras pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios días en condiciones estériles y secas (protegidos contra polvo y humedad). Manejar las muestras con pinzas finas y colocarlas en una placa de 12 pozos estéril sellada con parafilm. Desecante se puede utilizar para secar el ambiente.
6. nuclear análisis de microsonda
Nota: Análisis de microsonda Nuclear se llevó a cabo en la línea de microhaz de AIFIRA (aplicaciones Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine) utilizando las técnicas analíticas de haz de iones complementarios emisión de rayos x inducida por partículas (μ- PIXE) y microscopía de transmisión de iones (μ-STIM). La instalación está basada en un acelerador de partículas de 3,5 MV entrega de haces de iones ligeros en la gama de energía del MeV. 22 , 23
Pausa punto: AIFIRA es una instalación de la viga de ion organizada por la Universidad de Bordeaux que ofrece un acceso a los equipos nacionales e internacionales después de la evaluación científica del experimento propuesto.
- Monte los portamuestras PEEK en una placa perforada usando cinta de doble cara.
- Coloque la placa de apoyo muestra en un plano vertical perpendicular a la dirección de la viga.
- Cierre el compartimiento de análisis y vacío de la cámara de análisis.
- Microscopía de transmisión de iones (μ-STIM)
Nota: STIM se utiliza para registrar los mapas de densidad de las células después de la conversión de la pérdida de energía a masa celular, aprovechando el hecho de que la pérdida de energía es proporcional a la densidad areal de la muestra (expresada en μg.cm-2).- Utilizar un microhaz de helio (él+) de 2 MeV como una sonda con un tamaño en el plano focal de alrededor de 300 nm de diámetro y baja fluidez (2000 ions.s-1). Medida de la energía de los transmisión iones con un detector de silicio planar (detector de puntos, 25 mm2, 11 keV energía resolución @ 5,4 MeV), colocado detrás de la muestra en el eje de la viga.
- Partículas inducidas por emisión de rayos x (μ-PIXE) y espectrometría de retrodispersión Rutherford (RBS-μ).
Nota: los análisis Pixe de μ y μ-RBS proporcionan la distribución espacial y cuantificación de elementos químicos con una resolución del secundario-micrómetro.- Utilice un microhaz de protón (H+) de 1,5 MeV (50-150 pA), centrado hasta un diámetro de 1 μm y análisis sobre las mismas células de interés identificados por STIM de 4 a 8 horas y alrededor de 100 x 100 μm2.
- Recoger inducidos fotones de rayos x emitidos de los átomos presentes en la muestra (más pesada que el Na) por un detector estado sólido de alta resolución Li (resolución de energía de 145 eV, @Mn-Kα) colocados a 45 ° del eje de la viga entrante. Utilizar la energía del fotón detectado para identificar la naturaleza de los emisores (por ejemplo, Z del elemento) y la intensidad de rayos x para determinar la concentración de elemento.
- Al mismo tiempo recoger los protones back-esparcidas a-135 ° con un detector de silicio (detector parcialmente depletado, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) para medir el número total de partículas entrantes y para normalizar las intensidades de rayos x.
Crítica: Una colección de estándares de calibración certificados para la cuantificación de la concentración atómica se utiliza para calibrar la respuesta del detector de rayos x. Materiales de referencia son una colección de películas delgadas de atomicas en 6,3 μm espesor láminas de Mylar. Emite la gama de energías de rayos x de 0.6 (Li, K line) a 20.2 keV (Rh, K line).
7. Análisis de datos
- Reconstrucción de mapas elementales químicos usando el plugin de IBA-J de ImageJ. 24
Nota: Software dedicado en forma de un plugin para ImageJ ha sido desarrollado para procesar datos de análisis de microsonda nuclear cruda. Datos corresponden a una lista de acontecimientos derivados de la interacción del haz de partículas con las células que se registran junto con la posición de la viga como una secuencia cronológica.- Usar el plugin J IBA a ordenar los eventos según su tipo: transmite energía del ion (STIM), dispersión energía del ion (RBS) o energía del fotón de rayos x (PIXE). Luego, procesar por separado cada tipo de datos.
- Calcular el mapa de densidad de área STIM
- Calcular promedio espectros de energía de fotones de rayos x y definir para cada elemento químico de interés una ventana de energía para recuperar la distribución espacial del elemento.
- Definir regiones de interés (ROI) (por ejemplo, las células individuales, estructura densa, agregados, etcetera) y calcular los correspondientes espectros de rayos x.
- Analizar los correspondientes espectros RBS para calcular el número total de partículas incidentes25.
- Ajuste de los espectros de rayos x utilizando los Gupix software26 para determinar la concentración de elemento para cada ROI.
Nota: Típico límite de detección (LOD) del método está en la gama 1 a 10 μg.g-1 masa seca según el número atómico de los elementos (LOD está disminuyendo con Z).
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Representative Results
Cultivo celular y proyección de imagen de fluorescencia de etiquetado fluorescente TiO 2 NPs
Hemos diseñado un sostenedor de la muestra para cultivo celular, manejo de celular así como análisis multimodal. Específicamente, es importante que el titular permitió microscopia óptica rutinaria como bien como nuclear proyección de imagen y análisis de microsonda. Este sostenedor de la muestra se basa en una lámina de policarbonato grueso 2-μm depositada en un marco PEEK. Las células son cultivadas directamente en policarbonato, en condiciones de cultivo estériles durante varios días y luego utilizadas para diferentes configuraciones experimentales, tales como exposición de NPs.
La modificación química de la superficie con fluoróforos (TRITC) permitió la detección de TiO2 NPs así como su localización en situ y en vitro en vida o en paraformaldehido fijada las células mediante microscopía de fluorescencia. El núcleo de la célula y las mitocondrias fueron teñidas con el colorante vital Hoechst33342 (azul para el núcleo) y la matriz-roGFP transfected (verde para las mitocondrias), respectivamente. Esta coloración múltiple permitió la localización intracelular del TRITC TiO2 NPs (por su rojo emitiendo fluorescencia) 20 h después de la exposición. NPs se encontraron sólo en el citoplasma de las células expuestas con la no detección en el núcleo. NPs fueron localizados al azar en la región perinuclear del citoplasma y totalmente excluidas de las mitocondrias (no hay solapamiento entre TRITC y GFP señales).
Aunque la microscopía de fluorescencia es muy útil para localizar NPs dentro de las células expuestas, no es capaz de evaluar el número exacto de NPs por la célula. La principal dificultad de la microscopia de fluorescencia con respecto a la cuantificación de NPs está vinculada a la incertidumbre acerca de (i) el número de fluoróforos conectados a un determinado NP y la estabilidad blanqueaba de fluoróforo solicitada durante la observación y (ii) la Estado de agregación del NPs dentro de la célula.
Figura 1 : in vitro e in situ fluorescencia de U20S células transgénicas expresando RoGFP matriz de la proyección de imagen y expuestos a TiO TRITC 2 NPs. Las células U2OS (superior) marcadas con Hoechst33342 (azul), matriz-roGFP (verde) se exponen a 4 μg.cm-2 marcado con TRITC TiO2 nanopartículas (rojo) para 20 h. observaciones indican que el TiO2 agregado de NPs en células en un región perinuclear. Barra de escala: 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para superar estas deficiencias, microsonda nuclear análisis techniquesprovide un enfoque complementario a la microscopía óptica convencional debido a su sensibilidad a lo NPs que evita el uso de cualquier señal intermedia como la fluorescencia de una injertada colorante. Además, también son completamente cuantitativas, proporcionando datos sobre (i) el contenido bioquímico celular que es de otra manera desconocido y (ii) la cantidad intracelular de NPs a nivel unicelular.
Criofijación de células después de la proyección de imagen vivo.
La mayor restricción en la realización de análisis de microsonda nuclear debe trabajar bajo condiciones de vacío. Hemos desarrollado un protocolo de fijación celular que permite la preservación de la ultraestructura de la biológica y la integridad bioquímica de la muestra biológica. La fijación química se sabe que modificar la composición del elemento de rastro de células porque requiere el reemplazo de su medio celular por un polímero utilizado para preservar la ultraestructura celular. Por otra parte, la extracción de agua también libera iones libres y otras especies, que el general se modifica composición de la muestra. Por lo tanto, se convierte en obligatorio para dar prioridad a un método de fijación física, en particular métodos criogénicos. Estos procedimientos criogénicos inducen un rápido cese de la actividad celular y, en la escala de tiempo de milisegundos.
Microscopia de microsonda nuclear análisis y cuantificación de NPs a escala celular.
Microscopía de transmisión de iones (μ-STIM) y análisis de rayos x inducida por partículas de la emisión (μ-PIXE) fueron realizados en las muestras después de criofijación y deshidratación para obtener datos cuantitativos precisos en su composición química elemental.
Imágenes de μ-STIM reveló las diferencias locales de densidad y permite la detección de estructuras celulares como el núcleo y el citoplasma. Aunque la resolución lateral del haz permite la observación de densas estructuras tan estrechos como 300 nm ancho, fino aquí agregados visibles en el citoplasma, los métodos STIM no pueden discriminar entre NP agregados y otras estructuras celulares densos. Esto es porque, como microscopía electrónica de transmisión (TEM), el proceso físico que conduce a la variación en la energía transmitida es la interacción de los iones entrantes con la nube de electrones atómicos. A diferencia de los análisis TEM sin embargo, porque se analiza el volumen de toda la célula, las variaciones locales de espesor impiden la discriminación entre estructuras de alta impedancia y un aumento local de densidad celular.
Figura 2 : Imágenes de la densidad y distribución elemental obtienen por STIM μ y μ-PIXE en cryo-fijos U2OS células. U2OS células del control (arriba) comparadas expuesto células U2OS cryo-fijos (expuestas a 4 μg.cm-2 TiO2 NPs, abajo) y observadas mediante análisis de microsonda nuclear/microscopía. Microscopia STIM (a la izquierda, mapas de escala de grises) reveló densidad intra o extra cellular estructuras (núcleo, sal agregados, nanopartículas). La resolución espacial (300 nm) es comparable a la microscopía de fluorescencia y muestra estructuras como agregados de NP en la región perinuclear. Identificación de estructuras basadas solamente en su densidad sin embargo puede ser ambigua. Los mapas elementales μ-PIXE de K, P y Ti (escala de color termal) son complementarios a mapas de μ-STIM. Pueden ser utilizados para asegurar la presencia de NPs en células. Cada célula puede ser analizada individualmente en términos de concentración de elemento (ver figura 3). Barras de escala: 10 μm. escalas de Color van desde mínimo (azul) a intensidad máxima (gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como se ilustra en la figura 2, la representación de μ-STIM permite el reconocimiento de células individuales dentro de una población y compartimientos intracelulares secundario como el nucleolo y el núcleo. Lamentablemente y como se ha mencionado anteriormente, NPs no siempre se podían detectar con reconstrucción de μ-STIM.
Análisis de la emisión (μ-PIXE) de rayos x inducida por partículas proporciona no sólo la composición química de la muestra, sino también su mapeo elemental (figura 2). Durante la interacción con el haz emocionante, los elementos químicos se someten a procesos de excitación-de-excitación atómicos que eventualmente conducen a la emisión de un fotón que exhibe la energía característica del número atómico del elemento excitado. Un espectro característico pico se construye de la suma de todos los eventos de fotones emitidos y se considera una firma química de la muestra.
Configuraciones experimentales estándar y detectores utilizados para experimentos de μ-PIXE permiten la cuantificación simultánea de todos los elementos más pesados que el Na con un límite de detección de masa seca de 1 a 10 μg.g−1 . Exactitud en la medición de concentraciones elementales se limita generalmente a alrededor del 20% debido a la eficiencia de colección y detector de carga.
En este estudio, se observa la distribución de elementos como potasio y fósforo y para cuantificar la cantidad intracelular de TiO2 NPs con la asignación de titanio por análisis de microsonda nuclear. Mapas de elemento químico se calculan después de que los fotones se clasifican según la posición de la viga en el momento de la grabación y la selección de una ventana de energía centrada alrededor de un elemento específico. Mapas son representante del número de eventos detectados en la posición de la viga y cuantitativos. Ruido y fondo numérico simulados y filtran. Además, mapeo químico puede utilizarse para extraer el espectro PIXE local necesario para la cuantificación.
Como se ilustra en la figura 2, fósforo se distribuye homogéneamente en la célula, como era de esperar, mucha mayor concentración en el área nuclear. Potasio se distribuye homogéneamente en el volumen de la célula. Titanio se encuentra en la región citoplasmática perinuclear en forma de agregados, como se observó mediante microscopía de fluorescencia (figura 1). NPs muestran la misma localización perinuclear cualquiera que sea su estado superficial: funcionalizados (figura 1) o nativo (figura 2). Mientras tanto, no hay rastro de titanio fue detectada en células de control confirma que la distribución de titanio observada por μ-PIXE debe atribuirse al TiO2 NPs, de acuerdo con nuestros anteriores análisis por microscopía de fluorescencia.
Además, como se ilustra en la figura 2, es posible extraer la distribución intracelular de NPs y las concentraciones de NPs cuantitativas de regiones específicas de interés. Basado en los mapas STIM y en correlación con la distribución de fósforo potasio, análisis de células individuales es posible.
Figura 3 : Análisis cuantitativo de unicelular mediante μ-PIXE. Los espectros de rayos x calculados para las celdas que se muestra en la figura 2 se pueden montar con el fin de determinar la concentración del elemento en el nivel celular. Esta característica es particularmente interesante para el análisis de NP donde concentraciones celulares generalmente muestran fuertes variaciones dentro de la misma población. Por ejemplo, la misma supone la exposición, la gama de concentraciones de Ti desde 0.2 hasta 1,8 μg.cm-2. Controles corresponden a poblaciones celulares no tratados. Dosis de exposición: 4 μg.cm-2. Boxplots representan la distribución de las concentraciones celulares individuales con valor mediano (línea horizontal) y bares que se extiende hacia el menor y mayor medición valores. Las células de control: N = 14; Expuestas las células: N = 16.
Por consiguiente, hemos no sólo cuantifica el contenido promedio de titanio en una población celular pero también se muestra la distribución de titanio por la célula en una población en una condición experimental específica. El contenido promedio de titanio mide aquí es bastante bajo (500 ng.cm-2) en comparación con la dosis de exposición de 4 μg.cm-2 de la población de la célula (figura 3) y la variación entre las células es grande (Ti concentraciones van desde 0.2 hasta 1,8 μg.cm -2 según las células analizadas). También notamos un incremento de iones intracelulares como el potasio y calcio en las muestras expuestas, sugiriendo una homeostasis celular alteración inducida por la presencia de TiO2 NPs, como la descrita por varios autores. 21 , 27
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Discussion
Se describe un método que proporciona información útil más allá de lo que es posible con otras técnicas de imagen, especialmente en el nivel subcelular. Además de su capacidad de proyección de imagen, análisis de microsonda nuclear también ofrece posibilidades de cuantificación de elementos químicos en la composición de una muestra biológica. En el presente trabajo, estudiamos las poblaciones de células humanas y enfocado hacia el análisis de una región solicitada de interés basándose en una sola celda expuesta a TiO2 NPs. Su combinación con otras técnicas ofrece la proyección de imagen morfológica celular y datos cuantitativos precisos sobre la composición química elemental.
Para aplicar con éxito análisis de microsonda nuclear, es obligatorio respetar los siguientes puntos para evitar peligros potenciales. En primer lugar, es imprescindible utilizar un protocolo criogénico para la fijación de la célula para mantener su integridad bioquímica y su ultraestructura. En segundo lugar, también es obligatorio realizar análisis de muestras delgadas con espesor por debajo de 20 μm. Si es necesario, podría realizar seccionamiento de muestras cryofixed. Las muestras absolutamente deben mantenerse congeladas. En tercer lugar, también es importante tener en cuenta que el análisis de microsonda nuclear revela una representación bidimensional de las muestras biológicas. Así, la distribución de elementos químicos obtenida es una proyección bidimensional que posiblemente podría introducir confusiones. Esta limitación se pasa por alto en el futuro por el uso de adquisición tomográfica.
Análisis de microsonda nuclear también tiene limitaciones. Debe destacarse que su principal limitación es la necesidad de realizar análisis bajo vacío. Por lo tanto, es imperativo utilizar protocolos de fijación celular que preserva la integridad bioquímica y la ultraestructura de las células. Por lo tanto es necesario probar la resistencia de las muestras biológicas para el procedimiento de la criogenia (sin la adición de resina química). Esto podría limitar el uso de análisis de microsonda nuclear.
Otra limitación es la accesibilidad a las instalaciones para llevar a cabo análisis de microsonda nuclear. Los tiempos asignados de la viga son por lo tanto a veces limitados, y esto es una restricción adicional para este tipo de experimento desperdiciador de tiempo. A menudo se necesitan varias horas para una adquisición.
Esta técnica difiere de otros métodos analíticos, incluyendo microscopia, plasma MS (ICP-MS), MS (LC - MS), la cromatografía líquida de espectrometría de masas (MS) acoplado inductivamente e isótopo radiactivo. Este último hecho se utiliza para estimar la dosis celular de elementos químicos pero sólo son capaces de proporcionar información en un macroscópico escala es decir, en una cantidad macroscópica de una muestra. Ninguno de ellos puede dar acceso, como análisis de microsonda nuclear, una detección precisa y mapeo de una dosis subcelular de determinados elementos químicos (iones, de metal o metal óxido NPs). Estos datos ayudan a acceder a un estudio más sistemático de evaluación dosis-respuesta.
La estimación precisa de la dosis en el estudio de la internalización de NPs en células es crucial desde ambos NP toxicología y Farmacología puntos de vista cuantitativos. Según lo sugerido por la gran discrepancia en el contenido de NP observado, que muestra una diferencia de 10 veces entre el mínimo y máximo observado de las concentraciones (figura 3), la concentración celular media podría no ser un parámetro relevante para describir la fenómeno de la exposición de partículas. Esto es particularmente cierto cuando un efecto de umbral se supone que ocurren porque la dosis no homogénea exposición podría llevar a observaciones contradictorias. Puesto que la naturaleza fraccionada de nanopartículas aparece claramente en el nivel celular, este estudio plantea, por tanto, otra vez la cuestión de la pertinencia de métodos basados en el análisis de las variables globales en abordar preguntas acerca del comportamiento de las células expuestas a dosis no homogéneas de los contaminantes.
Como se ilustra en el caso estudiado aquí, observación y cuantificación de NPs en células individuales nos permiten entender mejor la bioacumulación de elementos endógenos/exógenos como el óxido de metal NPs. Esta es una tarea crítica para otros usos de NPs en biomedicina, donde un pobre entendimiento del subyacente distribución NP en las células podría conducir a resultados malinterpretados.
Este protocolo pone de relieve la conveniencia de utilizar análisis de microsonda nuclear con otras técnicas para futuras evaluaciones de las interacciones NP con muestras biológicas. El enfoque cuantitativo proporciona información sobre el impacto de estos NPs en cuanto a la detección, identificación, localización y cuantificación del nivel de una sola célula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Serge Borderes para dirección y edición del vídeo. La Agencia Nacional de investigación francés apoya el programa de investigación TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). El CNRS y la Comunidad Europea como una actividad de integración proporcionan el "apoyo de público y Industrial investigación usando Ion viga tecnología (espíritu)" bajo la CE contrato n ° 227012. Este trabajo ha sido apoyado por acciones Marie Curie - redes de formación inicial (ITN) como una "integración actividad apoyo postgrado con prácticas en industria y formación excelencia en la investigación" (SPRITE, D1.3) bajo contrato CE nº 317169. C'NANO Grand Sud Ouest y la región Aquitania apoyan el programa de investigación TOX-NANO (n ° 20111201003) y el programa de investigación POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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