Summary
cartographie Quantitativement métaux dans les tissus par ablation laser - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (LA-ICP-MS) est une technique d'analyse sensible qui peut fournir un nouvel éclairage sur la façon dont les métaux participent aux processus fonctionnels et les maladies normales. Ici, nous décrivons un protocole pour l'imagerie quantitative des métaux dans des coupes minces de tissu neurologique de la souris.
Abstract
On trouve des métaux ubiquitaire dans tout l'organisme, leur rôle biologique dictée à la fois par leur réactivité chimique et de l'abondance dans une région anatomique spécifique. Dans le cerveau, les métaux ont une distribution très compartimenté, selon la fonction principale qu'ils jouent dans le système nerveux central. Imagerie de la distribution spatiale des métaux a fourni un aperçu unique dans l'architecture biochimique du cerveau, ce qui permet une corrélation directe entre les régions neuroanatomiques et leur fonction connue en ce qui concerne les processus métal-dépendantes. En outre, plusieurs affections neurologiques liées à l'âge FEATURE perturbé homéostasie des métaux, qui est souvent limitée à de petites régions du cerveau qui sont autrement difficiles à analyser. Ici, nous décrivons une méthode globale pour l'imagerie quantitative des métaux dans le cerveau de la souris, en utilisant l'ablation laser - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (LA-ICP-MS) et de traitement d'image spécialement conçulogiciel. En se concentrant sur le fer, le cuivre et le zinc, qui sont trois des métaux les plus abondants et les maladies pertinentes dans le cerveau, nous décrivons les étapes essentielles dans la préparation des échantillons, l'analyse, les mesures quantitatives et traitement de l'image pour produire des cartes de répartition du métal dans le bas micromètre gamme de résolution. Cette technique, applicable à toute section de tissu coupée, est capable de montrer la répartition des métaux très variable au sein d'un organe ou d'un système, et peut être utilisé pour identifier des changements dans l'homéostasie des métaux et des valeurs absolues à l'intérieur des structures anatomiques fines.
Introduction
La chimie redox unique de métaux facilite une gamme de fonctions neurologiques, y compris la transduction du signal, la production d'énergie et la synthèse des neurotransmetteurs. Dans un certain nombre de grandes maladies neurodégénératives, dyshomeostasis de ces métaux ont été à la fois impliqués dans la pathogenèse des maladies et identifiées comme de nouvelles cibles potentielles pour une intervention thérapeutique 1. Pour mieux comprendre comment les métaux sont impliqués dans des conditions telles que la maladie d'Alzheimer et de Parkinson (AD et PD, respectivement), il est impératif de pouvoir mesurer la distribution et les niveaux de métal changent dans les régions affectées par le processus de la maladie. Ces changements sont souvent révélateurs des changements subtils dans les réactions biochimiques qui peuvent être intimement liés aux processus qui déclenchent la mort cellulaire, comme notre mécanisme proposé récemment de fer et de la dopamine dans la neurotoxicité PD 2.
Traditionnellement, les métal les niveaux au sein des régions anatomiques définies a été réalisé grâce à l' excision soigneuse, la digestion et l' analyse en utilisant une gamme de techniques analytiques 3. Cependant, une telle approche perd l'information spatiale, qui peut être critique lorsque des états pathologiques à l'étude concernent les petites régions bien définies ou des types cellulaires spécifiques. Un certain nombre de méthodes analytiques sont disponibles pour la visualisation de métaux dans des systèmes biologiques, à partir d' échantillons intacts à des coupes de tissus et en deux et trois dimensions, en utilisant la spectroscopie d'émission, des sondes fluorescentes et spectrométrie de masse 4. Chaque technique a des avantages et des inconvénients en ce qui concerne la sensibilité, la sélectivité des espèces chimiques et de la résolution spatiale qui peut être atteint. Pour un aperçu complet de la gamme des techniques disponibles, voir la revue de Hare et al. 5.
La spectrométrie de masse (MS) à base de méthodes sont les plus sensibles de ces techniquesCapable de mesurer la plupart des métaux biologiquement pertinents à la concentration native 6. L'ablation laser - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (LA-ICP-MS) imagerie utilise un faisceau laser ultraviolet concentré taille allant de 1 à> 100 um de diamètre (ou largeur, quand une forme de faisceau quadrilatérale est utilisé), en vertu duquel le échantillon est passé 7. Des informations quantitatives peut être atteint grâce à l'ablation représentatifs des matériaux de référence standard, qui peut être produit en utilisant une variété d'approches différentes 8, chacune avec des degrés de difficulté technique et pratique analytique. L'approche la plus courante utilise une matrice correspondante, où une série d'une composition chimique prédominante comparable à celle de l'échantillon est préparé en ensemençant avec l'analyte cible et évaluées avec précision pour l' homogénéité et de la concentration absolue en métal par des moyens analytiques indépendants 9, 10. L'ablation des étalons préparés peuvent ensuite être utilisées à des fins d'étalonnage externe, permettant à des données de concentration de l'échantillon d'image résultante à extraire par pixel.
La résolution d'image est déterminée à la fois par la taille du faisceau et la vitesse à laquelle l'échantillon est analysé. Le quadripôle-conception standard ICP-MS (qui représentent plus de 90% de tous les systèmes installés ICP-MS à travers le monde 11) est un analyseur de masse séquentielle, en ce que les cycles de détection de masse à travers tout rapport sélectionné masse-charge (m / z ) plutôt que la collecte de données simultanément. Ainsi, le temps d'acquisition pour chaque cycle de la masse doit correspondre au temps nécessaire pour que l'échantillon traverse une largeur du faisceau du laser afin d' assurer un représentant des pixels de la résolution souhaitée est acquise 12. Laser sélection de la taille du faisceau est un paramètre crucial qui a des effets significatifs sur la sensibilité et le temps total d'analyse. Comme l'ablation au laser phyment enlève de la matière qui est balayé à l'ICP-MS par un gaz porteur d'argon, la quantité de matière qui peut être physiquement détecté par l'analyseur de masse suit la loi carrée inverse. Par exemple, en réduisant le diamètre du faisceau laser à partir de 50 - 25 um entraîne une réduction de la matière ayant subi une ablation par un facteur de quatre. En outre, en tant que méthode d'analyse, les diamètres des faisceaux plus petites augmentent la durée totale nécessaire pour réaliser l'ablation d'une zone sélectionnée. Par conséquent, la conception expérimentale est indispensable pour équilibrer la résolution spatiale nécessaire aux besoins de la sensibilité et des contraintes de temps.
Imagerie par LA-ICP-MS a été appliquée à une gamme d'échantillons, matrices et états pathologiques, y compris des modèles animaux de troubles neurologiques 13, 14, lésion cérébrale traumatique 15, la distribution de l' exposition toxique médicaments anticancéreux 16 contenant du métal dans le placenta 17 et métal distribution dans les dents comme un biomarqueur du début de la vie des transitions alimentaires. 18 Dans ce protocole , nous décrivons une méthode générale pour l' imagerie du fer, du cuivre et de zinc dans le cerveau de souris WT à une résolution de 30 um, mais il peut être facilement adapté à une gamme de types d'échantillons et les résultats expérimentaux, sur la base des besoins de la analyste.
Protocol
Les procédures décrites ici ont été approuvés par le Comité d'éthique animale Howard Florey et se conformer aux normes du Conseil de recherches médicales nationales de santé et de soins aux animaux.
1. Préparation de l'échantillon pour l'analyse
Remarque: cette étape varie en fonction de la matrice de l'échantillon à analyser.
- La préparation des échantillons et la coupe
REMARQUE: La fixation à l'aide de 4% de paraformaldehyde (PFA) et la cryoprotection dans du saccharose à 30% dans du PBS 0,1 M résultera en des quantités de lixiviation des métaux à partir de tissus variés. Voir Hare et al 19 pour plus de détails. Veiller à ce que tous les échantillons ont subi une fixation et Cryoprotection étapes identiques.- Transcardiaque perfuser l'animal euthanasié avec de la glace à froid 0,1 M PBS, pH 7,4 (voir la section Méthodes de Dodt et al. 20 pour plus de détails) et retirer le cerveau.
- Placez le cerveau dans 4% PFA O / N pour fixer le tissu. <li> Cryoprotect le cerveau en le plaçant dans 30% de saccharose dans 0,1 M PBS pendant 24 h, puis changer à nouveau 30% de saccharose pendant 24 h. 19
- Geler le cerveau dans un cryostat à -20 ° C pendant au moins 1 h.
- Monter le cerveau sur un mandrin en utilisant un support de montage approprié.
- Section du cerveau sur un cryostat en utilisant une lame jetable sans métal (par exemple, le polytétrafluoroéthylène [PTFE] revêtues de couteaux) et monter sur une lame de microscope standard. L'épaisseur optimale pour la section doit être d'environ 30 um.
REMARQUE: Les effets précis de la fixation à long terme et de la paraffine-plongement d'échantillons biologiques ne sont pas connus. Comme décrit dans le 1.1, assurer que tous les échantillons ont subi des procédures de préparation des échantillons identiques si l'analyse comparative est destiné.
- déparaffiner paDes échantillons de Raffin-intégré par trempage de la lame dans 3 de xylène, 1 changement chacun: 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol et un minimum de 3 changements dans la norme ISO 3696 ou de l'eau purifiée équivalente (ci-après, dénommé « l' eau »; voir Hare et al 21 pour une méthode détaillée)..
2. Préparation des étalons Matrix appariés
NOTE: Ce qui suit est un protocole résumée précédemment publié 9. S'il vous plaît consulter le document original pour les étapes détaillées pour la préparation de normes de tissus matrice appariés.
- Obtenir les cerveaux d'agneau commerciaux (ou similaire) et rincer à l'eau, enlever tout le sang et le tissu conjonctif.
- À l'aide d'un scalpel, disséquer soigneusement environ 50 g de tissu corticale et partiellement homogénéisent en utilisant un homogénéisateur de tissu portatif avec un polycarbonate sonde jetable à faible puissance. Diviser en 5 g aliquotes, avec le nombre en fonction de la gamme d'étalonnage et le nombre de points d'étalonnage souhaités.
- Préparer des solutions de métaux pour chaque pic étalon par dissolution d' un sel soluble de chaque analyte (par exemple, FeSO 4 · H 2 O) dans 1% d' acide nitrique pour produire 0,1, 1 et 100 mg par ml de métal -1 actions.
- Ajouter un volume pré-calculée de la solution mère à 5 g de tissu aliquote (par exemple, 5 pi de 10 mg mL -1 pour une concentration finale approximative de 10 pg g -1 tissu humide) pour atteindre une gamme de niveaux de métaux enrichis en chaque norme.
- En fonction de la concentration finale souhaitée de chaque standard, utilisez une combinaison de chaque solution métal, afin de vérifier la quantité minimale de solutions sont ajoutées à la norme. Ajouter un pic final de l'eau à chaque norme pour assurer equivolumes valents de liquide ajouté est présent dans chaque norme.
- Homogénéiser les normes dopés à faible puissance pendant environ 30 s. Si ne pas être utilisé immédiatement, garder congelé à -20 ° C dans des tubes en polypropylène coiffés scellées avec du Parafilm.
- Déterminer la concentration précise et l' homogénéité de chaque standard en utilisant l'une des procédures suivantes:
- Micro-ondes digestion
- Placer avec précision (6 pesaient environ 50 mg) par portions aliquotes d'un standard dans un récipient de digestion de PTFE lavé et ajoute 4 ml de concentré (65%) d'acide nitrique et 1 mL de 30% de peroxyde d'hydrogène. Sceller et digérer à 500 W pendant 30 min.
- Après refroidissement du récipient de digestion, ouverture dans une hotte et quantitativement la solution digérée à un tube lavé à l'acide 50 ml en utilisant 10 aliquotes ml d'eau. Faire environ 50 ml, et peser la masse de la solution finale.
- Répétez les étapes 2.5.1.1 - 2.5.1.2 pour chaque norme.
- Utilisez la procédure suivante si l'équipement micro-ondes de la digestion ne sont pas disponibles:
- Placez six mesurées avec précision (entre 25-200 mg) aliquotes de la norme dans le tube lavé à l'acide / sans métal polypropylène et lyophilize O / N.
- Ajouter 40 ul d'acide nitrique concentré et de la chaleur, non bridée sur un bloc chauffant à 70 ° C pendant 5 min, puis ajouter 10 ul de 30% de peroxyde d'hydrogène. Chauffer pendant encore 5 min, puis faire précisément à 1 ml de volume total en utilisant 950 pi d'acide nitrique à 1%.
NOTE: Il est conseillé de digérer un matériau de référence certifié selon la méthode de choix pour garantir des procédures de digestion sont exacts.
- Micro-ondes digestion
- Déterminer la concentration en métal dans chaque solution de digestion par une solution nébulisation ICP-MS en utilisant un protocole standard. Évaluer l'homogénéité de chaque norme en déterminant l'écart type relatif (% RSD) entre chaque aliquote. Assurer% RSD tombent tous à moins de 15%. Utilisation de la masse mesurée de each aliquote, calculer la concentration en métal précise de chaque norme de tissu homogénéisé.
- De retour à la norme de tissu homogénéisé, emballer un jetable moule histologie plastique 5 x 5 mm et geler en iso pentane refroidi dans de l' azote liquide. Retirez le bloc de tissu congelé norme du moule et de l' article sur un cryostat à la même épaisseur que l'échantillon.
Note: Il est conseillé de préparer un certain nombre de sections à des épaisseurs variables pour des expériences futures. les normes de l'air séché peuvent être stockés indéfiniment dans un récipient étanche à l'air et sans poussière.
3. Préparation de LA-ICP-MS pour l'analyse
- normes de place et de l'échantillon dans la chambre d'ablation, veillant à ce qu'ils sont dans la profondeur de champ de la caméra CCD monté sur l'unité LA. Si le réglage de l'instrument est nécessaire, inclure un matériau approprié de référence (par exemple, le NIST 612 oligo - éléments en verre). Serrez les deux vis sur la porte de la chambre pour sceller eChambre d'ablation e.
- Dans le logiciel ICP-MS, sélectionnez Ouvrir le robinet de gaz d'argon dans le «Maintenance» ou panneau similaire et régler le débit de gaz porteur à 1,2 L min -1 dans la boîte de dialogue appropriée.
REMARQUE: Dans ce protocole, l'argon est utilisé comme gaz porteur. Plusieurs exemples utilisent soit de l'hélium ou un mélange d'hélium et d'argon comme gaz porteur. Voir Günther et Heinrich 22 pour les détails techniques pour l' utilisation de l' hélium et d' argon mélanges comme gaz vecteurs d'aérosol. - Dans le logiciel LA, cliquez sur le bouton «de purge» pour rincer la cellule avec du gaz argon pour un minimum de 30 min.
REMARQUE: Le temps de purge peut être modifié en cliquant sur un «temps de purge» ou un bouton similaire. Lors de l'utilisation d'un système d'ablation avec une cellule d'ablation en deux volumes, de déplacer périodiquement la scène à chaque coin et traverser en diagonale de la cellule pour assurer que la quantité d'air résiduel est éliminé de la cellule que possible. Ceci peut être réalisé en sélectionnant les «étapes de la maison» ou équivfonction alent. - Allumez l'ICP-MS en cliquant sur «plasma» et laisser chauffer pendant deux heures, au cours de laquelle les étapes 3.5 à 4.4 peut être effectuée. Réglages de l' appareil varient selon les fabricants, mais un exemple de conditions de fonctionnement LA-ICP-MS appropriés peuvent être trouvés dans Hare et al. 10.
- ablation représentant des normes de tissus
- Sélectionnez l'outil de ligne et tracer une ligne unique de l'ablation d'environ 3 mm de long à travers la surface du tissu.
- Définissez les paramètres comme suit par un clic droit sur la ligne d'ablation dans la liste de l'expérience et en changeant le suivant: diamètre du faisceau (choisis selon le cas par l'utilisateur; un faisceau carré de 30 um est utilisé ici), la vitesse de balayage (4 fois le diamètre du faisceau par seconde; 120 um s -1) et fluence énergétique (0,3 -0.5 J cm -2 pour les tissus mous; optimiser si nécessaire pour des matrices plus difficiles). A 30 um d'épaisseur de tissu le faisceau laser ne pénètre pas l'thique complètekness de ce tissu, ce qui élimine tout contaminant potentiel du support de microscope. Normalisant au carbone 23 peut être utilisé pour corriger la variation de la quantité de tissu soumise à une ablation. Définissez ces paramètres par défaut pour chaque ligne suivante en sélectionnant le bouton radio «par défaut».
- Dupliquer cette ligne six fois en sélectionnant la ligne initiale, un clic droit et en sélectionnant «scans en double». Assurez - vous que les lignes sont décalées soit dans le x - ou axe y- par le diamètre du faisceau. Cela donne un total de sept lignes par la norme, espacées en fonction du diamètre du faisceau.
- Répétez les étapes 3.5.1 - 3.5.3 pour chaque norme, assurant la ligne de longueur identique.
- Pour dessiner la zone d'ablation sur l'échantillon, suivre l'une des deux méthodes suivantes:
REMARQUE: Assurez-vous les mêmes paramètres de numérisation (diamètre du faisceau, la vitesse de balayage, fluence d'énergie) sont utilisés pour les lignes d'échantillonnage.- Si le système LA est équipé d'ungrand champ de vue, sélectionnez l'outil de ligne et tracer une ligne à partir du coin supérieur gauche de l'échantillon assez long pour couvrir l'échantillon à son point le plus large en utilisant les mêmes paramètres du laser décrits dans 3.5. Dupliquer cette analyse comme indiqué dans 3.5.3 avec des lignes espacées suivant le diamètre du faisceau autant de fois que nécessaire pour assurer une couverture complète de l'échantillon.
- Si une vue à grand champ ne sont pas disponibles, de déterminer et d' enregistrer les coordonnées x et y (généralement indiqué sur l'écran principal comme «position de scène» ou similaire) correspondant aux coins d'un rectangle couvrant l'ensemble de l' échantillon. Utiliser ces coordonnées afin de positionner des lignes parallèles d'ablation couvrant toute la surface de l'échantillon comme décrit au point 3.7.1.
- Tracez des lignes pour le balayage intermittent des normes au plus tard après ~ 20 h de balayage de l'échantillon en répétant le processus décrit dans 3.5. En fonction de la durée de l'analyse de l'échantillon ceci peut être nécessaire plusieurs fois. Mettre fin à l'expérience avec un addiscan tional des normes.
NOTE: Pour déterminer les coordonnées x et y tandis que la cellule est en cours de purge, la sélection des positions d'origine et l'étalonnage associé de l'axe va changer précédemment acquis des détails pour les coordonnées x et y tandis que la différence (soit la longueur de la ligne) sera être affecté.
4. Configuration de données Méthodes d'acquisition pour l'ICP-MS
- Pour la ligne standard de l'ablation, diviser la longueur de la ligne par la vitesse de balayage laser pour déterminer le temps total d'analyse pour une seule ligne. Répétez cette opération pour la ligne d'échantillon.
- Dans le logiciel ICP-MS, créer une nouvelle méthode (représentée ici comme un «lot») et veiller à ce que «le temps d'analyse résolu» ou équivalent est sélectionné. Sélectionnez les valeurs m / z à détecter, puis régler le temps d'intégration pour chaque m / z de sorte que le temps total d'intégration pour un cycle est égal à 0,25 s. Cliquez sur "Enregistrer Batch As 'et le nom en conséquence (par exemple, STD1).
REMARQUE: L'échantillon va traverser le faisceau laser à quatre fois le diamètre du faisceau, ce qui assure un point pour chaque masse équivalente des données sont enregistrées au diamètre du faisceau 12. Par exemple, en utilisant une taille de 100 um spot, une vitesse de balayage de 400 um s -1 avec un temps d'intégration de 0,25 s produira des images avec de vrais tailles de pixels. Le temps d'intégration peut être ajustée pour améliorer la sensibilité; lorsque l'on augmente le temps d'intégration à la vitesse de balayage de 0,33 devrait être ralenti à trois fois le diamètre du faisceau. - Pour les normes, entrez le temps d'analyse pour chaque balayage de ligne dans la case appropriée, plus un supplément de 15 s pour tenir compte de laser d'échauffement et de temps de rinçage. Entrez une liste échantillon d'exécution (ie l'ordre dans lequel les analyses sont exécutées) avec le même nombre d'acquisitions (séquentiellement généralement numérotées, à savoir 001, 002, etc.), le nombre total de lignes standard.
- Pour l'échantillon, Dupliquer la méthode utilisée pour les normes en sauvant la méthode actuelle ou d'un lot avec un nom de fichier de remplacement, et d'ajuster le temps total d'acquisition (y compris les autres 15 s) et le nombre total des acquisitions pour correspondre au nombre de lignes qui ablater l'échantillon .
NOTE: Comme la plupart des systèmes LA-ICP-MS utilisent un déclencheur à sens unique (LA déclenche ICP-MS), il est essentiel que le logiciel ICP-MS est en attente de la gâchette de la Los Angeles avant la ligne suivante de l'ablation commence. La fenêtre d'acquisition ICP-MS va lire 'attente pour le démarrage ».
5. Exécution de l'expérience
- Démarrer la file d'attente ICP-MS en ajoutant la première méthode ou d'un lot à la file d'attente et vérifiez que le logiciel attend le déclenchement du système LA.
- Dans le logiciel LA, activez l'alimentation du laser en cliquant sur «émission», cliquez sur «run» et régler le temps de préchauffage du laser à 10 s et le temps de lavage 20 s dans les cases appropriées.
Remarque: Ce dépassement seraassurer l'ICP-MS est prêt à commencer à acquérir de nouvelles données lorsque le laser commence chaque ligne subséquente de l'ablation. - Démarrez la séquence laser en cliquant sur 'start'. Si l'on utilise une cellule à deux volumes, d'assurer la coupelle d'échantillon est en position.
6. Calcul des normes Quantification
NOTE: Il existe de multiples variations pour convertir les données ICP-MS en images. Ceux - ci comprennent l'utilisation d'outils logiciels faits maison écrits dans des langages open-source 17, 24, 25, 26 et macros commerciales données logiciel d'analyse. 7 Ici, utilisez le plugin récemment développé des logiciels (décrit dans Paul et al. 27), sur la base d' une spécialisée LA-ICP-MS analyse des données Suite 28.
- Transférez tous les dossiers de lots contenant les données d'exécution (de 001.d, 002.d, etc.) Sur unautre ordinateur avec le logiciel d'analyse installé. Extraire les fichiers de données * .csv pour chaque ligne du lot dans un dossier séparé.
NOTE: Utilisation d'un script pour transférer automatiquement les fichiers * .csv dans un nouveau dossier est fortement recommandé. Voir le code Python ci-joint pour plus de détails. Ce script a été écrit pour répondre soit une série ICP-MS Agilent 7700 ou 8800, mais peut être modifiée en fonction du fichier de sortie d'autres fabricants. - Ouvrez la plate-forme logicielle et suivez la séquence des onglets pour importer et d'analyser les normes pour produire des images quantitatives comme décrit ci-dessous.
- Pour importer les données du premier lot standard, sélectionnez 'Agilent .csv' pour 'Type de fichier', 'dossier entier »pour« type d'importation »et vérifier que le format' Date 'est identique au format de l'ordinateur. Cliquez sur "Importer", sélectionnez le dossier contenant les fichiers .csv-pour la première série de normes, et de passer à l'onglet 'Baselines'.
- Baselinesoustraction
- Utilisez l'onglet «Sélections automatiques» (commande 2) à partir du menu principal application déroulant dans la barre d'outils, sélectionnez «Informations importation» et cliquez sur «Continuer».
- Cliquez sur "Sélectionner tout" et sélectionnez "Baseline_1" pour l'intégration.
- Pour sélectionner les 10 premières secondes de chaque ligne de balayage (correspondant au laser temps de préchauffage), recadrer les données en entrant les valeurs deuxième '0' et '(durée de la ligne - 10 s)' et cliquez sur 'Ajouter intégrations' (par exemple , , pour une 35 de ligne de balayage, entrez 0 'et' 25 'valeurs).
- Pour sélectionner les données d'échantillon, utilisez l'onglet «Sélections automatiques» comme décrit dans 6.4, mais choisissez «Output_1» comme l'intégration. Les données de récolte depuis le début et à la fin de chaque ligne standard pour exclure le signal de fond (par exemple , pour une 35 de ligne de balayage, entrez les valeurs '13' et '4').
- Pour exclure des gouttes dans le signal provoqué par possitrous bles dans les normes, dans l'onglet «échantillons», cliquez sur «canaux» en haut à gauche de la zone graphique pour sélectionner un canal avec un signal élevé par rapport au bruit (par exemple, C13 ou P31). Notez une chute brutale du signal et sélectionnez une valeur CPS suffisamment faible qui est en dessous de la variation normale dans les échantillons, mais suffisamment élevé pour ramasser les fortes baisses du signal.
- Cliquez sur l'onglet «DRS» et sélectionnez «Baseline_Subtract» pour le «Données actuelles Reduction Scheme». Choisissez le canal de 6,6 pour 'Channel Index »et la valeur CPS pour' seuil à utiliser pour masquer les signaux faibles. Insérez une valeur <0,5 s pour 'secondes pour couper avant / après de faibles signaux »pour tenir compte du retard dans le transfert de signal du laser à l'ICP-MS.
- Pour confirmer le masquage adéquat des zones de faible signal, cliquez sur Retour à l'onglet «échantillons» et sélectionnez un canal trace traitée (par exemple., Fe56_CPS). Répéter et affiner la CPS et & #39; secondes pour couper avant / après les valeurs de faibles signaux comme dans 6,7 si nécessaire.
- Cliquez sur l'onglet "Résultats" et choisissez "Exporter les données" dans le menu principal application déroulant. Entrez un nom de fichier pour générer un fichier de données de feuille de calcul des résultats (par exemple, les calculs STD1, STD2 ...).
- Ouvrez le fichier de données dans un programme de feuille de calcul approprié et calculer les valeurs de la SCP pour chaque canal individuel pour être quantifiée. Les concentrations de métaux prédéterminés de la solution nébulisation ICP-MS pour calculer le facteur de conversion des valeurs CPS en ppm (pg g -1) pour chaque élément quantifiable.
- Répétez les étapes 06.03 à 06.10 pour tous les ensembles de normes dans la course.
7. Construire Images quantitatives
- Ecrire 'Biolite ()' dans l'invite de commande pour ouvrir le logiciel.
- Importer les données d'échantillon en cliquant sur "Charger les images" et sélectionner le dossier contenant les fichiers .csv-for l'image de l'échantillon.
- Correction de base
- Cliquez sur l'onglet 'Baselines de d'appliquer une correction de fond pour l'échantillon. Sur le phosphore (P31) l'image a incité à l'écran, sélectionnez les zones de l'arrière-plan à l'aide de l'outil rectangle de tirage. Sélection autant de régions que possible crée une carte d'image à l'échelle de la dérive / plasma de signal pour assurer une compensation adéquate de ces facteurs de confusion.
- Pour rendre le signal de fond plus visible, sélectionnez l'outil graphique d'édition (en haut à gauche de l'image affichée) et cliquez droit sur l'image. Sélectionnez 'Modifier Aspect de l' image »et changer la« première couleur à Z =' une grande valeur négative (par exemple , -100.000). Continuez en cliquant sur «Terminé».
- Cliquez sur l'onglet «Normes pour faire apparaître une table pour les facteurs de correction CPS / ppm. Entrez les valeurs calculées à partir des normes à l'étape 6.10 pour chacun des éléments. Cette étape permettra de corriger la dérive de sensibilité dans le ICP-MS. Cliquez sur 'Go! '
- Open 'Data Browser "de l'onglet" Données ", qui contient les images pour chaque élément et chaque étape.
- Pour finaliser une image pour l'exportation, sélectionnez l'image souhaitée dans le dossier 'StdCorrImages', cliquez droit sur le nom de l'image (* de _ppm) et cliquez sur 'NewImage'. Cliquez droit sur l'image pour ouvrir 'Modifier Aspect de l'image' pour choisir une échelle de table de couleur et de la couleur désirée. Ajouter une échelle de couleurs à l'image en cliquant droit sur l'image et en sélectionnant «Ajouter Annotation». Sélectionnez 'ColorScale' dans le menu déroulant en haut à gauche et utilisez les onglets pour modifier l'échelle de la couleur désirée.
- Pour exporter une image, assurez-vous que l'image en question est sélectionnée et accédez à l'onglet "Fichier" et cliquez sur "Enregistrer graphiques ...». Sélectionnez le format souhaité et enregistrer l'image. Sinon, l'image sélectionnée peut être transférée à l'aide des outils de copier et coller.
- Répétez les étapes 7.6 et 7.7 pour toutes les images d'intérêt.
- QUANTIFrégions discrètes ying
- Pour activer les outils de ROI, accédez à l'onglet 'Analyse de, «Packages» et sélectionnez «Traitement d'image».
- Sélectionnez l'image désirée et accédez à l'onglet 'Image' et cliquez sur 'ROI ...'. Cliquez sur "Démarrer ROI draw 'et utiliser un outil de dessin pour sélectionner une région d'intérêt dans l'échantillon. Pour terminer le dessin, cliquez sur "Terminer le retour sur investissement».
- Pour acquérir les statistiques de la ROI sélectionnée, accédez à l'onglet 'Image' et cliquez sur 'Statistiques ...'.
- Copiez et collez les résultats à une feuille de calcul distincte. sélection Repeat ROI (7.9.2) pour toutes les régions et les éléments d'intérêt.
Representative Results
Pour démontrer les capacités de cette approche d'imagerie LA-ICP-MS, une expérience simple utilisant une seule section d'un WT C57BL / 6 cerveau de souris, bissectrice au corps calleux et en coupe dans le plan coronal, est présenté. Un flux de travail pour l'analyse des données en utilisant Biolite (Figure 1), tel que décrit dans les sections 6 et 7, ainsi que pour fournir une image représentative de la distribution des métaux dans la section analysée (figure 2) est également décrit.
Comme on le voit, la distribution du métal dans le cerveau de souris est variable en fonction de la région anatomique. Cela peut être attribué aux rôles variables des métaux, et plus particulièrement les protéines auxquelles ils sont liés, jouent dans chaque région du cerveau 27. Par exemple, le fer a tendance à avoir des concentrations plus élevées dans le mésencéphale et le long du gyrus denté, tandis que le zinc est le plus abondant dans le cortizones cal. Carbon, qui est une norme interne utilisée 8, est réparti de façon homogène. Cartes élémentaires (figure 2) peuvent être particulièrement utiles lorsqu'ils sont utilisés en conjonction avec les atlas existants anatomiques et fonctionnels référence 29, où l' information sur la colocalisation des métaux peut l'expression des protéines de liaison de métal spécifiques peut fournir un aperçu de la fonction des métaux dans un cerveau région, ou des changements dans les niveaux de métaux en ligne avec une biomolécule liée à la maladie identifiée. En utilisant l'approche décrite, qui est optimisé pour une plus large gamme d'analytes, n'empêche la sensibilité des éléments de faible abondance tels que le manganèse, et les méthodes peuvent être adaptées pour se concentrer principalement sur cette substance en augmentant les temps de séjour aux dépens des autres masses mesurées.
L'avantage majeur dans l'utilisation de l'imagerie par LA-ICP-MS observe des différences relatives à concentr métalliqueation et la distribution entre les groupes expérimentaux. Nous avons déjà utilisé cette technique pour démontrer fer accrue suite à une insulte neurotoxine imitant PD 2, 10, et les changements dans les niveaux de fer corticales dans les tissus de la maladie d'Alzheimer humaine 21. Un tel protocole tel que décrit ici peut être facilement adapté à tout autre type de tissu avec des modifications minimales aux méthodes énumérées.
Figure 1: Flux de travail pour le traitement de l' image. Flux de travail complémentaire aux articles 6 et 7, représentant la conversion des données brutes temps résolus du ICP-MS à des images quantitatives de la distribution des métaux dans le cerveau de la souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 2: Distribution élémentaire typique de Biometals dans un cerveau de souris. élément cartes représentatives d'une section coronale 30 um d'épaisseur d'un seul hémisphère de cerveau de souris analysées avec LA-ICP-MS. Images pour le phosphore-31 (P31) du carbone 13 (C13), le magnésium-24 (MG24) et affichées dans les échelles d'or de couleur (comptes par seconde; CPS) (rangée du haut). Images quantitatives (rangée du bas) pour le manganèse-55 (Mn55), le cuivre-63 (Cu63), le fer-56 (FE56) et de zinc-66 (Zn66) affichés avec des échelles de couleurs BlueHot correspondantes (pg g -1). temps d'analyse totale pour la partie du cerveau a été d'environ 5 heures. Barre d'échelle = 2 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
métaux d'imagerie dans le tissu neurologique est juste un exemple de la façon dont ce protocole peut fournir des informations utiles sur la distribution et des quantités de métaux dans toute matrice biologique. Bien que la préparation de matériaux de référence standard peut être ardu, il est une expérience qui peut être effectuée une fois et archivée pour une utilisation ultérieure.
LA-ICP-MS présente certains avantages par rapport aux méthodes alternatives, telles que la fluorescence X microscopie à base de synchrotron, principalement en termes d'accessibilité et de la sensibilité. Cependant, il y a certains inconvénients qui doivent être pris en considération lors de la préparation d' une expérience en utilisant LA-ICP-MS, et en tant que tel , il est souvent une technique complémentaire utile pour l' imagerie chimique qui comprend des techniques d'analyse des métaux de remplacement, ainsi que histochimie comparative 5.
Alignement avec les caractéristiques connues anatomiques du cerveau de la souris peut fournir des informations utiles sur la relati fonctionnelle possiblepionnat entre les niveaux de métaux et de la distribution spatiale. Auparavant, nous avons utilisé la ressource en ligne Allen Brain Atlas, 29 qui est un référentiel d'accès ouvert à la fois des données d'expression anatomiques et génétiques dans le cerveau de souris C57BL / 6 pour examiner la corrélation spatiale de la fois l' expression de l' enzyme dépendante métal-14 et neuroanatomie 27, 30. D' autres ressources, telles que le WorkBench Rongeur cerveau 31 sont également disponibles pour aider à l' enregistrement et l' alignement des images métalliques pour faciliter l'identification correcte de la distribution des métaux dans souvent de petites régions anatomiques.
Les applications de cette technique sont utiles pour évaluer les niveaux comment métalliques et les changements de distribution à l' échelle microscopique à travers les deux événements de la vie normale (par exemple, le vieillissement) et dans les états pathologiques; ainsi que d'étudier les effets des deux composés et de médicaments contenant des métaux destinés à me ciblermétabolisme tal. Les principales limites actuelles de LA-ICP-MS comme technique d'imagerie permettant d'évaluer la distribution spatiale des métaux sont le débit et la sensibilité. Il y a un compromis entre la vitesse de l' analyse et la résolution spatiale 5, 12, avec des images de haute résolution nécessitant de plus longues durées d'analyse. La technique est bien adaptée à des éléments biologiques à des concentrations plus élevées, bien que des éléments tels que le manganèse, le cobalt et le sélénium sont limitées en raison de leur faible abondance dans les tissus et / ou des limites normales dans leur détection par des moyens classiques ICP-MS. De nouvelles avancées dans la technologie ICP-MS, tels que l'introduction d'analyseurs de masse triple quadripôle, permettent la détection ciblée des analytes difficiles, tels que le sélénium 32 à des sensibilités plus élevées 33. Comme une procédure axée sur la technologie, les progrès dans les deux laser et la conception de la spectrométrie de masse verra cette technique d'imagerie continuent d'évoluer, de plus en plusla vitesse d'analyse et de sensibilité 34.
Acknowledgments
DJH et PAD sont pris en charge par un projet Australian Research Council Linkage (LP120200081) avec Agilent Technologies et ESI Ltd. La contribution de BK a été soutenue par la recherche School PLUS Université de la Ruhr, financé par l'Initiative d'excellence de l'Allemagne [DFG CGC 98/3]. DJH a été partiellement soutenue par la Fondation Ramaciotti. KK est soutenu par la Fondation Sigrid Juselius.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
| PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
| Parafomaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
| Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5368 | Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
| Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
| Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
| Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
| Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
| Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
| 1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
| 65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
| 30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
| 10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
| Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
| NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
| Excel | Microsoft | n/a | |
| IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |
References
- Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
- Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
- Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
- New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
- Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
- Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
- Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912 (2005).
- Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
- Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
- Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53 (2009).
- Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690 (2008).
- Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159 (2012).
- Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
- Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
- Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
- Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
- Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
- Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
- Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
- Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
- Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
- Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
- Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
- Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
- Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
- Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
- Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
- Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4 (2007).
- Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
- Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
- Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).
