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उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा - - लेजर पृथक से मस्तिष्क के ऊतकों में इमेजिंग धातु मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला आईसीपी एमएस)

Published: January 22, 2017 doi: 10.3791/55042
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5,6, 7, 7, 8, 8, 2, 3, 1
1Elemental Bio-imaging Facility, University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne, 3Department of Pathology, The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences, The University of Melbourne, 5Research School, Ruhr University, 6Department of Physiology, Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

Summary

मात्रात्मक लेजर पृथक से ऊतक में धातुओं मानचित्रण - उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा - मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला आईसीपी एमएस) एक संवेदनशील विश्लेषणात्मक तकनीक है कि कैसे धातुओं सामान्य कार्य और रोग प्रक्रियाओं में भाग लेने में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यहाँ, हम मात्रात्मक माउस मस्तिष्क संबंधी ऊतक की पतली वर्गों में धातुओं इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।

Abstract

धातुओं उनके जैविक भूमिका एक विशिष्ट संरचनात्मक क्षेत्र के भीतर दोनों उनकी रासायनिक जेट और बहुतायत से तय साथ एक जीव भर में सर्वत्र पाए जाते हैं। मस्तिष्क के भीतर, धातु प्राथमिक समारोह में वे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर खेलने पर निर्भर करता है, एक बहुत ही बंटे वितरण किया है। धातुओं के स्थानिक वितरण इमेजिंग neuroanatomical क्षेत्रों और धातु निर्भर प्रक्रियाओं के संबंध में अपने निर्धारित समारोह के बीच सीधा संबंध की अनुमति के मस्तिष्क के जैव रासायनिक संरचना में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। इसके अलावा, कई उम्र से संबंधित मस्तिष्क संबंधी बीमारियों धातु homeostasis, जो अक्सर मस्तिष्क के छोटे क्षेत्रों है कि अन्यथा विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हो जाता है तक ही सीमित है बाधित सुविधा। यहाँ, हम मात्रात्मक माउस मस्तिष्क में धातुओं इमेजिंग के लिए एक व्यापक विधि का वर्णन है, लेजर पृथक का उपयोग कर - उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा - मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला आईसीपी एमएस) और विशेष रूप से डिजाइन छवि प्रसंस्करणसॉफ्टवेयर। लोहा, तांबा और जस्ता, जो मस्तिष्क के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में और रोग-प्रासंगिक धातुओं के तीन हैं पर केंद्रित है, हम नमूना तैयार करने, विश्लेषण, मात्रात्मक मापन और छवि प्रसंस्करण में आवश्यक कदम कम माइक्रोमीटर के भीतर धातु वितरण के नक्शे का उत्पादन करने का वर्णन संकल्प सीमा होती है। इस तकनीक को किसी भी कटौती ऊतक अनुभाग के लिए लागू, एक अंग या प्रणाली के भीतर धातुओं के अत्यधिक चर वितरण का प्रदर्शन करने में सक्षम है, और ठीक शारीरिक संरचनाओं के भीतर धातु homeostasis में परिवर्तन और पूर्ण स्तर की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

धातुओं की अनूठी redox रसायन शास्त्र संकेत पारगमन, ऊर्जा उत्पादन और न्यूरोट्रांसमीटर संश्लेषण सहित मस्तिष्क संबंधी कार्यों की एक श्रृंखला की सुविधा। प्रमुख neurodegenerative रोगों के एक नंबर में, इन धातुओं के dyshomeostasis दोनों रोग रोगजनन में फंसा और चिकित्सकीय हस्तक्षेप 1 के लिए संभावित ठिकानों उपन्यास के रूप में पहचान की गई है। बेहतर समझ कैसे धातुओं अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग (ई और पीडी, क्रमशः) के रूप में की स्थिति में शामिल कर रहे हैं, इसे मापने के लिए कैसे धातु वितरण और स्तर क्षेत्रों पर प्रतिकूल रोग की प्रक्रिया से प्रभावित भीतर बदलने में सक्षम होना आवश्यक है। इन परिवर्तनों को अक्सर जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं है कि परिचित प्रक्रियाओं है कि इस तरह के पीडी 2 में लोहा और डोपामाइन न्यूरोटॉक्सिटी की हमारी हाल ही में प्रस्तावित तंत्र के रूप में कोशिका मृत्यु आरंभ करने के लिए जोड़ा जा सकता है में सूक्ष्म परिवर्तन के संकेत हैं।

परंपरागत रूप से, मेटापरिभाषित संरचनात्मक क्षेत्रों के भीतर एल स्तरों विश्लेषणात्मक तकनीकों 3 की एक सीमा का उपयोग सावधान छांटना, पाचन और विश्लेषण के माध्यम से हासिल किया गया है। हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण स्थानिक जानकारी है, जो महत्वपूर्ण हो सकता है जब रोग राज्यों जांच की जा रही छोटे, अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्रों या विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को शामिल खो देता है। विश्लेषणात्मक तरीकों का एक नंबर बरकरार नमूनों से ऊतक वर्गों के लिए और दो और तीन आयामों में जैविक प्रणालियों में धातु, visualizing, उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी, फ्लोरोसेंट जांच और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 4 का उपयोग के लिए उपलब्ध हैं। प्रत्येक तकनीक संवेदनशीलता, रासायनिक प्रजातियों के चयनात्मकता, और स्थानिक संकल्प है कि प्राप्त किया जा सकता है के बारे में फायदे और नुकसान है। उपलब्ध तकनीकों की श्रृंखला की एक व्यापक अवलोकन के लिए, हरे एट अल द्वारा समीक्षा देखें। 5।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित तरीकों इन तकनीकों का सबसे संवेदनशील होते हैंउनके पैतृक एकाग्रता 6 में सबसे जैविक रूप से प्रासंगिक धातुओं को मापने में सक्षम है। लेजर पृथक - उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा - मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला आईसीपी एमएस) इमेजिंग एक केंद्रित पराबैंगनी लेज़र 1 से> व्यास में 100 माइक्रोन (या चौड़ाई, जब एक चतुर्भुज आकार बीम का इस्तेमाल किया जाता है) करने के लिए आकार में लेकर किरण, जिसके तहत कार्यरत नमूना 7 पारित कर दिया है। मात्रात्मक जानकारी मानक संदर्भ सामग्री का प्रतिनिधि पृथक है, जो अलग-अलग दृष्टिकोण 8, तकनीकी कठिनाई और विश्लेषणात्मक व्यावहारिकता की डिग्री बदलती के साथ प्रत्येक की एक किस्म का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता माध्यम से हासिल किया जा सकता है। सबसे आम तरीका है, मैट्रिक्स मिलान, जहां एक प्रमुख रासायनिक श्रृंगार के साथ एक मानक नमूना के बराबर लक्ष्य analyte साथ spiking द्वारा तैयार किया जाता है और इसे सही स्वतंत्र विश्लेषणात्मक साधन 9 से एकरूपता और निरपेक्ष धातु एकाग्रता के लिए मूल्यांकन का उपयोग करता है 10। तैयार मानकों के पृथक तो बाहरी अंशांकन उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, की अनुमति परिणामी नमूना छवि से एकाग्रता डेटा पिक्सेल प्रति निकाला जाता था।

छवि संकल्प दोनों किरण आकार और गति, जिस पर नमूना जांच होती है द्वारा निर्धारित किया जाता है। मानक quadrupole डिजाइन आईसीपी एमएस (जो दुनिया भर में सभी स्थापित आईसीपी एमएस सिस्टम 11 से 90% से अधिक के लिए खाते) सभी चयनित बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी अनुपात के माध्यम से है कि बड़े पैमाने डिटेक्टर चक्र में, एक अनुक्रमिक जन विश्लेषक है (मी / z ) के बजाय एक साथ डाटा एकत्रित की तुलना में। इस प्रकार, आम जनता के प्रत्येक चक्र के लिए अधिग्रहण के लिए समय समय लेजर बीम से एक चौड़ाई पार करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए वांछित संकल्प के एक पिक्सेल प्रतिनिधि 12 अधिग्रहण कर लिया है नमूना के लिए ले जाया करने के लिए समान होगा। लेजर बीम आकार चयन एक महत्वपूर्ण पैरामीटर दोनों संवेदनशीलता और कुल विश्लेषण समय पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। लेजर पृथक श्री बुश के रूप मेंबड़ी सफाई सामग्री है कि एक आर्गन गैस वाहक द्वारा आईसीपी एमएस करने के लिए बह रहा है, इस मामले की राशि है कि शारीरिक रूप से जन विश्लेषक से पता लगाया जा सकता है उलटा वर्ग कानून इस प्रकार हटा। चार में से एक पहलू से 25 माइक्रोन परिणाम ablated सामग्री की कमी में - उदाहरण के लिए, 50 से लेजर बीम व्यास को कम करने। इसके अतिरिक्त, एक स्कैनिंग पद्धति के रूप में, छोटे व्यास बीम कुल समय एक चयनित क्षेत्र काटकर अलग करने के लिए आवश्यक वृद्धि हुई है। इसलिए, प्रयोगात्मक डिजाइन संवेदनशीलता की जरूरत है और समय की कमी के साथ आवश्यक स्थानिक संकल्प संतुलन के लिए आवश्यक है।

ला-आईसीपी एमएस द्वारा इमेजिंग के नमूने, matrices और रोग राज्यों की एक श्रृंखला के लिए लागू किया गया है, मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 13, 14, घाव मस्तिष्क की चोट के 15, नाल में धातु युक्त विरोधी दवाओं 16, विषैला जोखिम के वितरण के पशु मॉडल सहित 17 और धातु distrप्रारंभिक जीवन आहार बदलाव की एक बायोमार्कर के रूप में दांत में ibution। 18 इस प्रोटोकॉल में हम, 30 माइक्रोन के एक प्रस्ताव पर गुम्मट माउस मस्तिष्क में इमेजिंग लोहा, तांबा और जस्ता के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन है, हालांकि यह आसानी से नमूना प्रकार और प्रयोगात्मक परिणामों की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है की जरूरतों पर आधारित विश्लेषक।

Protocol

इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रियाओं हावर्ड फ्लोरे पशु आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और जानवरों की देखभाल के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के मानकों का पालन किया गया है।

1. विश्लेषण के लिए नमूना की तैयारी

नोट: यह कदम नमूना मैट्रिक्स के आधार पर विश्लेषण किया जा बदलता रहता है।

  1. नमूना तैयार करने और सेक्शनिंग
    नोट: फिक्सेशन 0.1 एम पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) और 30% sucrose में cryoprotection का उपयोग ऊतक से धातुओं की लीचिंग की मात्रा बदलती में परिणाम होगा। विशेष जानकारी के लिए हरे एट अल 19 देखें। सभी नमूनों सुनिश्चित समान निर्धारण और cryoprotection कदम आया है।
    1. Transcardially ठंडा 0.1 एम पीबीएस, पीएच 7.4 के साथ euthanized पशु (Dodt एट अल। विवरण के लिए 20 तरीके में अनुभाग देखें) छिड़कना और मस्तिष्क को हटा दें।
    2. 4% पीएफए ​​हे / एन में मस्तिष्क की जगह ऊतक ठीक करने के लिए।
      3. <li> Cryoprotect 24 घंटे के लिए 0.1 एम पीबीएस में 30% sucrose में रखकर, और तब तक मस्तिष्क एक और 24 घंटे के लिए नए सिरे से 30% sucrose के लिए बदल जाते हैं। 19
    3. कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat में मस्तिष्क फ्रीज।
    4. एक चक एक उपयुक्त बढ़ते मध्यम प्रयोग पर मस्तिष्क माउंट।
    5. धारा एक cryostat एक धातु मुक्त डिस्पोजेबल ब्लेड का उपयोग करने पर मस्तिष्क (जैसे, polytetrafluoroethylene [PTFE] लिपटे चाकू) और एक मानक खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट। खंड के लिए इष्टतम मोटाई लगभग 30 माइक्रोन होना चाहिए।
  2. इच्छित मोटाई पर आयल एम्बेडेड नमूने, अनुभाग का उपयोग करते हैं, तो एक गर्म पानी से स्नान पर रिबन नाव और मानक खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट।
    नोट: लंबी अवधि के निर्धारण और जैविक नमूने का आयल एम्बेडिंग की सटीक प्रभाव नहीं जाना जाता है। 1.1 में वर्णित है, सुनिश्चित करें कि सभी नमूने समान नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं से गुजरा है यदि तुलनात्मक विश्लेषण करना है।
    1. dewax देहातxylene के 3 परिवर्तन, 1 परिवर्तन प्रत्येक में स्लाइड सूई से raffin एम्बेडेड नमूने: 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल और आईएसओ 3696 या समकक्ष शुद्ध पानी (इसके बाद में 3 परिवर्तन का एक न्यूनतम, के रूप में भेजा ' पानी ';। हरे एट अल 21 देखें एक विस्तृत विधि के लिए)।
  3. नमूने के लिए अनुमति दें हवा शुष्क इस तरह के और रैक में खड़ी रखा नमूनों के साथ एक स्लाइड बॉक्स ढक्कन अधखुला छोड़ दिया के रूप में एक धूल से मुक्त वातावरण में लगभग 1 घंटे के लिए।

2. मैट्रिक्स मिलान मानकों की तैयारी

नोट: निम्न एक संक्षेप प्रोटोकॉल पहले 9 प्रकाशित किया है। कृपया मैट्रिक्स मिलान ऊतक मानकों की तैयारी के लिए विस्तृत कदम के लिए मूल कागज से परामर्श करें।

  1. प्राप्त वाणिज्यिक भेड़ के बच्चे के दिमाग (या समान) और पानी में कुल्ला, सभी रक्त और संयोजी ऊतक को हटाने।
  2. एक छुरी का प्रयोग, ध्यान cortical Tissu के लगभग 50 ग्राम काटनाई और आंशिक रूप से कम बिजली पर एक पॉली कार्बोनेट डिस्पोजेबल जांच के साथ एक हाथ से आयोजित ऊतक homogenizer का उपयोग homogenize। नंबर अंशांकन रेंज और वांछित अंशांकन अंकों की संख्या पर निर्भर करता है के साथ 5 ग्राम aliquots में फूट डालो।
  3. प्रत्येक analyte की एक घुलनशील नमक (जैसे, FeSO 4 · एच 2 ओ) 1% में नाइट्रिक एसिड 0.1, 1 और 100 मिलीग्राम धातु मिलीलीटर -1 शेयरों का उत्पादन करने के लिए भंग द्वारा प्रत्येक मानक स्पाइक के लिए धातुओं के समाधान तैयार करें।
  4. में नुकीला धातु स्तर की एक सीमा प्राप्त करने के लिए (10 माइक्रोग्राम जी -1 गीले टिश्यू की एक अनुमानित अंतिम एकाग्रता के लिए जैसे, 5 से 10 मिलीग्राम की μL एमएल -1) 5 ग्राम aliquoted ऊतकों को शेयर समाधान के एक पूर्व गणना की मात्रा में जोड़ें प्रत्येक मानक।
    1. प्रत्येक मानक के वांछित अंतिम एकाग्रता पर निर्भर करता है, प्रत्येक धातु शेयर समाधान के संयोजन का उपयोग समाधान की न्यूनतम राशि के मानक को जोड़ रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए। पानी की एक अंतिम कील प्रत्येक मानक में जोड़े सम सुनिश्चित करने के लिएजोड़ा तरल के वैलेंट मात्रा में प्रत्येक मानक में मौजूद है।
    2. लगभग 30 एस के लिए कम बिजली पर नुकीला मानकों Homogenize। तुरंत इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं हैं, तो Parafilm के साथ बंद छाया हुआ polypropylene ट्यूबों में -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए रहते हैं।
  5. सटीक एकाग्रता और निम्न कार्यविधियों का उपयोग कर या तो प्रत्येक मानक की एकरूपता का निर्धारण करते हैं:
    1. माइक्रोवेव पाचन
      1. 6 सही तौल (लगभग 50 मिलीग्राम) एक मानक की aliquots एक धोया PTFE पाचन के बर्तन में रखें और केंद्रित की 4 एमएल (65%) नाइट्रिक एसिड और 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 1 एमएल जोड़ें। सील और 30 मिनट के लिए 500 डब्ल्यू पर पचाने।
      2. एक धूआं हुड में पाचन पोत, खुले ठंडा और मात्रात्मक के बाद पानी के 10 एमएल aliquots का उपयोग कर एक एसिड से धोया 50 मिलीलीटर ट्यूब पचा समाधान हस्तांतरण। लगभग 50 एमएल के लिए, और सही ढंग से अंतिम समाधान के लिए बड़े पैमाने पर तौलना।
      3. प्रत्येक मानक के लिए 2.5.1.2 - दोहराएँ कदम 2.5.1.1।
    2. निम्न प्रक्रिया का उपयोग करता है, तो माइक्रोवेव पाचन उपकरण उपलब्ध नहीं है:
      1. मानक की aliquots एसिड धोया / धातु मुक्त polypropylene ट्यूब और lyophilize हे / एन में - छह सही मापा (200 मिलीग्राम 25 के बीच) रखें।
      2. केंद्रित नाइट्रिक एसिड और गर्मी, अनकैप्ड के 40 μL 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के लिए एक हीटिंग ब्लॉक पर, जोड़ें, और फिर 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 10 μL जोड़ें। एक और 5 मिनट के लिए गर्मी, और फिर सही 1 एमएल कुल मात्रा 1% नाइट्रिक एसिड के 950 μL का उपयोग कर सकते हैं।
        नोट: यह चुनाव की विधि का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए पाचन प्रक्रियाओं सही कर रहे हैं एक प्रमाणित संदर्भ सामग्री को पचाने के लिए सलाह दी जाती है।
  6. समाधान nebulization आईसीपी एमएस द्वारा प्रत्येक पचाने समाधान के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करने में धातु एकाग्रता का निर्धारण। प्रत्येक विभाज्य के बीच सापेक्ष मानक विचलन (% आरएसडी) के निर्धारण से प्रत्येक मानक की एकरूपता का आकलन करें। % RSDS 15% के भीतर सभी गिर जाता है। ईए के मापा बड़े पैमाने पर उपयोग करनाचर्चा विभाज्य, प्रत्येक homogenized ऊतक मानक की सटीक धातु एकाग्रता की गणना।
  7. Homogenized ऊतक मानक के लिए रिटर्निंग, एक 5 एक्स 5 मिमी प्लास्टिक डिस्पोजेबल ऊतक विज्ञान ढालना पैक और आईएसओ -pentane में फ्रीज तरल नाइट्रोजन में ठंडा। नमूने के रूप में एक ही मोटाई में एक cryostat पर मोल्ड और इस खंड से जमे हुए मानक ऊतक ब्लॉक निकालें।
    नोट: यह भविष्य के प्रयोगों के लिए मोटाई अलग वर्गों के एक नंबर तैयार करने के लिए सलाह दी जाती है। हवा सूखे मानकों एक हवाई तंग और धूल से मुक्त कंटेनर में अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।

विश्लेषण के लिए ला-आईसीपी एमएस के 3. तैयारी

  1. प्लेस मानकों और पृथक कक्ष में नमूना, यह सुनिश्चित करना है कि वे ला इकाई के लिए फिट सीसीडी कैमरे के क्षेत्र की गहराई के भीतर हैं। तो साधन की ट्यूनिंग आवश्यक है, एक उपयुक्त संदर्भ सामग्री (जैसे, ग्लास में NIST 612 ट्रेस तत्वों) शामिल हैं। कक्ष के दरवाजे पर दो शिकंजा कसने उंगली वें सील करने के लिएई पृथक चैंबर।
  2. आईसीपी एमएस सॉफ्टवेयर में, 'रखरखाव' या इसी तरह के पैनल में खुला आर्गन गैस वाल्व का चयन करें और उचित संवाद बॉक्स में मिनट -1 1.2 एल के लिए वाहक गैस के प्रवाह की स्थापना की।
    नोट: इस प्रोटोकॉल आर्गन में वाहक गैस के रूप में प्रयोग किया जाता है। कई उदाहरण या तो हीलियम या एक वाहक गैस के रूप में हीलियम और आर्गन का एक मिश्रण का उपयोग करें। एयरोसोल वाहक गैसों के रूप में हीलियम और आर्गन के मिश्रण का उपयोग कर के लिए तकनीकी जानकारी के लिए गुंठर और हेनरिक 22 देखें।
  3. ला सॉफ्टवेयर में, 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए आर्गन गैस के साथ सेल फ्लश करने के लिए 'शुद्ध' बटन पर क्लिक करें।
    नोट: शुद्ध समय एक 'शुद्ध' समय या इसी तरह के बटन पर क्लिक करके बदला जा सकता है। जब एक दो मात्रा पृथक सेल के साथ एक पृथक प्रणाली का उपयोग करते हुए समय-समय पर प्रत्येक कोने करने के लिए मंच के लिए कदम और तिरछे सेल पार सुनिश्चित करने के लिए के रूप में ज्यादा अवशिष्ट हवा संभव के रूप में सेल से निकाल दिया जाता है। इस 'घर चरणों' या समतुल्य का चयन करके प्राप्त किया जा सकताalent समारोह।
  4. 'प्लाज्मा' पर क्लिक करके आईसीपी एमएस पर मुड़ें और दो ज, जिसके दौरान कदम 3.5 के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं - 4.4 से बाहर किया जा सकता है। साधन सेटिंग्स, निर्माताओं के बीच भिन्न हालांकि उचित ला आईसीपी एमएस परिचालन की स्थिति का एक उदाहरण हरे एट अल में पाया जा सकता है। 10।
  5. ऊतक मानकों के प्रतिनिधि पृथक
    1. लाइन उपकरण का चयन करें और ऊतक सतह भर में लगभग 3 मिमी लंबे पृथक की एक पंक्ति आकर्षित।
    2. (स्कैन गति 4 बार किरण व्यास, किरण व्यास (एक 30 माइक्रोन वर्ग किरण यहाँ प्रयोग किया जाता है उपयोगकर्ता द्वारा उचित रूप में चयनित): के रूप में प्रयोग सूची में पृथक की लाइन राइट क्लिक करके और निम्न बदलकर इस प्रकार मानकों सेट प्रति सेकंड, 120 माइक्रोन एस -1) और ऊर्जा प्रभाव (0.3 -0.5 जम्मू सेमी -2 नरम ऊतक के लिए; अनुकूलन यदि कठिन matrices के लिए आवश्यक)। 30 माइक्रोन मोटाई के ऊतकों में लेजर बीम पूर्ण thic घुसना नहीं करता हैइस ऊतक के kness, माइक्रोस्कोप समर्थन से किसी भी संभावित दूषित पदार्थों को नष्ट करने। कार्बन 23 के लिए सामान्य ऊतक की राशि ablated में बदलाव के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 'डिफ़ॉल्ट' रेडियो बटन का चयन करके प्रत्येक बाद लाइन के लिए डिफ़ॉल्ट के रूप में इन मानकों को निर्धारित करें।
    3. शुरुआती लाइन, राइट क्लिक चुनकर और 'नकली स्कैन' का चयन करके इस लाइन डुप्लिकेट छह बार। या y- अक्ष किरण व्यास द्वारा - सुनिश्चित करें कि लाइनों में या तो भरपाई कर रहे हैं एक्स बनाओ। इस मानक के अनुसार सात लाइनों की कुल देता है, किरण व्यास के अनुसार अलग स्थान दिया।
    4. दोहराएँ 3.5.1 कदम - 3.5.3 प्रत्येक मानक के लिए, समान लंबाई की लाइन को सुनिश्चित करने।
  6. नमूना भर पृथक क्षेत्र की ओर आकर्षित करने के लिए, दो निम्न तरीकों में से एक का पालन करें:
    नोट: एक ही स्कैन मानकों (किरण व्यास, स्कैन गति, ऊर्जा प्रभाव) सुनिश्चित नमूना लाइनों के लिए उपयोग किया जाता है।
    1. ला प्रणाली एक साथ सुसज्जित हैदेखने के व्यापक क्षेत्र, लाइन उपकरण का चयन करें और नमूना लंबे समय से अपनी व्यापक बिंदु पर नमूना 3.5 में उल्लिखित ही लेजर मापदंडों का उपयोग को कवर करने के लिए पर्याप्त के ऊपरी बाएं कोने से एक रेखा खींचना। के रूप में किरण व्यास के अनुसार स्थान दिया गया है लाइनों के साथ 3.5.3 में उल्लिखित के रूप में आवश्यक के रूप में कई बार नमूना की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए इस स्कैन डुप्लिकेट।
    2. एक व्यापक क्षेत्र दृश्य उपलब्ध नहीं है, तो यह निर्धारित करने और एक्स और वाई निर्देशांक रिकॉर्ड पूरे नमूना कवर एक आयत के कोनों के लिए इसी (आमतौर पर 'चरण की स्थिति' या इसी तरह के रूप में मुख्य स्क्रीन पर दिखाया गया है)। पृथक के समानांतर लाइनों 3.7.1 में वर्णित के रूप में पूरे नमूना क्षेत्र को कवर करने की स्थिति के लिए इन निर्देशांक का प्रयोग करें।
    3. के बाद हाल ही में मानकों का रुक-रुक कर स्कैनिंग के लिए लाइनों ड्रा ~ प्रक्रिया 3.5 में वर्णित दोहरा द्वारा नमूना स्कैनिंग के 20 h। नमूना यह कई बार आवश्यक हो सकता है की अवधि स्कैन पर निर्भर करता है। एक addi के साथ प्रयोग को समाप्तमानकों की राष्ट्रीय स्कैन।
      नोट: जब एक्स और वाई निर्देशांक का निर्धारण करते हुए सेल पर्ज किया जा रहा है, घर की स्थिति का चयन और अक्ष के जुड़े अंशांकन बदल जाएगा पहले एक्स के लिए विशेष और y निर्देशांक अंतर जबकि अधिग्रहण कर लिया (यानी लाइन की लंबाई) होगा अप्रभावित हो।

4. आईसीपी एमएस के लिए डाटा अधिग्रहण के तरीके की स्थापना

  1. पृथक के मानक लाइन के लिए, एक ही पंक्ति के लिए कुल विश्लेषण समय निर्धारित करने के लिए स्पीड लेजर स्कैन द्वारा लाइन की लंबाई विभाजित। नमूना लाइन के लिए इस दोहराएँ।
  2. आईसीपी एमएस सॉफ्टवेयर में, एक नई विधि (यहाँ एक 'बैच' के रूप में दिखाया गया है) बनाने के लिए और सुनिश्चित करें कि 'समय का संकल्प विश्लेषण' या समकक्ष चयन किया जाता है। चयन मी / z मूल्यों का पता लगाया जा सकता है, और उसके बाद तो एक चक्र के लिए कुल एकीकरण के समय के बराबर होती है 0.25 प्रत्येक मी / z के लिए एकीकरण के समय को समायोजित। क्लिक करें 'सहेजें चमगादड़चर्चा के रूप में 'और नाम के हिसाब से (जैसे, Std1)।
    नोट: के रूप में नमूना चार बार किरण व्यास पर लेजर बीम को पार करेगा, यह प्रत्येक जन के लिए एक डेटा बिंदु किरण व्यास 12 के बराबर दर्ज की गई है सुनिश्चित करता है। उदाहरण के लिए, एक 100 माइक्रोन स्थान आकार, 400 माइक्रोन की एक स्कैन गति -1 का उपयोग कर 0.25 एस के एक एकीकरण के समय के साथ सच पिक्सेल आकार के साथ छवियों का उत्पादन होगा। एकता समय संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए समायोजित किया जा सकता है; जब 0.33 गति स्कैन करने के एकीकरण के समय को बढ़ाने के लिए तीन बार किरण व्यास को धीमा किया जाना चाहिए।
  3. मानकों के लिए, उपयुक्त बॉक्स में प्रत्येक पंक्ति स्कैन के लिए विश्लेषण समय दर्ज, प्लस एक अतिरिक्त 15 लेजर वार्म अप और वार्शआउट बार के लिए खाते। एक नमूना रन सूची दर्ज अधिग्रहण की एक ही नंबर के साथ (जिस क्रम में स्कैन चलाए जा रहे हैं यानी) (आमतौर पर गिने क्रमिक रूप से, आदि यानी 001, 002,) मानक लाइनों की कुल संख्या के रूप में।
  4. नमूना के लिए, लाइनों है कि नमूना काटकर अलग करना होगा की संख्या मैच के लिए वर्तमान पद्धति या एक वैकल्पिक फ़ाइल नाम के साथ बैच बचाने के द्वारा मानकों के लिए इस्तेमाल किया विधि नकल, और (अतिरिक्त 15 सहित) की कुल अधिग्रहण समय और अधिग्रहण की कुल संख्या को समायोजित ।
    नोट: सबसे ला आईसीपी एमएस सिस्टम एक तरह से ट्रिगर (ला चलाता आईसीपी एमएस) का उपयोग करने के रूप में, यह जरूरी है कि आईसीपी एमएस सॉफ्टवेयर पृथक शुरू के बाद लाइन से पहले ला से ट्रिगर का इंतजार है। आईसीपी एमएस अधिग्रहण खिड़की 'शुरू करने के लिए इंतजार कर' पढ़ा होगा।

5. प्रयोग चल रहा है

  1. कतार में पहली विधि या बैच जोड़कर आईसीपी एमएस कतार शुरू करने और यह सुनिश्चित सॉफ्टवेयर ला सिस्टम से ट्रिगर का इंतजार है।
  2. ला सॉफ्टवेयर में, 'उत्सर्जन' पर क्लिक करके लेजर बिजली की आपूर्ति सक्षम 'रन' पर क्लिक करें और उचित बक्से में 20 एस के लिए 10 एस के लिए लेजर warmup समय और वार्शआउट समय निर्धारित किया है।
    नोट: यह उग आया होगासुनिश्चित जब लेजर पृथक के प्रत्येक बाद लाइन शुरू आईसीपी एमएस नए डेटा प्राप्त करने शुरू करने के लिए तैयार है।
  3. 'शुरू' पर क्लिक करके लेजर क्रम शुरू। एक दो मात्रा सेल का उपयोग करते हैं, तो यह सुनिश्चित नमूना कप की स्थिति में है।

6. Quantitation मानकों की गणना

नोट: छवियों में आईसीपी एमएस डेटा परिवर्तित करने के लिए कई बदलाव कर रहे हैं। ये घर में बने सॉफ्टवेयर खुला स्रोत भाषाओं 17, 24, 25, वाणिज्यिक मैक्रो को 26 और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लिखा उपकरणों का उपयोग शामिल है। 7 इधर, हाल ही में विकसित सॉफ्टवेयर प्लगइन (पॉल एट अल। 27 में वर्णित), एक विशेष ला आईसीपी एमएस डेटा विश्लेषण सुइट 28 के आधार पर उपयोग करें।

  1. एक करने पर सभी बैच चलाने डेटा (001.d, 002.d, आदि।) युक्त फ़ोल्डरों स्थानांतरणस्थापित विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ अलग से कंप्यूटर। एक अलग फ़ोल्डर में बैच की प्रत्येक पंक्ति के लिए * .csv डेटा फ़ाइलों को निकालें।
    नोट: स्वचालित रूप से एक नया फ़ोल्डर में स्थानांतरित करने के लिए * .csv फ़ाइलें एक स्क्रिप्ट का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है। अधिक जानकारी के लिए संलग्न अजगर कोड देखें। यह स्क्रिप्ट सूट करने के लिए या तो एक Agilent 7700 या 8800 श्रृंखला आईसीपी एमएस में लिखा गया है, लेकिन अन्य निर्माताओं से आउटपुट फ़ाइल सूट करने के लिए संपादित किया जा सकता है।
  2. सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म खोलें और आयात और मानकों का विश्लेषण के रूप में नीचे वर्णित मात्रात्मक छवियों का उत्पादन करने के लिए टैब क्रमिक रूप से पालन करें।
  3. पहले बैच मानक से डेटा आयात करने के लिए, 'आयात प्रकार' के लिए चयन के लिए 'फ़ाइल प्रकार' 'Agilent .csv', 'संपूर्ण फ़ोल्डर' और जाँच करें कि 'तिथि प्रारूप' कंप्यूटर प्रारूप के साथ समान है। 'आयात' पर क्लिक करें मानकों के पहले सेट के लिए .csv फ़ाइलें वाले फ़ोल्डर का चयन करें, और 'आधार रेखा' टैब के लिए कदम।
  4. आधारभूतघटाव
    1. उपकरण पट्टी में मुख्य आवेदन लटकती मेनू से 'स्वत: चयन' टैब (कमांड 2) का प्रयोग करें, 'आयात की जानकारी' का चयन करें और 'जारी रखें' पर क्लिक करें।
    2. 'सभी चुनें' और एकीकरण के लिए 'Baseline_1' का चयन करें क्लिक करें।
    3. प्रत्येक पंक्ति स्कैन (लेजर वार्म अप समय के लिए इसी) के पहले 10 एस का चयन करने के लिए, दूसरी मूल्यों '0' और दर्ज करके डेटा फसल '(लाइन की अवधि - 10 s)' 'एकीकरण जोड़ें' पर क्लिक करें और (जैसे एक 35 लाइन स्कैन के लिए, मान '0' और '25' में प्रवेश)।
  5. नमूना डेटा का चयन करने के लिए, 6.4 में वर्णित के रूप में 'स्वत: चयन' टैब का उपयोग करें, लेकिन एकीकरण के रूप में 'OUTPUT_1' चुनें। शुरुआत और प्रत्येक मानक पंक्ति के अंत से फसल डेटा पृष्ठभूमि संकेत बाहर करने के लिए (एक 35 एस लाइन स्कैन के लिए जैसे, प्रवेश मूल्यों '13' और '4')।
  6. possi की वजह से संकेत में बूँदें बाहर करने के लिएमानकों में ble छेद, 'नमूने' टैब में, 'चैनल' ग्राफ क्षेत्र के ऊपर छोड़ दिया पर शोर अनुपात (जैसे, C13 या P31) के लिए एक उच्च संकेत के साथ एक चैनल का चयन करने के लिए क्लिक करें। संकेत में किसी भी तेज बूंदों के एक नोट करें और काफी कम एक सीपीएस मूल्य है कि नमूने के भीतर सामान्य बदलाव के नीचे है का चयन करें, लेकिन पर्याप्त उच्च संकेत में तेज बूंदों के बाहर लेने के लिए।
  7. 'डीआरएस' टैब पर क्लिक करें और 'मौजूदा डेटा कमी योजना' के लिए 'Baseline_Subtract' का चयन करें। 'सूचकांक चैनल' के लिए 6.6 से चैनल और 'जब कम संकेतों मास्किंग सीमा का उपयोग करने के लिए' के ​​लिए सीपीएस मान चुनें। आईसीपी एमएस करने के लिए लेजर से संकेत हस्तांतरण में देरी के लिए खाते में करने के लिए 'पहले / के बाद कम संकेतों ट्रिम करने के लिए सेकंड' एक मूल्य <के लिए 0.5 एस डालें।
  8. कम संकेत क्षेत्रों की पर्याप्त मास्किंग पुष्टि करने के लिए, 'नमूने' टैब पर क्लिक करें और वापस एक संसाधित (जैसे।, Fe56_CPS) चैनल का पता लगाने का चयन करें। दोहराएँ और सीपीएस और & # निखारने39; सेकंड 6.7 में यदि आवश्यक हो तो पहले के रूप में ट्रिम करने के लिए / कम संकेतों के मूल्यों के बाद।
  9. 'परिणाम' टैब पर क्लिक करें और मुख्य आवेदन लटकती मेनू से 'निर्यात' डाटा चुनें। परिणामों की एक स्प्रेडशीट डेटा फ़ाइल (जैसे, Std1 गणना, Std2 ...) उत्पन्न करने के लिए एक फ़ाइल नाम दर्ज करें।
  10. एक उपयुक्त स्प्रेडशीट प्रोग्राम में डेटा फ़ाइल को खोलने और सीपीएस मूल्यों की गणना के लिए प्रत्येक व्यक्ति के चैनल quantitated किया जाना है। (माइक्रोग्राम जी -1) प्रत्येक मात्रात्मक तत्व के लिए सीपीएस मूल्यों से रूपांतरण कारक गणना करने के लिए पीपीएम समाधान nebulization आईसीपी एमएस से पूर्व निर्धारित धातु सांद्रता का प्रयोग करें।
  11. दोहराएँ 6.3 कदम - 6.10 रन में मानकों के सभी सेट के लिए।

7. मात्रात्मक छवियाँ निर्माण

  1. कमांड प्रॉम्प्ट में 'Biolite ()' लिखें सॉफ्टवेयर को खोलने के लिए।
  2. 'लोड छवियाँ' पर क्लिक करें और फ़ोल्डर का चयन के लिए .csv फ़ाइलें युक्त द्वारा नमूना डेटा आयात करेंr नमूना छवि।
  3. पृष्ठभूमि सुधार
    1. नमूने के लिए पृष्ठभूमि सुधार लागू करने के लिए 'आधार रेखा' टैब पर क्लिक करें। फास्फोरस पर (P31) छवि स्क्रीन पर संकेत दिया है, आयत आकर्षित उपकरण का उपयोग पृष्ठभूमि के चुनिंदा क्षेत्रों में। बनाता है के रूप में संभव के रूप में कई क्षेत्रों का चयन संकेत / प्लाज्मा बहाव की एक छवि चौड़ा नक्शा इन कारकों से पर्याप्त मुआवजा सुनिश्चित करने के लिए।
    2. , पृष्ठभूमि संकेत अधिक दिखाई बनाने ग्राफ संपादित करें उपकरण का चयन करने (ऊपर प्रदर्शित छवि के बाएं) और सही छवि पर क्लिक करें। 'छवि उपस्थिति को संशोधित' और एक बड़ा नकारात्मक मूल्य (-100000 उदाहरण के लिए) के लिए 'जेड पर = पहले रंग' बदलने का चयन करें। क्लिक 'हो गया' से आगे बढ़ें।
  4. सीपीएस / पीपीएम सुधार कारकों के लिए एक मेज तक लाने के लिए 'मानक' टैब पर क्लिक करें। तत्वों में से प्रत्येक के लिए कदम 6.10 में गणना मानकों से मान दर्ज करें। यह कदम आईसीपी एमएस में संवेदनशीलता बहाव के लिए सही करने में मदद मिलेगी। क्लिक करें 'जाओ! '
  5. 'डाटा' टैब है, जो प्रत्येक तत्व और प्रत्येक चरण के लिए छवियों धारण से ओपन 'डेटा ब्राउज़र'।
  6. निर्यात के लिए एक छवि को अंतिम रूप देने के लिए, 'StdCorrImages' फ़ोल्डर में वांछित छवि का चयन करें, छवि नाम (* _ppm) राइट क्लिक करें और 'NewImage' पर क्लिक करें। राइट-क्लिक करें खोलने के लिए 'छवि उपस्थिति को संशोधित' एक वांछित रंग की मेज और रंग पैमाने का चयन करने के लिए छवि। छवि राइट-क्लिक करें और 'एनोटेशन जोड़ें' का चयन करके छवि के लिए एक रंग पैमाने जोड़ें। शीर्ष बाएँ लटकती मेनू से 'ColorScale' का चयन करें और इच्छित रंग पैमाने को संशोधित करने के लिए टैब का उपयोग करें।
  7. एक छवि का निर्यात करने के लिए, सुनिश्चित करें कि विचाराधीन छवि चयनित है और 'फ़ाइल' टैब पर जाएँ और क्लिक करें 'ग्राफिक्स बचाओ ...'। इच्छित स्वरूप का चयन करें और छवि को बचाने के। वैकल्पिक रूप से, चयनित छवि को कॉपी और पेस्ट उपकरण का उपयोग कर स्थानांतरित किया जा सकता है।
  8. दोहराएँ 7.6 और 7.7 हित के सभी छवियों के लिए कदम।
  9. Quantifयिंग असतत क्षेत्रों
    1. रॉय उपकरण सक्रिय करने के लिए, 'विश्लेषण' टैब, 'पैकेज' पर नेविगेट करें और 'इमेज प्रोसेसिंग'।
    2. वांछित छवि का चयन करें और 'छवि' टैब पर जाएँ और क्लिक करें 'रॉय ...'। क्लिक करें 'आरंभ रॉय ड्रा' और नमूने में ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करने के लिए एक ड्राइंग उपकरण का उपयोग करें। ड्राइंग खत्म करने के लिए, 'समाप्त रॉय' पर क्लिक करें।
    3. चुने हुए रॉय के लिए आँकड़े प्राप्त करने के लिए, 'छवि' टैब पर जाएँ और क्लिक करें 'आँकड़े ...'।
    4. कॉपी और एक अलग स्प्रेडशीट के लिए परिणाम पेस्ट। दोहराएँ रॉय चयन (7.9.2) सभी क्षेत्रों और ब्याज के तत्वों के लिए।

Representative Results

इस ला-आईसीपी एमएस इमेजिंग दृष्टिकोण की क्षमताओं का प्रदर्शन करने के लिए, एक WT C57BL / 6 माउस मस्तिष्क की एक एकल खंड, महासंयोजिका पर bisected और राज्याभिषेक विमान में sectioned का उपयोग कर एक सरल प्रयोग, प्रस्तुत किया है। Biolite (चित्रा 1) का उपयोग कर डेटा के विश्लेषण के लिए एक कार्यप्रवाह, अनुभाग का विश्लेषण (चित्रा 2) में धातु वितरण के एक प्रतिनिधि छवि प्रदान करने के लिए धारा 6 और 7 में वर्णित है, साथ ही के रूप में भी वर्णित है।

देखा जा सकता है, माउस मस्तिष्क में धातु वितरण संरचनात्मक क्षेत्र के अनुसार चर रहा है। यह चर भूमिकाओं धातुओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, और अधिक विशेष रूप से प्रोटीन है जो वे बाध्य कर रहे हैं, प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र 27 में खेलते हैं। उदाहरण के लिए, लोहा, मध्यमस्तिष्क में और दांतेदार गाइरस साथ उच्च सांद्रता के लिए है, जबकि जिंक कोर्टी में सबसे प्रचुर मात्रा में है आदतकैलोरी क्षेत्रों में। कार्बन, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया आंतरिक मानक 8, homogenously वितरित किया जाता है। मौलिक नक्शे (चित्रा 2) जब मौजूदा संरचनात्मक और कार्यात्मक संदर्भ एटलस 29, जहां धातुओं की colocalization के बारे में जानकारी विशिष्ट धातु बाध्यकारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक मस्तिष्क के भीतर धातुओं के समारोह में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कर सकते हैं के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है क्षेत्र, या एक की पहचान की बीमारी से संबंधित बायोमोलिक्यूल के साथ लाइन में धातु के स्तर में परिवर्तन। दृष्टिकोण का वर्णन किया है, जो analytes की एक व्यापक रेंज के लिए अनुकूलित है का उपयोग करते हुए, इस तरह के रूप में मैंगनीज कम बहुतायत तत्वों के लिए संवेदनशीलता रोकता है, और तरीकों के अन्य मापा जनता की कीमत पर ध्यान केन्द्रित करना गुना बढ़ाने के द्वारा इस analyte पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

ला-आईसीपी एमएस द्वारा इमेजिंग का उपयोग करने में बड़ा लाभ यह धातु concentr में रिश्तेदार मतभेद मना रहा हैव्यावहारिक और प्रयोगात्मक समूहों के बीच वितरण। हम पहले से बढ़ी हुई लोहे की एक न्यूरोटॉक्सिन अपमान पीडी 2, 10 नकल उतार के बाद, और मानव अल्जाइमर रोग ऊतक 21 में cortical लोहे के स्तर में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए एक ऐसी तकनीक का इस्तेमाल किया है। यहाँ के रूप में वर्णित इस तरह के एक प्रोटोकॉल को आसानी से सूचीबद्ध तरीकों के लिए कम से कम संशोधनों के साथ किसी अन्य ऊतक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: इमेज प्रोसेसिंग के लिए कार्यप्रवाह। कार्यप्रवाह धारा 6 और 7, माउस मस्तिष्क में धातु वितरण की मात्रात्मक छवियों आईसीपी एमएस से कच्चे समय सुलझाया डेटा के रूपांतरण का चित्रण करने के लिए पूरक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्र 2
चित्रा 2: एक माउस मस्तिष्क के भीतर Biometals की विशिष्ट मौलिक वितरण। एक माउस मस्तिष्क ला आईसीपी एमएस के साथ विश्लेषण गोलार्द्ध के एक 30 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक अनुभाग के प्रतिनिधि तत्व नक्शे। (शीर्ष पंक्ति), कार्बन -13 (C13), मैग्नीशियम -24 (Mg24) और फास्फोरस 31 (P31) के लिए छवियाँ गोल्ड रंग तराजू (सीपीएस प्रति दूसरे मायने रखता है) में दिखाया गया है। मैंगनीज-55 (Mn55), तांबा, 63 (Cu63), लौह-56 (Fe56) और जस्ता-66 (Zn66) के लिए मात्रात्मक छवियों (नीचे पंक्ति) इसी BlueHot रंग तराजू (माइक्रोग्राम जी -1) के साथ दिखाया गया है। मस्तिष्क अनुभाग के लिए कुल विश्लेषण समय लगभग 5 h था। स्केल बार = 2 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तंत्रिका विज्ञान के ऊतकों में इमेजिंग धातुओं कैसे इस प्रोटोकॉल किसी भी जैविक मैट्रिक्स में वितरण और धातुओं की मात्रा पर उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं की सिर्फ एक उदाहरण है। हालांकि मानक संदर्भ सामग्री की तैयारी कठिन हो सकता है, यह एक प्रयोग है कि एक बार किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए संग्रहीत है।

ला-आईसीपी एमएस इस तरह के विकिरण के आधार पर एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में वैकल्पिक तरीकों, ज्यादातर पहुंच और संवेदनशीलता के मामले में अधिक कुछ फायदे हैं। हालांकि, वहाँ कुछ नुकसान है कि जब एक प्रयोग में ला-आईसीपी एमएस का उपयोग कर तैयारी पर विचार किया जाना चाहिए रहे हैं, और इस तरह के रूप में यह अक्सर रासायनिक इमेजिंग कि वैकल्पिक धातु विश्लेषण तकनीक के साथ-साथ तुलनात्मक ऊतकरसायनविज्ञान 5 शामिल है के लिए एक उपयोगी पूरक तकनीक है।

माउस मस्तिष्क के ज्ञात संरचनात्मक सुविधाओं के साथ संरेखण संभव कार्यात्मक relati पर उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैंधातु स्तर और स्थानिक वितरण के बीच onship। इससे पहले, हम एलन ब्रेन एटलस ऑनलाइन संसाधन, 29 जो C57BL / 6 माउस मस्तिष्क में दोनों शारीरिक और जीन अभिव्यक्ति डेटा की एक खुले उपयोग रिपोजिटरी दोनों धातु पर निर्भर एंजाइम अभिव्यक्ति 14 और 27 के neuroanatomy स्थानिक सहसंबंध जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है, 30। इस तरह के कृंतक मस्तिष्क कार्यक्षेत्र 31 के रूप में अन्य संसाधनों, भी अक्सर छोटे संरचनात्मक क्षेत्रों में धातु वितरण की सही पहचान करने में सहायता करने के लिए पंजीकरण और धातु छवियों के संरेखण के साथ सहायता के लिए उपलब्ध हैं।

इस तकनीक के आवेदन दोनों सामान्य जीवन की घटनाओं के दौरान microscale में कैसे धातु के स्तर और वितरण परिवर्तन का आकलन करने में उपयोगी होते हैं (जैसे, उम्र बढ़ने) और रोग राज्यों में; साथ ही दोनों धातु युक्त यौगिकों और ड्रग्स के लिए डिज़ाइन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मुझे लक्ष्यताल चयापचय। स्थानिक धातु वितरण का आकलन करने के लिए एक इमेजिंग तकनीक के रूप में ला आईसीपी एमएस के वर्तमान प्रमुख सीमाओं throughput और संवेदनशीलता कर रहे हैं। वहाँ नहीं रह विश्लेषण बार की आवश्यकता होती है उच्च संकल्प छवियों के साथ विश्लेषण की गति और स्थानिक संकल्प 5, 12 के बीच एक tradeoff है। तकनीक अच्छी तरह से उच्च सांद्रता में जैविक तत्वों के लिए अनुकूल है, हालांकि इस तरह के मैंगनीज, कोबाल्ट और सेलेनियम जैसे तत्वों को सामान्य ऊतकों और / या पारंपरिक आईसीपी एमएस द्वारा उनका पता लगाने में सीमाओं में उनके कम बहुतायत के कारण प्रतिबंधित कर रहे हैं। ऐसे ट्रिपल quadrupole मास एनालाइजर की शुरूआत के रूप आईसीपी एमएस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में नई प्रगति, उच्च संवेदनशीलता 33 पर ऐसे सेलेनियम 32 के रूप में मुश्किल analytes, के लक्षित पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। एक प्रौद्योगिकी संचालित प्रक्रिया के रूप में, दोनों लेजर और मास स्पेक्ट्रोमेट्री डिजाइन के क्षेत्र में प्रगति इस इमेजिंग तकनीक विकसित करने के लिए जारी देखेंगे, बढ़ रही हैविश्लेषण और संवेदनशीलता 34 की गति।

Acknowledgments

DJH और पैड एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद लिंकेज परियोजना (LP120200081) टेक्नोलॉजीज लिमिटेड और ईएसआई बीके के योगदान के साथ द्वारा समर्थित हैं रूहर यूनिवर्सिटी रिसर्च स्कूल अलावा, जर्मनी की उत्कृष्टता पहल [DFG GSC 98/3] द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया। DJH आंशिक रूप से Ramaciotti फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। केके सिग्रिड Juselius फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soda glass microscope slides n/a n/a Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades C.L. Stuckey DT315R50 Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 16005 Any supplier suitable
Sucrose n/a n/a Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate-buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P5368 Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene Sigma-Aldrich 247624 Any supplier suitable
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Any supplier suitable
Lamb brain n/a n/a Available from most local butchers
Metal salts n/a n/a Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser Omni Inc THP115 Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes Omni Inc TH115-PCRH
Microwave digestion unit n/a n/a Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes TechnoPlas P4010 Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid Merk Millipore 100441 Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 95321 Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds Ted Pella 27181
Isopentane Sigma-Aldrich 76871
Liquid nitrogen n/a n/a Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system ESI Ltd n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS Agilent Technologies n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite Iolite Software n/a Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel Microsoft n/a
IGOR Pro Wave Metrics n/a Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm

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उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा - - लेजर पृथक से मस्तिष्क के ऊतकों में इमेजिंग धातु मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला आईसीपी एमएस)
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