Summary
Kvantitativt kartläggning metaller i vävnad genom laserablation - induktivt kopplad plasma - masspektrometri (LA-ICP-MS) är en känslig analytisk teknik som kan ge nya insikter i hur metaller deltar i normala funktion och sjukdomsprocesser. Här beskriver vi ett protokoll för att kvantitativt avbildning metaller i tunna sektioner av mus neurologisk vävnad.
Abstract
Metaller finns ubiquitously genom en organism, med sin biologiska roll dikteras av både deras kemiska reaktivitet och överflöd inom en viss anatomisk region. I hjärnan, metaller har en mycket compartmentalized fördelning, beroende på den primära funktionen de spelar inom det centrala nervsystemet. Avbildning av geografiska fördelningen av metaller har gett unik inblick i den biokemiska arkitekturen i hjärnan, vilket direkt korrelation mellan neuroanatomiska regionerna och deras kända funktion när det gäller metallberoende processer. Dessutom funktionen flera åldersrelaterade neurologiska sjukdomar störs metall homeostas, som ofta är begränsad till små områden av hjärnan som annars är svåra att analysera. Här beskriver vi en omfattande metod för att kvantitativt avbildning metaller i mushjärna med hjälp av laserablation - induktivt kopplad plasma - masspektrometri (LA-ICP-MS) och särskilt utformade bildbehandlingprogramvara. Med fokus på järn, koppar och zink, som är tre av de mest förekommande och sjukdomsrelevanta metaller i hjärnan, beskriver vi de viktigaste stegen i provberedning, analys, kvantitativa mätningar och bildbehandling för att producera kartor över distributions metall i låga mikrometer upplösningsområde. Denna teknik, som gäller för varje avsnitt skära vävnad, är i stånd att påvisa mycket varierande fördelning av metaller inom ett organ eller system, och kan användas för att identifiera förändringar i metall homeostas och absoluta nivåer inom fina anatomiska strukturer.
Introduction
Den unika redoxkemi av metaller underlättar en rad neurologiska funktioner, inklusive signaltransduktion, energiproduktion och neurotransmittor syntes. I ett antal stora neurodegenerativa sjukdomar, har dyshomeostasis av dessa metaller varit både inblandade i sjukdoms patogenes och identifierats som potentiella nya mål för terapeutisk intervention 1. För att bättre förstå hur metallerna är involverade i tillstånd såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdom (AD och PD, respektive), är det viktigt att kunna mäta hur distribution och nivåer metall förändras inom regioner som drabbas av sjukdomsprocessen. Dessa förändringar är ofta ett tecken på subtila förändringar i de biokemiska reaktioner som kan vara intimt kopplade till de processer som initierar celldöd, såsom vår nyligen föreslagna mekanismen av järn och dopamin neuro i PD 2.
Traditionellt metal nivåer inom definierade anatomiska regioner har uppnåtts genom noggrann excision, matsmältning och analys med hjälp av en rad analysmetoder 3. Men förlorar ett sådant tillvägagångssätt geografisk information, som kan vara avgörande när sjukdomstillstånd utreds innebära små, väl definierade områden eller specifika celltyper. Ett antal analytiska metoder är tillgängliga för att visualisera metaller i biologiska system, från intakta prover till vävnadssnitt och i två och tre dimensioner, med hjälp av emissionsspektroskopi, fluorescerande prober och masspektrometri 4. Varje teknik har sina fördelar och nackdelar när det gäller känslighet, selektivitet av kemiska arter, och den rumsliga upplösningen som kan uppnås. För en omfattande översikt av de olika tekniker som finns, se granskning av Hare et al. 5.
Masspektrometri (MS) -baserade metoder är mest känsliga av dessa teknikerSom kan mäta mest biologiskt relevanta metallerna på sitt eget koncentration sex. Laserablation - induktivt kopplad plasma - masspektrometri (LA-ICP-MS) avbildning utnyttjar en fokuserad ultraviolett laserstråle varierar i storlek från 1 till> 100 nm i diameter (eller bredd, när en fyrsidig balk form används), enligt vilken provet leds 7. Kvantitativ information kan åstadkommas genom den representativa ablation av standardreferensmaterial, som kan framställas med hjälp av olika olika metoder 8, var och en med varierande grad av tekniska svårigheter och analytisk praktiska. Det vanligaste tillvägagångssättet använder matris matchning, där en standard med en dominerande kemiska sammansättning är jämförbar med den hos prov bereds genom spetsning med målanalyten och noggrant utvärderas för homogenitet och absoluta metallkoncentration av oberoende analysmetoder 9, 10. Ablation av preparerade standarder kan sedan användas för externa kalibreringsändamål, så att koncentrationsdata från den resulterande provbild som skall extraheras per pixel.
Bildupplösningen bestäms av både strålen storlek och hastighet vid vilken provet avsökes. Standarden quadrupol design ICP-MS (som står för mer än 90% av alla installerade ICP-MS-system över hela världen 11) är en sekventiell massa analysator, i att massdetektor går igenom alla valda massa till laddningsförhållande (m / z ) snarare än att samla in data samtidigt. Sålunda måste uppsamlingstiden för varje cykel av massorna motsvara den tid det tar för provet att passera en bredd av laserstrålen för att säkerställa en pixel är representativt för den önskade upplösningen förvärvas 12. Laserstrålen storlek val är en avgörande parameter som har en betydande inverkan på både känslighet och totala analystiden. Såsom laserablation physitiskt tar bort material som sveps till ICP-MS genom en argon bärargas, mängden av materia som kan vara fysiskt detekteras av massanalysatorn följer kvadratlagen. Till exempel, reducera laserstrålens diameter från 50 - 25 | j, m resulterar i en minskning av ablationsbehandlad materialet med en faktor av fyra. Dessutom, som en avsökningsmetod, mindre stråldiametrar öka den totala tid som krävs för att avlägsna ett valt område. Därför är experimentell design viktigt att balansera den nödvändiga rumsliga upplösningen med känslighets behov och tidsbrist.
Imaging av LA-ICP-MS har använts till en rad prover, matriser och sjukdomstillstånd, inklusive djurmodeller av neurologiska sjukdomar 13, 14, traumatisk hjärnskada 15, distribution av metallinnehållande cytostatika 16, giftämne exponering i moderkakan 17 och metall distribution i tänder som en biomarkör för tidigt livet kost övergångar. 18 I detta protokoll beskriver vi en generell metod för att avbilda järn, koppar och zink i WT mushjärna med en upplösning på 30 nm, även om det kan lätt anpassas till en rad provtyper och experimentella resultat, baserat på behoven hos analytiker.
Protocol
Förfaranden som beskrivs häri har godkänts av Howard Florey Animal etikkommittén och ansluta sig till den nationella hälsa- och Medical Research Council normer för djurvård.
1. Framställning av prov för analys
OBS: Detta steg varierar beroende på provmatrisen som skall analyseras.
- Provberedning och sektionering
OBS: Fixering med användning av 4% paraformaldehyd (PFA) och kryoskydd i 30% sackaros i 0,1 M PBS kommer att resultera i varierande mängder av läckage av metaller från vävnad. Se Hare et al 19 för specifika detaljer. Se till att alla prover har genomgått samma fixering och kryoskydd steg.- Transcardially BEGJUTA avlivas djuret med iskall 0,1 M PBS, pH 7,4 (se Metoder avsnittet i et al. Dodt 20 för mer information) och ta bort hjärnan.
- Placera hjärnan i 4% PFA O / N för att fixera vävnaden. <li> Cryoprotect hjärnan genom att placera den i 30% sackaros i 0,1 M PBS under 24 timmar, och sedan byta till färskt 30% sackaros i ytterligare 24 timmar. 19
- Frysa hjärnan i en kryostat vid -20 ° C under minst 1 h.
- Montera hjärnan på en chuck med ett lämpligt monteringsmedel.
- Avsnittet hjärnan på en kryostat med hjälp av en metallfria engångsbladet (t.ex. polytetrafluoretylen [PTFE] belagda knivar) och montera på en vanlig objektglas. Den optimala tjockleken för sektionen bör vara ungefär 30 pm.
OBS: Exakta effekter på lång sikt fixering och paraffin-inbäddning av biologiska prover är inte kända. Som beskrivits i 1.1, se till att alla prover har genomgått samma provberedningsförfaranden om jämförande analys är avsedd.
- avvaxa paRaffin inbäddade prover genom att doppa bilden i 3 byten av xylen, en förändring var och en av: 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol och minst 3 förändringar i ISO 3696 eller motsvarande renat vatten (hädanefter kallad " vatten ", se Hare et al 21 för en detaljerad metod)..
2. Framställning av Matrix-matchade Standards
OBS: Följande är en sammanfattande protokoll tidigare publicerats 9. Kontakta den ursprungliga papper för detaljerade anvisningar för framställning av matrisanpassade vävnads standarder.
- Skaffa kommersiella lamm hjärnor (eller liknande) och skölj i vatten, ta bort allt blod och bindväv.
- Med hjälp av en skalpell, noggrant dissekera cirka 50 g kortikal tissue och delvis homogenisera med hjälp av en handhållen vävnadshomogenisator med en polykarbonat engångs sond på låg effekt. Dela upp i 5 g portioner, med numret beroende på kalibreringsområdet och antalet kalibreringspunkter önskas.
- Bered lösningar av metaller att spika varje standard genom att lösa ett lösligt salt av varje analyt (t.ex. FeSO 4 · H2O) i 1% salpetersyra för att producera 0,1, 1 och 100 mg metall ml -1 lager.
- Lägga en pre-beräknade volymen av stamlösningen till 5 g alikvoteras vävnad (t.ex. 5 mikroliter av 10 mg ml -1 för en ungefärlig slutlig koncentration av 10 | j, g g -1 våt vävnad) för att uppnå ett område av spetsade metallnivåer i varje standard.
- Beroende på den önskade slutkoncentrationen av varje standard, använda en kombination av varje metallstamlösning för att säkerställa en minimal mängd av lösningarna sättes till standarden. Lägg till en slutlig spik av vatten till varje standard för att säkerställa equivalent volymer tillsatt vätska är närvarande i varje standard.
- Homogenisera preparerade standarder för låg effekt för cirka 30 s. Om inte skall användas omedelbart, hålla fryst vid -20 ° C i tillslutna polypropenrör förseglade med Parafilm.
- Bestäm exakt koncentration och enhetligheten hos varje standard med någon av följande metoder:
- mikrovågsnedbrytning
- Placera 6 noggrant vägt (ca 50 mg) alikvoter av en standard i en tvättad PTFE uppslutningskärlet och tillsätt 4 ml koncentrerad (65%) salpetersyra och 1 ml 30% väteperoxid. Täta och smälta vid 500 W under 30 minuter.
- Efter kylning digestionskärlet, öppen i ett dragskåp och kvantitativt överföra den uppslutna lösningen till en syratvättad 50 ml rör med användning av 10 ml alikvoter av vatten. Göra till cirka 50 ml, och noggrant väga massan av den slutliga lösningen.
- Upprepa steg 2.5.1.1 - 2.5.1.2 för varje standard.
- Använd följande procedur om mikrovågsnedbrytning utrustning inte är tillgänglig:
- Placera sex exakt uppmätta (mellan 25-200 mg) alikvoter av standard i syratvättad / metallfritt polypropenrör och lyofilisera O / N.
- Tillsätt 40 mikroliter av koncentrerad salpetersyra och värme, icke-begränsade, på ett uppvärmningsblock till 70 ° C under 5 min, och sedan lägga 10 mikroliter av 30% väteperoxid. Värme under ytterligare 5 min, och sedan noggrant göra till en ml totalvolym med användning av 950 mikroliter av 1% salpetersyra.
OBS: Det är lämpligt att smälta ett certifierat referensmaterial genom att använda en lämplig metod för att säkerställa uppslutningsförfaranden är korrekta.
- mikrovågsnedbrytning
- Bestäm metallkoncentrationen i varje smälta lösning genom lösning finfördelning ICP-MS använder ett standardprotokoll. Bedöma enhetligheten hos varje standard genom att bestämma den relativa standardavvikelsen (% RSD) mellan varje portion. Säkerställa% rsds alla faller inom 15%. Använda den uppmätta massan av each portion, beräkna den exakta metall koncentrationen av varje homogeniserad vävnad standard.
- För att återgå till den homogeniserade vävnaden standard, packa en 5 x 5 mm plast disponibel histologi mögel och frysa i iso-pentan kyld i flytande kväve. Avlägsna frysta standardvävnadsblock från formen och avsnittet om en kryostat vid samma tjocklek som provet.
Obs: Det är lämpligt att förbereda ett antal sektioner med varierande tjocklekar för framtida experiment. Lufttorkade standarder kan lagras på obestämd tid i en lufttät och dammfri behållare.
3. Framställning av LA-ICP-MS för analys
- Placera standarder och prov i ablation kammaren, se till att de är inom skärpedjupet av CCD-kameran monterad på LA enheten. Om inställning av instrumentet är nödvändig, innefattar ett lämpligt referensmaterial (t.ex. NIST 612 spårämnen i glas). Dra åt de två skruvarna på kammardörren för att täta the ablation kammaren.
- I ICP-MS programvara, välj öppna ventilen argongas i "Underhåll" eller liknande panel och ställ in bärgasflödet till 1,2 L min -1 i lämplig dialogrutan.
OBS: I detta protokoll argon används som bärargas. Flera exempel använda antingen helium eller en blandning av helium och argon som bärargas. Se Günther och Heinrich 22 tekniska detaljer för att använda helium och argonblandningar som aerosol bärgaser. - I LA programmet, klicka på "utrensning" för att spola cellen med argongas under minst 30 minuter.
OBS: Rensa tid kan ändras genom att klicka på en "renings tid" eller liknande knapp. Vid användning av en ablation system med en två-volym ablation cell, periodiskt flytta scenen till varje hörn och diagonalt korsar cellen för att säkerställa så mycket kvarvarande luft avlägsnas från cellen som möjligt. Detta kan åstadkommas genom att välja "stadier hem" eller motsvrande funktion. - Slå på ICP-MS genom att klicka på plasma på "och låt värma upp i två timmar, under vilka steg 3,5-4,4 kan utföras. Instrumentinställningar varierar mellan tillverkare, men ett exempel på lämpliga LA-ICP-MS driftsförhållanden kan hittas i Hare et al. 10.
- Representativ ablation av vävnad standarder
- Välj linjeverktyget och rita en enda rad ablation ungefär 3 mm lång över vävnadsytan.
- Ställ in parametrarna enligt följande genom att högerklicka på raden av ablation i experimentlistan och ändra följande: strålens diameter (vald på lämpligt sätt av användaren, en 30 um kvadrat stråle används här), skanningshastighet (4 gånger stråldiametern per sekund, 120 fim s -1) och energifluens (0,3 -0,5 J cm -2 för mjukvävnad, optimera om det behövs för hårdare matriser). Vid 30 pm vävnadstjocklek laserstrålen inte penetrerar hela thickness av denna vävnad, vilket eliminerar varje potentiell kontaminant från stöd mikroskop. Normalisering till kol 23 kan användas för att korrigera för variation i mängden av vävnad avlägsnas. Ställ in dessa parametrar som standard för varje efterföljande linje genom att välja "default" knappen.
- Duplicera denna linje sex gånger genom att välja den första linjen, högerklicka och välja "dubbla skanningar". Se till att linjer är förskjutna i antingen x - eller y-axeln av strålen diameter. Detta ger totalt sju linjer per standard, åtskilda enligt stråldiametern.
- Upprepa steg 3.5.1 - 3.5.3 för varje standard, se raden av samma längd.
- Att dra ablation området över provet, följa en av följande två metoder:
OBS: Se till att samma scan parametrar (stråldiameter, skanna hastighet, energifluens) används för provledningar.- Om LA-systemet är utrustat med enbrett synfält, välj linjeverktyget och dra en linje från övre vänstra hörnet av provet tillräckligt länge för att täcka provet vid dess bredaste punkt med hjälp av samma laserparametrar som beskrivs i 3.5. Duplicera denna skanning som beskrivs i 3.5.3 med linjer fördelade enligt stråldiametern så många gånger som behövs för att säkerställa fullständig täckning av provet.
- Om ett brett fält uppfattning är inte tillgänglig, bestämma och registrera x- och y-koordinater (typiskt visas på huvudskärmen som "normalläge" eller liknande) som motsvarar hörnen av en rektangel som täcker hela provet. Använd dessa koordinater för att placera parallella linjer av ablation täcker hela provområdet som beskrivs i 3.7.1.
- Rita linjer för intermittent scanning av standarder senast efter på ~ 20 h för att skanna provet genom att upprepa den process som beskrivs i 3.5. Beroende på scan-durationen av provet detta kan krävas flera gånger. Avsluta försöket med en ytternella genomsökning av standarder.
OBS: Vid bestämning x och y-koordinater medan cellen som renas, välja utgångslägen och tillhörande kalibrering av axeln kommer att förändra tidigare förvärvade detaljerna för x- och y-koordinater, medan skillnaden (dvs. längden på linjen) kommer vara opåverkad.
4. Installera datainsamling metoder för ICP-MS
- För standardlinjen av ablation, dividera längden på linjen av laseravsökningshastighet för att bestämma den totala analystiden för en enda rad. Upprepa detta för provledningen.
- I ICP-MS programvara, skapa en ny metod (visas här som en "parti") och se till att "tidsupplöst analys" eller motsvarande väljs. Välj de m / z-värden som skall detekteras, och sedan justera integrationstiden för varje m / z så att den totala integrationstiden för en cykel är lika med 0,25 s. Klicka på "Spara Batch Som "och namnet på motsvarande sätt (t.ex. STD1).
OBS: När provet kommer att gå genom laserstrålen vid fyra gånger stråldiametern, säkerställer detta en datapunkt för varje massa registreras motsvarar stråldiametern 12. Till exempel med hjälp av en 100 um punktstorlek, en skanningshastighet på 400 um s -1 med en integreringstid av 0,25 s ger bilder med äkta storlekar pixel. Integrationstiden kan justeras för att förbättra känsligheten; när ökande integrationstiden till 0,33 s skanningshastighet bör bromsas till tre gånger stråldiametern. - För standarder anger analystiden för varje linjeavsökning i lämplig ruta, plus ytterligare 15 s för att redogöra för laser uppvärmning och spolnings gånger. Ange en lista provkörningen (dvs den ordning som skannar drivs) med samma antal förvärv (typiskt numrerade sekventiellt, det vill säga 001, 002, etc.) som det totala antalet standardlinjer.
- För provet, Kopiera den metod som används för standarderna genom att spara den nuvarande metoden eller parti med ett alternativt filnamn, och justera den totala förvärvstiden (inklusive de ytterligare 15 s) och totalt antal förvärv för att matcha antalet linjer som kommer att avlägsna provet .
OBS: Eftersom de flesta LA-ICP-MS-system använder en enkelriktad avtryckaren (LA utlöser ICP-MS), är det viktigt att ICP-MS programvara väntar på avtryckaren från LA innan den efterföljande raden av ablation påbörjas. ICP-MS förvärvet fönster kommer att läsa "väntar på start".
5. Köra experimentet
- Starta ICP-MS kö genom att tillsätta den första metoden eller sats till kön och se programmet väntar på avtryckaren från LA-systemet.
- I LA programmet gör det möjligt för laserströmförsörjningen genom att klicka på "utsläpp", klicka på "kör" och ställ in laser uppvärmningstid till 10 s och washout tid till 20 s i rutorna.
Obs: Detta överskridande voresäkerställa ICP-MS är redo att börja förvärva nya data när lasern börjar varje efterföljande rad av ablation. - Starta lasersekvensen genom att klicka på "start". Vid användning av en två-volym cell, se till provkoppen är i läge.
6. Beräkning Kvantifiering Standards
OBS: Det finns flera varianter för konvertering ICP-MS-data till bilder. Dessa inkluderar användning av hemmagjorda programvaruverktyg skrivna i öppen källkod språk 17, 24, 25, kommersiella makron 26 och dataanalys programvara. 7 Här använder nyligen utvecklad programvara plugin (beskriven i Paul et al. 27), baserat på en specialiserad LA-ICP-MS dataanalys suite 28.
- Överför alla sats mappar som innehåller data Run (001.d, 002.d, osv.) På enseparat dator med analysen programvara installerad. Extrahera * .csv datafiler för varje rad i satsen i en separat mapp.
OBS: Om du använder ett skript för att automatiskt överföra * .csv-filer till en ny mapp rekommenderas. Se bifogad Python-kod för mer information. Detta skript har skrivits för att passa antingen en Agilent 7700 eller 8800-serien ICP-MS, men kan redigeras för att passa utdatafilen från andra tillverkare. - Öppna mjukvaruplattform och följa flikarna i tur och ordning för att importera och analysera normer för att producera kvantitativa bilderna som beskrivs nedan.
- Att importera data från den första standarden partiet, välj "Agilent CSV" för "File Type", "hela mappen" för "Import typ" och kontrollera att "Datumformat" är identisk med datorn format. Klicka på "Import", välj den mapp som innehåller de CSV-filer för första uppsättning standarder, och flytta till fliken "baslinjerna".
- baslinjesubtraktion
- Använd "Automatic Selections fliken (kommando 2) från programmets huvudrullgardinsmenyn i verktygsfältet, välj" Information från import "och klicka på" Fortsätt ".
- Klicka på "Markera alla" och välj "Baseline_1" för integration.
- För att välja de första 10 sekunderna i varje sveplinje (motsvarande laser uppvärmningstid), beskära data genom att starta andra värden "0" och "(längd linje - 10 s) och klicka på" Lägg till integrationer "(t.ex. för en 35 s sveplinje, mata in värden "0" och "25").
- För att välja exempeldata, använd fliken Automatiska val "som beskrivs i 6.4, men välj" OUTPUT_1 "som integrationen. Beskär data från början och slutet av varje standardlinje för att utesluta bakgrundssignalen (t.ex. för en 35 s sveplinje, mata in värden "13" och "4").
- För att utesluta droppar i signalen som orsakas av möjbara hål i standarderna, på fliken "Prov", klicka på "kanaler" längst upp till vänster i graf-området att välja en kanal med en hög signalbrusförhållande (t.ex. C13 eller P31). Anteckna några skarpa droppar i signalen och välj en CPS värde tillräckligt lågt som ligger under den normala variationen inom proverna, men tillräckligt hög för att plocka ut de skarpa droppar i signalen.
- Klicka på fliken "DRS" och välj "Baseline_Subtract" för "Scheme Aktuellt Data Reduction" den. Välj kanalen från 6,6 för "index Channel" och CPS värdet för "Threshold att använda när masker låga signaler". Sätt ett värde <0,5 s för "sekunder att trimma före / efter låga signaler" att redogöra för förseningen signalöverföring från lasern till ICP-MS.
- För att bekräfta tillräcklig maskering av de låga signalområdena, klicka tillbaka till fliken "Prov" och välj en bearbetad (eg., Fe56_CPS) kanal spår. Upprepa och förfina CPS och & #39, sekunder att trimma före / efter låga signaler värderingar som i 6,7 om det behövs.
- Klicka på fliken "Resultat" och välj "Export uppgifter från programmets huvudrullgardinsmenyn. Ange ett filnamn för att generera ett kalkylark datafil av resultaten (t.ex., STD1 beräkningar, STD2 ...).
- Öppna datafilen i en lämplig kalkylprogram och beräkna CPS värden för varje enskild kanal som ska kvantifieras. Använd de förutbestämda metallhalter från lösningen nebulisation ICP-MS för att beräkna omvandlingsfaktorn från CPS värden ppm (ig g -1) för varje kvantifierbar element.
- Upprepa steg från 6,3 till 6,10 för alla uppsättningar av standarder i körningen.
7. Konstruera Kvantitativa Images
- Skriv "BioLite ()" i kommandotolken för att öppna upp programmet.
- Importera exempeldata genom att klicka på "Load Images" och välja den mapp som innehåller de CSV-filer for exempelbilden.
- bakgrundskorrigering
- Klicka på fliken baslinjer "att tillämpa bakgrundskorrektion för provet. På fosfor (P31) bild uppmanas på skärmen väljer delar av bakgrunden med hjälp av rektangeln ritverktyget. Om du väljer så många regioner som möjligt skapar en bild omfattande karta över signal / plasma drift för att säkerställa tillräcklig kompensation från dessa felkällor.
- För att göra bakgrundssignalen mer synlig, välj grafredigeringsverktyget (överst till vänster i den visade bilden) och högerklicka på bilden. Välj "Ändra bildens utseende" och ändra "Första färg på Z =" till ett stort negativt värde (t.ex. -100.000). Fortsätt genom att klicka på "Klar".
- Klicka på fliken "Standards" för att få upp en tabell för CPS / ppm korrektionsfaktorer. Ange värden som beräknats från de normer i steg 6,10 för vart och ett av elementen. Detta steg kommer att hjälpa till att korrigera för känslighetsdriften i ICP-MS. Klicka på "Go! "
- Öppna "Data Browser" från "Data" fliken som håller bilderna för varje element och varje steg.
- Att slutföra en bild för export, välj den önskade bilden i mappen "StdCorrImages", högerklicka på bildnamnet (* _ppm) och klicka på "newimage". Högerklicka på bilden för att öppna "Ändra bildens utseende" att välja en önskad färgtabell och färgskala. Lägg till en färgskala i bilden genom att högerklicka på bilden och välja "Lägg till kommentar". Välj "ColorScale" från övre vänstra rullgardinsmenyn och använd flikarna för att ändra önskad färgskala.
- För att exportera en bild, se till att bilden i fråga har valts och navigera till "File" fliken och klicka på "Spara grafik ...". Välj önskat format och spara bilden. Alternativt kan den valda bilden överförs med hjälp av kopiera och klistra in verktyg.
- Upprepa steg 7,6 och 7,7 för alla bilder av intresse.
- Quantifying diskreta områden
- Att aktivera ROI verktyg, gå till "Analys" fliken "Paket" och välj "bildbehandling".
- Välj önskad bild och navigera till "Image" fliken och klicka på "ROI ...". Klicka på "Start ROI draw" och använder ett ritverktyg för att välja ett område av intresse i provet. För att avsluta ritning, klicka på "Finish ROI.
- Att förvärva statistik för det valda ROI, navigera till "Bild" fliken och klicka på "Statistik ...".
- Kopiera och klistra in resultaten till en separat kalkylblad. Upprepa ROI val (7.9.2) för alla regioner och delar av intresse.
Representative Results
För att visa möjligheterna med denna LA-ICP-MS avbildningsteknik, ett enkelt experiment med hjälp av ett enda avsnitt av en WT C57BL / 6 mushjärna, bisected vid corpus callosum och sektioneras i frontalplanet, presenteras. Ett arbetsflöde för analys av data med hjälp av BioLite (Figur 1), som beskrivs i avsnitt 6 och 7, samt för att ge en representativ bild av distributions metall i avsnittet analyseras (Figur 2) beskrivs också.
Såsom kan ses, är fördelningen av metall i mushjärna variabel enligt anatomiska regionen. Detta kan tillskrivas den rörliga roller metaller, och mer specifikt de proteiner till vilka de är bundna, spela i varje hjärna region 27. Till exempel tenderar järn att ha högre koncentrationer i mitthjärnan och längs dentate gyrus, medan zink är mest riklig i cortigrafiska områden. Kol, som är ett vanligt använt intern standard 8, är homogent fördelad. Elemental kartor (Figur 2) kan vara särskilt användbar när den används tillsammans med befintliga anatomiska och funktionella referensmaterial 29, där information om samlokalisering av metaller kan uttrycket av specifika metallbindande proteiner kan ge insikt i funktionen av metaller inom en hjärna region, eller förändringar i metallnivåer i linje med en identifierad sjukdomsrelaterad biomolekyler. Använda den metod som beskrivs, som är optimerad för ett bredare spektrum av analyter, utesluter känslighet för låg förekomst element såsom mangan, och metoder kan anpassas till i första hand fokusera på denna analyt genom att öka uppehållstider på bekostnad av andra beräknade massan.
Den stora fördelen med att använda avbildning av LA-ICP-MS observerar relativa skillnader i metall concentration och distribution mellan försöksgrupper. Vi har tidigare använt en sådan teknik för att visa ökad järn efter ett nervgift förolämpning härma PD 2, 10, och förändringar i kortikala järnnivåer i mänsklig Alzheimers sjukdom vävnad 21. Ett sådant protokoll som beskrivs här kan lätt anpassas till varje annan vävnadstyp med minimala ändringar angivna metoder.
Figur 1: Workflow för bildbehandling. Workflow komplement till avsnitten 6 och 7, som visar omvandling av rå tid beslutade data från ICP-MS kvantitativa bilder av distributions metall i mushjärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2: Typisk Elemental Fördelning av Biometals inom en mus hjärna. Representativa elementet kartor över en 30 um tjock koronalt avsnitt av en enda mus hjärnhalvan analyseras med LA-ICP-MS. Bilder för kol-13 (C13), magnesium-24 (MG24) och fosfor-31 (P31) visas i guld färgskalor (pulser per sekund, CPS) (övre raden). Kvantitativa bilder (nedersta raden) för mangan-55 (Mn55), koppar-63 (Cu63), järn-56 (Fe56) och zink-66 (Zn66) visas med motsvarande BlueHot färgskalor (ig g -1). Totala analystiden för hjärnan sektionen var ungefär 5 timmar. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Imaging metaller i neurologisk vävnad är bara ett exempel på hur detta protokoll kan ge värdefull information om fördelningen och mängder av metaller i någon biologisk matris. Även framställning av standardreferensmaterial kan vara svår, är det ett experiment som kan utföras en gång och arkiveras för senare användning.
LA-ICP-MS har vissa fördelar jämfört med alternativa metoder, såsom synkrotron baserade röntgen fluorescensmikroskopi, främst när det gäller tillgänglighet och känslighet. Det finns dock vissa nackdelar som bör beaktas när man förbereder ett experiment med hjälp av LA-ICP-MS, och som sådan är ofta en användbar kompletterande teknik för kemisk avbildning som innehåller alternativa metallanalystekniker, samt jämförande histokemi 5.
Anpassning till kända anatomiska särdrag hos mus hjärnan kan ge värdefull information om eventuell funktionell relationship mellan metallnivåer och rumsliga fördelning. Tidigare har vi använt Allen Brain Atlas online-resurs, 29, som är en öppen tillgång förvaringsplats för både anatomiska och genuttryck data i C57BL / 6 mushjärna att undersöka rumslig korrelation av både metall-beroende enzym uttryck 14 och neuroanatomi 27, 30. Andra resurser, såsom Gnagare Brain Workbench 31 finns också att hjälpa till med registrering och anpassning av metall bilder för att underlätta korrekt identifiering av distributions metall i ofta små anatomiska regioner.
Tillämpningar av denna teknik är användbara för att bedöma hur metallnivåer och ändra fördelning på mikro under både normala livshändelser (t.ex. åldrande) och sjukdomstillstånd; såväl som att studera effekterna av de båda metallinnehållande föreningar och läkemedel som är utformade för att rikta migtal metabolism. De nuvarande stora begränsningar av LA-ICP-MS som en bildteknik för rums bedömning distributions metall är genomströmning och känslighet. Det finns en kompromiss mellan analyshastigheten och spatial upplösning 5, 12, med bilder med högre upplösning kräver längre analystider. Tekniken är väl lämpad för biologiska elementen vid högre koncentrationer, även om element såsom mangan, kobolt och selen är begränsade på grund av deras låga förekomst i normal vävnad och / eller begränsningar i deras detektering genom konventionell ICP-MS. Nya framsteg i ICP-MS-teknik, såsom införandet av triple-kvadrupolsmass analysatorer möjliggöra målinriktat detektion av svåra analyter, såsom selen 32 vid högre känsligheter 33. Som ett teknikdrivet förfarande framsteg inom både laser och masspektrometri designen kommer att se denna avbildningsteknik fortsätter att utvecklas, vilket ökaranalyshastigheten och känslighet 34.
Acknowledgments
DJH och PAD stöds av en Australian Research Council Linkage Project (LP120200081) med Agilent Technologies och ESI Ltd. bidrag BK stöddes av Ruhr University Research School PLUS, finansierat av Tysklands Excellence Initiative [DFG GSC 98/3]. DJH delvis stöds av Ramaciotti Foundation. KK stöds av Sigrid Juselius Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
| PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
| Parafomaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
| Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5368 | Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
| Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
| Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
| Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
| Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
| Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
| 1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
| 65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
| 30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
| 10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
| Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
| NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
| Excel | Microsoft | n/a | |
| IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |
References
- Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
- Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
- Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
- New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
- Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
- Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
- Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912 (2005).
- Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
- Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
- Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53 (2009).
- Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690 (2008).
- Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159 (2012).
- Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
- Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
- Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
- Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
- Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
- Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
- Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
- Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
- Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
- Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
- Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
- Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
- Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
- Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
- Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
- Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4 (2007).
- Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
- Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
- Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).
