Protocol
1. Preparazione del terreno di coltura e di Piatti (10 min)
- Aggiungere 100 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino al 10% (FBS) per i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti V-parte inferiore.
- Rimuovere un pre-aliquotati-fiala di circa 100 ml di matrice semisolida dal congelatore 20 ° C e posizionarlo direttamente sul ghiaccio.
NOTA: Eseguire questa prima ganglio della radice dorsale (DRG) raccolta perché la matrice semisolida dura circa 30 minuti per raggiungere stato liquido sul ghiaccio, che è necessaria per le fasi successive. Il mancato mantenimento matrice semisolida su ghiaccio in ogni momento comporterà una matrice gocciolina di scarsa qualità. - Etichetta di vetro a fondo culture piastre con inchiostro permanente, creando identificatori unici in ciascuno dei quattro angoli sulla superficie inferiore della piastra. Posizionare le piastre lato destro in alto sul ghiaccio per raffreddare la superficie della piastra.
NOTA: resa ogni mouse 32 - 40 DRG, così etichettateli da 1 a 40. Non è necessario pre-raffreddare pipet punte, come suggerimenti refrigerati riscalderanno nel corso di collocare le goccioline di matrice, potenzialmente introdurre differenze di consistenza della matrice.
2. La dissezione di Murine DRG (45 min)
- Euthanize un mouse nudi atimici secondo protocolli di laboratorio specifici, ad esempio attraverso l'uso di una camera di CO 2 e una toracotomia.
- Impostare l'area dissezione e microscopio. Utilizzare la parte inferiore pulito, sterilizzato, e piatto di contenitori in polistirolo per 15- o conici 50 mL.
NOTA: Inoltre, sono adatti per l'uso come la superficie dissezione, come sono economici, monouso, e consentire il fissaggio della colonna con perni o aghi. Utilizzare solo strumenti sterilizzati e aghi. - Sotto visione naturale, fare una incisione longitudinale lungo la colonna vertebrale dalla radice della coda alla testa del mouse con un paio di forbici sottili dritte o curve.
- Utilizzare le stesse forbici per dividere trasversalmente al di sotto del sacral rachide. Sezionare entrambi i lati della colonna vertebrale tutta la strada fino alla base cranica usando le forbici. A questo punto, assicurarsi che la colonna vertebrale cervicale è sezionato cranialmente quanto possibile con le forbici.
- Osservare fine cervicale della colonna vertebrale sotto il microscopio operatorio a bassa potenza. Il midollo spinale bianca è evidente nel mezzo di un anello osseo, che è circondata da quantità variabili di muscoli paravertebrali e dei tessuti molli.
- Dividere la dorsale o aspetto superiore dei primi 2 - 3 corpi vertebrali con le forbici a molla microscopici. Utilizzando l'azione della molla delle forbici, aprire questo ossea iniziale tagliare per garantire che la dissezione corpo vertebrale avvenuta alla linea mediana. Continuare piccoli incrementi verso il sacrale e quindi bisect rachide completando i tagli identiche sul faccia ventrale o inferiore dei corpi vertebrali.
NOTA: mancata garantire la dissezione linea mediana della colonna vertebrale ossea si tradurrà in una resa DRG inferiore. - A thipunto s, la colonna vertebrale è divisa in due metà. Mettere una emi-colonna vertebrale a parte, con il midollo spinale in atto e rivolto verso il basso su un piatto sterile.
NOTA: Lasciare il midollo spinale in atto impedirà i DRG si secchi, come i DRG sono profonde al midollo spinale. - Fissare due estremità dell'altro emi-spinale con due aghi calibro 18 sulla piattaforma polistirene dissezione. A partire dalla fine cervicale (che è evidente in quanto la colonna vertebrale è stretto, il DRG sono più vicini l'uno all'altro, e ci sono inserzioni costola), sbucciare delicatamente il midollo spinale da circa 4 livelli vertebrali.
- Osservare i nervi sensoriali (di solito due) che collegano il DRG. Nella zona in cui i nervi inseriscono al DRG, prenda delicatamente la fascia circostanti con una pinza microscopici. Sezionare e tagliare questa fascia e altri tessuto nervoso con le forbici a molla microscopici per liberare il DRG. retrazione Gentle porterà DRG fuori dalla sua posizione all'interno della colonna vertebrale ossea.
NOTA: L'aumento dellaalimentazione del microscopio in questa fase è vantaggiosa. Crush lesioni al DRG limiterà in modo significativo la crescita dei neuriti. Questo è evitato mai afferrare direttamente il DRG, bensì afferrando la fascia circostanti. - Tagliare il nervo periferico (DRG ha generalmente un nervo periferico, che è profondo relativo alla vista dissezione) con le forbici a molla microscopici per rilasciare il DRG.
NOTA: È più facile accertare dove le estremità nervose e DRG inizia mentre sulla tensione, rendendo questo taglio il più vicino possibile al DRG a questo punto è ideale. Una volta che questo ramo distale è tagliato, i rami prossimali vengono tagliati pure. - Tagliare il DRG di eventuali fibre nervose randagi o allegati fasciali con le forbici primavera microscopici. Dopo un adeguato isolamento, posizionare il DRG nel medium temperatura ambiente all'interno della piastra a 96 pozzetti V-bottom.
NOTA: Posizionamento di un fondo scuro sotto la piastra fa visualizzare il sub-mm DRG bianchi più facile. Solo mettere un DRG in EACh ben; questo modo, possono essere rappresentato più facilmente nei passaggi successivi. - Ripetere questo processo fino in fondo un emi-colonna vertebrale e poi l'altro. Ogni lato produce 16 - 20 DRG, per un totale di 32 - 40.
NOTA: Se ci sono meno DRG di questo, la dissezione della colonna vertebrale deve essere effettuata ulteriormente craniale e / o caudalmente. I DRG diventano sempre meno ben definito come si procede caudale.
3. Preparazione del semiduri Matrix goccioline (<1 min per piastra)
- Rimuovere una lastra di vetro ben inferiore dal ghiaccio e posizionarlo su un blocco di ghiaccio sotto il microscopio operatorio. Assicurarsi che la aliquota di matrice rimane sul ghiaccio in ogni momento.
- Posizionare una goccia 1,5 ml di matrice in ciascuno dei quattro angoli della piastra con fondo di vetro con un 2-microlitri o 10 microlitri micropipetter, lasciando una distanza almeno grande quanto la stessa goccia dal bordo del vetro bene.
- Posizionare la punta della pipetta direttamente suil vetro in un angolo di 45 gradi. Lentamente pipettare la matrice. Lentamente allontanarsi dal fondo di vetro dopo la matrice è impegnata sulla piastra.
NOTA: La tensione superficiale tra la matrice ed il vetro dovrebbe creare un emisfero perfetto ogni volta. - Arrestare pipettaggio appena prima della punta è vuoto, in quanto l'iniezione accidentale di aria nel gocciolina matrice rende il diametro della goccia matrice molto più grande ed è difficile da rimuovere.
NOTA: l'utilizzo di una seconda mano per stabilizzare la mano pipettaggio facilita il posizionamento più accurato.
- Posizionare la punta della pipetta direttamente suil vetro in un angolo di 45 gradi. Lentamente pipettare la matrice. Lentamente allontanarsi dal fondo di vetro dopo la matrice è impegnata sulla piastra.
4. Inserimento di DRG in semiduri Matrix goccioline (<2 min per piastra)
- Lasciare la piastra con le goccioline matrice brevemente a temperatura ambiente (~ 1 min). Questo irrigidisce leggermente la matrice, rendendo più facile per il posizionamento preciso del DRG.
- Scoop (non cogliere) il DRG delicatamente con una pinza microscopiche chiuse nella mano sinistra. Ancora una volta, un fondo scuro contro il piccolo, biancoDRG facilita la visualizzazione. Trasferire il DRG alla punta di un ago 21-gauge nella mano destra. Questo trasferimento lascerà i media residua sulle pinze.
- Inserire delicatamente la DRG nel mezzo della goccia di matrice utilizzando l'ago 21-gauge (Figura 1). La maggior parte del tempo, il DRG saranno facilmente rilasciare nella matrice e quindi possono essere posizionati centralmente con l'ago.
- Se il DRG attacca all'ago, utilizzare le pinze microscopici per spingere il DRG fuori dell'ago e nella gocciolina di matrice. Wick supporto via eccesso dalla pinza microscopici con un laboratorio di pulire.
NOTA: Introdurre supporto alla matrice altera il diametro, il volume e la consistenza del test. Un blocco di ghiaccio con il colore o la scrittura colorata offre il contrasto di fondo, che facilita la visualizzazione di questo delicato processo.
- Se il DRG attacca all'ago, utilizzare le pinze microscopici per spingere il DRG fuori dell'ago e nella gocciolina di matrice. Wick supporto via eccesso dalla pinza microscopici con un laboratorio di pulire.
- Dopo la piastra ha quattro DRG, eseguire un controllo finale per garantire che il DRG è al centro della goccia matrice. Effettuare le regolazionise necessario con l'ago 21-calibro.
- Trasferire la piastra di completamento di un incubatore a 37 °. Questo rafforzerà la matrice semisolida e fissare il DRG in posizione.
- Ripetere questa procedura per tutte le DRG. Mettere goccioline di matrice vuoti senza un DRG come il controllo negativo.
- Aggiungere 4 ml di DMEM con 10% FBS supporti per ogni piatto fondo di vetro dopo aver completato tutti i piatti e li espone alla 37 ° C incubatore per almeno 3 minuti. Porre la piastra con una leggera angolazione e aggiungere lentamente il mezzo, in modo tale che entra in contatto con le unità matrice DRG.
NOTA: Se si aggiunge troppo velocemente o con forza il medium, la matrice e / o DRG può diventare sloggiato. - Conservare i saggi nel 37 ° C incubatore per le prossime 48 - 72 ore.
NOTA: Esame periodico dei saggi mostrerà conseguenza circonferenziale dei neuriti verso il bordo della matrice (Figura 2). Quando i neuriti sono superiori tre quarti della strada per la matrice,è opportuno piastra le cellule.
5. Preparazione della testa e del collo cellule tumorali
NOTA: Le linee cellulari diverse testa e cellule di carcinoma delle cellule squamose del collo possono essere utilizzati in questo disegno sperimentale.
- Mantenere le linee di carcinoma delle cellule squamose cellule in DMEM con 10% FBS in fusti preferiti o piastre di coltura in un incubatore a 37 °. Per preparare le cellule per la sperimentazione, l'aspirazione tutto il medium dal pallone di coltura o un piatto e lavare due volte con PBS. Sospendere le cellule aggiungendo un'appropriata quantità di 0,025% tripsina per 5 minuti, seguito da DMEM con 10% FBS. Dispensare 4 ml della miscela delle cellule e dei media in capsule di Petri 6-mL.
NOTA: una piastra di coltura a 6 ml fornisce più di abbastanza cellule, anche se meno del 50% confluenti. - Esporre le linee di cellule HNSCC alle diverse condizioni di 24 ore prima della colorazione e placcatura sul test DRG. Re-dosare la condizione di una volta che le cellule sono placcati per mantenere una environme coerentent.
NOTA: Aggiungere gli anticorpi, fattori di crescita, citochine, o altre molecole per i piatti di coltura cellulare 1 - 2 giorni dopo la dissezione del mouse e l'impianto del DRG nella matrice. - Aggiungere macchie di cellule fluorescenti 1 h prima placcatura le cellule (2 - 3 giorni dopo la raccolta e l'impianto DRG nella matrice).
NOTA: Le macchie particolari usati qui passare liberamente attraverso la membrana cellulare; tuttavia, dopo reagire con gruppi tiolici intracellulari, la macchia rimane all'interno della cellula e viene trasmesso alle cellule figlie. La colorazione facilita notevolmente la visualizzazione all'interno dei saggi. Queste macchie temporanee sono ideali per questi saggi perché la fluorescenza è presente per 2 - 3 giorni, che è il termine di questi esperimenti. Esso consente anche l'uso di molti colori diversi e elimina la necessità di creare linee cellulari trasfettate proteine fluorescenti.- Preparare 10 mM di soluzione colorante miscelando 2 ml di 10 mM macchie stock cellule in 2 ml di DMEM senza sieroper ogni condizione cellule. Riscaldare questo a 37 ° C prima di aggiungere alle celle.
- Rimuovere il terreno di coltura all'interno della piastra 6-mL, lasciando le cellule aderenti HNSCC sulla piastra. Aggiungere 2 ml di PBS (PBS) e rimuovere 2 ml di 10 macchia cellule micron / DMEM senza siero aggiunto a ogni piatto
- Riportare la piastra di coltura a 6 ml con la macchia cella a 37 ° C incubatore per 40 min.
- Dopo 40 min, aspirare il terreno. Aggiungere 2 ml di PBS e la aspirerà. Aggiungere 1 ml di 0,025% tripsina ad ogni piatto e sostituirli nel 37 ° C incubatore.
- Aggiungere 2 ml di DMEM con 10% FBS dopo il 3 - 5 minuti e trasferire le cellule in sospensione in una provetta conica da 15 ml. Spin le cellule e risospeso in 1 ml di DMEM con 10% FBS.
- Contare le cellule con un emocitometro o contatore automatico di cellule, e quindi aggiungere DMEM con 10% FBS per creare una concentrazione cellulare finale di 300.000 cellule per ml.
6. placcatura testa e NLe cellule tumorali eck
- Rimuovere le piastre con fondo di vetro con i saggi di matrice-DRG dal termostato.
NOTA: Anche in questo caso, essi sono appropriati quando neuriti sono almeno il 75% del fino al bordo della matrice, che generalmente si verifica dopo 2 - 3 giorni. Questo si vede meglio utilizzando almeno un obiettivo 10X. - Aspirare il terreno all'interno della piastra con fondo di vetro. Completamente aspirare il terreno all'interno del vetro e senza rimuovere le unità di matrice DRG.
- Elaborare 200 ml di 300.000 cellule / ml di media utilizzando una pipetta da 200 ml. Mettere due gocce di cellule su ogni saggio matrice-DRG. Eseguire questo passaggio per ogni goccia di matrice, la creazione di quattro ripetizioni di ogni condizione di cella su una piastra.
NOTA: La forma emisferica della matrice permette alle cellule di stabilirsi in un anello lungo la periferia del test (Figura 3a, Figura 3b). Trovare una pipetta con un trigger liscia rende il posizionamento di uniforme scende molto più facile. - Confermare il numero di cellule simili e distribuzione delle diverse condizioni di cellule sotto 4X microscopia.
- Posizionare le lastre di vetro-fondo nel 37 ° C incubatore per circa 60 min. NOTA: Anche se c'è solo una piccola quantità di cellule e dei media (~ 150 mL), i saggi non si asciugano fino a diverse ore di tempo incubatore sono trascorsi.
- Dopo 60 min, aggiungere delicatamente 4 ml di DMEM con 10% FBS lungo la parete laterale della piastra di fondo di vetro.
NOTA: Per un periodo di tempo, le cellule parzialmente aderiscono al fondo piatto, e il metodo di aggiunta del mezzo non disturba le cellule. Diversi tipi di cellule fanno prendere più o meno tempo per iniziare ad aderire alla lastra di vetro-bottom. - Sostituire tutte le droghe esogeni o fattori di crescita in questo momento per mantenere i livelli di concentrazione precedenti.
- Riportare i test per la 37 ° C incubatore, tranne quando vengono esaminati al microscopio. Quantificare i risultati di questo test da immagini microscopiche. In breve, contare i fili di invasione perineurale conin quattro quadranti usando un'immagine microscopica 4X.
NOTA: Un microscopio con un 4X capacità oggettivi e fluorescenza è adeguata per la foto-documentare i test. La dimensione dei saggi adatta bene all'interno del campo di un obiettivo 4X, che è dettagliato sufficiente a catturare le singole aree di invasione perineurale. invasione perineurale si manifesta entro 24 ore, ma dopo 48 h, l'integrità dei saggi comincia a indebolirsi, come le cellule tumorali dividono lungo la periferia della matrice e invadere. Al di là di 48 ore, vi è anche sostanziale efflusso dei fibroblasti del DRG, che oscura la visualizzazione usando la microscopia in campo chiaro. Pertanto, è consigliabile foto-documento i risultati con 4X microscopia almeno due volte durante questa finestra (ad esempio, a 24 e 48 ore dopo placcatura le cellule tumorali). Essere consapevoli che questi sono saggi 3-dimensionale, ed è difficile completamente l'immagine intero test. Più invasione perineurale si verifica in un piano dal basso della piastra, dove tegli cellule sono incorporati nella matrice leggermente sopra il fondo della piastra. Poiché questo piano è vicino a orizzontale, la stragrande maggioranza dei neuriti con cellule tumorali vengono catturate un'immagine singolo livello 4X in.
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Representative Results
Dopo la dissezione del DRG e il posizionamento all'interno della gocciolina di matrice, l'aspetto del dosaggio dovrebbe assomigliare alla Figura 1. Si noti che il DRG non sia perfettamente circolare, ma è centrato all'interno della gocciolina di matrice. Questo permette la conseguenza di neuriti a 360 gradi, illustrata parzialmente in figura 2. Essere consapevoli del fatto che alcune parti del DRG inviano neuriti più velocemente e in numero maggiore rispetto ad altri, in genere corrispondente al punto in cui la efferenti e rami nervosi afferenti sono entrati e usciti DRG, rispettivamente. Abbiamo conto di questo e per le differenze di dimensioni tra DRG di placcatura in modo casuale i DRG in gruppi di 4 e quindi assegnare casualmente un dato piatto per ogni condizione di cella.
Come descritto sopra, piastra linee cellulari HSNCC volta neuriti hanno esteso almeno ¾ della fino al bordo della matrice, che è tipicamente sugiorno 3. Le cellule aggiunte formano un anello circonferenziale intorno alla matrice (Figura 3a). Successivamente abbiamo fotografare il test il giorno 4 (figura 3b) e il giorno 5 (Figura 3c). La linea cellulare mostrato qui (Fadu) dimostra una capacità superiore alla media per tracciare lungo neuriti. La linea cellulare SQCCY1 mostrato nella Figura 4, tuttavia, mostra poca o nessuna tendenza ad invadere i saggi.
Quando si utilizza una nuova linea di cellule, è importare di utilizzare diversi controlli negativi per esaminare come quella particolare linea cellulare si comporta in tutto il saggio. Primo, cellule piastra intorno un saggio "vuoto" composto da matrice da sola (Figura 5). Tutte le linee cellulari che nostro laboratorio ha esaminato attivamente dividono intorno alla matrice, ma non entrano o estendono sopra la parte superiore della matrice. Quando le cellule vengono lasciate eccessive sulla sommità della matrice, ci può essere una crescita significativa sulla matrice. Ciò evidenzia la necessità di eNsure che come molte cellule cadono verso la periferia della matrice possibile, invece di essere lasciata riposare e dividere sulla sommità della matrice. Questo può essere realizzato picchiettando delicatamente sulle piastre prima che le cellule aderiscono o pipettando piccole quantità di supporto direttamente sulla parte superiore della goccia matrice una volta che le cellule hanno iniziato ad aderire alla lastra di vetro.
Un secondo controllo negativo, in cui le cellule vengono piastrate il giorno stesso che il DRG è posizionato all'interno della matrice, può essere eseguito. L'obiettivo di questo approccio è quello di dimostrare che non è un'attrazione neurotropo che spinge le cellule a DRG, ma piuttosto che la presenza dei neuriti è obbligatoria. Inoltre, quando le cellule tumorali hanno risieduto lungo la periferia della matrice per più di 2 giorni, il bordo della matrice diventa indistinta. La matrice poi comincia a sollevare di fuori dal fondo di vetro e può essere trovato libero di fluttuare nei media poco dopo. Per questo motivo, questa protocol descrive placcatura cellule HNSCC volta neuriti hanno esteso 75% della distanza dal bordo della matrice.
Ci sono innumerevoli opzioni per quantificare i risultati di ciò che sono visivamente differenze molto evidenti tra i saggi. In uno di questi metodi, le immagini dei test sono divisi in quattro quadranti con una verticale e una linea orizzontale (figura 6). Un punto viene assegnato per ogni quadrante che ha almeno una stringa di PNI. Se il PNI estende oltre il 50% della distanza tra il bordo della matrice al DRG, poi 2 punti sono assegnati invece. In questo modo, un punteggio di 0 - può essere assegnato 8 punti. Il principale vantaggio di questo sistema è che saggi che hanno troppi unità PNI per contare possono essere rapidamente valutati. Uno svantaggio è che è non esprimere adeguatamente il grado di PNI (cioè, un quadrante con 1 neuriti con invasione 100% della distanza al DRG riceve lo stesso punteggio (2) come quadrant con 10 neuriti simile-invasi). Il confronto delle immagini campo chiaro e fluorescenti rende questo sistema molto facile, anche con una significativa efflusso fibroblasti.
Scoring campione è mostrato in Figura 6. L'utilizzo di questo sistema di punteggio a quattro quadranti per la Figura 3, 0 punti, 2 punti e 7 punti sono stati assegnati per i pannelli figura, 3a, Figura 3a, e Figura 3c, rispettivamente. Figura 4 ha ricevuto un punteggio di 2 punti e 2 punti in pannelli Figura 4a e 4b Figura, rispettivamente. I dati nella tabella 1 mostra i risultati di diversi esperimenti usando linee cellulari Fadu e SQCCY1. Si noti che anche con una scala di classificazione limitata come questo, differenze statisticamente significative nei punteggi medi quattro quadranti sono facilmente ottenuti usando il campioni indipendenti t-test.
Figura 1. DRG-matrix Assay. Posizionamento corretto del ganglio della radice dorsale all'interno della gocciolina di matrice, indicata con la microscopia in campo chiaro a 4X. Barra di scala rappresenta 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. conseguenza di neuriti. Neuriti sono assenti il giorno 0 subito dopo aver posizionato il DRG nella gocciolina matrice (A). Di giorno 1 (B), crescita dei neuriti è evidente a 10 volte al microscopio campo chiaro. La crescita dei neuriti continua il giorno 2 (C) e il giorno 3 (D); Tuttavia, nota l'efflusso dei fibroblasti. Scale barra rappresenta 0,1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Assay DRG-matrice Fadu. Testa e collo squamose linea di carcinoma a cellule Fadu aggiunto perifericamente attorno ad un test il giorno 3 (A), mostrata in verde fluorescente e la microscopia in campo chiaro a 4X progressiva invasione neurale è visto il giorno 4 (B) e il giorno 5 (C). Barra di scala rappresenta 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. DRG- Assay matrice SQCCY1. Testa e la linea del collo a cellule squamose SQCCY1 aggiunto il giorno 4 (A), mostrata in campo chiaro e microscopia a fluorescenza verde a 4X. Si noti che questa linea cellulare non è così abile a invasione perineurale come Fadu, anche di giorno 5 (B). Barra di scala rappresenta 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Assay Matrix con Fadu. Testa e linea di cellule carcinoma a cellule squamose del collo Fadu aggiunto intorno ad una gocciolina matrice senza un DRG il giorno 3. campo chiaro e microscopia a fluorescenza verde (4X) mostrato il giorno 4 (A). Si noti che le cellule tumorali non entrano nella matrice o crescono sopra la parte superiore di esso, anche di giorno 5 (B). Barra di scala rappresenta 1 mm.TTP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Metodo quattro quadranti per Assay quantificazione. Un punto è assegnato per ogni quadrante con PNI meno del 50% della distanza dal bordo della matrice al DRG. 2 punti sono assegnati quando il PNI estende oltre il 50%. Il primo esempio (A) riceverebbe un punteggio di 5 (1 punto per ogni quadrante per una PNI meno del 50%, eccetto il basso a destra, che ha un PNI estende oltre il 50%, in cui sono segnati 2 punti). Il secondo esempio (B) è ottenuto come 8 (a PNI oltre il 50% nei quattro quadranti). Barra di scala rappresenta 1 mm. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.
| Linea cellulare | n | 4 ° giorno | SD | P-value | giorno 5 | SD | P-value |
| Fadu | 24 | 2.88 | 1.42 | arbitro | 6.04 | 0.35 | arbitro |
| SQCCY1 | 20 | 0.60 | 0.60 | <0.001 | 1.05 | 0,17 | <0.001 |
Tabella 1. Confronto del PNI Tra Fadu e SQCCY1. I punteggi medi quattro quadranti come mostrato in figura 6 tra linee cellulari Fadu e SQCCY1 a 24 ore (giorno 4) e 48 h (giorno 5) dopo che le cellule sono state piastrate in tutto il test DRG-matrice. I confronti sono effettuate con il sam indipendentepio t-test e presentato con la deviazione standard (SD) e P-valori.
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Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
I passi più importanti all'interno di questo protocollo sono la dissezione precisa e l'estrazione del gangli spinali. La corretta resezione della colonna vertebrale e una divisione linea mediana-longitudinale in due emi-spine sono fondamentali per ottenere un gran numero di DRG. Durante la dissezione dei singoli DRG, il ganglio non dovrebbe mai essere gestiti direttamente, ma piuttosto la fascia circostanti deve essere afferrata con le pinze microscopici. In caso contrario, questo si tradurrà in una lesione da schiacciamento del DRG, che è probabilmente la principale causa di fallimento per crescita dei neuriti. E 'molto meglio sotto-tagliare le tessuti neurali circostanti durante la dissezione che al rischio di un eccesso di movimentazione DRG e ottenendo nessuna crescita dei neuriti nel saggio.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Il protocollo sperimentale descritto sopra riflette l'ottimale incontratohodology stabilito da un gran numero di aggiustamenti procedurali effettuati nell'arco di diversi anni. Elencate direttamente sotto il gradino corrispondente nella sezione del protocollo è un certo numero di note e le insidie che hanno portato dalle esperienze degli autori quando si utilizza questo metodo. Dato il numero di passaggi necessari, ci sono infatti molte modifiche che possono essere fatte a questo protocollo dagli investigatori futuri. Come esperienza con queste modifiche cresce, si prevede che ulteriori mezzi di risoluzione dei problemi saranno sviluppati in base alle preferenze del gruppo di sperimentazione.
LIMITI DELLA TECNICA
Ci sono tre principali limitazioni a questa tecnica. La prima è che neuriti molto sottili sono utilizzati come un surrogato della grande invasione neurale, che è quello che i patologi osservano nei campioni tumorali. Non è noto quale sia il ruolo dei neuriti, al contrario di neuroni, sono in vivo poiché identificare perineuriteinvasione è oltre le capacità di un esame istopatologico di routine. In secondo luogo, invasione perineurale è una forma di invasione del tessuto molle che non può semplicemente comportare cellule tumorali e un neurone adiacente, come è simulato in questo saggio. Come, fattori esogeni tali native della vitro ambiente tumore nel mancano in questo saggio. Infine, il periodo di tempo durante il quale PNI può essere studiato è limitato a circa 48 h grazie alla combinazione di fibroblasti efflusso e perdita di integrità della matrice. In questo modo, le linee cellulari che sono efficaci a invasione neurale, ma sono lenti di divisione e / o di invadere ci mancherà e presume di non essere abile a PNI.
Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
A nostra conoscenza, questo è l'unico modello in vitro attualmente disponibile per esaminare PNI in HNSCC. Data la frequenza con cui si verifica PNI in HNSCC e la limitata conoscenza dei meccanismi cheAttualmente esiste, questo metodo è vantaggioso per diversi motivi. Innanzitutto, ha un tasso di successo molto alto ed eccellente riproducibilità. Il tempo totale esperimento è anche relativamente breve rispetto ai protocolli simili 12,17-19. Infine, con il gran numero di saggi che possono essere generati da un singolo mouse, molte condizioni possono essere testati con repliche scientificamente appropriate. La combinazione di questi fattori consente la rapida valutazione di molte condizioni diverse con risultati coerenti.
Allo stesso tempo, la qualità del test consente esame più dettagliato delle interazioni tra le cellule tumorali e le neuriti. L'uso di live-cell imaging consente per l'apprezzamento del processo di crescita dei neuriti e l'invasione delle cellule HSNCC in forma di video time-lapse. L'aggiunta di cellule fluorescenti-macchiato crea molto chiara differenziazione tra le cellule tumorali e materiale di base, come i fibroblasti e denso ou neuritetgrowth (rossa che auto-fluorescenza). Se seguendo questo protocollo o quelli descritti da altri, questo disegno sperimentale generale è nella sua relativa infanzia, e vi è lontano da un gold standard per lo studio in vitro della PNI. Per queste ragioni, più si avvicina a questo test che sono descritti in dettaglio, maggiore è la possibilità per lo sviluppo collaborativo di una metodologia ideale.
Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Così come ci sono diversi approcci diversi per l'impostazione dei saggi, ci sono diversi approcci alla misurazione dei risultati. Nel testo di cui sopra, è stato presentato un metodo unico per rapidamente quantificare il grado di invasione perineurale in ogni test. Questo è l'ideale per lo screening l'impatto di numerose vie diverse su PNI, tanto più che si può isolare 32 - 40 DRG per il mouse. Ci sono una serie di tecniche di imaging avanzate per valutare PNI,inclusa la quantità di fluorescenza in una data zona, la distanza e la velocità di invasione delle cellule, e il numero grezzo delle cellule all'interno del dosaggio. Una volta che la parte dinamica dell'esperimento è terminata, le cellule all'interno del dosaggio e / o il surnatante possono essere raccolti per ulteriori analisi molecolari.
Questa metodologia sperimentale offre l'opportunità di chiarire i meccanismi coinvolti nella PNI di HNSCC e di altri tumori. Questa conoscenza può guidare lo sviluppo di terapie per indirizzare i percorsi di PNI, che, attualmente, sono privi di HNSCC. il targeting specifico di PNI quando identificato come una caratteristica patologica avversa potenzialmente in grado di ovviare alla necessità per le non-specifici trattamenti adiuvanti, come la radioterapia e la chemioterapia, che sono attualmente utilizzati.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES | Corning Cellgro | 10-090-CV | Manassas, VA |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11150 | Flowery Branch, GA |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies Corporation | 25200056 | Grand Island, NY |
| Phosphate buffered Saline 1x | Corning | 21-040-CM | Manassas, VA |
| Matrigel hESC-Qualif Mouse | Corning Incorporated | 354277 | Bedford, MA |
| Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Ashland, MA |
| SteREO Discovery.V8 Operating Microscope | Carl Zeiss Microimaging | 495015-0021-000 | Thornwood, NY |
| Schott ACE I light source | Schott | A20500 | Germany |
| CellTracker | Life Technologies Corporation | C2925 | Carlsbad, CA |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G | BD | 305195 | Franklin Lakes, NJ |
| Premium Microdissecting Tweezer | Harvard Apparatus | 60-3851 | Holliston, MA |
| Premium Fine Operating Standard Scissors | Harvard Apparatus | 52-2789 | Holliston, MA |
| Premium Spring Scissors | Harvard Apparatus | 60-3923 | Holliston, MA |
| Dressing Forceps | Harvard Apparatus | 72-8949 | Holliston, MA |
| Athymic nude mice (002019) | Jackson Laboratory | 002019 | Bar Harbor, ME |
References
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).
- Hinerman, R. W., et al. Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience. Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).
- Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).
- Woolgar, J. A., Scott, J. Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth. Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).
- Tai, S. K., et al. Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy. Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).
- George, D. L., et al. Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study. Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).
- Fagan, J. J., et al. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).
- Soo, K. C., et al. Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck. Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).
- Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).
- Liao, C. T., et al. Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).
- Fan, K. H., et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- He, S., et al. GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- Bakst, R. L., et al. Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment. PLoS One. 7 (6), 39925 (2012).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion. J Vis Exp. (110), (2016).
