Protocol
1. Fremstilling af dyrkningsmedium og fade (10 min)
- Tilsæt 100 pi Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) til brøndene i en 96-brønds V-bundplade.
- Fjern en forud alikvoteret-hætteglas med ca. 100 pi halvfast matrix fra 20 ° C fryser og placere den direkte på is.
BEMÆRK: Gør dette før dorsale ganglion (DRG) høst, fordi den halvfaste matrix tager cirka 30 minutter at nå flydende tilstand på is, som er nødvendig for de efterfølgende trin. Undladelse af at føre den halvfaste matrix på is hele tiden vil resultere en dårlig kvalitet matrix dråbe. - Label glasbund kulturer plader med permanent blæk, skabe unikke identifikatorer i hvert af de fire hjørner på undersiden af pladen. Placer pladerne højre side opad på is for at afkøle pladeoverfladen.
BEMÆRK: Hver mus udbytter 32-40 DRG, så mærke dem fra 1 til 40. Det er ikke nødvendigt at pre-chill pipet tips, som kølede tips vil varme i løbet af placere matrix dråber, potentielt indføre forskelle i matrix konsistens.
2. Dissektion af murint DRG (45 min)
- Aflive en atymiske, nøgne mus som pr specifikke laboratorie protokoller, såsom ved anvendelse af en CO 2 kammer og en torakotomi.
- Opsæt dissektion området og mikroskop. Brug ren, steriliseret, og flad underside polystyren beholdere til 15- eller 50-ml koniske rør.
BEMÆRK: De er endvidere egnede til anvendelse som dissekere overflade, da de er billige, engangsbrug, og tillader fiksering af rygsøjlen under anvendelse af stifter eller nåle. Brug kun steriliserede instrumenter og nåle. - Under naturlige vision, lave en langsgående snit langs rygsøjlen fra roden af halen til hovedet af musen med et par lige eller buede fine sakse.
- Brug de samme saks til tværgående kløft under Sacral rygsøjlen. Dissekere begge sider af rygsøjlen hele vejen op til kraniet base ved anvendelse af en saks. På dette tidspunkt, at halshvirvelsøjlen gennemskæres kranialt så vidt muligt med en saks.
- Observere cervikal ende af rygsøjlen under operationsmikroskopet ved lav effekt. Den hvide rygmarv er tydelig i midten af en knoklet ring, som er omgivet af variable mængder af paraspinale muskler og blødt væv.
- Split ryg eller overlegen aspekt af de første 2 - 3 hvirvellegemer med mikroskopiske foråret saks. Brug af fjedervirkning af saksen, åbne denne indledende benede formindskes for at sikre, at hvirvellegemet dissektion forekom ved midterlinjen. Fortsæt i små trin mod sakrale rygsøjlen, og derefter gennemskære rygsøjlen ved at udfylde de samme nedskæringer på den ventrale eller ringere aspekt af hvirvellegemerne.
BEMÆRK: Manglende sikring midterlinjen dissektion af den benede rygsøjlen vil resultere i en lavere DRG udbytte. - Ved this punkt, er rygsøjlen opdelt i to halvdele. Placer en hemi-ryg til side, med rygmarven på plads og nedad på en steril plade.
BEMÆRK: forlader rygmarven på plads vil forhindre DRG tørrer ud, da DRG er dybe til rygmarven. - Enten til enden af den anden hemi-rygsøjlen med to 18-gauge nåle på polystyren dissekere platform. Begyndende ved den cervikale ende (som det fremgår fordi rygsøjlen er smallere, DRG er tættere på hinanden, og der er ribben indsættelser), forsigtigt skrælle rygmarven fra omkring 4 vertebrale niveauer.
- Overhold de sensoriske nerver (normalt to) forbinder DRG. I det område, hvor nerverne indsætte til DRG Klem forsigtigt de omkringliggende fascie med mikroskopiske pincet. Dissekere og trim denne fascia og andre nervevæv med de mikroskopiske foråret saks til at frigøre DRG. Blid tilbagetrækning vil bringe DRG ud af sin position i knoklet rygsøjlen.
BEMÆRK: Forøgelse afmikroskop magt på dette trin er gavnligt. Knus skade på DRG betydelig grad vil begrænse væksten i neuritter. Dette undgås ved aldrig at tage fat i DRG direkte, men snarere ved at gribe de omgivende fascia. - Skær den perifere nerve (DRG generelt har en perifer nerve, som er dyb i forhold til dissekere view) med de mikroskopiske fjeder saks til at frigive DRG.
BEMÆRK: Det er nemmest at fastslå, hvor nerve ender og DRG begynder mens spændinger, så gør denne nedskæring så tæt som muligt på DRG på dette punkt er ideel. Når denne distale gren er skåret, er de proksimale grene trimmet så godt. - Trim DRG af enhver omstrejfende nervefibre eller fascie vedhæftede filer med de mikroskopiske foråret saks. Efter tilstrækkelig isolation, placere DRG ind i stuetemperatur medium i 96-brønds V-bundplade.
BEMÆRK: Placering af en mørk baggrund under pladen gør visualisere sub-mm hvide DRG lettere. Kun placere én DRG i EACh brønd; denne måde, kan de tegnede sig for lettere i de efterfølgende trin. - Gentag denne proces hele vejen ned én hemi-ryg og derefter den anden. Hver side giver 16 - 20 DRG, i alt 32-40.
BEMÆRK: Hvis der er færre DRG end dette, skal gennemføres yderligere kranialt og / eller kaudalt dissektion af rygsøjlen. De DRG blive mindre og mindre godt defineret som et forløber kaudalt.
3. Fremstilling af Halvfaste Matrix dråber (<1 min pr plade)
- Tag et glas godt bundplade fra is og placere den på en isblok under drift mikroskop. Sørg for, at prøve af matrix forbliver på is på alle tidspunkter.
- Placer en 1,5-pi dråbe af matrix i hver af de fire hjørner af glas-bundplade med en 2-pi eller 10-pi micropipetter, efterlader en afstand er mindst lige så stor som den lille dråbe sig fra kanten af glasset godt.
- Placér spidsen af pipetten direkte påglasset i en 45 graders vinkel. pipetteres langsomt matrixen. bevæge sig langsomt væk fra glasset bunden efter matrixen er i indgreb på pladen.
BEMÆRK: overfladespænding mellem matricen og glas bør skabe en perfekt halvkugle hver gang. - Stop pipettering lige før spidsen er tom, fordi utilsigtet injektion af luft ind i matrixen dråbe gør diameteren af matricen dråben langt større og er vanskelig at fjerne.
BEMÆRK: Brug af en anden hånd til at stabilisere pipettering hånd letter mere nøjagtig placering.
- Placér spidsen af pipetten direkte påglasset i en 45 graders vinkel. pipetteres langsomt matrixen. bevæge sig langsomt væk fra glasset bunden efter matrixen er i indgreb på pladen.
4. Indsættelse af DRG i Halvfaste Matrix Droplets (<2 min per plade)
- Efterlad pladen med matrixen dråber kortvarigt ved stuetemperatur (~ 1 min). Dette afstiver lidt matricen, hvilket gør det lettere for den præcise placering af DRG.
- Scoop (ikke fatte) DRG forsigtigt med lukkede mikroskopiske pincet i venstre hånd. Igen, en mørk baggrund mod den lille, hvideDRG letter visualisering. Overfør DRG til spidsen af en 21-gauge nål i den højre hånd. Denne overførsel vil efterlade resterende medier på tangen.
- Sæt forsigtigt DRG ind i midten af matricen dråbe under anvendelse af 21-gauge nål (figur 1). Det meste af tiden, vil DRG let slipper ind i matrixen og derefter kan placeres centralt med nålen.
- Hvis DRG klæber til nålen, bruge de mikroskopiske pincet til at skubbe DRG off af nålen og ind i matrixen dråbe. Wick væk overskydende medier fra mikroskopiske pincet med en lab tørre.
BEMÆRK: Introduktion medier til matricen vil ændre diameter, volumen og konsistens af analysen. En isblok med farve eller farvet skriftligt giver baggrund kontrast, der letter visualisering af denne vanskelige proces.
- Hvis DRG klæber til nålen, bruge de mikroskopiske pincet til at skubbe DRG off af nålen og ind i matrixen dråbe. Wick væk overskydende medier fra mikroskopiske pincet med en lab tørre.
- Efter pladen har alle fire DRG, udføre en slutkontrol at sikre, at DRG er i centrum af matrixen dråbe. Foretag justeringerefter behov med 21-gauge nål.
- Overfør den færdige plade til en 37 ° C inkubator. Dette vil størkne den halvfaste matrix og fiksere DRG fast.
- Gentag denne proces for alle de DRG. Placer datoer matrix dråber uden en DRG som negativ kontrol.
- Tilsæt 4 ml DMEM med 10% FBS medier til hvert glas-bundplade efter endt alle plader og udsætte dem for 37 ° C inkubator i mindst 3 min. Pladen anbringes i en lille vinkel og tilsæt langsomt mediet, således at den gradvist kommer i kontakt med matrixen-DRG enheder.
BEMÆRK: Hvis der tilsættes mediet for hurtigt eller kraftigt, matricen og / eller DRG kan løsne sig. - Opbevar assays i 37 ° C inkubator i de næste 48 - 72 timer.
BEMÆRK: Periodisk undersøgelse af assays viser rundtgående udvækst af neuritter mod matrixen kant (figur 2). Når neuritter er større end tre fjerdedele af vejen til matrixen, deter passende til plade cellerne.
5. Forberedelse af hoved- og halscancer Cells
BEMÆRK: andre end hoved og hals pladecellecarcinom celler cellelinier kan anvendes i denne eksperimentelle design.
- Oprethold pladecellecarcinom cellelinier i DMEM med 10% FBS i foretrukne kolber eller dyrkningsskåle i en 37 ° C inkubator. Til fremstilling celler til eksperimenter, sugning alt mediet fra kulturen kolben eller skål og vaske det to gange med PBS. Suspendere cellerne ved tilsætning af en passende mængde på 0,025% trypsin i 5 minutter, efterfulgt af DMEM med 10% FBS. Pipette 4 ml af blandingen cellen og medier i 6-ml dyrkningsskåle.
BEMÆRK: En 6-ml kultur plade giver mere end nok celler, selv når mindre end 50% sammenflydende. - Udsætte HNSCC cellelinjer til forskellige forhold 24 timer før farvning og udpladning på DRG-assayet. Re-dosis tilstanden, når cellerne udplades til at opretholde en konsistent environment.
BEMÆRK: Tilføj antistoffer, vækstfaktorer, cytokiner eller andre molekyler til cellen dyrkningsskåle 1 - 2 dage efter muse dissektion og implantering af DRG i matrixen. - Tilføj fluorescerende celle pletter 1 time, før udpladning af celler (2 - 3 dage efter DRG høst og implantation i matrixen).
BEMÆRK: De særlige pletter der anvendes her passere frit gennem cellemembranen; men efter omsætning med intracellulære thiolgrupper, pletten forbliver i cellen og overføres til datterceller. Farvningen høj grad letter visualisering inden assayene. Disse midlertidige pletter er ideelle til disse assays fordi fluorescensen er til stede i 2 - 3 dage, hvilket er tidsrammen af disse forsøg. Det giver også mulighed for anvendelse af mange forskellige farver og forebygger behovet for at skabe fluorescerende protein-transficerede cellelinier.- Forbered 10 uM farveopløsning ved blanding 2 pi 10 mM stamopløsning celle pletter i 2 ml serumfrit DMEMfor hver celle tilstand. Varm dette til 37 ° C, før du tilføjer den til cellerne.
- Fjern kulturmediet indenfor 6-ml plade, forlader adhærente HNSCC celler på pladen. Tilsæt 2 ml phosphatbufret saltvand (PBS) og fjern 2 mL af 10 uM cellefarvende / serumfrit DMEM tilsat til hver plade
- Returnere 6-ml kultur plade med cellefarvende til 37 ° C inkubator i 40 min.
- Efter 40 min, aspireres mediet. Tilsæt 2 ml PBS og derefter suge det. Tilsæt 1 ml 0,025% trypsin til hver plade og erstatte dem i 37 ° C inkubator.
- Tilsæt 2 ml DMEM med 10% FBS efter 3 - 5 min og overføre de suspenderede celler til et 15 ml konisk rør. Spin cellerne og resuspenderes dem i 1 ml DMEM med 10% FBS.
- Tæl cellerne med et hæmocytometer eller automatiseret celletæller, og derefter tilføje DMEM med 10% FBS for at skabe en endelig cellekoncentration på 300.000 celler pr ml.
6. Belægning Hoved og Neck Cancer Cells
- Fjern glas-bund plader med matrix-DRG-analyser fra inkubatoren.
BEMÆRK: Igen, de er hensigtsmæssige, når neuritter er mindst 75% af vejen til kanten af matrixen, hvilket generelt sker efter 2 - 3 dage. Dette ses bedst ved anvendelse af mindst en 10X objektiv. - Aspirer medium i glas-bundplade. Aspirér medium inden glasset godt uden at fjerne matrix-DRG enheder.
- Udarbejder 200 pi af 300.000 celler / ml medium ved anvendelse af en 200-pi pipette. Placer to dråber cellerne over hver matrix-DRG-analysen. Udfør dette trin for hver matrix dråbe, skabe fire gentagelser af hver celle tilstand på én plade.
BEMÆRK: halvkugleform af matrixen tillader cellerne at slå sig ned i en ring langs periferien af assayet (figur 3a, figur 3b). Finde en pipette med en glat udløser gør placering af uniform falder langt lettere. - Bekræft lignende celleantal og distribution af de forskellige celle betingelser i henhold 4X mikroskopi.
- Placer glas-bottom plader ind i 37 ° C inkubator i ca. 60 min. BEMÆRK: Selv om der kun er en lille mængde af celler og medier (~ 150 ul), behøver de analyser ikke tørre ud, før adskillige timers inkubator tid er gået.
- Efter 60 min, forsigtigt tilsættes 4 ml DMEM med 10% FBS langs sidevæggen af glas-bundplade.
BEMÆRK: Over en tidsperiode, cellerne delvis klæber til pladen bund, og fremgangsmåden til at tilsætte mediet ikke forstyrrer cellerne. Forskellige celletyper gør tage mere eller mindre tid til at begynde at holde sig til glas-bundplade. - Erstat eventuelle exogene lægemidler eller vækstfaktorer på dette tidspunkt for at opretholde de tidligere koncentrationsniveauer.
- Retur assayene til 37 ° C inkubator, undtagen når de undersøges mikroskopisk. Tal på resultaterne af dette assay ved mikroskopisk billeddannelse. Kort fortalt tælle dele af perineurale invasion medi fire kvadranter ved hjælp af en 4X mikroskopisk billede.
BEMÆRK: En mikroskop med et 4X objektive og fluorescens kapaciteter er tilstrækkelig til foto-dokumentere analyserne. Størrelsen af assayene passer fint inden for et 4X objektiv, der er detaljeret nok til at fange de enkelte områder af perineural invasion. Perineural invasion viser sig inden for 24 timer, men mere end 48 timer, integriteten af assayene begynder at svække, som tumorcellerne opdele langs periferien af matrixen og invadere. Beyond 48 h, er der også en betydelig udstrømning af fibroblaster fra DRG, som tilslører visualisering ved hjælp brightfield mikroskopi. Derfor er det tilrådeligt at foto-dokument resultaterne med 4X mikroskopi mindst to gange i dette vindue (fx ved 24 og 48 timer efter udpladning tumorcellerne). Vær opmærksom på, at disse er 3-dimensionale analyser, og det er vanskeligt fuldstændigt billede af hele assay. Mest perineural invasion forekommer i et plan fra bunden af pladen, hvor than celler er indlejret i matrixen lidt over bunden af pladen. Fordi dette plan er tæt på vandret, er det store flertal af neuritter med tumorceller fanget i et enkelt-niveau billede på 4X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter dissektion af DRG og placeringen i matrixen dråben bør forekomst af assayet ligne figur 1. Bemærk, at DRG er ikke perfekt rund, men det er centreret i matrixen dråbe. Dette giver mulighed for udvækst af neuritter i 360 grader, delvist vist i figur 2. Vær opmærksom på at visse dele af DRG sende neuritter hurtigere og i større antal end andre, typisk svarende til hvor efferente og afferente nerve grene indtastet og afsluttet DRG hhv. Vi tage højde for dette og for størrelsesforskelle mellem DRG ved tilfældigt udpladning af DRG i grupper på 4 og derefter tilfældigt tildele en given plade til hver celle tilstand.
Som beskrevet ovenfor, belægges alle de HSNCC cellelinjer når neuritter har udvidet mindst ¾ af vejen til kanten af matrixen, som typisk er pådag 3. De tilføjede celler danner en rundtgående ring omkring matrixen (figur 3a). Vi efterfølgende fotografere assays på dag 4 (figur 3b) og dag 5 (figur 3c). Cellen linje vises her (FaDu) demonstrerer en over gennemsnittet mulighed for at spore langs neuritter. Den SQCCY1 cellelinien vist i figur 4, viser imidlertid lidt at ingen tilbøjelighed til at invadere assayene.
Ved brug af en ny cellelinje, men det er vigtigt at anvende adskillige negative kontroller for at undersøge, hvordan den bestemte cellelinje opfører omkring assayet. Først plade cellerne omkring en "blank" assay bestående af matrix alene (Figur 5). Alle cellelinier, vores laboratorium har undersøgt aktivt deler omkring matrixen, men ikke ind i eller strække sig over toppen af matrixen. Når alt for store celler efterlades på toppen af matrixen, kan der være betydelig vækst i matrixen. Dette understreger behovet for at ePÍ at så mange celler falder til periferien af matricen som muligt, snarere end at blive overladt til hvile og dividere oven på matrixen. Dette kan opnås ved forsigtigt at banke på pladerne før cellerne klæber eller ved pipettering små mængder medier direkte på toppen af matrixen droplet når cellerne er begyndt at klæbe til glaspladen.
En anden negativ kontrol, hvor cellerne udplades på den samme dag, som DRG placeres i matrixen, kan køres. Målet med denne fremgangsmåde er at vise, at det ikke er en neurotropisk tiltrækning, der driver celler til DRG, men snarere, at tilstedeværelsen af neuritter er obligatorisk. Endvidere, når tumorceller har boet langs periferien af matrixen i mere end 2 dage, matricen kant bliver utydeligt. Matrixen derefter begynder at løfte af off glas bunden og kan findes fritflydende i mediet kort derefter. Derfor dette protocol beskriver udpladning af HNSCC celler når neuritter har udvidet 75% af afstanden til kanten af matrixen.
Der er utallige muligheder for at kvantificere resultaterne af hvad er visuelt meget tydelige forskelle mellem analyser. I en sådan fremgangsmåde, er billederne af assayene opdelt i fire kvadranter med en lodret og en vandret linje (figur 6). Et punkt er tildelt til hver kvadrant, der har mindst en streng af PNI. Hvis PNI strækker sig ud over 50% af vejen fra kanten af matricen til DRG, derefter 2 point tildelt stedet. På denne måde, en score på 0 - kan 8 point tildeles. Den største fordel af dette system er, at assays med for mange PNI enheder tæller hurtigt kan vurderes. En ulempe er, at er ikke tilstrækkeligt udtrykke graden af PNI (dvs. en kvadrant med 1 neurit med invasion 100% af afstanden til DRG modtager den samme score (2) som en quadrant med 10 tilsvarende-invaderede neuritter). Sammenligning af lysfelt og fluorescerende billeder gør systemet meget let, selv med betydelig fibroblast efflux.
Prøve scoring er vist i figur 6. Brug af denne fire-kvadrant Pointsystemet for figur 3, 0 point, 2 point og 7 point blev tildelt til paneler Figur 3a, 3a, og figur 3c hhv. Figur 4 fik en score på 2 point og 2 point i paneler Figur 4a og figur 4b hhv. Dataene i tabel 1 viser resultaterne af adskillige eksperimenter under anvendelse af cellelinierne FaDu og SQCCY1. Bemærk, at selv med en begrænset karakterskala som denne, er statistisk signifikante forskelle i de gennemsnitlige fire-kvadrant scoringer let opnås ved hjælp af den uafhængige stikprøver t-test.
Figur 1. DRG-matrix analysen. Korrekt placering af den dorsale rodganglier i matrixen dråben, vist med lysfeltmikroskopi på 4X. Scale bar betegner 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. udvækst af neuritter. Neuritter er fraværende på dag 0 umiddelbart efter anbringelse af DRG i matrixen dråbe (A). På dag 1 (B), neuritudvækst er tydelig ved 10X på brightfield mikroskopi. Neurit vækst fortsætter på dag 2 (C) og dag 3 (D); dog opmærksom på udstrømning af fibroblaster. scale bar repræsenterer 0,1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. DRG-matrix Assay med FaDu. Hoved og hals pladecellecarcinom linje FaDu tilsat perifert omkring et assay på dag 3 (A), der er vist i grønt fluorescerende og lysfeltmikroskopi på 4X Progressive neural invasion ses på dag 4 (B) og dag 5 (C). Scale bar betegner 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. DRG- matrix Assay med SQCCY1. Hoved og hals planocellulært linje SQCCY1 tilsat på dag 4 (A), der er vist i lysfelt og grønt fluorescerende mikroskopi ved 4X. Bemærk, at denne cellelinie er ikke så dygtige til perineural invasion som FaDu, selv ved dag 5 (B). Scale bar betegner 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Matrix Assay med FaDu. Hoved og hals pladecellecarcinom cellelinie FaDu tilføjet omkring en matrix dråbe uden DRG på dag 3. lysfelt og grønt fluorescerende mikroskopi (4X) vises på dag 4 (A). Bemærk, at tumorcellerne ikke kommer ind i matrixen eller vokse over toppen af det, selv ved dag 5 (B). Scale bar betegner 1 mm.TTP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Fire-kvadrant Fremgangsmåde til assay Kvantificering. Et punkt er tildelt til hver kvadrant med en PNI mindre end 50% af afstanden fra kanten af matricen til DRG. 2 point tildeles når PNI strækker sig ud over 50%. Det første eksempel (A) ville modtage en score på 5 (1 point for hver kvadrant til PNI mindre end 50%, undtagen nederst til højre, som har en PNI strækker sig ud over 50%, hvor 2 point scoret). Det andet eksempel (B) er scoret som en 8 (a PNI over 50% i alle fire kvadranter). Scale bar betegner 1 mm. Klik her for at view en større version af dette tal.
| cellelinie | n | Dag 4 | SD | P-værdi | Dag 5 | SD | P-værdi |
| FaDu | 24 | 2,88 | 1,42 | Ref | 6,04 | 0,35 | Ref |
| SQCCY1 | 20 | 0.60 | 0.60 | <0,001 | 1,05 | 0,17 | <0,001 |
Tabel 1. Sammenligning af PNI Mellem FaDu og SQCCY1. Mean fire-kvadrant scores som vist i figur 6 mellem cellelinier FaDu og SQCCY1 ved 24 timer (dag 4) og 48 timer (dag 5) efter at cellerne blev udpladet omkring DRG-matrix assay. Sammenligninger er lavet ved hjælp af uafhængige sample t-test og præsenteret med standardafvigelsen (SD) og P-værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
De vigtigste trin i denne protokol er den præcise dissektion og udvinding af dorsalrodsganglier. Korrekt overskæring af rygsøjlen og en midtlinie-langsgående opdeling i to hemi-spines er afgørende for opnåelse af store antal af DRG. Under dissektion af individuelle DRG bør ganglion aldrig håndteres direkte, men snarere de omgivende fascia bør gribes med de mikroskopiske pincet. Undladelse af at gøre dette vil resultere i en crush skade af DRG, hvilket sandsynligvis den største årsag til fiasko for neuritudvækst. Det er langt bedre at under-trimme omgivende neurale væv under dissektion end til risiko over-håndtering DRG og opnåelse ingen neuritvækst i assayet.
Ændringer og fejlfinding
Den eksperimentelle protokol som beskrevet ovenfor afspejler den optimale opfyldthodology etableret fra en lang række proceduremæssige justeringer over flere år. Anført direkte under tilsvarende trin i protokollen afsnit er en række noter og faldgruber, der førte fra de erfaringer, forfatterne, når du bruger denne metode. I betragtning af antallet af trin involveret, er der faktisk mange modifikationer, der kan gøres til denne protokol ved fremtidige efterforskere. Som erfaringerne med disse modifikationer vokser, forventes det, at yderligere midler til fejlfinding vil blive udviklet i overensstemmelse med de præferencer efterforskningsholdet.
Begrænsninger af teknikken
Der er tre store begrænsninger for denne teknik. Den første er, at meget fine neuritter anvendes som et surrogat for stor neural invasion, hvilket er, hvad patologer observere i tumor prøver. Det vides ikke, hvilken rolle neuritter, i modsætning til neuroner, er in vivo, fordi identificere perineuriteinvasion er ud over mulighederne i en rutine histopatologisk eksamen. For det andet, perineural invasion er en form for blødt væv invasion, som måske ikke blot at omfatte tumorceller og et tilstødende neuron, som er simuleret i dette assay. Som sådan ydre faktorer native for in vitro tumor milieu mangler i dette assay. Endelig er den tidsperiode, under hvilken PNI kan studeres begrænset til ca. 48 timer som følge af kombinationen af fibroblast efflux og tab af matrix integritet. På denne måde vil cellelinjer, der er effektive på neural invasion, men er langsomme dividere og / eller invaderende blive savnet og formodes at være dygtige til PNI.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
Så vidt vi ved, er dette det eneste in vitro model øjeblikket er til rådighed til at undersøge PNI i HNSCC. I betragtning af den hyppighed, hvormed PNI forekommer i HNSCC og den begrænsede viden om mekanismer, someksisterer i øjeblikket, er denne fremgangsmåde fordelagtig af flere grunde. For det første har en meget høj succesrate og fremragende reproducerbarhed. Den samlede eksperiment tid er også forholdsvis kort i forhold til lignende protokoller 12,17-19. Endelig med det store antal assays, der kan genereres fra en enkelt mus, mange betingelser kan testes med videnskabeligt passende replikater. Kombinationen af disse faktorer giver mulighed for hurtig vurdering af mange forskellige tilstande med ensartede resultater.
Samtidig, den høje kvalitet af analysen tillader mere detaljeret undersøgelse af interaktionen mellem tumorcellerne og neuritter. Brugen af live-cell imaging giver mulighed for opskrivning af neuritudvækst processen og HSNCC celle invasion i time-lapse video formular. Tilføjelsen af fluorescens-farvede celler skaber meget klar differentiering mellem kræftceller og baggrundsmateriale, såsom fibroblaster og tætte neurit outgrowth (som auto-fluorescerer rødt). Hvorvidt følger denne protokol eller dem beskrevet af andre, denne generelle eksperimentelle design er i sin relative vorden, og der er langt fra en guld standard for in vitro-undersøgelse af PNI. Af disse grunde er mere tilgange til dette assay, der er beskrevet i detaljer, jo større mulighed for den kollaborative udvikling af en ideel metode.
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Denne teknik
Ligesom der er flere forskellige tilgange til opsætning af analyser, der er flere tilgange til at måle resultaterne. I ovenstående tekst, blev en enkelt metode til hurtigt at kvantificere graden af perineurale invasion i hvert assay præsenteret. Dette er ideelt til screening af virkningen af mange forskellige veje på PNI, især i betragtning, at man kan isolere 32 - 40 DRG pr mus. Der er en række af avanceret billedbehandling teknikker til at vurdere PNI,herunder mængden af fluorescens inden for et givet område, afstanden og hastigheden af celleinvasion, og den rå antal celler i assayet. Når den dynamiske del af forsøget er afsluttet, kan cellerne i assayet og / eller supernatanten også opsamles til yderligere molekylær analyse.
Denne eksperimentelle metode giver mulighed for at belyse mekanismer involveret i PNI af HNSCC og andre kræftformer. Denne viden kan drive udviklingen af terapeutiske midler til at målrette de veje PNI, som på nuværende tidspunkt mangler i HNSCC. Specifik målretning af PNI når identificeret som en negativ patologisk træk kan potentielt fjerne behovet for de ikke-specifikke adjuvans-behandlinger, såsom strålebehandling og kemoterapi, der i øjeblikket anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES | Corning Cellgro | 10-090-CV | Manassas, VA |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11150 | Flowery Branch, GA |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies Corporation | 25200056 | Grand Island, NY |
| Phosphate buffered Saline 1x | Corning | 21-040-CM | Manassas, VA |
| Matrigel hESC-Qualif Mouse | Corning Incorporated | 354277 | Bedford, MA |
| Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Ashland, MA |
| SteREO Discovery.V8 Operating Microscope | Carl Zeiss Microimaging | 495015-0021-000 | Thornwood, NY |
| Schott ACE I light source | Schott | A20500 | Germany |
| CellTracker | Life Technologies Corporation | C2925 | Carlsbad, CA |
| BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G | BD | 305195 | Franklin Lakes, NJ |
| Premium Microdissecting Tweezer | Harvard Apparatus | 60-3851 | Holliston, MA |
| Premium Fine Operating Standard Scissors | Harvard Apparatus | 52-2789 | Holliston, MA |
| Premium Spring Scissors | Harvard Apparatus | 60-3923 | Holliston, MA |
| Dressing Forceps | Harvard Apparatus | 72-8949 | Holliston, MA |
| Athymic nude mice (002019) | Jackson Laboratory | 002019 | Bar Harbor, ME |
References
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).
- Hinerman, R. W., et al. Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience. Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).
- Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).
- Woolgar, J. A., Scott, J. Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth. Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).
- Tai, S. K., et al. Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy. Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).
- George, D. L., et al. Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study. Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).
- Fagan, J. J., et al. Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).
- Soo, K. C., et al. Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck. Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).
- Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).
- Liao, C. T., et al. Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).
- Fan, K. H., et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach. Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- He, S., et al. GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- Bakst, R. L., et al. Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment. PLoS One. 7 (6), 39925 (2012).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion. J Vis Exp. (110), (2016).
