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Cancer Research

सिर और गर्दन के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में Perineural आक्रमण के लिए एक मॉडल

Published: January 5, 2017 doi: 10.3791/55043
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Otolaryngology, University of Pittsburgh Medical Center, 2University of Pittsburgh Cancer Institute, Hillman Cancer Center

Protocol

1. मध्यम संस्कृति की तैयारी और व्यंजन (10 मिनट)

  1. 100 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट के कुओं के लिए साथ की μL जोड़ें।
  2. 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से semisolid मैट्रिक्स के लगभग 100 μL के एक पूर्व aliquoted-शीशी निकालें और बर्फ पर सीधे जगह है।
    नोट: इस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि से पहले (डीआरजी) फसल करो क्योंकि semisolid मैट्रिक्स बर्फ, जो बाद के चरणों के लिए आवश्यक है पर तरल अवस्था तक पहुंचने के लिए लगभग 30 मिनट लगते हैं। सभी समय पर बर्फ पर semisolid मैट्रिक्स रखने में विफलता एक गरीब गुणवत्ता मैट्रिक्स छोटी बूंद परिणाम होगा।
  3. लेबल गिलास नीचे स्थायी स्याही के साथ संस्कृतियों प्लेट, थाली के undersurface पर चार कोनों में से प्रत्येक में अद्वितीय पहचानकर्ता बनाने। प्लेटों सही साइड प्लेट की सतह शांत करने के लिए बर्फ पर रखें।
    नोट: प्रत्येक माउस की पैदावार 32 - 40 डीआरजी, तो 40 से 1 से उन्हें लेबल यह पूर्व ठंडा करने के लिए आवश्यक नहीं है गड़बड़ीपालतू टिप्स, के रूप में ठंडा युक्तियों मैट्रिक्स बूंदों रखने, संभावित मैट्रिक्स स्थिरता में मतभेद शुरू करने का पाठ्यक्रम गर्म होगा।

2. Murine डीआरजी के विच्छेदन (45 मिनट)

  1. इस तरह के एक सीओ 2 कक्ष और एक thoracotomy के उपयोग के माध्यम के रूप में विशिष्ट प्रयोगशाला प्रोटोकॉल, के अनुसार एक athymic नग्न माउस euthanize।
  2. विच्छेदन क्षेत्र और माइक्रोस्कोप सेट करें। 15- या 50-एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए polystyrene कंटेनरों की, स्वच्छ निष्फल, और फ्लैट नीचे का प्रयोग करें।
    नोट: इसके अलावा, वे विदारक सतह के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं, क्योंकि वे सस्ती, डिस्पोजेबल कर रहे हैं, और रीढ़ की हड्डी पिन या सुई का उपयोग के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं। केवल निष्फल उपकरणों और सुइयों का उपयोग करें।
  3. प्राकृतिक दृष्टि के तहत, सीधे या घुमावदार ठीक कैंची की एक जोड़ी के साथ माउस के सिर पर पूंछ की जड़ से स्पाइनल कॉलम के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाते हैं।
  4. sacr नीचे transversely डिवाइड करने के लिए एक ही कैंची का प्रयोग करेंअल रीढ़। रीढ़ की हड्डी के दोनों पक्षों को काटना कैंची का उपयोग खोपड़ी आधार करने के लिए सभी तरह से ऊपर। इस बिंदु पर, यह सुनिश्चित करें कि ग्रीवा रीढ़ कैंची से संभव के रूप में के रूप में दूर cranially transected है।
  5. कम बिजली पर ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत स्पाइनल कॉलम की ग्रीवा अंत का निरीक्षण करें। सफेद रीढ़ की हड्डी एक बोनी की अंगूठी, जो paraspinal मांसपेशियों और कोमल ऊतकों के चर मात्रा से घिरा हुआ है के बीच में स्पष्ट है।
  6. सूक्ष्म वसंत कैंची के साथ 3 कशेरुका निकायों - पृष्ठीय या पहले 2 की बेहतर पहलू विभाजित। कैंची के वसंत कार्रवाई का उपयोग करना, इस प्रारंभिक बोनी सुनिश्चित करने के लिए कि कशेरुका शरीर विच्छेदन midline में हुई कटौती खुला। त्रिक रीढ़ की दिशा में छोटे वेतन वृद्धि में जारी रखें, और उसके बाद कशेरुका निकायों के उदर या अवर पहलू पर समान कटौती पूरा करके रीढ़ दोटूक।
    नोट: बोनी स्पाइनल कॉलम के midline विच्छेदन सुनिश्चित करने के लिए एक कम डीआरजी उपज में परिणाम होगा विफलता।
  7. थी परबात, स्पाइनल कॉलम दो हिस्सों में बांटा गया है। एक अर्ध-रीढ़ अलग जगह में और एक बाँझ थाली पर नीचे की ओर रखें, रीढ़ की हड्डी के साथ।
    नोट: जगह में रीढ़ की हड्डी को छोड़कर, बाहर सुखाने के रूप में DRGs रीढ़ की हड्डी को गहरी हैं से DRGs पाएगा।
  8. polystyrene विदारक मंच पर दो 18 गेज सुई के साथ अन्य अर्ध-रीढ़ की हड्डी के दोनों छोर सुरक्षित। गर्भाशय ग्रीवा के अंत में शुरू (जो स्पष्ट है क्योंकि रीढ़ संकरा है, डीआरजी एक दूसरे के करीब हैं, और वहाँ पसली सम्मिलन) कर रहे हैं, धीरे से लगभग 4 कशेरुकी स्तर से रीढ़ की हड्डी वापस छील।
  9. संवेदी तंत्रिकाओं (आमतौर पर दो) डीआरजी को जोड़ने का निरीक्षण करें। ऐसा क्षेत्र है जहां नसों डीआरजी को डालने में, धीरे सूक्ष्म संदंश के साथ आसपास के प्रावरणी समझ। काटना और डीआरजी को मुक्त करने के लिए इस प्रावरणी और सूक्ष्म वसंत कैंची के साथ अन्य तंत्रिका ऊतक ट्रिम। कोमल त्याग बोनी रीढ़ की हड्डी के भीतर अपनी स्थिति से बाहर डीआरजी लाएगा।
    नोट: बढ़ानाइस कदम पर माइक्रोस्कोप बिजली फायदेमंद है। डीआरजी को चोट क्रश काफी neurites के विकास को सीमित कर देगा। यह कभी नहीं डीआरजी सीधे लोभी से बचा जाता है, बल्कि आसपास के प्रावरणी लोभी द्वारा।
  10. परिधीय तंत्रिका सूक्ष्म वसंत कैंची डीआरजी को रिहा करने के साथ (डीआरजी आम तौर पर एक परिधीय तंत्रिका, जो है विदारक दृश्य को गहरी रिश्तेदार है) में कटौती।
    नोट: यह पता लगाने के लिए जहां तंत्रिका समाप्त होता है और डीआरजी जबकि तनाव पर शुरू होता है, तो इस बिंदु पर संभव के रूप में बंद डीआरजी को यह कटौती कर रही है आदर्श है सबसे आसान है। एक बार जब यह बाहर का शाखा कट जाता है, समीपस्थ शाखाओं के रूप में अच्छी तरह से छंटनी कर रहे हैं।
  11. किसी भी आवारा तंत्रिका तंतुओं या सूक्ष्म वसंत कैंची से प्रावरणीय संलग्नक के डीआरजी ट्रिम। पर्याप्त अलगाव के बाद, 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट के भीतर कमरे के तापमान माध्यम में डीआरजी जगह है।
    नोट: एक काले रंग की पृष्ठभूमि में रखकर नीचे प्लेट उप मिमी visualizing सफेद DRGs आसान बना देता है। केवल पूर्वी वायु कमान में एक डीआरजी जगहअच्छी तरह से ज; इस तरह, वे और अधिक आसानी से बाद के चरणों के लिए जिम्मेदार हो सकता है।
  12. एक अर्ध-रीढ़ की हड्डी और फिर अन्य नीचे इस प्रक्रिया के लिए सभी तरह से दोहराएँ। 20 DRGs, 32 कुल - - 40 प्रत्येक पक्ष 16 पैदावार।
    नोट: इस की तुलना में कम DRGs देखते हैं, तो रीढ़ की हड्डी के विच्छेदन आगे cephalad और / या दुमदारी बाहर ले जाने की जरूरत है। DRGs तेजी से कम एक अच्छी तरह से परिभाषित दुमदारी आय के रूप में हो गया है।

3. semisolid मैट्रिक्स बूंदों की तैयारी (<प्रति प्लेट 1 मिनट)

  1. बर्फ से एक गिलास अच्छी तरह से नीचे की थाली निकालें और ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के नीचे एक बर्फ ब्लॉक पर जगह है। सुनिश्चित करें कि मैट्रिक्स के विभाज्य हर समय बर्फ पर रहता है।
  2. गिलास नीचे की थाली के चारों कोनों में से प्रत्येक में मैट्रिक्स के एक 1.5 μL छोटी बूंद एक 2 μL या 10 μL micropipetter साथ रखें, एक दूरी कांच के किनारे अच्छी तरह से छोटी बूंद के रूप में ही कम से कम के रूप में महान छोड़ने।
    1. पिपेट की नोक की जगह सीधे परएक 45 डिग्री के कोण पर गिलास। धीरे-धीरे मैट्रिक्स pipet। धीरे-धीरे गिलास नीचे से दूर ले जाने के बाद मैट्रिक्स प्लेट पर लगी हुई है।
      ध्यान दें: मैट्रिक्स और कांच के बीच सतह तनाव एक आदर्श गोलार्द्ध हर बार बनाना चाहिए।
    2. pipetting बस से पहले टिप, खाली है, क्योंकि मैट्रिक्स छोटी बूंद में हवा के अनजाने इंजेक्शन मैट्रिक्स छोटी बूंद तक अधिक से अधिक का व्यास बनाता है और दूर करने के लिए मुश्किल है बंद करो।
      नोट: pipetting हाथ को स्थिर करने के लिए एक दूसरे हाथ का प्रयोग अधिक सटीक स्थान की सुविधा।

Semisolid मैट्रिक्स बूंदों में डीआरजी का 4. निवेशन (<प्लेट प्रति 2 मिनट)

  1. संक्षेप में कमरे के तापमान (~ 1 मिनट) पर मैट्रिक्स बूंदों के साथ थाली छोड़ दें। यह थोड़ा मैट्रिक्स stiffens, यह डीआरजी का सटीक प्लेसमेंट के लिए आसान बना।
  2. स्कूप (समझ नहीं है) डीआरजी धीरे बाएं हाथ में बंद सूक्ष्म संदंश के साथ। फिर, छोटे के खिलाफ एक काले रंग की पृष्ठभूमि, सफेदडीआरजी दृश्य की सुविधा। दाहिने हाथ में एक 21 गेज सुई की नोक के लिए डीआरजी स्थानांतरण। इस हस्तांतरण संदंश पर अवशिष्ट मीडिया छोड़ देंगे।
  3. धीरे 21 गेज सुई (चित्रा 1) का उपयोग मैट्रिक्स छोटी बूंद के बीच में डीआरजी डालें। समय से अधिकांश, डीआरजी आसानी से मैट्रिक्स में रिलीज होगी और उसके बाद सुई के साथ केन्द्र में तैनात किया जा सकता है।
    1. डीआरजी सुई से चिपक हैं, तो सुई के बंद और मैट्रिक्स छोटी बूंद में डीआरजी पुश करने के लिए सूक्ष्म संदंश का उपयोग करें। बाती एक प्रयोगशाला के साथ सूक्ष्म संदंश से दूर अतिरिक्त मीडिया पोंछे।
      नोट: मैट्रिक्स के लिए मीडिया का परिचय व्यास, मात्रा, और परख की निरंतरता बदल जाएगा। रंग या रंग का लेखन के साथ एक बर्फ ब्लॉक पृष्ठभूमि विपरीत है, जो इस नाजुक प्रक्रिया के दृश्य को आसान बनाता है।
  4. बाद थाली सभी चार DRGs है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डीआरजी मैट्रिक्स छोटी बूंद के केंद्र में है एक अंतिम निरीक्षण करते हैं। समायोजन करें21-गेज सुई के साथ की जरूरत के रूप में।
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए पूरा थाली हस्तांतरण। इस semisolid मैट्रिक्स जमना और स्थिति में डीआरजी ठीक कर देंगे।
  6. DRGs के सभी के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक डीआरजी के बिना खाली मैट्रिक्स बूंदों रखें।
  7. सभी प्लेटों को पूरा करने और कम से कम 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए उन्हें उजागर करने के बाद प्रत्येक गिलास नीचे थाली करने के लिए 10% FBS के मीडिया के साथ DMEM के 4 एमएल जोड़ें। एक मामूली कोण पर थाली प्लेस और धीरे धीरे मध्यम जोड़ने, ऐसी है कि यह धीरे-धीरे मैट्रिक्स-डीआरजी इकाइयों के साथ संपर्क में आता है।
    नोट: मध्यम भी जल्दी या सख्ती, मैट्रिक्स और / या डीआरजी जोड़ा जाता है तो उखाड़ फेंकना बन सकता है।
  8. 72 एच - अगले 48 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में assays स्टोर।
    नोट: assays के आवधिक परीक्षा मैट्रिक्स बढ़त (चित्रा 2) की ओर neurites की परिधीय परिणाम दिखाएगा। जब neurites मैट्रिक्स के लिए जिस तरह की तीन-चौथाई से अधिक कर रहे हैं यहकोशिकाओं थाली करने के लिए उपयुक्त है।

5. सिर और गर्दन के कैंसर की कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं की तुलना में अन्य सेल लाइनों इस प्रयोगात्मक डिजाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा सेल DMEM में 10% FBS के साथ पसंदीदा बोतल या संस्कृति बर्तन में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लाइनों को बनाए रखें। प्रयोग, सक्शन संस्कृति कुप्पी या पकवान से सभी मध्यम के लिए कोशिकाओं को तैयार करने और पीबीएस के साथ दो बार इसे धोने के लिए। 5 मिनट के लिए 0.025% trypsin के एक उचित मात्रा में, 10% FBS के साथ DMEM के द्वारा पीछा जोड़कर कोशिकाओं को निलंबित। 6-एमएल संस्कृति बर्तन में सेल और मीडिया के मिश्रण के पिपेट 4 एमएल।
    ध्यान दें: एक 6-एमएल संस्कृति की थाली पर्याप्त से अधिक कोशिकाओं प्रदान करता है, तब भी जब कम से कम 50% मिला हुआ।
  2. विभिन्न परिस्थितियों 24 घंटे धुंधला हो जाना और डीआरजी परख पर चढ़ाना करने से पहले करने के लिए HNSCC सेल लाइनों को बेनकाब। पुन खुराक हालत एक बार कोशिकाओं को एक सुसंगत वातावरण बनाए रखने के लिए चढ़ाया जाता हैNT।
    ध्यान दें: एंटीबॉडी, विकास कारकों, साइटोकिन्स, या अन्य अणुओं सेल संस्कृति बर्तन में जोड़े 1 - माउस विच्छेदन और मैट्रिक्स में डीआरजी का आरोपण के बाद 2 दिनों के लिए।
  3. (- 3 दिन डीआरजी फसल और मैट्रिक्स में आरोपण के बाद 2) चढ़ाना कोशिकाओं से पहले फ्लोरोसेंट सेल दाग 1 घंटे जोड़ें।
    नोट: विशेष रूप से यहां इस्तेमाल कोशिका झिल्ली के माध्यम से स्वतंत्र रूप से पारित दाग; हालांकि, intracellular thiol समूहों के साथ प्रतिक्रिया के बाद, दाग कोशिका के भीतर रहता है और बेटी कोशिकाओं को पारित कर दिया है। धुंधला हो जाना बहुत assays के भीतर दृश्य की सुविधा। ये अस्थायी दाग ​​इन assays के लिए आदर्श होते हैं क्योंकि प्रतिदीप्ति 2 के लिए मौजूद है - 3 दिन, जो इन प्रयोगों की समय सीमा है। यह भी कई अलग-अलग रंगों के उपयोग के लिए अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों बनाने के लिए जरूरत अनावश्यक।
    1. सीरम मुक्त DMEM के 2 एमएल में 2 से 10 की μL मिमी स्टॉक सेल दाग मिश्रण से डाई समाधान के 10 माइक्रोन तैयारहर कोशिका हालत के लिए। कोशिकाओं में जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस को यह गर्म।
    2. 6-एमएल प्लेट के भीतर संस्कृति के माध्यम से निकालें, थाली पर पक्षपाती HNSCC कोशिकाओं को छोड़कर। 10 माइक्रोन सेल दाग / सीरम मुक्त DMEM के फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 2 मिलीलीटर जोड़ने और 2 को दूर एमएल प्रत्येक प्लेट को जोड़ा गया
    3. 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए सेल दाग के साथ 6-एमएल संस्कृति की थाली लौटें।
    4. 40 मिनट के बाद, मध्यम aspirate। पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ने और फिर इसे aspirate। 0.025% trypsin के 1 एमएल प्रत्येक थाली करने के लिए जोड़ें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह।
    5. 3 के बाद 10% FBS के साथ DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़ें - 5 मिनट और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब निलंबित कोशिकाओं को हस्तांतरण। कोशिकाओं स्पिन और 10% FBS के साथ DMEM के 1 एमएल में उन्हें फिर से निलंबित कर दिया।
    6. एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना, और फिर एमएल प्रति 300,000 कोशिकाओं के अंतिम सेल एकाग्रता बनाने के लिए 10% FBS के साथ DMEM जोड़ें।

6. चढ़ाना सिर और एनEck कैंसर कोशिकाओं

  1. इनक्यूबेटर से मैट्रिक्स-डीआरजी assays के साथ गिलास नीचे प्लेटों निकालें।
    नोट: - 3 दिनों फिर, वे जब neurites मैट्रिक्स, जो आम तौर पर 2 के बाद होता है के किनारे करने के लिए जिस तरह के कम से कम 75% कर रहे हैं उपयुक्त हैं। यह सबसे अच्छा है कम से कम एक 10X उद्देश्य का उपयोग कर देखा जाता है।
  2. गिलास नीचे प्लेट के भीतर मध्यम aspirate। पूरी तरह से अच्छी तरह से मैट्रिक्स-डीआरजी इकाइयों को हटाने के बिना गिलास के भीतर मध्यम aspirate।
  3. 300,000 कोशिकाओं / एमएल मध्यम एक 200 μL pipet का उपयोग कर के 200 μL ड्रा। प्रत्येक मैट्रिक्स-डीआरजी परख पर कोशिकाओं की दो बूंदों रखें। प्रत्येक मैट्रिक्स छोटी बूंद के लिए यह कदम, एक थाली पर प्रत्येक कोशिका हालत के चार दोहराता बनाने प्रदर्शन करना।
    नोट: मैट्रिक्स के अर्धगोल आकार कोशिकाओं परख (चित्रा 3 ए, चित्रा 3 बी) की परिधि के साथ एक अंगूठी में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है। एक चिकनी ट्रिगर के साथ एक pipet ढूँढना वर्दी की नियुक्ति की बूँदें अभी तक आसान बनाता है।
  4. इसी तरह के सेल नंबर और Di की पुष्टि4X माइक्रोस्कोपी के तहत विभिन्न सेल की स्थिति के stribution।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में गिलास नीचे प्लेटों के लगभग 60 मिनट के लिए रखें। नोट: हालांकि केवल कोशिकाओं और मीडिया (~ 150 μL) की एक छोटी मात्रा होती है, assays के बाहर सूखी नहीं है जब तक इनक्यूबेटर समय के कई घंटे बीत चुके हैं।
  6. 60 मिनट के बाद, धीरे गिलास नीचे प्लेट के sidewall साथ 10% FBS के साथ DMEM के 4 एमएल जोड़ें।
    नोट: समय की अवधि के दौरान, कोशिकाओं को आंशिक रूप से प्लेट नीचे, और मध्यम कोशिकाओं को परेशान नहीं करता जोड़ने की विधि का पालन करें। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के कम या ज्यादा समय लेने के लिए गिलास नीचे प्लेट का पालन करने के लिए शुरू करने के लिए बनाते हैं।
  7. पिछले एकाग्रता का स्तर बनाए रखने के लिए इस समय किसी भी बहिर्जात दवाओं या विकास के कारकों को बदलें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर assays लौटें, जब वे microscopically जांच कर रहे हैं को छोड़कर। सूक्ष्म इमेजिंग द्वारा इस परख के परिणाम यों। संक्षेप में, साथ perineural आक्रमण की किस्में गिनतीचार quadrants में एक 4X सूक्ष्म छवि का उपयोग करते हुए।
    नोट: एक 4X उद्देश्य और प्रतिदीप्ति क्षमताओं के साथ एक माइक्रोस्कोप तस्वीर-दस्तावेजीकरण assays के लिए पर्याप्त है। assays के आकार के एक 4X उद्देश्य है, जो perineural आक्रमण के अलग अलग क्षेत्रों पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त विस्तृत है के क्षेत्र के भीतर अच्छी तरह से फिट बैठता है। Perineural आक्रमण 24 घंटे के भीतर स्पष्ट हो जाता है, लेकिन 48 घंटे से परे है, assays की अखंडता को कमजोर करने के लिए, के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं मैट्रिक्स की परिधि के साथ विभाजित है और आक्रमण शुरू होता है। के अलावा 48 घंटे, वहाँ भी डीआरजी, जो brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग दृश्य को धुंधला से fibroblasts की पर्याप्त तपका है। (जैसे, 24 और 48 घंटे ट्यूमर कोशिकाओं चढ़ाना के बाद से) इसलिए, यह इस विंडो के दौरान कम से कम दो बार फोटो दस्तावेज़ 4X माइक्रोस्कोपी के साथ परिणाम की सलाह दी जाती है। प्रति जागरूक रहें कि इन 3-आयामी assays हैं, और यह पूरी तरह से छवि के लिए पूरे परख मुश्किल है। अधिकांश perineural आक्रमण प्लेट के नीचे, जहां टी से एक विमान में होता हैवह कोशिकाओं थोड़ा प्लेट के नीचे से ऊपर मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं। क्योंकि इस विमान क्षैतिज के करीब है, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ neurites के विशाल बहुमत 4X पर एक एकल स्तर छवि में कब्जा कर रहे हैं।

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Representative Results

डीआरजी का विच्छेदन और मैट्रिक्स छोटी बूंद के भीतर नियुक्ति के बाद, परख की उपस्थिति के समान होना चाहिए चित्रा 1. ध्यान दें कि डीआरजी पूरी तरह गोल नहीं है, लेकिन यह मैट्रिक्स छोटी बूंद के भीतर केंद्रित है। यह 360 डिग्री में neurites के परिणाम, चित्रा 2 में आंशिक रूप से दिखाए के लिए अनुमति देता है। कि डीआरजी के कुछ भागों में तेजी से और अधिक से अधिक संख्या में neurites बाहर भेजने दूसरों की तुलना में, जहां आम तौर अपवाही और अभिवाही तंत्रिका शाखाओं में प्रवेश किया और क्रमश डीआरजी से बाहर निकल गया, करने के लिए इसी अवगत रहें। हम इस के लिए और बेतरतीब ढंग से 4 के समूह में DRGs चढ़ाना और फिर अनियमित प्रत्येक कोशिका हालत के लिए एक दिया प्लेट बताए द्वारा DRGs के बीच मतभेद आकार के लिए खाते।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, हम HSNCC सेल लाइनों एक बार neurites मैट्रिक्स के किनारे है, जो आमतौर पर है के लिए जिस तरह के कम से कम ¾ बढ़ाया है थाली3. दिन कहा कोशिकाओं मैट्रिक्स (चित्रा 3 ए) के चारों ओर एक परिधीय अंगूठी के रूप में। हम बाद में दिन 4 (चित्रा 3 बी) और दिन 5 (चित्रा 3 सी) पर assays तस्वीर। सेल लाइन यहाँ दिखाया गया है (FaDu) एक के ऊपर औसत neurites साथ ट्रैक करने की क्षमता को दर्शाता है। SQCCY1 सेल 4 चित्र में दिखाया लाइन, हालांकि, छोटे कोई प्रवृत्ति को assays के आक्रमण को दर्शाता है।

एक नया सेल लाइन का उपयोग करते हैं, यह जांच करने के लिए कैसे है कि विशेष सेल लाइन परख के आसपास बर्ताव करता है कई नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए आयात की है। सबसे पहले, अकेले मैट्रिक्स से मिलकर एक "रिक्त" परख के आसपास प्लेट कोशिकाओं (चित्रा 5)। सभी सेल लाइनों है कि हमारी प्रयोगशाला में सक्रिय रूप से जांच की गई मैट्रिक्स के आसपास विभाजित लेकिन प्रवेश या मैट्रिक्स के शीर्ष पर विस्तार नहीं है। अत्यधिक कोशिकाओं मैट्रिक्स के शीर्ष पर छोड़ दिया जाता है, वहाँ मैट्रिक्स से अधिक महत्वपूर्ण विकास हो सकता है। इस ई करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गयाNsure कि के रूप में कई कोशिकाओं संभव के रूप में मैट्रिक्स की परिधि के लिए आते हैं, के बजाय आराम और मैट्रिक्स के शीर्ष पर विभाजित करने के लिए छोड़ दिया जा रहा है। यह धीरे प्लेटों पर दोहन से पहले कोशिकाओं पालन द्वारा या सीधे मैट्रिक्स छोटी बूंद के शीर्ष पर मीडिया की थोड़ी मात्रा pipetting कोशिकाओं को एक बार कांच की प्लेट का पालन करना शुरू कर दिया है द्वारा पूरा किया जा सकता है।

एक दूसरा नकारात्मक नियंत्रण, जिसमें कोशिकाओं को एक ही दिन है कि डीआरजी मैट्रिक्स के भीतर रखा जाता है पर चढ़ाया जाता है, चलाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के लक्ष्य को दिखाना है कि यह एक neurotropic आकर्षण है कि डीआरजी के लिए कोशिकाओं ड्राइव, लेकिन neurites की उपस्थिति अनिवार्य है बजाय कि नहीं है। इसके अलावा, जब ट्यूमर कोशिकाओं को अधिक से अधिक से अधिक 2 दिनों के लिए मैट्रिक्स की परिधि के साथ रहते है, मैट्रिक्स बढ़त अस्पष्ट हो जाता है। मैट्रिक्स तो गिलास नीचे बंद की लिफ्ट करने के लिए शुरू होता है और मुक्त अस्थायी मीडिया में शीघ्र ही पाया जा सकता है। इस कारण से, इस आद्यकर्नल HNSCC चढ़ाना कोशिकाओं का वर्णन एक बार neurites मैट्रिक्स के किनारे करने के लिए दूरी के 75% बढ़ाया है।

वहाँ क्या नेत्रहीन assays के बीच बहुत स्पष्ट मतभेद हैं के परिणामों को बढ़ाता के लिए अनगिनत विकल्प हैं। ऐसे ही एक विधि में, assays की छवियों को एक ऊर्ध्वाधर और एक क्षैतिज रेखा (चित्रा 6) के साथ चार quadrants में विभाजित हैं। एक बिंदु हर चतुर्थ भाग PNI की कम से कम एक स्ट्रिंग है के लिए सौंपा है। PNI डीआरजी के लिए मैट्रिक्स के किनारे से जिस तरह के 50% से परे फैली हुई है, तो 2 अंक बजाय आवंटित कर रहे हैं। इस तरह, 0 के स्कोर - 8 अंक सौंपा जा सकता है। प्रमुख लाभ इस प्रणाली के लिए कि assays है कि गिनती करने के लिए भी कई PNI इकाइयों तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता है। एक नुकसान यह है कि पर्याप्त रूप से (यानी, आक्रमण के साथ 1 neurite डीआरजी के लिए दूरी की 100% के साथ एक वृत्त का चतुर्थ भाग में एक ही अंक प्राप्त PNI की डिग्री व्यक्त नहीं करता है (2) एक qu के रूप में10 इसी तरह आक्रमण neurites के साथ adrant)। brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों की तुलना बहुत आसान है, इस प्रणाली को भी महत्वपूर्ण fibroblast तपका के साथ बनाता है।

नमूना स्कोरिंग 6 चित्र में दिखाया गया है। चित्रा 3 के लिए इस चार चतुर्थ भाग स्कोरिंग प्रणाली का प्रयोग, 0 अंक, 2 अंक, और 7 अंक पैनलों चित्रा 3 ए, चित्रा 3 ए, और चित्रा -3 सी, क्रमशः के लिए सौंपा गया। चित्रा 4 क्रमशः 2 अंक और पैनलों चित्रा -4 ए में 2 अंक और के स्कोर प्राप्त चित्रा 4 बी। तालिका 1 में डेटा कई प्रयोगों सेल लाइनों FaDu और SQCCY1 का उपयोग कर के परिणामों को दर्शाया गया है। ध्यान दें कि इस तरह के रूप में भी एक सीमित ग्रेडिंग पैमाने के साथ, मतलब चार चतुर्थ भाग स्कोर में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद आसानी से स्वतंत्र नमूने टी परीक्षण का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं।


चित्रा 1. डीआरजी मैट्रिक्स परख। मैट्रिक्स छोटी बूंद के भीतर पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि का सही स्थान, 4x में brightfield माइक्रोस्कोपी के साथ दिखाया गया है। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 neurites के परिणाम। Neurites तुरंत मैट्रिक्स छोटी बूंद (ए) में डीआरजी रखने के बाद 0 दिन अनुपस्थित रहे हैं। दिन 1 (बी) के द्वारा, neurite परिणाम brightfield माइक्रोस्कोपी पर 10X में स्पष्ट है। Neurite वृद्धि दिन 2 (सी) और दिन 3 (डी) पर जारी है; हालांकि, fibroblasts की तपका ध्यान दें। सुप्रीम कोर्टशराब बार 0.1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. FaDu साथ डीआरजी मैट्रिक्स परख। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा लाइन FaDu दिन 4 (बी) और दिन 5 (सी) पर देखा जाता है दिन 3 (ए) पर एक परख, 4X प्रगतिशील तंत्रिका आक्रमण पर हरी फ्लोरोसेंट और brightfield माइक्रोस्कोपी में दिखाया आसपास सतही तौर पर जोड़ा जाता है। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. DRG- SQCCY1 साथ मैट्रिक्स परख। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल लाइन SQCCY1 दिन 4 (ए) पर कहा, 4x में brightfield और हरी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में दिखाया गया है। ध्यान दें कि यह सेल लाइन भी दिन 5 (बी) के द्वारा, FaDu रूप perineural आक्रमण के रूप में कुशल नहीं है। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. FaDu साथ मैट्रिक्स परख। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा सेल लाइन FaDu दिन 3. brightfield और हरी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (4X) दिवस 4 (ए) पर दिखाया गया है पर एक डीआरजी के बिना एक मैट्रिक्स छोटी बूंद आसपास जोड़ा। ध्यान दें कि ट्यूमर कोशिकाओं मैट्रिक्स दर्ज नहीं है या यह के शीर्ष पर बड़े होते हैं, यहां तक कि दिन 5 (बी) के द्वारा। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है।टीटीपी: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 परख मात्रा के लिए चार चतुर्थ भाग विधि। एक बिंदु डीआरजी के लिए मैट्रिक्स के किनारे से दूरी की एक PNI से कम 50% के साथ हर चतुर्थ भाग के लिए सौंपा है। 2 अंक आवंटित कर रहे हैं जब PNI 50% से परे फैली हुई है। पहला उदाहरण (ए) (नीचे सही है, जो एक PNI 50%, जहां 2 अंक अर्जित कर रहे हैं परे का विस्तार किया है, सिवाय एक PNI से कम 50% के लिए हर चतुर्थ भाग के लिए 1 अंक) 5 के स्कोर प्राप्त होगा। दूसरा उदाहरण (बी) (सभी चार quadrants में 50% से परे एक PNI) एक 8 के रूप में रन बनाए है। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। वी के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

कोशिका की परत n 4 दिन एसडी पी-मूल्य दिन 5 एसडी पी-मूल्य
FaDu 24 2.88 1.42 रेफरी 6.04 0.35 रेफरी
SQCCY1 20 0.60 0.60 <0.001 1.05 0.17 <0.001

तालिका 1 FaDu और SQCCY1 बीच PNI की तुलना। चार चतुर्थ भाग स्कोर का अर्थ है के रूप में 24 घंटे (4 दिन) और 48 एच (5 दिन) के बाद कोशिकाओं डीआरजी मैट्रिक्स परख के आसपास चढ़ाया गया पर चित्रा 6 सेल लाइनों FaDu और SQCCY1 के बीच में दिखाया गया है। तुलना स्वतंत्र सैम का उपयोग किया जातामिसाल टी परीक्षण और मानक विचलन (एसडी) और पी-मूल्यों के साथ प्रस्तुत किया।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

इस प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम सटीक विच्छेदन और पृष्ठीय रूट ganglia की निकासी कर रहे हैं। दो अर्ध-कांटा में स्पाइनल कॉलम और एक midline अनुदैर्ध्य विभाजन के समुचित transection डीआरजी की बड़ी संख्या को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। व्यक्तिगत DRGs के विच्छेदन के दौरान, नाड़ीग्रन्थि कभी नहीं सीधे नियंत्रित किया जाना चाहिए, बल्कि आसपास के प्रावरणी सूक्ष्म संदंश के साथ समझा जाना चाहिए। यह करने में विफलता डीआरजी, जो की संभावना neurite परिणाम के लिए विफलता का प्रमुख कारण है की एक क्रश चोट में परिणाम होगा। यह अभी तक अधिक-से निपटने डीआरजी और परख में कोई neurite विकास प्राप्त करने के लिए जोखिम से विच्छेदन के दौरान आसपास के तंत्रिका ऊतकों के तहत ट्रिम करने के लिए बेहतर है।

संशोधन और समस्या निवारण

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के रूप में ऊपर वर्णित इष्टतम मुलाकात को दर्शाता हैhodology प्रक्रियात्मक कई वर्षों में किए गए समायोजन की एक बड़ी संख्या से की स्थापना की। प्रोटोकॉल अनुभाग में इसी कदम के तहत सीधे सूचीबद्ध नोट्स और नुकसान है कि लेखकों के अनुभवों से हुई जब इस पद्धति का उपयोग कर के एक नंबर है। शामिल कदम की संख्या को देखते हुए, वहाँ वास्तव में कई संशोधनों है कि भविष्य में जांचकर्ताओं द्वारा इस प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है। इन संशोधनों के साथ अनुभव बढ़ता है, यह अनुमान है समस्या निवारण के अतिरिक्त साधन की जांच कर रही टीम की प्राथमिकताओं के अनुसार विकसित किया जाएगा कि।

तकनीक की सीमाएं

इस तकनीक के लिए तीन प्रमुख सीमाएं हैं। पहला यह है कि बहुत ठीक neurites बड़े तंत्रिका आक्रमण, जो है, जो पैथोलॉजिस्ट ट्यूमर नमूनों में निरीक्षण के लिए एक किराए के रूप में उपयोग किया जाता है। यह ज्ञात नहीं है क्या neurites की भूमिका, के रूप में न्यूरॉन्स के लिए विरोध किया, क्योंकि पहचान करने विवो में हैं perineuriteआक्रमण एक नियमित histopathological परीक्षा के बूते के बाहर है। दूसरे, perineural आक्रमण नरम ऊतक आक्रमण है कि बस ट्यूमर कोशिकाओं और एक आसन्न न्यूरॉन, नहीं शामिल हो सकता है के रूप में इस परख में नकली है का एक रूप है। इस तरह, बहिर्जात इन विट्रो ट्यूमर परिवेश का निवासी कारकों के रूप में इस परख में कमी कर रहे हैं। अंत में, समय अवधि के दौरान जो PNI अध्ययन किया जा सकता fibroblast तपका और मैट्रिक्स अखंडता के नुकसान के संयोजन के कारण लगभग 48 घंटे तक सीमित है। इस रास्ते में, सेल लाइनों है कि तंत्रिका आक्रमण में प्रभावी रहे हैं, लेकिन धीमी गति से विभाजन और / या हमला कर रहे हैं याद किया और PNI में कुशल होने के लिए नहीं माना जाएगा।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

हमारे ज्ञान करने के लिए, यह केवल इन विट्रो मॉडल वर्तमान में HNSCC में PNI जांच करने के लिए उपलब्ध है। आवृत्ति जिसके साथ PNI HNSCC में होता है और तंत्र के सीमित ज्ञान दिया किवर्तमान में मौजूद है, इस विधि के कई कारणों के लिए फायदेमंद है। सबसे पहले, यह एक बहुत ही उच्च सफलता दर और उत्कृष्ट reproducibility है। कुल प्रयोग समय समान प्रोटोकॉल 12,17-19 की तुलना में भी अपेक्षाकृत कम है। अंत में, assays एक माउस से उत्पन्न किया जा सकता है कि बड़ी संख्या के साथ, कई शर्तों के वैज्ञानिक रूप से उचित प्रतिकृति के साथ परीक्षण किया जा सकता है। इन कारकों का संयोजन अनुरूप परिणाम के साथ कई अलग अलग परिस्थितियों के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

इसी समय, परख की उच्च गुणवत्ता ट्यूमर कोशिकाओं और neurites के बीच बातचीत का अधिक विस्तृत जांच के लिए परमिट। लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग neurite परिणाम प्रक्रिया की सराहना की और समय चूक वीडियो के रूप में HSNCC सेल आक्रमण के लिए अनुमति देता है। fluorescently से सना हुआ कोशिकाओं के अलावा इस तरह के fibroblasts और घने neurite कहां के रूप में कैंसर की कोशिकाओं और पृष्ठभूमि सामग्री के बीच बहुत स्पष्ट भेदभाव बनाता हैtgrowth (जो ऑटो प्रतिदीप्ति लाल)। इस प्रोटोकॉल या दूसरों के द्वारा वर्णित उन निम्नलिखित हैं, यह सामान्य प्रयोगात्मक डिजाइन उसके रिश्तेदार प्रारंभिक अवस्था में है, और वहाँ PNI की इन विट्रो अध्ययन के लिए एक स्वर्ण मानक से दूर है। इन कारणों के लिए, और अधिक से अधिक एक आदर्श पद्धति के सहयोगी विकास के लिए अवसर इस परख में विस्तार से वर्णन किया गया हैं कि करने के लिए दृष्टिकोण।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश इस तकनीक माहिर के बाद

बस के रूप में वहाँ assays स्थापित करने के लिए कई अलग अलग दृष्टिकोण हैं, वहाँ परिणामों को मापने के लिए कई दृष्टिकोण हैं। ऊपर पाठ में, तेजी से प्रत्येक परख में perineural आक्रमण की डिग्री बढ़ाता के लिए एक ही तरीका पेश किया गया। माउस प्रति 40 DRGs - यह PNI पर कई अलग अलग रास्ते का प्रभाव है, खासकर यह देखते हुए कि एक 32 अलग कर सकते हैं स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है। वहाँ उन्नत इमेजिंग तकनीकों का एक नंबर PNI आकलन करने के लिए कर रहे हैं,एक दिए गए क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति की राशि, दूरी और सेल आक्रमण की दर, और परख के भीतर कोशिकाओं के कच्चे संख्या भी शामिल है। एक बार प्रयोग के गतिशील हिस्से को समाप्त हो गया है, परख और / या सतह पर तैरनेवाला के भीतर कोशिकाओं को भी आगे आणविक विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है।

इस प्रयोगात्मक कार्यप्रणाली HNSCC और अन्य कैंसर के PNI में शामिल तंत्र को स्पष्ट करने का अवसर प्रदान करता है। यह ज्ञान चिकित्सा विज्ञान के विकास ड्राइव PNI, जो वर्तमान समय में, HNSCC में कमी कर रहे हैं के रास्ते निशाना बनाने के लिए कर सकते हैं। PNI के विशिष्ट लक्ष्यीकरण जब एक प्रतिकूल रोग सुविधा संभवतः इस तरह के विकिरण चिकित्सा और रसायन चिकित्सा के रूप में गैर विशिष्ट सहायक उपचार, कि वर्तमान में उपयोग किया जाता है के लिए जरूरत नहीं रहेगी कर सकते हैं के रूप में पहचान की।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES Corning Cellgro 10-090-CV Manassas, VA
Fetal bovine serum Atlanta biologicals S11150 Flowery Branch, GA
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies Corporation 25200056 Grand Island, NY
Phosphate buffered Saline 1x Corning 21-040-CM Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse Corning Incorporated 354277 Bedford, MA
Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Operating Microscope Carl Zeiss Microimaging 495015-0021-000  Thornwood, NY
Schott ACE I light source Schott A20500 Germany
CellTracker  Life Technologies Corporation C2925 Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G BD 305195 Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer Harvard Apparatus 60-3851 Holliston, MA
Premium Fine Operating Standard Scissors Harvard Apparatus 52-2789 Holliston, MA
Premium Spring Scissors Harvard Apparatus 60-3923 Holliston, MA
Dressing Forceps Harvard Apparatus 72-8949 Holliston, MA
Athymic nude mice (002019) Jackson Laboratory 002019 Bar Harbor, ME

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References

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सिर और गर्दन के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में Perineural आक्रमण के लिए एक मॉडल
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Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J. Vis. Exp. (119), e55043, doi:10.3791/55043 (2017).

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