Introduction
واحدة من المسائل الرئيسية في تطوير المصنع الفهم هو كيف تتصرف الخلايا واحدة خلال التمايز الجهاز والنمو. من الناحية المثالية، الأحداث الخلوية، مثل أنماط التعبير الجيني والخلايا توطين البروتين، يمكن أن ينظر إليه في ضوء سياق أوسع من الأنسجة. هذا الهدف تحديات التقنية ويفرض رقابة الجهاز كله مع مكانية عالية وكذلك قرار الزمني على مدى فترات طويلة من الزمن، والتي قد تتسبب في آثار صور سمية. منذ النباتات التكيف بسرعة مع التغيرات البيئية، وظروف النمو يجب أن تخضع لرقابة مشددة. من أجل القيام التصوير على المدى الطويل دون التدخل في الحالة الفسيولوجية للنبات، وإلى أن تكفل ثلاثة أشياء الظروف، 1) نموا في حجرة العينة، 2) عينة مستقرة تصاعد على مدى فترات طويلة من الزمن، و 3) التصوير مع شدة الإضاءة المنخفضة لتجنب الصور الضرر وظروف غير الفسيولوجية.
الفسيولوجية conditi المتزايدالإضافات في غرفة المجهر العينة هي حاسمة لإجراء التجارب على المدى الطويل. وهناك عدد من البروتوكولات المتاحة التي تصف غرف النمو التصوير لالمجاهر مبائر 1-3. ومع ذلك، الفحص المجهري متحد البؤر يقدم عالية للضوء كثافة لهذا المصنع، الذي يمكن أن يسبب استجابات التوتر، وعادة ما يمنع نمو 4. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم المجاهر التقليدية تسمح المواقع الأفقي فقط من العينة، وهي ليست الأمثل لمحطات لأنها محاولة لإعادة توجيه أنفسهم والتطور نحو متجه الجاذبية. على مدى السنوات العشر الماضية، ظهرت للضوء ورقة المجهر كأداة قوية للقبض على تطوير نماذج كبيرة في قرار الخلوية لفترات زمنية تصل إلى عدة أيام 5-9. ورقة الخفيفة المجهري يسمح المواقع العينة عموديا، ويستخدم بشكل متزايد في البحوث النباتية دراسة التنمية الجذرية 10-21، استعرضت مؤخرا من قبل بيرتر وMaizel 22. العديد من الدراسات المذكورة 10،13 - 18،21 كانت الأمثل والتي أجريت في مختبر إرنست هونج كونج ستلزر توظيف بطريقة خاصة من عينة تصاعد تتميز نموا في الجذر على سطح هلام 17. في هذه الدراسات، تم استخدام المجهر حسب الطلب، والذي يقام المصنع من أسفل. في المقابل، فإن الغالبية العظمى من المجاهر الضوئية ورقة المتاحة على نطاق واسع الاستمرار على عينة من أعلى. وهكذا، وهذا الأسلوب إعداد خاص لا يمكن تطبيقها بسهولة. الطريقة المعروضة هنا يوفر بروتوكول لعلى سطح طريقة التركيب راسخة للتطبيق لOpenSPIM 23، وهي منصة مفتوحة المصدر لتطبيق وتعزيز الانتقائية طائرة الإضاءة المجهري (SPIM).
ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو تمكين التصوير على المدى الطويل من جذور نبات الأرابيدوبسيس في OpenSPIM الخفيفة ورقة المجهر. ويتم إنجاز هذا من خلال زراعة نبات تستقيم على الصورةurface من هلام مع جذور في الوسط السائل في حين تظل الأوراق في الهواء. من أجل ضمان النشاط الضوئي للنبات، ونظام الإضاءة حسب الطلب ينير الأوراق ولكن ليس الجذور (الشكل 1).
Protocol
1. نبات الأرابيدوبسيس التثقيف قبل التصوير
- إعداد ½ MS المتوسطة (نصف القوة وسط موراشج وسكوج) وذلك بإضافة 2.15 ز MS-المتوسطة، و 10 غرام السكروز، 0.97 ز MES (2- (N -morpholino) حمض ethanesulfonic) و 1 L ده 2 O (الماء المقطر المزدوج ) في زجاجة 1 لتر. ضبط درجة الحموضة إلى 5.8 باستخدام KOH.
- إضافة 15 جرام / لتر جيلان اللثة إلى متوسطة ½ MS والأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
- صب 30 مل من المتوسط الساخنة في أطباق بتري مربع (245 س 245 × 25 ملم) لإنشاء طبقة من الجل مع سمك حوالي 2 مم. السماح للأطباق يبرد إلى درجة حرارة الغرفة للسماح المتوسط ويصلب.
- وضع بذور نبات الأرابيدوبسيس المعقم في أنبوب رد فعل 1.5 مل تحتوي على 1 مل H 2 O. العقيمة التقاط البذور باستخدام الماصة الزجاج أو 1000 ميكرولتر طرف الماصة وزرعها على سطح هلام. وضع البذور بشكل منفصل عن 10 ملم على حدة. ختم لوحة مع الشريط.
- احتضان لوحة لمدة 24 ساعة عند 4° C (الطبقية).
- زراعة لوحة في حاضنة النمو، على سبيل المثال عند 22 درجة مئوية في / دورة يلة 16/8 ساعة يوميا مع 120-140 مكرومول / م / ث كمية الضوء لمدة 6 أيام. تصل إلى 10 أيام المصانع القديمة يمكن استخدامها.
2. عينة نباتية طريقة التحضير
ملاحظة: صاحب العينة يمكن إما 3D المطبوعة أو اليد التي قدمت في ورشة عمل الجهاز باستخدام الأبعاد هو مبين في الشكل 2C. يتم توفير ملف نموذج 3D في المواد التكميلية (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). انظر إلى الوصلة للطلب الطباعة 3D في قائمة المواد.
- إضافة 5 غ منخفضة تذوب-الاغاروز في زجاجة 50 مل تحتوي على 50 مل ½ MS المتوسطة والأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
- قسامة الحل 1٪ المنخفضة للذوبان الاغاروز في أنابيب 1.5 مل رد فعل. مخزن في 4 درجات مئوية (يمكن أن تستخدم لمدة أشهر على الأقل).
- تذوب قسامة من 1 الاغاروز ٪٪ المنخفضة للذوبان في 80 درجة مئوية، وندعه يبرد ل33 ° C.
- تنظيف صاحب العينة في وحدة الموجات فوق الصوتية. تعقيم صاحب العينة مع 70٪ من الإيثانول ويغسل بالماء المعقم.
- قطع هلام حول المصنع باستخدام مشرط.
- رفع كتلة مع ملعقة مسطحة والانزلاق بعناية على صاحب العينة باستخدام ملعقة الثانية.
- الغراء هلام على صاحب العينة مع 1٪ الاغاروز (عند 33 درجة مئوية) باستخدام ماصة 100 ميكرولتر.
- الغراء المصنع على الجل مع 1٪ الاغاروز باستخدام ماصة 10 ميكرولتر. استخدام المجهر ستيريو للتحقق من أن يترك ليست مغطاة هلام. لا وضع الجل مباشرة على المنطقة من اهتمام.
- لمنع النبات من الجفاف، والعمل دون انقطاع. إدراج صاحب العينة إلى 1000 ميكرولتر طرف الماصة كلما أمكن ذلك. استخدام طرف الماصة كما قبعة والانزلاق بعناية على نهاية واحدة من صاحب العينة حيث يقع المصنع.
- وضع صاحب العينة في مربع طرف ماصة وإعداد المزيد من محطات إذا لزم الأمر. يمكن للنباتات أن يكون المباشرهتصوير TLY أو وضع مرة أخرى في الحاضنة النمو.
3. إعداد المجهر
ملاحظة: نظام الإضاءة LED هو مصباح مبنية خصيصا. التفاصيل التقنية اللازمة لبناء الصمام الدائري يمكن العثور عليها في الشكل (3) وقائمة المواد. راجع ملف المواد التكميلية (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) لمجلس التصميم.
- برغي أو الغراء (مثل الشريط مزدوجة من جانب) حلقة الصمام على الجانب السفلي من الذراع OpenSPIM س / ص / ض / θ المرحلة.
- ربط حلقة الصمام مع إمدادات الطاقة القابلة للتعديل (0-30 V، ماكس 2 أ).
- ضبط الجهد لشدة الضوء المطلوب (على نبات الأرابيدوبسيس، 120-140 مكرومول / م 2 / ث، الشكل 3D).
- تعقيم حجرة العينة مع 70٪ من الإيثانول ويغسل بالماء المعقم.
- تنظيف عدسة الهدف مع الأنسجة البنزين وعدسة التنظيف. تعقيم العدسة الشيئية مع 70٪ من الإيثانول.
- ربط perfusiعلى أنابيب إلى غرفة عينة في الترتيب في اتجاه واحد. وضع زجاجة 1 لتر تحتوي على الطازجة ½ MS المتوسطة وزجاجة فارغة آخر بجوار مضخة نضح تحوي. ربط زجاجة مع المتوسط مع مدخل أقل من حجرة العينة باستخدام أنبوب نضح واحد. قم بتوصيل منفذ العلوي من حجرة العينة مع زجاجة فارغة إلى سلة المهملات الوسيلة المستخدمة باستخدام أنبوب نضح آخر.
- ضبط سرعة تدفق إلى 1 مل / دقيقة.
ملاحظة: ليست بالامتداد حجرة العينة، فمن المهم أن يكون هناك تدفق أعلى من تدفق. إما زيادة معدل الضخ أو استخدام أنبوب بقطر داخلي أكبر لتدفق. - قطع احباط البلاستيك الأسود إلى مربعات صغيرة 3 مم، وغسل مع الايثانول 70٪ والسماح لهم الجافة قبل وضعها في حجرة العينة على سطح الماء.
- إزالة طرف الماصة من صاحب العينة وإدراج صاحب العينة في حجرة العينة. إذا لا تناسب صاحب العينة المصنعة حديثا في الذراع مرحلة، واستخدام الرمال الناعمةورقة لجعله أرق أو استخدام يا الدائري (∅ 6 ملم) في حال كانت رقيقة جدا.
- لإنشاء الأغطية، وقطع رقائق الألومنيوم الأسود إلى قسمين 50 × 25 قطعة مم. جعل 5 مم قطع في منتصف جانب واحد من كل قطعة. أضعاف لخلق المسافة البادئة مثلث (1D الشكل). إغلاق حجرة العينة مع الغطاءان من خلال وضع الأغطية على رأس حجرة العينة مع المسافات البادئة مثلث يواجه صاحب العينة. تأكد من أن أوراق النبات ليست في ظلال الجفون وتلقي الضوء من نظام الإضاءة.
- العثور على المنطقة ذات الاهتمام باستخدام المرحلة س / ص / ض وتناوب لوضع جذر الجانبية الناشئة في مجال الرؤية.
- قبل تسجيل، والسماح للنظام لكي تتوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- الإعداد الحصول على الصور.
- وضع كومة من 217 الصور مع 3 ميكرون ض تباعد (650 ميكرون)، وتعيين الفاصل الزمني مع 15 دقيقة فترة التصوير لفترة إجمالية من 17 ساعة.
ملاحظة: وثائق تفصيلية حولكيفية تشغيل ويمكن الاطلاع على البرنامج OpenSPIM على (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
- وضع كومة من 217 الصور مع 3 ميكرون ض تباعد (650 ميكرون)، وتعيين الفاصل الزمني مع 15 دقيقة فترة التصوير لفترة إجمالية من 17 ساعة.
- ابدأ التسجيل.
Representative Results
يسمح هذا الأسلوب إعداد نموذج لزراعة النباتات داخل حجرة العينة المجهر مع مراعاة نظام الجذر مع المجهر الخفيفة ورقة (الشكل 1). ينمو النبات على سطح طبقة من الهلام (½ MS المتوسطة تحتوي على 1.5٪ جيلان اللثة) التي شنت على مصممة خصيصا صاحب العينة (الشكل 2). صاحب العينة هو 3D المطبوعة باستخدام راتنج شفاف كمادة. ويصور نسخة صنعت تسليط الضوء على أبعاد في الشكل 2C. مغمورة جذور في السائل (½ MS المتوسطة)، التي يتم تحديث بشكل مستمر من خلال نظام الارواء. تظل الأوراق في الهواء هي مضاءة باستمرار مع شدة الضوء من 130 مكرومول / م / ق القادمة من المصابيح الزرقاء والحمراء التي يتم ترتيبها في حلقة فوق محطة (الشكل 1A، B) والشكل (3A-C). يتم تصنيعها في حلقة الصمام في ورشة عمل لدينا آلة ونحن نقدم التفاصيل التقنية حول كيفية بناء الصمام الدائري في الشكل (3) وقائمة المواد. شدة الضوء يمكن تعديلها بشكل مستمر تتراوح 30-250 مكرومول / م 2 / ث (الشكل 3D). مظللة نظام الجذر ورقة صغيرة من رقائق بلاستيكية سوداء تغطي سطح الماء (الشكل 1). يتم تصفية أي ضوء شارد من الإضاءة التي يتم جمعها من قبل عدسة الكشف من قبل مرشح GFP (الشكل 3E).
مع هذا الإعداد، تم تسجيل مرور الوقت من تزايد الجذر الوحشي نبات الأرابيدوبسيس لمدة 17 ساعة باستخدام عدسة 20X / 0.5 (الشكل 4). جذور الجانبي له أصله في طبقة الخلايا محيط بالدائرة، والذي يقع في عمق الجذر الرئيسي. من أجل إظهار قدرات التصوير أكثر عمقا داخل الأنسجة لفترات زمنية طويلة، تم استخدام أعلى التكبير (40X / 0.75) للقبض على تشكيل ريال عماني الجانبيبعد التمديد من أول منشم مرحلة حتى ظهور للخروج من الجذر الرئيسي في غضون فترة زمنية من 38 ساعة (الشكل 5). ويرد شريحة 2D نموذجية من مجموعة البيانات في الشكل. 5B. هذا تسجيل يسمح لنا لمتابعة ديناميات تشكيل الجذر الوحشي في 3D (الشكل 5A) مع قرار الخلوية.
الشكل 1: تزايد الأوضاع داخل حجرة العينة OpenSPIM. أ) رسم لغرفة التصوير. نبات ينمو في وضع مستقيم على سطح هلام، التي شنت على العرف بنيت صاحب العينة (انظر أيضا الشكل 2). جذور تنمو في وسط سائل، والتي يتم تبادلها بشكل مستمر من خلال نظام الارواء. يترك نبات ينمو في الهواء وتنيره المصابيح الحمراء والزرقاء (انظر أيضا الشكل 3). المظللة نظام الجذر خفة دم ح ورقة صغيرة من رقائق بلاستيكية سوداء تغطي سطح الماء. وغطاء مصنوعة من قطعتين من رقائق الألومنيوم الأسود يقلل كذلك كمية الضوء تحت سطح الماء ويحافظ على الرطوبة في حجرة العينة. لوحة مكبرة على حق يسلط الضوء على النباتات التي تنمو على سطح كتلة من هلام مغمورة في وسط سائل. قطرة الاغاروز يتصاعد الجذر على هلام. يشير مربع متقطع في المنطقة من اهتمام لوحظ من قبل المجهر. ب) صورة من غرفة التصوير (بدون غطاء). أرقام (1) - (10) في ألف وباء تمثل: (1): س / ص / ض / θ المرحلة مع عصابة LED، (2): صاحب العينة، (3): غطاء، (4): نبات الأرابيدوبسيس thaliana (5): ورقة من رقائق البلاستيك الأسود، (6): نظام نضح، (7): كشف العدسة الشيئية، (8): وسط سائل، (9): حجرة العينة، (10): إضاءة عدسة الهدف. C) ويتكون غطاء من قطعتين من رقائق الألومنيوم الأسود. الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صاحب العينة. أ) نموذج 3D. يتم توفير ملف نموذج 3D في المواد التكميلية. ب) صورة من يطبع 3D باستخدام مواد مختلفة (1) - (3): البلاستيك الاكريليك الشفاف، (4) و (5): الراتنج، (6): راتنج شفاف. C) الرسم التقني لصاحب العينة، أرقام تمثل ملليمتر. D) صورة لصاحب العينة المصنعة مع مصنع تركيب. منطقة متقطع يمكن ملاحظتها من خلال المجهر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحميل / 55044 / 55044fig3.jpg "/>
الشكل (3): الإعداد الإضاءة النبات. أ) مخطط الرسم البياني تخطيطي للمصباح. أزواج من المصابيح يمكن أن تحول على / قبالة بشكل فردي عن البرق الاتجاه. الصمام: الادية، R: المقاومة، T: الترانزستور، JP: رأس الدبوس. ب) وتم سحب التصميم النهائي للمصباح الإضاءة باستخدام الكلور البرمجيات (PCB: لوحة الدوائر المطبوعة). ونحن نقدم ملف مجلس التصميم في المواد التكميلية. ثم تم تصنيعها المجلس وتجميعها في ورشة ميكانيكا ميبا معهدنا ل. C) صورة من حلقة الصمام وضع التشغيل. يتم ترتيب أربعة أزواج من الأحمر والأزرق LED في الحلبة. D) مجموعة من الجهد يمكن تعديلها بين 3.5 الخامس والخامس 14.0 مقاومات استخدمت للوصول إلى كمية الضوء التي تتراوح 30-250 مكرومول / م 2 / ث (R1-8: 220 أوم، R9-12: 1220 أوم ). E) وطيف الانبعاث من المصباح، GFP و YFP. ن: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الفاصل الزمني تسجيل نبات الأرابيدوبسيس thaliana الجذر الوحشي. الشتلات 5 أيام القديمة تعبر عن علامة غشاء (pUBQ10 :: YFP-PIP1؛ 4) ومراسل النووي (pGATA23 :: NLS-المكتب المركزي للاحصاءات-GFP) وضع علامات على وجه التحديد محيط بالدائرة الخلايا التي تتطور إلى الجذر الوحشي. تم القبض على كومة من 217 صور (3 ميكرون ض تباعد) كل 15 دقيقة لتسجيل 17 ساعة باستخدام عدسة 20X / 0.5. أ) يتم عرض أربع نقاط الوقت للخروج من 69 في أقصى الإسقاط كثافة. ب) يتم عرض ستة من أصل 217 شرائح واحدة من ض المكدس نقطة مرة واحدة. الحانات النطاق في A و B تمثل 100 ميكرون.تحميل / 55044 / 55044fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: الفاصل الزمني تسجيل نبات الأرابيدوبسيس thaliana الجذر الوحشي. الشتلات 6 أيام القديمة تعبر عن علامة غشاء (pUBQ10 :: YFP-PIP1؛ 4) ومراسل النووي (pGATA23 :: NLS-المكتب المركزي للاحصاءات-GFP) وضع علامات على وجه التحديد محيط بالدائرة الخلايا التي تتطور إلى الجذر الوحشي. تم القبض على كومة من 200 صورة (1.5 ميكرون ض تباعد) كل 15 دقيقة لتسجيل 38 ساعة باستخدام عدسة 40X / 0.75. أ) تقديم 3D من أربع نقاط الوقت، والأرقام في الشبكة تمثل ميكرون، B) شريحة واحدة من خلال الطائرة المركزية من الجذر الرئيسي. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون. من فضلكانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. يتم توفير ملف نموذج 3D. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي الصمام الدائري Board.brd. يتم توفير ملف مجلس التصميم. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
ورقة الخفيفة الإسفار المجهري لديه ميزة كبيرة على الجمع بين انخفاض الضيائية وسرعة اكتساب فائق السرعة، والتي يمكن استخدامها لالتقاط حجم كبير مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية مع الحفاظ على عينة في الحالة الفسيولوجية. حل المجهر ورقة خفيفة يمكن مقارنة بما كان عليه من المجهر متحد البؤر 9. ومع ذلك، تشتت الضوء وامتصاص يحدث على طول مسار الإثارة وانبعاث بشكل فردي وجودة الصورة الشاملة يمكن أن يكون أقل من ذلك بكثير داخل الأنسجة مبهمة مقارنة مع السطح. للتحايل على هذه المضاعفات يمكن للمرء أن استخدام إمكانية تدوير العينة على طول المحور الرأسي ونلاحظ نفس الحجم من اتجاهات مختلفة. ولكن هذا ليس دائما مفيدا، على سبيل المثال الجذور الجانبية تظهر على جانب واحد من الجذر والتصوير من وراء النتائج في جودة الصورة منخفضة دون الحصول على مزيد من المعلومات. ومع ذلك، فإن دوران يمكن أن تستخدم أساسا لوضع عصيدةلو في أفضل طريقة. الترتيب الأفقي الكلاسيكية من العدسات موضوعية يسمح عن سبل جديدة لعينة المتصاعدة. تستفيد النباتات من وضع عمودي. المقدمة هنا، فإن "على سطح الجل" طريقة التركيب ديها العديد من المزايا بالمقارنة مع الطرق تصاعد أخرى مثل تضمين الجذر داخل هلام 24،25. 1) نظام الجذر هو على اتصال مباشر مع الوسط السائل. توصيل حجرة العينة إلى نظام نضح الذي يوفر متوسطة جديدة باستمرار. ويمكن أن تستخدم أيضا لتبادل بسرعة وحدة التخزين بالكامل من غرفة عينة لتطبيق وسائل الإعلام أو أدوية مختلفة. 2) وقبل أخذ عينات النباتات إعداد تنمو كما أنها تستخدم لتنمو في المختبرات. النباتات يمكن اختيار تحت المجهر مضان وتحتاج إلى أن تكون مستعدة فقط النباتات المطلوبة. 3) يتم نقل المصنع من طبق بيتري لصاحب العينة دون لمسها. وبالتالي يمكن للمصنع مواصلة تطوير على نفس هلام انها تنمو على في incubato النمويتم تقليل ص والضغط الميكانيكي إلى أدنى حد ممكن. 4) وجهة النظر على عينة هو دون عائق ويتم الحد من الانحرافات البصرية لأنه يتم ملء الفضاء بين العينة والهدف كشف فقط مع المتوسطة وأية مواد أخرى مع اختلاف مؤشرات الانكسار.
من أجل أداء التصوير على المدى الطويل، من الضروري النظام مصنع إضاءة لضمان النشاط الضوئي للنبات. في معظم المختبرات تنمو النباتات على مادة هلامية شفافة، أي أن يتعرض لها جذور للضوء. وهذا قد يسبب ردود فعل متباينة تجاه بيئتهم ويؤدي الى تغييرات في الكيمياء الحيوية وتنميتها 26،27. من أجل تقليل كمية الضوء على نظام الجذر، وكان يستخدم رقائق البلاستيك الأسود لتغطية سطح المياه، فضلا عن غطاء مصنوع من رقائق الألومنيوم سوداء تغطي حجرة العينة. ضوء يمكن أن تصل إلى النبات الأوراق من خلال ثقب مركزي في الغطاء. في هذا الإعداد، لوحظ عدم وجود زيادة في ضوء الخلفية، suggestinز أن كمية الضوء الشارد من المصابيح الحمراء والزرقاء وخفضت بشكل كبير من قبل مرشح GFP والنهج التظليل. وهذا ما سمح الحفاظ على ضوء تشغيل خلال الحصول على الصور دون زيادة الضوضاء الكاميرا الخلفية.
تم تصميم صاحب العينة للطباعة 3D. ومع ذلك، فإن اختيار المواد أمر بالغ الأهمية كما كانت عدة البلاستيك التي تم اختبارها ليس 100٪ مستقرة، مما أدى إلى انحراف العينة. ولذلك، فمن المستحسن استخدام راتنجات بدلا من ذلك أو بناء على صاحب العينة من قبل الطحن البولي إثيلين (PEP) قضيب. عند استخدام الإعداد المجهر ورقة خفيفة مع نظام الإضاءة على الوجهين صاحب العينة قد تتداخل مع واحدة من الأوراق ضوء اعتمادا على زاوية دوران. للحد من إجهاد أثناء شفط المصنع من لوحة، واستخدام زاوية مسطحة من الملعقة. مصنع يمكن أن يجف بسرعة وتدفق الهواء التجربة للمرة الأولى. في محاولة لتجنب أي مشروع الهواء (الحركات السريعة، وتدفق المكيف)، التعليم الجامعير دون انقطاع، وحرك صاحب العينة إلى 1000 ميكرولتر طرف الماصة كلما أمكن ذلك. داخل المجهر، فمن الأهمية بمكان أن لا تراجع مصنع كامل في السائل والحفاظ على الأوراق الجافة.
تقنية مثالية لتصوير المراحل الأولى من تكوين الجذر الوحشي. عند إجراء التصوير على المدى الطويل من النصائح جذر ناضجة واحد يجب أن نضع في اعتبارنا أن جذور نبات الأرابيدوبسيس تنمو مع 100-300 ميكرون / ساعة بسرعة للخروج من مجال الرؤية. ويمكن أن يكون تنفيذ مفيد جدا في المستقبل خوارزمية تتبع الآلي، والتي من شأنها أن تسمح النمو طرف الجذر التالية على مدى فترات طويلة من الزمن. القدرة على التحكم في الظروف البيئية مثل الضوء وتكوين المغذيات من المتوسط خلال عملية الاستحواذ تسمح بالتحقيق في كيفية تكيف النباتات مع التغيرات. الجذر هو على اتصال مباشر مع الوسط السائل، والتي يمكن استخدامها لتطبيق الأدوية لتنشيط كيميائيا التعبير الجيني، على سبيل المثال باستخدام ديكساميثازون محرض 28 أو β-ESTRadiol نظام محرض 29. ومع ذلك، فإنه يستغرق وقتا طويلا لتبادل كامل حجم حجرة العينة لتغسل المخدرات. ويمكن تحسين الإعداد عن طريق التقليل من حجم حجرة العينة لتسريع تبادل المتوسط. ومع ذلك، هذه التقنية لديها امكانات كبيرة. مزيج الداخلي المتصاعد، ظروف النمو القياسية والحصول على الصور لطيف باستخدام ضوء ورقة المجهر يسمح دراسات طويلة الأجل للتنمية النباتات مع ارتفاع القرار على المستوى العضوي. وهذا سوف يساعد الباحثين على استكشاف الآليات الأساسية للتنمية النبات.
Acknowledgments
نشكر ماتياس Fendrych للحرج القراءة / عرض وستيفان Stadlbauer لأجهزة سمعية. بفضل متجر آلة ميبا في IST النمسا لمساهمتهم في OpenSPIM. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من برنامج الناس (تطبيقات ماري كوري) من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7 / 2007-2013) تحت REA اتفاقية منحة ن المجلس الأوروبي للبحوث (مشروع ERC-2011 ° [291734] و -StG-20101109-تطوير القطاع الخاص).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board - PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
- Grossmann, G., Guo, W. -J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
- Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).
- Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
- Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
- Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
- Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
- Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
- Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).
- Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
- Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
- Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
- Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
- Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
- Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
- Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
- Aoyama, T., Chua, N. -H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
- Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).
