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Biology

पौधे की जड़ों के प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक जेल की सतह पर बढ़ रहा है

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55044
Automatic Translation
1, 2, 1
1Developmental and Cell Biology of Plants, Institute of Science and Technology Austria, 2Bioimaging Facility, Institute of Science and Technology Austria

Introduction

समझ संयंत्र के विकास में महत्वपूर्ण प्रश्नों में से एक है कैसे एकल कक्षों अंग भेदभाव और विकास के दौरान व्यवहार करते हैं। आदर्श रूप में, सेलुलर घटनाओं, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और intracellular प्रोटीन स्थानीयकरण की तरह, ऊतक के एक व्यापक संदर्भ की रोशनी में देखा जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए तकनीकी चुनौतियों का बना हुआ है और एक उच्च स्थानिक साथ पूरे अंग अवलोकन करने के साथ ही समय की लंबी अवधि, जो तस्वीर विषाक्तता प्रभाव के कारण सकता है पर अस्थायी समाधान की आवश्यकता है। संयंत्रों के बाद से जल्दी से पर्यावरण परिवर्तन के लिए अनुकूल है, बढ़ती शर्तों कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए। आदेश संयंत्र की शारीरिक स्थिति के साथ हस्तक्षेप के बिना लंबे समय तक इमेजिंग करने के लिए, तीन बातें नमूना कक्ष में सुनिश्चित किया जाना चाहिए है, 1) बढ़ती शर्तों, 2) स्थिर नमूना समय की लंबी अवधि में बढ़ते, और 3) इमेजिंग कम प्रकाश तीव्रता के साथ तस्वीर क्षति और गैर-शारीरिक स्थितियों से बचने के लिए।

शारीरिक बढ़ रही conditiमाइक्रोस्कोप नमूना कक्ष में ons लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं। 3 - कि confocal सूक्ष्मदर्शी 1 के लिए इमेजिंग विकास कक्षों का वर्णन उपलब्ध प्रोटोकॉल का एक नंबर रहे हैं। हालांकि, confocal माइक्रोस्कोपी संयंत्र है, जो तनाव प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकता है के लिए उच्च प्रकाश तीव्रता का परिचय और आमतौर पर 4 विकास को रोकता है। इसके अलावा, सबसे पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी नमूना है, जो पौधों के लिए इष्टतम नहीं है, क्योंकि वे खुद को नई दिशा और गुरुत्वाकर्षण के वेक्टर की ओर बढ़ने की कोशिश की केवल क्षैतिज स्थिति की अनुमति। 9 - पिछले दस वर्षों में, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी कई दिनों से 5 तक की समय अवधि के लिए सेलुलर संकल्प पर बड़े नमूनों के विकास पर कब्जा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। लाइट-चादर माइक्रोस्कोपी स्थिति नमूना खड़ी की अनुमति देता है और तेजी से विकास जड़ 10 का अध्ययन संयंत्र अनुसंधान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है - 21, हाल ही में बर्थ द्वारा समीक्षाटी और Maizel 22। उल्लेख के अध्ययन 10,13 से कई - 18,21 अनुकूलित और अर्नस्ट एच Stelzer की प्रयोगशाला नमूना का एक विशेष तरीका रोजगार में आयोजित की गई एक जेल से 17 की सतह पर जड़ से बढ़ रहा है की विशेषता बढ़ते। इन अध्ययनों में, एक कस्टम बनाया माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया था, जिसमें संयंत्र के नीचे से आयोजित किया जाता है। इसके विपरीत, मोटे तौर पर उपलब्ध प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप के बहुमत के ऊपर से नमूना पकड़। इस प्रकार, इस विशेष तैयारी विधि आसानी से लागू नहीं किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत विधि अच्छी तरह से स्थापित ऑन-सतह बढ़ते विधि OpenSPIM 23, लागू करने और चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) को बढ़ाने के लिए एक खुला मंच का उपयोग करने के लिए लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य OpenSPIM प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप में Arabidopsis जड़ों की लंबी अवधि इमेजिंग के लिए सक्षम है। इस रों पर ईमानदार एक संयंत्र से बढ़ रही द्वारा पूरा किया हैएक तरल माध्यम में जड़ों के साथ एक जेल के urface जबकि पत्ते हवा में रहते हैं। आदेश संयंत्र के संश्लेषक गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए एक कस्टम बनाया प्रकाश व्यवस्था पत्ते नहीं बल्कि जड़ों (चित्रा 1) illuminates।

Protocol

1. Arabidopsis संवर्धन इमेजिंग के लिए पहले

  1. 2.15 छ MS-मध्यम, 10 ग्राम सूक्रोज, 0.97 छ एमईएस (2- (एन -morpholino) ethanesulfonic एसिड) और 1 एल DDH 2 हे (डबल आसुत जल जोड़कर आधा एमएस मध्यम (आधा ताकत Murashige और Skoog मध्यम) तैयार ) एक 1 एल बोतल में। KOH का उपयोग कर 5.8 पीएच को समायोजित करें।
  2. आधा एमएस माध्यम से 15 जी / एल Gellan गम जोड़े और 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए यह आटोक्लेव।
  3. के बारे में 2 मिमी की मोटाई के साथ जेल की एक परत बनाने के लिए वर्ग पेट्री डिश (245 x 245 x 25 मिमी) में गर्म माध्यम के 30 एमएल डालो। व्यंजन कमरे के तापमान को शांत मध्यम जमना करने की अनुमति दें।
  4. एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया युक्त 1 मिलीलीटर बाँझ एच 2 ओ एक गिलास pipet या 1,000 μL pipet टिप का उपयोग बीज उठाओ और उन्हें जेल की सतह पर बोना ट्यूब में निष्फल Arabidopsis बीज डाल दिया। बीज के अलावा अलग से लगभग 10 मिमी रखें। टेप के साथ थाली सील।
  5. 4 में 24 घंटे के लिए थाली सेतेडिग्री सेल्सियस (स्तरीकरण)।
  6. 120-140 μmol / वर्ग मीटर / एस प्रकाश के 6 दिन के लिए राशि के साथ एक 16/8 ज दिन / रात के चक्र में वृद्धि इनक्यूबेटर में थाली, 22 डिग्री सेल्सियस पर जैसे खेती। 10 दिनों के लिए पुराने पौधों का इस्तेमाल किया जा सकता है।

2. संयंत्र नमूना तैयार विधि

नोट: नमूना धारक या तो 3 डी मुद्रित किया जा सकता है या हाथ आयाम चित्रा -2 में दर्शाया का उपयोग कर एक मशीन कार्यशाला में बनाया है। 3 डी मॉडल फ़ाइल पूरक सामग्री (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl) में प्रदान की जाती है। सामग्री की सूची में 3 डी प्रिंट आदेश देने के लिए लिंक देखें।

  1. 5 ग्राम 50 एमएल आधा एमएस मध्यम युक्त एक 50 मिलीलीटर की बोतल में agarose कम पिघल और 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए यह आटोक्लेव जोड़ें।
  2. 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में 1% कम पिघल agarose समाधान विभाज्य। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (कम से कम दो महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)।
  3. 80 डिग्री सेल्सियस पर 1 %% कम पिघल agarose के एक विभाज्य पिघला और यह करने के लिए ठंडा होने दें33 डिग्री सेल्सियस।
  4. एक अल्ट्रासाउंड इकाई में नमूना धारक को साफ करें। 70% इथेनॉल के साथ नमूना धारक जीवाणुरहित और बाँझ पानी से धो लें।
  5. एक छुरी का उपयोग संयंत्र के आसपास के जेल में काट लें।
  6. एक फ्लैट रंग के साथ ब्लॉक लिफ्ट और एक दूसरे रंग का उपयोग नमूना धारक पर ध्यान से स्लाइड।
  7. (33 डिग्री सेल्सियस) 1% agarose के साथ नमूना धारक पर जेल गोंद एक 100 μL पिपेट का उपयोग।
  8. 1% agarose एक 10 μL पिपेट का उपयोग के साथ जेल पर संयंत्र गोंद। सत्यापित करने के लिए कि पत्तियों जेल के साथ कवर नहीं कर रहे एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। ब्याज के क्षेत्र पर सीधे जेल की स्थिति नहीं है।
  9. बाहर सुखाने से संयंत्र को रोकने के लिए लगातार काम करते हैं। एक 1000 μL pipet टिप में नमूना धारक डालें जब भी संभव है। एक टोपी के रूप में pipet टिप का उपयोग करें और नमूना धारक जहां संयंत्र स्थित है के एक छोर पर ध्यान से स्लाइड।
  10. एक विंदुक टिप बॉक्स में नमूना धारक रखो और यदि आवश्यक हो तो अधिक पौधों को तैयार है। पौधों निदेशक हो सकता हैtly imaged या विकास इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया।

3. माइक्रोस्कोप सेट अप

नोट: एलईडी रोशनी प्रणाली एक कस्टम निर्मित दीपक है। तकनीकी एलईडी अंगूठी बनाने के लिए आवश्यक विवरण चित्रा 3 और सामग्री की सूची में पाया जा सकता है। बोर्ड डिजाइन के लिए पूरक सामग्री फ़ाइल (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) देखें।

  1. पेंच या गोंद (जैसे दो तरफा टेप) OpenSPIM एक्स / y / z / θ चरण बांह के निचले तरफ एलईडी अंगूठी।
  2. एक समायोज्य बिजली की आपूर्ति (0-30 वी, अधिकतम 2 ए) के साथ एलईडी अंगूठी कनेक्ट करें।
  3. वांछित प्रकाश की तीव्रता के लिए वोल्टेज समायोजित (Arabidopsis, 120-140 μmol / एम 2 / एस, चित्रा 3 डी के लिए)।
  4. 70% इथेनॉल के साथ नमूना कक्ष जीवाणुरहित और बाँझ पानी से धो लें।
  5. पेट्रोल और लेंस सफाई ऊतक के साथ उद्देश्य लेंस साफ करें। 70% इथेनॉल के साथ उद्देश्य लेंस जीवाणुरहित।
  6. perfusi कनेक्टएक तरह से व्यवस्था में नमूना चैम्बर के लिए ट्यूब पर। क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला छिड़काव पंप के बगल में एक 1 एल ताजा आधा एमएस मध्यम और एक अन्य खाली बोतल युक्त बोतल रख दिया। एक छिड़काव ट्यूब का उपयोग नमूना कक्ष के निचले प्रवेश के साथ मध्यम के साथ बोतल कनेक्ट करें। इस्तेमाल किया मध्यम एक और छिड़काव ट्यूब का उपयोग करने के लिए कचरा खाली बोतल के साथ नमूना कक्ष के ऊपरी आउटलेट से कनेक्ट करें।
  7. 1 एमएल / मिनट के लिए प्रवाह की गति सेट करें।
    नोट: नमूना कक्ष overspill नहीं करने के लिए, यह प्रवाह की तुलना में अधिक बहिर्वाह के लिए महत्वपूर्ण है। या तो पंपिंग दर में वृद्धि या बहिर्वाह के लिए एक बड़ा भीतरी व्यास के साथ एक ट्यूब का उपयोग करें।
  8. 3 मिमी छोटे वर्गों में एक काले रंग की प्लास्टिक की पन्नी में कटौती, 70% इथेनॉल से धो लें और उन्हें पानी की सतह पर नमूना कक्ष में उन्हें रखने से पहले सूखी।
  9. नमूना धारक से pipet टिप निकालें और नमूना कक्ष में नमूना धारक डालें। नव निर्मित नमूना धारक मंच हाथ में फिट नहीं करता है, एक ठीक रेत का उपयोगकागज यह पतली बनाने के लिए या मामले में एक हे अंगूठी (∅ 6 मिमी) का उपयोग यह भी पतली है।
  10. पलकों बनाने के लिए, दो 50 x 25 मिमी टुकड़ों में काले एल्यूमीनियम पन्नी काटा। एक 5 मिमी प्रत्येक टुकड़े के एक तरफ के बीच में कटौती करें। एक त्रिकोण खरोज (चित्रा -1) बनाने के लिए मोड़ो। नमूना धारक का सामना करना पड़ त्रिकोण indentations के साथ नमूना कक्ष के शीर्ष पर पलकों डालने से दो lids के साथ नमूना कक्ष बंद करें। सुनिश्चित करें कि संयंत्र के पत्तों पलकों की छांव में नहीं कर रहे हैं और प्रकाश व्यवस्था से प्रकाश प्राप्त करते हैं।
  11. देखने के क्षेत्र में एक उभरती हुई पार्श्व रूट की स्थिति के लिए एक्स / y / z और रोटेशन मंच का उपयोग हित के क्षेत्र का पता लगाएं।
  12. रिकॉर्डिंग से पहले, प्रणाली में कम से कम 15 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  13. सेटअप छवि अधिग्रहण।
    1. 3 माइक्रोन जेड रिक्ति (650 माइक्रोन) के साथ 217 छवियों का एक ढेर सेट और 17 घंटा की कुल अवधि के लिए 15 मिनट के अंतराल इमेजिंग के साथ समय व्यतीत हो जाने की स्थापना की।
      नोट: पर एक विस्तृत दस्तावेजकैसे संचालित करने के लिए OpenSPIM सॉफ्टवेयर पर पाया जा सकता है (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack)।
  14. रिकॉर्डिंग शुरू।

Representative Results

जबकि एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के साथ जड़ प्रणाली को देख यह नमूना तैयारी विधि माइक्रोस्कोप नमूना कक्ष के अंदर पौधों की खेती की अनुमति देता है। संयंत्र जेल (आधा एमएस 1.5% Gellan गम युक्त मध्यम) की एक परत की सतह पर बढ़ता एक कस्टम डिजाइन नमूना धारक (चित्रा 2) पर मुहिम शुरू की। नमूना धारक 3 डी सामग्री के रूप में एक पारदर्शी राल का उपयोग कर मुद्रित है। आयामों पर प्रकाश डाला एक निर्मित संस्करण चित्रा -2 में दिखाया गया है। जड़ों तरल (आधा एमएस मध्यम) है, जो लगातार एक छिड़काव प्रणाली द्वारा ताजा है में डूब रहे हैं। पत्ते हवा में रहते हैं और लगातार 130 μmol / वर्ग मीटर / s नीले और लाल एलईडी कि संयंत्र (चित्रा 1 ए, बी और चित्रा 3 ए सी) के ऊपर एक अंगूठी में व्यवस्थित कर रहे हैं से आ रही एक प्रकाश की तीव्रता के साथ प्रकाशित कर रहे हैं। एलईडी अंगूठी हमारे मशीन कार्यशाला में निर्मित है औरहम कैसे चित्रा 3 और सामग्री की सूची में एलईडी अंगूठी बनाने के लिए पर तकनीकी जानकारी प्रदान करते हैं। प्रकाश की तीव्रता लगातार 30-250 μmol / एम 2 / s (चित्रा 3 डी) से लेकर समायोजित किया जा सकता है। जड़ प्रणाली पानी की सतह को कवर करने के लिए एक काले रंग की प्लास्टिक की पन्नी के छोटे शीट (चित्रा 1) द्वारा छायांकित है। रोशनी से किसी भी आवारा प्रकाश है कि पता लगाने के लेंस से एकत्र किया जाता है GFP फिल्टर (चित्रा 3E) द्वारा फ़िल्टर किया जाता है।

इस स्थापना के साथ, एक से बढ़ Arabidopsis पार्श्व रूट की एक समय व्यतीत हो जाने के एक 20X / 0.5 लेंस (चित्रा 4) का उपयोग करते हुए 17 घंटे के लिए दर्ज किया गया था। पार्श्व रूट पेरिसाइकिल सेल परत है, जो प्राथमिक जड़ अंदर गहरे स्थित है में अपने मूल है। आदेश में लंबे समय अवधि के लिए इमेजिंग क्षमताओं को एक ऊतक के अंदर भी गहरा को प्रदर्शित करने के लिए, एक उच्च आवर्धन (40X / 0.75) एक पार्श्व आरओ के गठन पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया थापहले चरण के उत्स से ओटी तक 38 एच (चित्रा 5) के एक समय अवधि के भीतर प्राथमिक जड़ से बाहर उद्भव। डेटा सेट के एक अनुकरणीय 2 डी टुकड़ा चित्र में दिखाया गया है। 5 ब। यह रिकॉर्डिंग एक सेलुलर संकल्प के साथ 3 डी (चित्रा 5 ए) में पार्श्व जड़ गठन की गतिशीलता का पालन करने के लिए हमें की अनुमति देता है।

आकृति 1
चित्रा 1: OpenSPIM नमूना कक्ष के अंदर की स्थिति बढ़ रहा है। ए) इमेजिंग कक्ष के स्केच। संयंत्र एक जेल की सतह पर ईमानदार बढ़ रहा है, एक कस्टम बनाया नमूना धारक पर मुहिम शुरू की है (देखें भी चित्रा 2)। जड़ों को एक तरल माध्यम है, जो लगातार एक छिड़काव प्रणाली से बदल जाता है में बढ़ रहे हैं। संयंत्र के पत्ते हवा में आगे बढ़ने और लाल और नीले एलईडी (भी 3 आंकड़ा देखें) द्वारा प्रकाशित कर रहे हैं। जड़ प्रणाली बुद्धि छायांकित है पानी की सतह को कवर करने के लिए एक काले रंग की प्लास्टिक की पन्नी की ज छोटे चादरें। काले एल्यूमीनियम पन्नी के दो टुकड़े से बना एक ढक्कन के आगे पानी की सतह के नीचे प्रकाश की मात्रा को कम कर देता है और नमूना कक्ष में नमी बनाए रखता है। सही पर बढ़ाया पैनल संयंत्र तरल माध्यम में डूबे जेल के एक ब्लॉक की सतह पर बढ़ रही है पर प्रकाश डाला गया। agarose की एक बूंद जेल पर जड़ mounts। धराशायी बॉक्स माइक्रोस्कोप से मनाया ब्याज के क्षेत्र इंगित करता है। बी) इमेजिंग कक्ष (ढक्कन के बिना की तस्वीर)। नंबर (1) - (10) ए और बी में प्रतिनिधित्व करते हैं: (1): एक्स / y / z / एलईडी की अंगूठी के साथ θ चरण, (2): नमूना धारक, (3): ढक्कन, (4): Arabidopsis thaliana (5): छिड़काव प्रणाली, (7): पता लगाने के उद्देश्य लेंस, (8): तरल माध्यम है, (9): नमूना कक्ष, (10): रोशनी उद्देश्य लेंस काले रंग की प्लास्टिक की पन्नी, (6) की चादरों। सी) ढक्कन काले एल्यूमीनियम पन्नी के दो टुकड़े से बना है। लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: नमूना धारक। ए) 3 डी मॉडल। 3 डी मॉडल फ़ाइल पूरक सामग्री में प्रदान की जाती है। पारदर्शी ऐक्रेलिक प्लास्टिक (4) और (5),: राल, (6): पारदर्शी राल (3) - बी) के विभिन्न सामग्रियों (1) का उपयोग कर 3 डी प्रिंट की तस्वीर। सी) नमूना धारक की तकनीकी ड्राइंग, संख्या मिलीमीटर प्रतिनिधित्व करते हैं। डी) एक संयंत्र के साथ निर्मित नमूना धारक की तस्वीर मुहिम शुरू की। धराशायी क्षेत्र माइक्रोस्कोप से देखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3: संयंत्र रोशनी सेटअप। ए) दीपक के योजनाबद्ध सर्किट आरेख। एल ई डी के जोड़े दिशात्मक बिजली के लिए व्यक्तिगत रूप से बंद / पर बंद किया जा सकता है। एलईडी: प्रकाश उत्सर्जक डायोड, आर: प्रतिरोध, टी: ट्रांजिस्टर, जेपी: सिरा। मुद्रित सर्किट बोर्ड): बी) रोशनी दीपक के अंतिम डिजाइन एक पीसीबी सॉफ्टवेयर (पीसीबी का उपयोग कर तैयार किया गया था। हम पूरक सामग्री में बोर्ड डिजाइन फ़ाइल प्रदान करते हैं। बोर्ड तो निर्मित है और हमारे संस्थान के MIBA मशीन की दुकान में इकट्ठा किया गया था। सी) एलईडी अंगूठी की तस्वीर पर बंद कर दिया। एक लाल और एक नीले एलईडी के चार जोड़े एक अंगूठी में व्यवस्थित कर रहे हैं। डी) वोल्टेज की सीमा 3.5 वी और 14.0 वी Resistances के बीच समायोजित किया जा सकता 30-250 μmol / मीटर से लेकर प्रकाश की राशि तक पहुंचने के लिए इस्तेमाल किया गया 2 / s (R1-8: 220 ओम, R9-12: 1,220 ओम )। ई) दीपक, GFP और YFP के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम। टी.पी.: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Arabidopsis के समय चूक रिकॉर्डिंग थालिअना पार्श्व जड़। 5 दिन पुरानी अंकुर एक झिल्ली मार्कर (pUBQ10 :: YFP-PIP1, 4) को व्यक्त करता है और एक परमाणु रिपोर्टर (pGATA23 :: एनएलएस गस GFP) विशेष कोशिकाओं है कि एक पार्श्व जड़ में विकसित पेरिसाइकिल अंकन। 217 छवियों (3 माइक्रोन जेड रिक्ति) के एक ढेर एक 20X / 0.5 लेंस का उपयोग कर 17 h रिकॉर्डिंग के लिए हर 15 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था। ए) 69 में से चार बार के अंक में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण में दिखाया जाता है। बी) एक समय बिंदु की एक z ढेर के 217 में से छह एकल स्लाइस दिखाए जाते हैं। ए और बी में स्केल सलाखों 100 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं।लोड / 55044 / 55044fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: Arabidopsis के समय चूक रिकॉर्डिंग थालिअना पार्श्व जड़। 6 दिन पुरानी अंकुर एक झिल्ली मार्कर (pUBQ10 :: YFP-PIP1, 4) को व्यक्त करता है और एक परमाणु रिपोर्टर (pGATA23 :: एनएलएस गस GFP) विशेष कोशिकाओं है कि एक पार्श्व जड़ में विकसित पेरिसाइकिल अंकन। 200 छवियों (1.5 माइक्रोन जेड रिक्ति) के एक ढेर एक 40X / 0.75 लेंस का उपयोग कर 38 ज रिकॉर्डिंग के लिए हर 15 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था। ए) चार बार अंक के 3 डी प्रतिपादन, ग्रिड में संख्या मुख्य जड़ के केंद्रीय विमान के माध्यम से माइक्रोन, बी) एकल टुकड़ा प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl। 3 डी मॉडल फ़ाइल प्रदान की जाती है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल एलईडी अंगूठी Board.brd। बोर्ड डिजाइन फ़ाइल प्रदान की जाती है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कम phototoxicity और ultrafast अधिग्रहण की गति है, जो है, जबकि एक शारीरिक स्थिति में नमूना रखने के लिए एक उच्च स्थानिक-सामयिक संकल्प के साथ एक बड़ी मात्रा में कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है गठबंधन करने के लिए महान लाभ है। एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप का संकल्प एक confocal खुर्दबीन 9 की तुलना की जा सकती है। हालांकि, प्रकाश बिखरने और अवशोषण को व्यक्तिगत रूप से उत्तेजना और उत्सर्जन मार्ग के किनारे होता है और समग्र छवि गुणवत्ता में काफी सतह की तुलना में अपारदर्शी ऊतकों के अंदर कम हो सकता है। इस जटिलता को नाकाम करने के लिए एक ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ नमूना बारी बारी से और अलग अलग दिशाओं से एक ही मात्रा का निरीक्षण करने की संभावना का उपयोग कर सकते हैं। लेकिन यह हमेशा फायदेमंद नहीं है, जैसे पार्श्व जड़ों अधिक जानकारी पाने के बिना जड़ और एक कम छवि गुणवत्ता में परिणाम के पीछे से इमेजिंग के एक तरफ उभरेगा। हालांकि, रोटेशन मुख्यतः samp की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासबसे अच्छा तरीका में ले। ऑब्जेक्टिव लेंस की क्लासिक क्षैतिज व्यवस्था नमूना बढ़ते के नए तरीके के लिए अनुमति देता है। पौधे एक ऊर्ध्वाधर स्थिति से लाभ। यहाँ प्रस्तुत बढ़ते विधि "जेल की सतह पर" इस तरह के एक जेल 24,25 के अंदर जड़ embedding के रूप में अन्य बढ़ते तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं। 1) जड़ प्रणाली तरल माध्यम से सीधे संपर्क में है। नमूना कक्ष एक छिड़काव प्रणाली है जो लगातार ताजा माध्यम प्रदान से जुड़ा है। यह भी तेजी से नमूना कक्ष की पूरी मात्रा का आदान-प्रदान करने के लिए विभिन्न मीडिया या दवाओं लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 2) नमूने के लिए पूर्व तैयारी पौधों को बढ़ने के रूप में वे प्रयोगशालाओं में विकसित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। पौधे एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे का चयन किया जा सकता है और केवल वांछित पौधों तैयार रहने की जरूरत है। 3) संयंत्र छुआ जा रहा बिना नमूना धारक को पेट्री डिश से स्थानांतरित कर रहा है। जिससे संयंत्र आगे एक ही जेल में यह विकास incubato में बढ़ रहा था पर विकसित कर सकते हैंआर और यांत्रिक तनाव एक न्यूनतम करने के लिए कम है। 4) नमूना पर देखें अबाधित है और ऑप्टिकल aberrations कम कर रहे हैं, क्योंकि नमूना और पता लगाने के उद्देश्य के बीच अंतरिक्ष के लिए पूरी तरह मध्यम और अपवर्तक सूचकांक भिन्न के साथ कोई अन्य सामग्री से भर जाता है।

आदेश में लंबे समय तक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, संयंत्र रोशनी प्रणाली संयंत्र के संश्लेषक गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। ज्यादातर प्रयोगशालाओं में पौधों को एक पारदर्शी जेल पर बड़े होते हैं, यानी जड़ों प्रकाश के संपर्क में रहे हैं। यह अपने पर्यावरण के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाओं का कारण है और उनकी जैव रसायन और विकास 26,27 में परिवर्तन लाती सकता है। आदेश जड़ प्रणाली पर प्रकाश की मात्रा को कम करने के लिए, काले रंग की प्लास्टिक की पन्नी पानी की सतह के साथ ही एक ढक्कन काले एल्यूमीनियम पन्नी से बना नमूना कक्ष कवर को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। लाइट संयंत्र तक पहुँच सकते हैं ढक्कन में केंद्रीय छेद के माध्यम से छोड़ देता है। इस सेटअप में, पृष्ठभूमि प्रकाश में कोई वृद्धि मनाया गया, suggestinछ है कि लाल और नीले एलईडी से आवारा प्रकाश की मात्रा काफी GFP फिल्टर और छायांकन दृष्टिकोण की कमी थी। इस कैमरे पृष्ठभूमि शोर में वृद्धि के बिना प्रकाश छवि अधिग्रहण के दौरान चालू रखने की अनुमति दी।

नमूना धारक 3 डी मुद्रण के लिए बनाया गया है। हालांकि, सामग्री का चुनाव महत्वपूर्ण है के रूप में कई प्लास्टिक कि परीक्षण किया गया नमूने की एक बहाव में जिसके परिणामस्वरूप 100% स्थिर थे। इसलिए, यह बजाय रेजिन का उपयोग करें या एक पॉलीथीन (पीईपी) रॉड मिलिंग द्वारा नमूना धारक का निर्माण करने की सिफारिश की है। दो तरफा रोशनी प्रणाली के साथ एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग करते नमूना धारक रोटेशन कोण के आधार पर प्रकाश चादरों से एक के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। थाली से संयंत्र scooping के दौरान यांत्रिक तनाव को कम करने के लिए, रंग के एक फ्लैट कोण का उपयोग करें। संयंत्र जल्दी बाहर सूखी और बहुत पहले समय के लिए हवा का प्रवाह अनुभव कर सकते हैं। किसी भी हवाई मसौदा (रैपिड आंदोलनों, हवा हालत प्रवाह) से बचने के लिए प्रयास करें, woआरके uninterruptedly और एक 1000 μL pipet टिप में नमूना धारक स्लाइड जब भी संभव है। माइक्रोस्कोप के अंदर, यह तरल में पूरे संयंत्र डुबकी और न पत्तियों को सूखा रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

तकनीक पार्श्व जड़ गठन के प्रारंभिक दौर इमेजिंग के लिए आदर्श है। जब परिपक्व जड़ सुझावों की दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदर्शन एक को ध्यान में रखना चाहिए कि Arabidopsis जड़ों तेजी से 100-300 मीटर / ज के साथ बढ़ने देखने के क्षेत्र से बाहर है। एक बहुत ही उपयोगी भविष्य कार्यान्वयन एक स्वचालित ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म, जो समय की लंबी अवधि में निम्नलिखित जड़ टिप विकास की अनुमति होगी हो सकता है। अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान इस तरह के प्रकाश और मध्यम के पोषक तत्व संरचना के रूप में पर्यावरण की स्थिति को नियंत्रित करने की क्षमता की जांच कैसे पौधों बदलाव के लिए अनुकूल है। जड़ inducible 28 dexamethasone या β-ESTR का उपयोग कर उदाहरण के लिए, तरल माध्यम है, जो रासायनिक जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए दवाओं लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ सीधे संपर्क में हैinducible प्रणाली 29 adiol। हालांकि, यह नमूना कक्ष की पूरी मात्रा का आदान-प्रदान करने के लिए एक दवा बाहर धोने के लिए समय लगता है। सेटअप मध्यम आदान-प्रदान में तेजी लाने का नमूना कक्ष की मात्रा कम करके सुधार किया जा सकता है। फिर भी, इस तकनीक के लिए एक महान क्षमता है। बढ़ते प्रक्रिया, मानकीकृत बढ़ती शर्तों और सौम्य छवि अधिग्रहण प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का उपयोग के संयोजन एक शारीरिक स्तर पर उच्च संकल्प के साथ संयंत्र के विकास के लंबे समय तक अध्ययन की अनुमति देता है। यह शोधकर्ताओं मदद संयंत्र के विकास के मौलिक तंत्र का पता लगाने के लिए होगा।

Acknowledgments

हम ऑडियो उपकरणों के लिए महत्वपूर्ण पढ़ने / देखने के लिए Matyas Fendrych और स्टीफ़न Stadlbauer धन्यवाद। OpenSPIM के लिए उनके योगदान के लिए IST ऑस्ट्रिया में Miba मशीन शॉप के लिए धन्यवाद। अनुसंधान इन परिणामों के लिए अग्रणी वजह अनुदान समझौते n ° [291734] और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी परियोजना -2011 के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) के लोग कार्यक्रम (मैरी क्यूरी प्रक्रिया) से धन प्राप्त हुआ है -StG-20101109-PSDP)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose, low melting VWR AFFY3282125GM
Black aluminum foil Thorlabs BKF12
Black plastic foil Carl Roth HT83.2
LED blue (453 nm) OSRAM LD CN5M-1R1S-35-1
LED red (625 nm) OSRAM LR T66F-ABBB-1-1
LED board - PCB design software Cadsoft Eagle
MES monohydrate Duchefa M1503.0100
Micropore Surgical Tape 3M 1530-1
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) Duchefa M0221
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Sample holder 3D print i.materialise https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1
Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm) VWR 734-2179
Sucrose Sigma-Aldrich 84097-1KG

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References

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प्लांट बायोलॉजी अंक 119 Lightsheet माइक्रोस्कोपी लाइट-शीट प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी LSFM चयनित विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी SPIM Arabidopsis पौधों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जीवोत्पत्ति विकास
पौधे की जड़ों के प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक जेल की सतह पर बढ़ रहा है
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von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044, doi:10.3791/55044 (2017).

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