Introduction
Uma das questões-chave no desenvolvimento da planta entendimento é como as células individuais se comportam durante a diferenciação de órgãos e crescimento. Idealmente, eventos celulares, como padrões de expressão de genes e localização da proteína intracelular, pode ser vista à luz de um contexto mais amplo do tecido. Este objectivo coloca desafios técnicos e requer observação de órgãos inteiros com uma alta resolução espacial, bem como a resolução temporal ao longo de períodos prolongados de tempo, que podem causar efeitos foto-toxicidade. Desde que as plantas se adaptar rapidamente às mudanças ambientais, as condições de crescimento deve ser rigidamente controlado. A fim de fazer imagiologia de longo prazo, sem interferir com o estado fisiológico da planta, três coisas têm que ser asseguradas condições, 1) que crescem na câmara da amostra, 2) amostra estável de montagem ao longo de grandes períodos de tempo, e 3) a imagem com baixas intensidades de luz para evitar a foto-dano e condições não fisiológicas.
Fisiológica conditi crescenteons na câmara de microscópio amostras são cruciais para experimentos de longa duração. Há uma série de protocolos disponíveis que descrevem câmaras de crescimento de imagem para microscópios confocal 1 - 3. No entanto, a microscopia confocal introduz luz alta intensidade para a planta, que pode causar respostas ao estresse e, geralmente inibe o crescimento 4. Além disso, a maioria dos microscópios convencionais só permitem o posicionamento horizontal da amostra, que não é óptima para as plantas, uma vez que tentar reorientar-se e crescem em direcção do vector de gravidade. Ao longo dos últimos dez anos, a microscopia de luz folhas emergiu como uma ferramenta poderosa para captar o desenvolvimento de grandes espécimes em resolução celular durante períodos de tempo de até vários dias 5 - 9. A microscopia de luz folhas permite posicionar a amostra verticalmente e é cada vez mais utilizado na investigação de plantas estudando o desenvolvimento radicular 10-21, revisto recentemente por Berthet e Maizel 22. Muitos dos estudos mencionados 10,13 - 18,21 foram optimizadas e conduzidos em laboratório de Ernst HK Stelzer empregando uma forma especial da amostra de montagem caracteriza-se por crescimento da raiz na superfície de um gel de 17. Nestes estudos, foi utilizado um microscópio feito por medida, no qual a planta é realizada a partir do fundo. Em contraste, a maioria dos microscópios luz folhas amplamente disponíveis manter a amostra a partir do topo. Assim, este método de preparação particular pode não ser prontamente aplicado. O método aqui apresentado fornece um protocolo para o método de montagem bem estabelecida on-superfície aplicável para a OpenSPIM 23, uma plataforma de acesso aberto para aplicar e melhorar seletiva Avião Illumination Microscopy (SPIM).
O objetivo geral deste protocolo é permitir imaging longo prazo de raízes de Arabidopsis na OpenSPIM microscópio de luz folhas. Isto é conseguido por crescimento de uma planta na vertical sobre o Surface de um gel com as raízes em um meio líquido, enquanto as folhas permanecem no ar. A fim de assegurar a actividade fotossintética da planta, um sistema de iluminação feito por encomenda ilumina as folhas, mas não as raizes (Figura 1).
Protocol
1. Arabidopsis A cultura antes da imagem
- Preparar o meio ½ MS (meia-força de Murashige e Skoog) por adição de 2,15 g MS-meio, 10 g de sacarose, 0,97 g de MES (ácido 2- (N-morfolino) etanossulfónico) e 1 L de ddH2O (água bidestilada ) numa garrafa de 1 L. Ajustar o pH para 5,8, utilizando KOH.
- Adicionar 15 g / l de goma de gelano ao meio ½ MS e que autoclave durante 20 min a 121 ° C.
- Pour 30 ml do meio quente em placas de Petri quadradas (245 x 245 x 25 mm) para criar uma camada de gel com uma espessura de cerca de 2 mm. Deixe os pratos de arrefecer até à temperatura ambiente para permitir que a forma a solidificar.
- Coloque as sementes de Arabidopsis esterilizados num tubo de reacção de 1,5 ml contendo 1 ml de H 2 O. estéril pegar as sementes utilizando uma pipeta de vidro ou uma ponta de pipeta de 1000 mL e semear-los sobre a superfície do gel. Coloque as sementes separadamente cerca de 10 mm. Selar a placa com fita adesiva.
- Incubar a placa durante 24 h a 4° C (estratificação).
- Cultivar a placa numa incubadora de crescimento, por exemplo a 22 ° C em um / ciclo noite 16/8 h dias com 120-140 / m² / s quantidade umol de luz durante 6 dias. Até 10 dias de idade plantas pode ser utilizada.
2. Planta Sample Método de Preparação
Nota: O suporte de amostras pode ser tanto 3D impressa ou mão feita em uma oficina da máquina usando as dimensões apresentadas na Figura 2C. O arquivo do modelo 3D é fornecida no material suplementar (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Veja o link para encomendar a impressão 3D na lista de materiais.
- Adicionar 5 g de agarose de baixa fusão em um frasco de 50 mL contendo 50 mL de meio MS e ½ autoclave durante 20 min a 121 ° C.
- Alíquota da solução de agarose 1% baixo ponto de fusão em 1,5 tubos de reacção mL. Armazenar a 4 ° C (pode ser usado para, pelo menos, dois meses).
- Derreter-se uma alíquota de 1 agarose %% baixo ponto de fusão a 80 ° C e deixe esfriar para33 ° C.
- Limpe o suporte de amostras em uma unidade de ultra-som. Esterilizar o suporte de amostra com 70% de etanol e lava-se com água estéril.
- Corte o gel ao redor da planta usando um bisturi.
- Levante o bloco com uma espátula plana e deslize-o cuidadosamente no suporte de amostras usando um segundo espátula.
- Cole o gel sobre o suporte de amostra com 1% de agarose (a 33 ° C), utilizando uma pipeta de 100 uL.
- Cole a planta no gel com agarose a 1% utilizando uma pipeta de 10 mL. Usar um microscópio estéreo para verificar que as folhas não são cobertas com gel. Não posicionar o gel directamente sobre a região de interesse.
- Para evitar que a planta de secagem para fora, trabalhar ininterruptamente. Insira o suporte da amostra em uma ponta de pipeta de 1000 mL sempre que possível. Use a ponta da pipeta como uma tampa e deslize-o cuidadosamente sobre uma extremidade do suporte de amostras, onde a fábrica está localizada.
- Coloque o suporte de amostras em uma caixa de ponta de pipeta e preparar mais plantas se necessário. As plantas podem ser direcTLY fotografada ou colocar de volta na incubadora crescimento.
3. Configure o microscópio
NOTA: O sistema de iluminação LED é uma lâmpada custom-built. Os detalhes técnicos necessários para construir o anel de LED pode ser encontrada na Figura 3 e a lista de materiais. Consulte o arquivo de material suplementar (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) para o projeto da placa.
- Parafuso ou cola (por exemplo, fita dupla face) do anel LED no lado inferior do braço OpenSPIM x / y / z / θ-stage.
- Ligue o anel de LED com uma fonte de alimentação ajustável (0-30 V, max 2 A).
- Ajustar a tensão para a intensidade da luz desejada (por Arabidopsis, 120-140 umol / m 2 / s, a Figura 3D).
- Esterilizar a câmara de amostras com 70% de etanol e lava-se com água estéril.
- Limpar a lente objetiva com o tecido benzina e lente de limpeza. Esterilizar a lente objectiva com 70% de etanol.
- Ligue os perfusiem tubos para a câmara de amostras em um arranjo de uma via. Coloque uma garrafa de 1 L contendo MS meio fresco ½ e outra garrafa vazia ao lado da bomba de perfusão peristáltica. Ligue o frasco com meio com a entrada inferior da câmara de amostras usando um tubo de perfusão. Ligue a tomada superior da câmara de amostra com a garrafa vazia para o lixo o meio utilizado usando outro tubo de perfusão.
- Defina a velocidade do fluxo de 1 mL / min.
NOTA: Para não transbordamento da câmara da amostra, é importante ter uma saída maior que o fluxo de entrada. Ou aumentar a taxa de bombagem, ou utilizar um tubo com um diâmetro interno maior para o escoamento. - Corte uma folha de plástico preto no 3 mm quadrados pequenos, lavar com 70% de etanol e deixe-os secar antes de os colocar na câmara de amostra na superfície da água.
- Retire a ponta da pipeta do porta-amostras e inserir o suporte de amostras na câmara de amostra. Se o titular da amostra recém-fabricados não se encaixa no braço fase, use uma areia finapapel para torná-lo mais fino ou usar um anel de vedação (∅ 6 mm) no caso de ser muito fino.
- Para criar as tampas, cortar a folha de alumínio preto em duas 50 x 25 mm peças. Adicione a 5 mm cortados no meio de um lado de cada peça. Dobrar a criar uma reentrância triângulo (Figura 1D). Fechar a câmara de amostras com as duas tampas, colocando as tampas no topo da câmara de amostras com os entalhes triângulo virado para o suporte da amostra. Certifique-se de que as folhas de plantas não estão na sombra das pálpebras e receber a luz do sistema de iluminação.
- Localizar a região de interesse, utilizando a fase de X / Y / Z e rotação para posicionar um raízes laterais emergente no campo de visão.
- Antes de gravar, permitir que o sistema atinja o equilíbrio durante pelo menos 15 min.
- Configuração da aquisição da imagem.
- Definir uma pilha de 217 imagens com 3 mm z-spacing (650 mm) e definir o lapso de tempo com intervalo de 15 min de imagem, por um período total de 17 h.
NOTA: A documentação detalhada sobrecomo operar o software OpenSPIM pode ser encontrado em (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
- Definir uma pilha de 217 imagens com 3 mm z-spacing (650 mm) e definir o lapso de tempo com intervalo de 15 min de imagem, por um período total de 17 h.
- Comece a gravar.
Representative Results
Este método de preparação da amostra permite que o cultivo da planta para dentro da câmara de amostras microscópio enquanto observa o sistema de raiz com um microscópio de luz folhas (Figura 1). A planta cresce na superfície de uma camada de gel (½ meio MS contendo 1,5% de goma de gelano) montado sobre um suporte de amostra projetado (Figura 2). O suporte de amostras é 3D impresso usando uma resina transparente quanto material. Uma versão fabricado com destaque para as dimensões é representado na Figura 2C. As raízes são imersos em líquido (½ meio MS), que é continuamente refrescado por um sistema de perfusão. As folhas permanecem no ar e são continuamente iluminada com uma intensidade de luz de 130 umol / m² / s vinda dos LEDs vermelho e azul, que são dispostos num anel acima da planta (Figura 1A, B e A Figura 3A-C). O anel LED é fabricado em nossa oficina de máquinas enós fornecemos detalhes técnicos sobre como construir o anel LED na Figura 3 e a lista de material. A intensidade de luz pode ser ajustada variando continuamente 30-250 umol / m 2 / s (Figura 3D). O sistema radicular é sombreada por pequenas folhas de uma folha de plástico preto cobrindo a superfície da água (Figura 1). Qualquer luz difusa da iluminação que é recolhida pela lente de detecção é filtrado pelo filtro GFP (Figura 3E).
Com esta configuração, um lapso de tempo de uma crescente Arabidopsis raízes laterais foi gravado durante 17 h usando uma lente de 20x / 0,5 (Figura 4). A raiz lateral tem sua origem na camada de células periciclo, que está localizado no fundo da raiz primária. A fim de demonstrar as capacidades de imagem ainda mais profundas no interior de um tecido por um período de tempo prolongado, uma ampliação maior (40x / 0.75) foi utilizado para capturar a formação de um ro lateraisOT a partir da primeira fase primórdio até o aparecimento da raiz principal dentro de um período de tempo de 38 h (Figura 5). Uma fatia 2D exemplificativa do conjunto de dados é mostrado na Fig. 5B. Esta gravação permite-nos acompanhar a dinâmica de formação de raízes laterais em 3D (Figura 5A) com uma resolução celular.
Figura 1: Crescimento condições no interior da câmara de amostra OpenSPIM. A) Esboço da câmara de imagem. A planta está a crescer na vertical, sobre a superfície de um gel, montado num suporte de amostra construído sob encomenda (ver também a Figura 2). As raízes estão crescendo num meio líquido, que é continuamente trocadas por um sistema de perfusão. A folhas de plantas crescem em ar e são iluminados por LEDs vermelhos e azuis (ver também a Figura 3). O sistema radicular é sombreada wit h folhas pequenas de uma folha de plástico preto cobrindo a superfície da água. Uma tampa feita de duas peças de folha de alumínio preto reduz ainda mais a quantidade de luz por baixo da superfície da água e mantém a humidade na câmara de amostra. O painel da direita ampliada em evidencia a planta que cresce na superfície de um bloco de gel de imerso no meio líquido. Uma gota de agarose monta a raiz sobre o gel. A caixa a tracejado indica a região de interesse observado pelo microscópio. B) Fotografia da câmara de imagem (sem tampa). Os números (1) - (10) em A e B representam: (1): X / Y / Z / θ-fase com anel de LED, (2): suporte de amostra, (3): tampa, (4): Arabidopsis thaliana , (5): folhas de folha de plástico preto, (6): sistema de perfusão, (7): detecção de lente objectiva, (8): meio líquido, (9): câmara de amostras, (10): iluminação lente objectiva. C) A tampa é feita de duas peças de folha de alumínio preto. target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O suporte de amostras. A) modelo 3D. O arquivo do modelo 3D é fornecido no material suplementar. B) Fotografia de impressões em 3D usando diferentes materiais (1) - (3): plástico transparente de acrílico, (4) e (5): resina, (6): resina transparente. C) Desenho técnico de suporte da amostra, números representam milímetro. D) Fotografia do suporte de amostra do fabricado com uma planta montada. A área a tracejado pode ser observado pelo microscópio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: Instalação de iluminação Plant. A) diagrama de circuito esquemático da lâmpada. Pares de LEDs pode ser ligado / desligado individualmente para um raio direcional. LED: diodo emissor de luz, R: Resistência, T: transistor, JP: cabeça de alfinete. B) O desenho final da lâmpada de iluminação foi tirado usando uma PCB-software (PCB: placa de circuito impresso). Nós fornecemos o arquivo projeto da placa no material suplementar. A placa foi então fabricados e montados na oficina mecânica MIBA do nosso instituto. C) A fotografia do anel LED ligado. Quatro pares de vermelho e um LED azul estão dispostos em um anel. D) A gama de tensão pode ser ajustado entre 3,5 V e 14,0 V. Resistências foram usadas para atingir a quantidade de luz que varia de 30-250 mmol / m 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) O espectro de emissão da lâmpada, GFP e YFP. tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Tempo de gravação de lapso de Arabidopsis thaliana raiz lateral. Os 5 dias de idade mudas expressa um marcador de membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) e um repórter nuclear (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) especificamente marcação periciclo células que se desenvolvem em uma raiz lateral. Uma pilha de 217 imagens (3 mm z-espaçamento) foi capturada a cada 15 minutos durante 17 horas de gravação usando uma lente de 20x / 0,5. A) Quatro pontos de tempo de 69 são mostrados numa projecção de intensidade máxima. B) Seis em cada 217 fatias individuais de um z-stack de um ponto de tempo são mostrados. Barras de escala em A e B representam 100 mm.carga / 55044 / 55044fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Tempo de gravação de lapso de Arabidopsis thaliana raiz lateral. A 6 dias de idade plântulas expressa um marcador de membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) e um repórter nuclear (NLS-pGATA23 :: GUS-GFP) especificamente marcação periciclo células que se desenvolvem em um raízes laterais. Uma pilha de 200 imagens (1,5 um z-espaçamento) foi capturada a cada 15 minutos por 38 h de gravação usando uma lente de 40x / 0,75. A) A rendição 3D de quatro pontos no tempo, os números na grade representam um, B) única fatia através do plano central da raiz principal. A barra de escala representa 50 um. Por favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. O arquivo do modelo 3D é fornecido. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Suplementar Arquivo LED Anel Board.brd. O arquivo de projeto da placa é fornecida. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Discussion
Folha de luz microscopia de fluorescência tem a grande vantagem de combinar baixa fototoxicidade e a velocidade de aquisição ultra-rápida, que pode ser utilizado para capturar uma grande volume, com uma alta resolução espaço-temporal, mantendo a amostra em um estado fisiológico. A resolução de uma folha de microscópio de luz pode ser comparada com a de um microscópio confocal 9. No entanto, a dispersão de luz e absorção ocorre ao longo do caminho de excitação e de emissão individualmente e a qualidade da imagem global pode ser significativamente inferior no interior tecidos opacas em comparação com a superfície. Para contornar esta complicação pode-se usar a possibilidade de girar a amostra ao longo do eixo vertical e observar o mesmo volume a partir de diferentes direcções. Mas nem sempre é vantajosa, por exemplo, raízes laterais emergem de um lado da raiz e imagiologia por trás resulta em uma baixa qualidade de imagem sem ganhar mais informações. No entanto, a rotação pode ser principalmente utilizado para posicionar o SAMPle da melhor maneira. O arranjo horizontal clássica das lentes objetivas permite novas formas de montagem de amostra. Plantas beneficiar de uma posição vertical. Apresentado aqui, o "sobre a superfície do gel" método de montagem tem várias vantagens em comparação com outros métodos de fixação, tais como a incorporação da raiz no interior de um gel de 24,25. 1) O sistema radicular está em contato direto com o meio líquido. A câmara da amostra é ligado a um sistema de perfusão que fornece meio fresco continuamente. Ele também pode ser usado para trocar rapidamente a totalidade do volume da câmara de amostragem para aplicar diferentes meios ou drogas. 2) Antes da amostra de preparação de plantas crescer à medida que eles são utilizados para crescer em laboratórios. As plantas podem ser seleccionadas sob um microscópio de fluorescência e apenas as plantas desejadas precisam ser preparados. 3) A unidade é transferido da placa de Petri para o suporte de amostras, sem ser tocado. Deste modo, a planta pode desenvolver no mesmo gel foi crescendo em crescimento na incubatoR e tensão mecânica é reduzida a um mínimo. 4) A vista sobre o espécime é desobstruída e as aberrações ópticas são minimizados porque o espaço entre a amostra e o objectivo de detecção é apenas preenchido com meio e não há outros materiais com diferentes índices de refracção.
A fim de realizar imagem de longo prazo, o sistema de iluminação planta é necessária para garantir a actividade fotossintética da planta. Na maior parte dos laboratórios de plantas crescem sobre um gel transparente, ou seja, as raízes são expostas à luz. Isso pode causar diferentes respostas ao seu ambiente e induz mudanças na sua bioquímica e desenvolvimento 26,27. A fim de reduzir a quantidade de luz sobre o sistema de raiz, folha de plástico preto foi usada para cobrir a superfície da água, bem como uma tampa feita de folha de alumínio preto coberto a câmara de amostras. A luz pode atingir a folhas de plantas através do orifício central na tampa. Nesta configuração, nenhum aumento de luz de fundo foi observado, suggesting que a quantidade de luz dispersa a partir dos LEDs vermelhos e azuis foi significativamente reduzida pelo filtro GFP e as abordagens de sombreamento. Isto permitiu manter a luz acesa durante a aquisição de imagem, sem aumentar o ruído de fundo da câmera.
O suporte de amostras é projetado para impressão 3D. No entanto, a escolha do material é crucial como vários plásticos que foram testados não foram 100% estável, resultando em um desvio da amostra. Portanto, é recomendado o uso de resinas, em vez ou construir o suporte de amostra por moagem de uma haste (PEP) de polietileno. Quando se utiliza uma configuração de folha de luz do microscópio com sistema de iluminação de dupla face titular a amostra pode interferir com uma das folhas de luz em função do ângulo de rotação. Para reduzir a tensão mecânica durante a escavar a planta a partir da placa, usar um ângulo plano da espátula. A planta pode rapidamente secar e fluxo de experiência ar pela primeira vez. Tente evitar qualquer corrente de ar (movimentos rápidos, o fluxo de ar-condicionado), work ininterruptamente e deslize o suporte de amostras em uma ponta da pipeta de 1000 mL sempre que possível. Dentro do microscópio, é crucial para não molhar a planta inteira em líquido e manter as folhas secas.
A técnica é ideal para imagens estágios iniciais de formação de raízes laterais. Ao realizar imagem de longo prazo de pontas de raízes maduras é preciso ter em mente que as raízes de Arabidopsis crescer com 100-300 mm / h rapidamente para fora do campo de visão. A futura aplicação muito útil poderia ser um algoritmo de acompanhamento automatizado, o que permitiria o crescimento ponta seguinte raiz ao longo de períodos prolongados de tempo. A capacidade de controlar as condições ambientais tais como a luz e a composição de nutrientes do meio durante o processo de aquisição permite investigar como as plantas se adaptar a alterações. A raiz está em contacto directo com o meio líquido, o qual pode ser usado para aplicar medicamentos para activar a expressão do gene quimicamente, por exemplo utilizando a dexametasona 28 induzível ou o β-estraadiol sistema inducible 29. No entanto, leva tempo para trocar todo o volume da câmara da amostra para lavar uma droga. A configuração pode ser melhorada através da minimização do volume da câmara da amostra para acelerar a troca de meio. No entanto, esta técnica tem um grande potencial. A combinação de procedimento de montagem, condições de crescimento padronizados ea aquisição de imagem suave usando microscopia de luz folhas permite estudos de longo prazo de desenvolvimento da planta com alta resolução a um nível fisiológico. Isso vai ajudar os pesquisadores a explorar mecanismos fundamentais do desenvolvimento da planta.
Acknowledgments
Agradecemos Matyáš Fendrych para leitura / visualização crítica e Stephan Stadlbauer para o equipamento de áudio. Graças à Oficina Miba no IST Áustria por sua contribuição para o OpenSPIM. A investigação conducente a estes resultados beneficiaram de financiamento do Programa Pessoas (Acções Marie Curie) do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão REA n ° [291734] e do Conselho Europeu de Investigação (ERC projecto-2011 -StG-20101109-PSDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board - PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
- Grossmann, G., Guo, W. -J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
- Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).
- Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
- Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
- Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
- Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
- Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
- Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).
- Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
- Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
- Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
- Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
- Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
- Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
- Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
- Aoyama, T., Chua, N. -H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
- Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).
