Summary
Die Leptomeningen Explantatkultur Protokoll aus menschlichem post mortem Gehirn ist eine technisch robuste und einfache Art und Weise Fibronektin-positive meningeal Fibroblasten innerhalb von 6-8 Wochen und kryokonserviert werden etwa 20-30 Millionen Zellen abzuleiten.
Abstract
Obwohl große Fortschritte in der klinischen Charakterisierung der Parkinson-Krankheit, einige Studien durchgeführt worden, berichten, dass die Diagnose der Parkinson-Krankheit ist nicht pathologisch bis zu 25% der klinisch diagnostizierten Parkinson-Krankheit bestätigt. Daher ist aus klinisch diagnostizierten Patienten gesammelt Gewebe mit idiopathischen Parkinson-Krankheit eine hohe Rate von Fehldiagnose haben kann; daher in vitro Studien aus solchen Geweben Parkinson-Krankheit zu studieren , wie einem präklinischen Modell zwecklos werden kann.
Durch das Sammeln von postmortalen humanen Leptomeningen mit einer bestätigten neuropathologischen Diagnose der Parkinson-Krankheit und gekennzeichnet durch nigrostriatalen Zellverlust und die intrazelluläre Proteineinschlüsse genannt Lewy - Körperchen, kann man sicher sein , dass klinisch beobachtet Parkinsonismus nicht von einem anderen zugrundeliegenden Krankheitsprozess verursacht wird (zB Tumor, Arteriosklerose).
Dieses Protokoll presents die Präparation und Herstellung von postmortalen menschlichen Leptomeningen zur Ableitung eines meningeal Fibroblasten-Kultur. Dieses Verfahren ist robust und besitzt eine hohe Erfolgsquote. Die Herausforderung der Kultur liegt Sterilität als das Gehirn Beschaffungs allgemeinen nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird. Daher ist es wichtig, die Kulturmedien mit einem Cocktail aus Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. zu ergänzen
Die Ableitung der meningealen Fibroblasten von Autopsie bestätigten Fälle mit Parkinson-Krankheit ist die Grundlage für in vitro - Modellierung von Parkinson-Krankheit. Meningeale Fibroblasten erscheinen 3-9 Tage nach der Probenvorbereitung und etwa 20-30 Millionen Zellen können in 6-8 Wochen kryokonserviert werden. Die meningeal Fibroblasten-Kultur ist homogen und die Zellen exprimieren Fibronektin, eine häufig verwendete Marker Hirnhaut zu identifizieren.
Introduction
Meninges bestehen aus drei Membranen, die das Gehirn zu schützen: Dura mater, Arachnoidea und Pia mater. In jüngerer Zeit wurde erkannt , dass Meningen eine wichtige Rolle auch in der Entwicklung des Gehirns und des Gehirns Homöostase 1. Meningen aus mesenchymalen und Neuralleiste abgeleiteten Zellen abgeleitet und interessanterweise , es , dass Vorläuferzellen in Meningen wurden , können in verursachen Neuronen in vitro und vivo nach der Transplantation 2, 3, 4 wohnhaft gezeigt. Meningen Kulturen wurden auch erfolgreich als Feeder - Schichten verwendet werden, wie sie für stromal cell-derived induzierende Aktivität besitzen , die Differenzierung von embryonalen Stammzellen in dopaminerge Neuronen 5. Außerdem haben Leptomeningen das Potential direkt differenzieren sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten unter ischämischen Bedingungen 6.
Aus diesem Protokoll werden menschliche Obduktion Hirnhaut Proben aus der Arachnoidea und Pia mater gesammelt, kollektiv die Leptomeningen und werden als Teil eines menschlichen Gehirns Spende für wissenschaftliche Zwecke beschafft. Sezieren des Gehirns wird in 24 h des Todes durchgeführt und die Probe wird in Leptomeningen Kaltwachstumsmedien für die Weiterverarbeitung in der nächsten 6-8 h angeordnet, wie hier in diesem Protokoll veranschaulicht.
Dieses Protokoll beschreibt die Präparation und Herstellung von Human Meningen Proben für die Entwicklung der Patienten primären Leptomeningen Zellkultur. Das Gewebe wird zugeschnitten 25-30 Stücke von ca. 3 mm x 3 mm Quadraten. Drei Stücke sind in jedem 6-Well-Gelatine beschichtete gut und gehalten mit runden Glasplättchen gelegt. Die Meningen Präparation dauert etwa 25-35 min. Die größte Herausforderung bei dieser Kultur ist Sterilität wie das Gehirn Beschaffung, Transport und Präparation werden in der Regel nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Therefore, ist es wichtig, die Kulturmedien mit einem Cocktail aus Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B und verwenden Multiwellschalen separat Kulturgewebestücke zu ergänzen.
Outgrowth meningealer Fibroblasten erfolgt in der Regel innerhalb der ersten Woche. Medium wird alle zwei bis drei Tage gewechselt, bis die Zellen konfluent sind und die Zellen enzymatisch agiert. Die meningeal Fibroblasten sind kryokonservierten bei 1 Million Zellen pro ml / Fläschchen in Kryokonservierung Medien. Mit diesem Protokoll 20-30 Millionen meningealen Fibroblasten können in 6-8 Wochen für die Kryokonservierung ableiten. Downstream Anwendungen dieser meningeal Fibroblasten sind Primärkulturen für die Erforschung von Krankheiten, direkte neuronale Differenzierung oder Ableitung von induzierten pluripotenten Stammzellen, die aus den Leptomeningen für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und für die Arzneimittelentwicklung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Gehirn Spende Anmeldung umfasst die Dokumentation vom Registranten ihrer Absicht zu spenden. Die Autopsie Erlaubnis für Gewebeentnahme wird durch die nächsten Angehörigen zur Verfügung gestellt, wie dies gesetzlich zulässig ist. Wissenschaftliche Studien gesammelt Autopsieproben verwendet werden von der Institutional Review Board (IRB) überprüft, um die Einhaltung Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) Vorschriften.
HINWEIS: Leptomeningen Proben werden durch das Gehirn Dissektor oder neuropathologist während einer Gehirnsezierung gesammelt und in 50 ml konischen Röhrchen, die 25-30 ml Meningen Wachstumsmedium gespeichert. Die Probe wird bei 4ºC bis zur Probenvorbereitung aufbewahrt. Die Verarbeitung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, da die Lebensfähigkeit von Zellen mit der Zeit post mortem abnimmt.
1. Set-up, bevor die Leptomeningen Dissection starten
Hinweis: Die Schritte 1,1-1,3 sind in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden.
- Bereiten Meningen Wachstumsmedien durch die Kombination 375 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, 100 ml fötalem Rinderserum, 5 ml 10 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat, 5 ml 10.000 U / ml Penicillin / Streptomycin und 5 ml 250 ug / ml Amphotericin B in 500 ml-Filtereinheit. Filter und mischen. Verwenden Sie Medien für bis zu vier Wochen.
- Legen Sie alle Materialien, die in der Biosicherheitsschrank vor der Präparation beginnen: 4x Petrischalen, 2x 6-Well-Platten, 2x Skalpelle, 15-20 sterilisierten 15-mm-Deckgläser, Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), serologischen Pipetten, Absaugen Pipetten.
- 1 ml steriles autoklavierte 0,1% ige Gelatinelösung zu jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Stellen Sie den Teller zur Seite 30-60 min. Bereiten Sie 2x 6-Well-Platten.
2. Herstellung von Leptomeningen Proben
Hinweis: Die Schritte 2,1-2,3 sind in einem Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
- In etwa 10 ml PBSeine sterile 10-cm-Gewebekulturschale und die Meningen Probe in die Schüssel legen. Mit einer Pinzette vorsichtig waschen Leptomeningen mit PBS Blut zu entfernen.
- Übertragen Sie die Meningen in eine neue 10-cm-Gewebekulturschale mit 10 ml frischem PBS und Waschen fortzusetzen. Bei Bedarf wiederholen, so viel Blut wie möglich zu entfernen.
- Mit Hilfe von zwei Skalpelle schneiden Leptomeningen Gewebe in einem ca. 6 cm x 6 cm großes Stück.
- Deckel auf einer Kulturschale und in ein Präpariermikroskop in einer horizontalen laminaren Strömungshaube.
3. Dissection von Leptomeningen Tissue
Hinweis: Die Schritte 3,1-3,3 sind in einer horizontalen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um ein Binokular mit.
- Entfernen Blutgefäße aus einem Bereich auf der Leptomeningen Stück (Schritt 2.3) groß genug, um mindestens 20 bis 25 März mm x 3 mm Stücke zu schaffen. Halten Sie die Leptomeningen an Ort und Stelle mit einem Skalpell und mit dem anderen, verwenden Sie eine sanfte und flache Schaben motion die Gefäße zu trennen.
- Schneiden Sie kleine Quadrate von Gewebe aus dem vorbereiteten Region. Schneiden Sie in einem schrittweisen Prozess durch erste größere Stücke zu machen und dann diejenigen in kleinere Abschnitte schneiden.
- Verwenden Sie ein Skalpell, das Gewebe in Position zu halten und ein weiteres Skalpell das Gewebe mit einer Schaukelbewegung zu schneiden. Aufgrund der Konsistenz des Gewebes, ist es schwierig, die Skalpelle, gegeneinander zu gleiten. Dies wird nur das Gewebe zerreißen und führt in unregelmäßigen Kanten.
- Weiter, um die Stücke zu halbieren, bis es ca. 20-25 3 mm x 3 mm große Stücke.
4. Übertragung von Dissected Meninges Stück auf Gewebekulturplatten
HINWEIS: Schritt 4 ist im Inneren eines biologischen Sicherheit Schrank durchgeführt werden.
- Absaugen Gelatine aus 6-Well-Platte (aus Schritt 1.3). 1 mL Hirnhaut Wachstumsmedien in jede Kammer. Mit einer sterilen Pinzette, legen 3-4 Biopsie Stücke in jede Vertiefung.
5. Platzierung der Deckgläser über Meninges Pieces
Hinweis: Die Schritte 5,1-5,2 sind in einer horizontalen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um ein Binokular mit.
- Decken Sie die Stücke mit 1-2 sterilen 15-mm-Kreisdeck pro Vertiefung.
- Drücken Sie fest mit einer Pinzette die Stücke berühren den Boden der Platte zu gewährleisten. Dies ermöglicht Befestigung von Gewebestücken an den Boden des Bohrlochs.
- Legen Sie die 6-Well - Platte in eine 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator.
6. Zellkultur Wartung
Hinweis: Die Schritte 6,1-6,3 sind in einem Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Behandeln Sie Kulturschalen mit Sorgfalt als Deck sollten nicht die Meningen Stücke bewegen und entfernen.
- Nach 2 Tagen in Kultur zusätzlich 1 ml frisches Meningen Wachstumsmedien in jede Vertiefung hinzu.
- Am 7. Tag absaugen sorgfältig die Medien und fügen Sie 2 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung.
- Nach dem Tag 9, weiterhin Wachstumsmedien wechseln alleanderen Tag bis Kultur wird konfluent.
7. Passagierung
HINWEIS: Alle Schritte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden sollen. Sobald meningealen Fibroblasten wurden aus den meningealen Gewebestücke migriert und beginnen zu den Rändern des Kulturgefäßes zu wachsen, meningealen Fibroblasten in größere Kulturschale erweitern.
- Vor dem Start der Passagierung Beschichtung der Kulturschale mit 1% Gelatine für 15-30 min.
- Absaugen Medien von 6-Well-Platte und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS.
- 1 ml Trypsin / EDTA zu jeder Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 5-10 min. Es ist nicht erforderlich, die Deckgläser oder die meningealen Gewebe für diesen Schritt zu entfernen.
- Wenn die Zellen sind gerundet und beginnen zu lösen, fügen Sie 2 ml Kulturmedien.
- Pipette Zellen nach oben und unten, um vollständig alle Klumpen stören und die Zelllösung zu größeren Kulturschale übertragen.
- Verwenden, um ein Verhältnis von 1: 3 bis 1: 4 zu Zellen von drei 6-Well-Schalen in kombinierenzu einer T75 Kulturschale.
- Sobald Zellen meningealen Fibroblasten in T75 Kulturflaschen konfluent sind, trypsinize die Zellen, und in Kryokonservierung Medien bei 1x10 6 Zellen / ml pro Fläschchen Kryokonservierung. Ein T75 Kulturflasche mit konfluenten meningeal Fibroblasten enthält etwa 5-7 Millionen Zellen.
8. Charakterisierung der Meningeale Fibroblasten durch Immunostaining
HINWEIS: Vor Beginn des Verfahrens, Herstellung von 4% Paraformaldehydlösung, 5% normalem Ziegenserum in PBS (Blocking-Puffer), 0,3% Triton X-100 in PBS (Permeabilisierung Puffer), primäre und sekundäre Antikörperlösungen und 1 & mgr; g / ml Hoechst 33342 in PBS von 10 mg / ml Stamm verdünnt.
- Seed 15.000 bis 30.000 meningealen Fibroblasten in 8-Well-Kammerobjektträger mit 0,1% Gelatine beschichtet.
- Nach 24 Stunden, wenn die Zellen gebunden sind, fixieren Zellen in 100 & mgr; l 4% Paraformaldehyd pro Vertiefung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Vertiefungen 3 mal mit 1x PBS.
- Permeabilisierung der Zellen mit 150 & mgr; l 0,3% Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Vertiefungen 3 mal mit 1x PBS.
- Mit 200 & mgr; l Blockierungslösung (PBS + 5% normales Ziegenserum) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie das Blockierungslösung, und fügen Sie 150 ul der gewünschten Primär in Blockierungslösung verdünnt Antikörper. Für Doppel-Färbung, bereiten Verdünnungen von primären Antikörpern in separaten Zentrifugenröhrchen auf Eis arbeitet wie folgt:
- Vorbereitung 1: 300 Verdünnung von anti-Fibronectin + 1: 200-Verdünnung von Anti-Nestin in Blockierlösung. Bereiten Sie 1: 250 Verdünnung von Anti-SERPINH1 + 1: 1000 Verdünnung von Anti-TuJ1 in Blocking-Lösung. Vorbereitung 1: 250 Verdünnung von anti-SERPINH1 + 1: 100-Verdünnung von anti-SOX2 in Blockierungslösung
- über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Waschen Sie die Vertiefungen 3 mal mit 1x PBS.
- Bereiten Sie eine Arbeits 1: 400 Verdünnung von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper Ziege anti-Kaninchen (grün; Ex / Em 2 2 590/617 nm) in Blocking - Lösung und mit 100 & mgr; l zu jeder Vertiefung. Inkubieren für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dann waschen Brunnen einmal mit 1x PBS.
- Je 100 & mgr; l von 1 ug / ml Hoechst 33342 (blau; Ex / Em 2 358/461 nm) Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 3 min im Dunkeln. Waschen Sie Wells 3 mal mit 1x PBS, in der auch in der letzten 1x PBS waschen lassen, und decken Sie die Folie mit einer Aluminiumfolie.
- Analysieren Sie die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wenn das Leptomeningen Verarbeitungsprotokoll erfolgreich war, Auswuchs meningealer Fibroblasten beobachtet ersten drei bis neun Tage nach der Sektion, obwohl dies von der Länge der Post-mortem-Intervall für das Gehirn verlassen können. Abbildung 1 zeigt meningeal Fibroblasten - Kulturen von vier verschiedenen Spendern. 1A zeigt eine Leptomeningen Stück von einem Deckglas (dunkel diagonale Linie) und Fibroblasten - Auswuchs um das Gewebe vier Tage nach der Verarbeitung von einem 88-jährigen Spender mit 10 h 20 min post-mortem Intervall gedrückt gehalten wird. 1B zeigt spärliche Fibroblasten - Auswuchs 7 Tage Nachbearbeitung von einem 70-jährigen Spender und 11 h 45 min post-mortem - Intervall. 1C zeigt Fibroblasten - Auswuchs 13 Tage nach der Präparation von einem 88-jährigen Spender und 24 h post-mortem - Intervall. 1D zeigt eine konfluente Kultur , die in eine T75 vess agiert wurdeel und Zellen können in diesem Stadium kryokonserviert werden.
Meningeale Fibroblasten sind bipolare oder multipolare und haben längliche oder unregelmäßige Formen (Abbildung 2). Sie werden durch die Expression von Glycoprotein Fibronectin und Fibroblasten - Marker SERPINH gekennzeichnet , die an das endoplasmatische Retikulum lokalisiert ist (2A bis 2C). Meningeale Fibroblasten sind nicht immunreaktiv Transkriptionsfaktor SRY (Geschlecht bestimmende Region Y) -Box 2 (SOX2) , das ein Marker für undifferenzierte Stammzellen ist (2A). Jedoch ist eine Teilmenge von leptomeningealen Fibroblasten positiv für Typ VI Intermediärfilament nestin, einer neuralen Stammzellmarker (2B) und Neuron-spezifische Klasse III beta-Tubulin (TuJ1) (Abbildung 2C).
Abbildung 1.Beispiele für das Auswachsen von meningeal Fibroblasten von vier verschiedenen Spendern. A) Leptomeningen Gewebestück wird durch ein Deckglas (dunkel diagonale Linie) und Fibroblasten - Auswuchs um das Gewebe gedrückt wurde von einem 88-jährigen Spender mit 10 h 20 min post-mortem - Intervall nach der Bearbeitung 4 Tage beobachtet. B) Sparse Fibroblasten - Auswuchs 7 Tage Nachbearbeitung von einem 70-jährigen Spender und 11 h 45 min post-mortem - Intervall. C) Meningeale Fibroblasten - Auswuchs 13 Tage nach der Präparation von einem 88-jährigen Spender und 24 h post-mortem - Intervall. D) Confluent meningeal Fibroblasten - Kultur in ein T75 Gefäß agiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Immunost aining für Meningen, Stammzellen, neurale Stammzellen, und Neuron-Marker. A) Immunfluoreszenzfärbung für Fibroblasten - Marker SERPINH1 (grün) und Stammzellmarker SOX2 (rot). SERPINH1 wurde in allen gezählten Zellkernen exprimiert. Stammzellmarker SOX2 wurde in dieser Leptomeningen Kultur nicht nachgewiesen werden. B) Immunfluoreszenzfärbung für Hirnhaut spezifische Marker Fibronektin (grün) und neurale Stammzellmarker NESTIN (rot). 52,1% der gezählten Zellkerne waren positiv für beide NESTIN und Fibronektin. C) Immunfluoreszenzfärbung für SERPINH1 (grün) und neuronalen Marker TuJ1 (rot). 6,9% der gezählten Kerne waren positiv für SERPINH1 und TuJ1. Zellzahl-Daten wurden unter Verwendung der manuellen Zellzähler Multi-Select-Tool auf ImageJ bestimmt. Single stained Bilder wurden durch Zählen der Anzahl von DAPI-positiven Zellen im Vergleich zu der Anzahl der Zellen, die positiv für jede Markierung in Prozent bewertet.Lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Tag | Erwartete Ergebnisse | |||||
| 3-9 | Auswuchs der ersten meningeal Fibroblasten. | |||||
| 18.07 | Meningeale Fibroblasten zu erweitern, und die Kultur wird dichter. Medienwechsel von 2 ml jeden zweiten Tag. | |||||
| 18-25 | 6-Well-Platte wird konfluent, sobald meningeal Fibroblasten konfluenten kombinieren drei Brunnen in einen T75-Kulturkolben (Passage im Verhältnis 1: 3 bis 1: 4). | |||||
| 26-45 | Eine konfluente T75 Kulturflasche Ergebnisse an 5-7 Millionen Zellen. meningeal Fibroblasten bei 1 Million Zellen / Fläschchen kryokonserviert werden. | |||||
Table 1: Timeline von zellulären Auswuchs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen und robusten Protokoll eine meningealen Fibroblastenkultur von humanen post mortem Leptomeningen in Verbindung mit einer Gehirn Spende gesammelt abzuleiten. Es gibt sehr wenige Beschreibungen von Protokollen Zellkulturen aus postmortalen menschlichen Material abzuleiten. Zwei Studien beschreiben Haut abgeleiteten Fibroblastkulturen 7, 8, 9, eine Studie beschreibt dura Proben 10 und ein anderer beschreibt nicht kryokonserviert gefrorenen dura Proben 11.
Wir bereiten zwei 6-Well-Platten mit 2-3 Gewebestücke (ca. 3 mm x 3 mm) in jede Vertiefung ausreichend Auswuchs und Expansion vor Kryokonservierung zu gewährleisten. Es ist entscheidend, dass die Meningen Stücke an der Kulturschale angebracht sind durch vorsichtiges einer sterilen Glasdeckglas auf die Gewebestücke drücken sie in Position zu halten. Ohne Deckglas werden die Meningen Stücke keint auf den Boden der Kulturschale befestigen. Successful Auswuchs wird nur beobachtet, wenn die Gewebestücke in direkten Kontakt mit dem Kunststoffboden sind. Wenn die Gewebestücke in das Kulturmedium schweben, von dem Gewebe keine Zelle Auswuchs beobachtet. Dies sollte mit etwa 500 & mgr; l Wachstumsmedium durchgeführt werden, um die Proben nicht austrocknen und fügen Sie dann bis zu 1 ml Wachstumsmedium zu dem Gefäß. Es ist nicht notwendig, weitere Silikon verwenden, um die Deckgläser in Position zu halten.
Wenn die Stücke kleiner als 3 mm x 3 mm, ist das Auswachsen langsamer und in einigen Fällen keine konfluente Kulturen hergestellt werden kann. Es ist wichtig, nicht die Zellen wachsen zu spärlich und wir empfehlen, ein Split-Verhältnis von 1: 3 bis 1: 4. Einzelne kleine Vertiefungen ermöglichen eine bessere Verwaltung mögliche Kontamination. Wells können einzeln zugeführt werden und Pipetten sollte zwischen den Vertiefungen verändert werden.
Wir haben erfolgreich meningeal Fibroblasten von 9 Obduktion Proben mit einem po abgeleitetstmortem Intervall zwischen 24.10 h. Die Spender waren zwischen 70 und 88 Jahre alt sind und Krankheitsdauern der Parkinson-Krankheit zwischen 8-31 Jahren. Wir bemerken, dass Gewebe mit einer längeren Post-mortem-Intervall länger dauern, bis die ersten Zellen wachsen (bis zu 9 Tage). Bei Proben mit kürzeren postmortalen Intervall beobachten wir Auswuchs sobald 3 Tage nach der Vorbereitung. Wir haben keinen Unterschied in Wachstum auf Grund des Alters der Spender bemerkt, aber wir hatten nur Spender> 70 Jahren.
Die Bedeutung des Verfahrens ist die Ableitung einer primären Zellkultur für eine sporadische neurodegenerative Krankheiten wie Parkinson-Krankheit, die derzeit nur bei der Autopsie 12 bestätigt werden kann, 13, 14 , da es definieren keine vollständig klinischen Charakteristika, Bildgebungstechniken oder Biomarker , die können bieten eine definitive Diagnose während des Lebens 15. Wir haben vorher devewickelten ein Protokoll für die Ableitung von Fibroblasten , die aus Hautbiopsien in erster Linie für genetisch bestätigten Fälle von Parkinson-Krankheit 16 , die uns erlaubt haben , zu induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugen und studieren Krankheitsmechanismen 17, 18, aber dieses neue Protokoll wird von entscheidender Bedeutung sein , um direkt neuropathologischen Veränderungen vergleichen mit den Ergebnissen in vitro für sporadische Parkinson-Krankheit. Unseres Wissens ist dies das erste Protokoll meningeal Fibroblasten von postmortalen menschlichen Leptomeningen abzuleiten.
Meningeale Fibroblastenkulturen können direkt für die Untersuchung molekularer Mechanismen für Krankheiten oder Verletzungen , oder als Quelle 19 für die Kern Umprogrammierung zu induzierten pluripotenten Stammzellen oder direkte Umwandlung in neuronalen Kulturen wie fortgeschrittenen präklinischen Modellen für sporadische Parkinson-Krankheit oder anderen neurodegenerativen Erkrankungen im Zusammenhang verwendet werden. Diese huMann Patienten stammenden Modelle bilden die Grundlage und beschleunigen Fortschritte in der personalisierten und regenerativen Medizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1,000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
