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Neuroscience

शवपरीक्षा मानव मस्तिष्क दाताओं से Leptomeninges explant संस्कृतियों की व्युत्पत्ति

Published: January 21, 2017 doi: 10.3791/55045
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Parkinson’s Institute and Clinical Center
* These authors contributed equally

Summary

मानव को पोस्टमार्टम के मस्तिष्क से leptomeninges explant संस्कृति प्रोटोकॉल 6-8 हफ्तों के भीतर फ़ाइब्रोनेक्टिन पॉजिटिव तानिका fibroblasts निकाले जाते हैं और लगभग 20-30 मिलियन कोशिकाओं cryopreserve करने के लिए एक तकनीकी रूप से मजबूत और सरल तरीका है।

Abstract

हालांकि काफी प्रगति पार्किंसंस रोग के नैदानिक ​​लक्षण वर्णन में किया गया है, कई अध्ययनों की रिपोर्ट है कि पार्किंसंस रोग के निदान pathologically चिकित्सकीय निदान पार्किंसंस रोग के 25% तक में इस बात की पुष्टि नहीं कर रहा है। इसलिए, ऊतक अज्ञातहेतुक पार्किंसंस रोग misdiagnosis के एक उच्च दर हो सकती है साथ चिकित्सकीय निदान रोगियों से एकत्र; इसलिए इस तरह के ऊतकों से इन विट्रो अध्ययन में पार्किंसंस रोग का अध्ययन करने के रूप में एक preclinical मॉडल व्यर्थ बन सकता है।

पार्किंसंस रोग के एक पुष्टि की नयूरोपथोलोगिकल निदान के साथ पोस्टमार्टम मानव leptomeninges इकट्ठा करने और nigrostriatal सेल नुकसान और intracellular प्रोटीन समावेशन Lewy निकायों कहा जाता है के द्वारा होती करके, एक कुछ किया जा सकता है कि चिकित्सकीय मनाया पार्किंसनिज़्म अन्य अंतर्निहित रोग प्रक्रिया (जैसे ट्यूमर, धमनीकाठिन्य) की वजह से नहीं है।

इस प्रोटोकॉल presenविच्छेदन और एक तानिका fibroblast संस्कृति की व्युत्पत्ति के लिए पोस्टमार्टम मानव leptomeninges की तैयारी TS। यह प्रक्रिया मजबूत है और एक उच्च सफलता दर है। संस्कृति की चुनौती बाँझपन के रूप में मस्तिष्क की खरीद में आम तौर पर बाँझ शर्तों के तहत किया नहीं है। इसलिए, यह एक प्रकार की दवा, स्ट्रेप्टोमाइसिन, और amphotericin बी के एक कॉकटेल के साथ संस्कृति मीडिया के पूरक के लिए महत्वपूर्ण है

पार्किंसंस रोग के साथ शव परीक्षण की पुष्टि के मामलों से तानिका fibroblasts की व्युत्पत्ति पार्किंसंस रोग की इन विट्रो मॉडलिंग के लिए आधार प्रदान करता है। तानिका fibroblasts 3-9 दिनों नमूना तैयार करने के बाद दिखाई देते हैं और के बारे में 20-30 मिलियन कोशिकाओं 6-8 सप्ताह में cryopreserved जा सकता है। तानिका fibroblast संस्कृति समरूप है और कोशिकाओं fibronectin, आमतौर पर इस्तेमाल किया तानिका की पहचान करने के लिए मार्कर व्यक्त करते हैं।

Introduction

ड्यूरा मेटर, मकड़ी और पिया मेटर: तानिका तीन झिल्ली कि मस्तिष्क की रक्षा से मिलकर बनता है। अभी हाल ही में यह स्वीकार किया गया है कि तानिका भी मस्तिष्क के विकास और मस्तिष्क homeostasis 1 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। तानिका mesenchymal और तंत्रिका शिखा व्युत्पन्न कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं और दिलचस्प है, यह दिखाया गया है कि पूर्वज तानिका में रहने वाले कोशिकाओं इन विट्रो और इन विवो 2, 3, 4 में प्रत्यारोपण के बाद न्यूरॉन्स को जन्म दे सकते हैं। तानिका संस्कृतियों भी सफलतापूर्वक के रूप में वे डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 5 में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए stromal सेल व्युत्पन्न उत्प्रेरण गतिविधि के अधिकारी, फीडर परतों के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, leptomeninges संभावित सीधे इस्कीमिक की स्थिति 6 के तहत न्यूरॉन्स, astrocytes, और oligodendrocytes में अंतर करने के लिए है।

इस प्रोटोकॉल के लिए, मानव पोस्टमार्टम तानिका नमूने मकड़ी और पिया मेटर से एकत्र कर रहे हैं, सामूहिक leptomeninges कहा जाता है, और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए एक मानव मस्तिष्क दान के हिस्से के रूप में खरीद रहे हैं। मस्तिष्क के विच्छेदन की मौत के 24 घंटे के भीतर किया जाता है और leptomeninges नमूने के रूप में इस प्रोटोकॉल में यहाँ सचित्र अगले 6-8 घंटे के भीतर आगे की प्रक्रिया के लिए ठंड विकास मीडिया में रखा गया है।

इस प्रोटोकॉल रोगी प्राथमिक leptomeninges सेल संस्कृति के विकास के लिए विच्छेदन और मानव तानिका नमूनों की तैयारी का वर्णन है। ऊतक लगभग 3 मिमी x 3 मिमी चौकों की 25-30 टुकड़ों में काट रहा है। तीन टुकड़े प्रत्येक 6 अच्छी तरह से में रखा जाता है जिलेटिन लेपित अच्छी तरह से और दौर कांच coverslips के साथ नीचे का आयोजन किया। तानिका विच्छेदन 25-35 मिनट के बारे में लेता है। इस संस्कृति के साथ मुख्य चुनौती मस्तिष्क की खरीद, परिवहन, और विच्छेदन के रूप में आम तौर पर बाँझपन बाँझ शर्तों के तहत किया नहीं कर रहे हैं। टीherefore, यह पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन, और amphotericin बी के एक कॉकटेल के साथ संस्कृति मीडिया के पूरक और संस्कृति के लिए अलग से ऊतक टुकड़े बहु अच्छी तरह से व्यंजन का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।

तानिका fibroblasts के परिणाम आम तौर पर पहले सप्ताह के भीतर होता है। मीडिया हर दो से तीन दिन बदल जाता है जब तक कोशिकाओं मिला हुआ हैं और कोशिकाओं enzymatically passaged हैं। तानिका fibroblasts cryopreservation मीडिया में प्रति एमएल / शीशी 1 मिलियन कोशिकाओं पर cryopreserved हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, 20-30 मिलियन तानिका fibroblasts cryopreservation के लिए 6-8 सप्ताह में प्राप्त किया जा सकता है। इन तानिका fibroblasts की बहाव के अनुप्रयोगों रोग अनुसंधान, प्रत्यक्ष neuronal भेदभाव या रोग तंत्र को समझने के लिए और नशीली दवाओं के विकास के लिए leptomeninges से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की व्युत्पत्ति के लिए प्राथमिक संस्कृतियों हैं।

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Protocol

मस्तिष्क दान पंजीकरण उनकी मंशा दान करने के कुलसचिव द्वारा प्रलेखन भी शामिल है। के रूप में कानून द्वारा अनुमति ऊतक पुनः प्राप्ति के लिए शव परीक्षण की अनुमति के परिजनों द्वारा प्रदान की जाती है। एकत्र शव परीक्षण नमूनों का उपयोग कर शोध अध्ययनों से संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा समीक्षा की स्वास्थ्य बीमा सुवाह्यता और जवाबदेही अधिनियम (HIPAA) के नियमों के अनुपालन सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं।

नोट: Leptomeninges नमूने एक मस्तिष्क विच्छेदन के दौरान मस्तिष्क चीड़फाड़ या neuropathologist द्वारा एकत्र कर रहे हैं और 50 एमएल शंक्वाकार 25-30 एमएल तानिका विकास मीडिया युक्त ट्यूबों में जमा हो जाती है। नमूना 4 डिग्री सेल्सियस नमूना तैयार करने तक में संग्रहित है। के रूप में कोशिकाओं की व्यवहार्यता का समय पोस्टमार्टम साथ कम हो जाती प्रसंस्करण संभव के रूप में जल्द ही किया जाना चाहिए।

1. सेट-अप Leptomeninges विच्छेदन शुरू करने से पहले

नोट: कदम 1.1 - 1.3 जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन हो रहे हैं।

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया के 375 एमएल के संयोजन से तानिका विकास मीडिया तैयार करें, भ्रूण गोजातीय सीरम के 100 एमएल, 5 एमएल 10 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 5 एमएल 200 मिमी एल alanyl-एल glutamine, 5 एमएल 100 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 5 एमएल 10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 5 एमएल 250 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin बी 500 एमएल फिल्टर यूनिट में। फिल्टर और मिश्रण। अप करने के लिए चार सप्ताह के लिए मीडिया का प्रयोग करें।
  2. जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी सामग्री विच्छेदन शुरू करने से पहले जगह: 4x पेट्री डिश, 2x 6 अच्छी तरह प्लेटें, 2x नलियां, 15-20 निष्फल 15 एमएम कवर फिसल जाता है, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), सीरम वैज्ञानिक pipettes, pipettes aspirating।
  3. बाँझ autoclaved 0.1% जिलेटिन समाधान के 1 एमएल 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। 30-60 मिनट के लिए अलग प्लेट सेट करें। 2x 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें।

2. Leptomeninges नमूना की तैयारी

नोट: कदम 2.1 - 2.3 जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन हो रहे हैं।

  1. पीबीएस के लगभग 10 मिलीलीटर में जोड़ेएक बाँझ 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान और डिश में तानिका नमूना रखें। संदंश का प्रयोग, धीरे पीबीएस के साथ leptomeninges धोने के खून निकालने के लिए।
  2. एक नया 10 सेमी टिशू कल्चर ताजा पीबीएस के 10 एमएल युक्त डिश में तानिका स्थानांतरण और कपड़े धोने के लिए जारी है। के रूप में जितना संभव हो उतना खून को दूर करने के लिए आवश्यक दोहराएँ।
  3. दो नलियां, एक लगभग 6 सेमी x 6 सेमी बड़ा टुकड़ा में ऊतक leptomeninges कटौती का उपयोग करना।
  4. एक क्षैतिज लामिना का प्रवाह हुड में एक संस्कृति पकवान और एक विदारक माइक्रोस्कोप के लिए स्थानांतरण पर प्लेस ढक्कन।

3. Leptomeninges ऊतक के विच्छेदन

नोट: कदम 3.1 के - 3.3 क्षैतिज लामिना का प्रवाह एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग हुड के अंदर प्रदर्शन हो रहे हैं।

  1. leptomeninges टुकड़ा (2.3 कदम) के लिए काफी बड़े पैमाने पर कम से कम 20-25 3 मिमी x 3 मिमी टुकड़े बनाने के लिए पर एक क्षेत्र से रक्त वाहिकाओं निकालें। एक छुरी के साथ जगह में leptomeninges पकड़ो और दूसरे के साथ, एक सज्जन और उथले स्क्रैप मो का उपयोगजहाजों को अलग करने के tion।
  2. तैयार क्षेत्र से ऊतक के छोटे वर्गों में कटौती। पहले बड़े टुकड़े कर रही है और उसके बाद छोटे वर्गों में उन टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा एक stepwise प्रक्रिया में कट।
  3. एक छुरी का प्रयोग जगह में ऊतक और एक अन्य छुरी रखने के लिए एक कमाल की गति के साथ ऊतक में कटौती करने के लिए। ऊतक की संगति के कारण, यह एक दूसरे के खिलाफ नलियां स्लाइड करने के लिए मुश्किल है। यह केवल ऊतक फाड़ और प्रचंड किनारों में परिणाम होगा।
  4. छमाही में टुकड़ों को काटने जारी रखें जब तक वहां 20-25 के बारे में 3 मिमी x 3 मिमी टुकड़े कर रहे हैं।

टिशू कल्चर प्लेटों पर विच्छेदित तानिका मोहरे की 4. स्थानांतरण

नोट: चरण 4 एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन किया जा रहा है।

  1. 6 अच्छी तरह से थाली से (1.3 कदम से) महाप्राण जिलेटिन। तानिका विकास मीडिया के 1 एमएल प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें। बाँझ संदंश का प्रयोग, प्रत्येक कुएं में 3-4 बायोप्सी टुकड़े जगह है।

5. मीटर से अधिक कवर फिसल जाता है की नियुक्तिeninges मोहरे

नोट: कदम 5.1 - 5.2 क्षैतिज लामिना का प्रवाह एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग हुड के अंदर प्रदर्शन हो रहे हैं।

  1. 1-2 बाँझ 15 मिमी प्रति अच्छी तरह से परिपत्र coverslips के साथ टुकड़े को कवर किया।
  2. यह सुनिश्चित करने के टुकड़े प्लेट के नीचे छू रहे हैं संदंश के साथ मजबूती से नीचे प्रेस। यह अच्छी तरह से नीचे के लिए ऊतक टुकड़े की कुर्की की अनुमति देता है।
  3. 6 अच्छी तरह से थाली एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें।

6. सेल संस्कृति रखरखाव

नोट: कदम 6.1 - 6.3 जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन हो रहे हैं। देखभाल के साथ संस्कृति बर्तन संभाल coverslips नहीं बढ़ना चाहिए के रूप में और तानिका टुकड़े जगह देना।

  1. संस्कृति में 2 दिनों के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नए सिरे से तानिका विकास मीडिया के एक अतिरिक्त 1 एमएल जोड़ने।
  2. 7 दिन में, ध्यान से मीडिया aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए नए सिरे से मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. दिन 9 के बाद, विकास मीडिया हर बदलने के लिए जारीसंस्कृति जब तक दूसरे दिन मिला हुआ हो जाता है।

7. Passaging

नोट: सभी चरणों के एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन हो रहे हैं। एक बार जब तानिका fibroblasts तानिका ऊतक के टुकड़े से बाहर चले गए और बड़े संस्कृति डिश में, संस्कृति पोत के किनारों की ओर बढ़ने तानिका fibroblasts का विस्तार करने के लिए शुरू कर दिया है।

  1. 15-30 मिनट के लिए passaging, कोट संस्कृति 1% जिलेटिन के साथ पकवान शुरू करने से पहले।
  2. 6 अच्छी तरह से पकवान से महाप्राण मीडिया और 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोने कोशिकाओं।
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए trypsin / EDTA के 1 एमएल जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। यह कवर फिसल जाता है या इस कदम के लिए तानिका ऊतक निकालने के लिए आवश्यक नहीं है।
  4. जब कोशिकाओं गोल कर रहे हैं और अलग संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए शुरू।
  5. पिपेट कोशिकाओं ऊपर और नीचे पूरी तरह से सभी गुच्छों को बाधित और बड़े संस्कृति डिश के लिए सेल समाधान हस्तांतरण करने के लिए।
  6. में तीन 6 अच्छी तरह से व्यंजन से कोशिकाओं गठबंधन करने के लिए 4: 1 के लिए 3: 1 के अनुपात का उपयोगएक T75 संस्कृति डिश के लिए।
  7. एक बार जब तानिका fibroblasts कोशिकाओं T75 संस्कृति बोतल में मिला हुआ हैं, कोशिकाओं trypsinize, और 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल प्रति शीशी में cryopreservation मीडिया में cryopreserve। मिला हुआ तानिका fibroblasts के साथ एक T75 संस्कृति फ्लास्क के बारे में 5-7 करोड़ सेल शामिल हैं।

Immunostaining द्वारा तानिका fibroblasts की विशेषता 8.

नोट: प्रक्रिया शुरू करने से पहले, 4% paraformaldehyde समाधान, पीबीएस (अवरुद्ध बफर) में 5% सामान्य बकरी सीरम तैयार 0.3% ट्राइटन X-100 पीबीएस (permeabilization बफर), प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान है, और 1 ग्राम का / एमएल में Hoechst 33342 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक से पीबीएस में पतला।

  1. 8 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड में बीज 15,000 से 30,000 तानिका fibroblasts 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित।
  2. 24 घंटे के बाद जब कोशिकाओं से जुड़े होते हैं, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μL 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक। कुओं 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन X-100 के 150 μL के साथ कोशिकाओं permeabilize। कुओं 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  4. अवरुद्ध समाधान 200 μL (पीबीएस + 5% सामान्य बकरी सीरम) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जोड़ें।
  5. अवरुद्ध समाधान Aspirate, और वांछित प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी के 150 μL जोड़ें। डबल-धुंधला के लिए, बर्फ पर इस प्रकार के रूप में अलग सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में प्राथमिक एंटीबॉडी का काम कर रहे dilutions तैयार:
    1. विरोधी fibronectin + 1 के 300 कमजोर पड़ने: समाधान को रोकने में विरोधी nestin के 200 कमजोर पड़ने 1 तैयार करें। विरोधी SERPINH1 + 1 के 250 कमजोर पड़ने: समाधान को रोकने में विरोधी TUJ1 के 1,000 कमजोर पड़ने 1 तैयार करें। 1 तैयार: विरोधी SERPINH1 के 250 कमजोर पड़ने + 1: समाधान को रोकने में विरोधी Sox2 के 100 कमजोर पड़ने
  6. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं।
  7. कुओं 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  8. एक काम 1 तैयार: 400 fluorescently के कमजोर पड़ने लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी खरगोश (हरा, पूर्व / एम 2 2 590/617 एनएम) अवरुद्ध समाधान में और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μL जोड़ें। 1 घंटे के लिए सेते हैं, अंधेरे में कमरे के तापमान पर। फिर 1x पीबीएस के साथ एक बार कुओं धो लें।
  9. समाधान प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से और 3 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं, 1 ग्राम के 100 μL / एमएल Hoechst 33342 (पूर्व / एम 2 358/461 एनएम नीला) जोड़ें। कुओं, 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं कुएं में अंतिम 1x पीबीएस धोने में छोड़ रहा है, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ स्लाइड को कवर किया।
  10. फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का विश्लेषण।

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Representative Results

जब leptomeninges प्रसंस्करण प्रोटोकॉल सफल रहा है, तानिका fibroblasts के परिणाम, तीन से नौ दिनों विच्छेदन के बाद पहली बार मनाया जाता है हालांकि यह मस्तिष्क के लिए पोस्टमार्टम अंतराल की लंबाई पर निर्भर कर सकते हैं। चित्रा 1 चार अलग अलग दाताओं की तानिका fibroblast संस्कृतियों को दर्शाता है। चित्रा 1 ए 10 घंटे 20 मिनट पोस्टमार्टम के अंतराल के साथ एक गिलास को कवर पर्ची (अंधेरे विकर्ण लाइन) और fibroblast परिणाम ऊतक चार दिनों चारों ओर प्रसंस्करण के बाद एक 88 वर्षीय दाता से नीचे द्वारा आयोजित एक leptomeninges टुकड़ा पता चलता है। चित्रा 1 बी एक 70 वर्षीय दाता और 11 घंटे 45 मिनट पोस्टमार्टम के अंतराल से विरल fibroblast परिणाम सात दिनों के बाद प्रसंस्करण से पता चलता है। चित्रा 1C fibroblast परिणाम से पता चलता है एक 88 वर्षीय दाता और 24 घंटे के पोस्टमार्टम के अंतराल से विच्छेदन के बाद 13 दिनों के लिए। चित्रा -1 मिला हुआ संस्कृति है कि एक T75 Vess में passaged था पता चलता हैएल और कोशिकाओं को इस स्तर पर cryopreserved जा सकता है।

तानिका fibroblasts द्विध्रुवी या बहुध्रुवीय हैं और लम्बी है या अनियमित आकार (चित्रा 2)। वे ग्लाइकोप्रोटीन फ़ाइब्रोनेक्टिन और fibroblast मार्कर SERPINH की अभिव्यक्ति है जो जालिका (आंकड़े 2A -2 सी) के लिए स्थानीय है की विशेषता है। तानिका fibroblasts प्रतिलेखन कारक sry (लिंग का पता लगाने क्षेत्र वाई) -Box 2 (Sox2) जो अविभाजित स्टेम कोशिकाओं (2A चित्रा) के लिए एक मार्कर है इम्युनो-प्रतिक्रियाशील नहीं हैं। हालांकि, leptomeningeal fibroblasts की एक सबसेट के लिए प्रकार छठी मध्यवर्ती रेशा nestin, एक तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर (चित्रा 2 बी), और न्यूरॉन विशिष्ट वर्ग III बीटा ट्यूबिलिन (TUJ1) (चित्रा -2) सकारात्मक है।

आकृति 1
आकृति 1।चार अलग-अलग दाताओं से तानिका fibroblasts के परिणाम के उदाहरण हैं। ए) Leptomeninges ऊतक टुकड़ा एक गिलास को कवर पर्ची (अंधेरे विकर्ण लाइन) और ऊतकों के आसपास fibroblast परिणाम से नीचे आयोजित किया जाता है 10 घंटे 20 मिनट पोस्टमार्टम के अंतराल के साथ एक 88 वर्षीय दाता से चार दिनों के प्रसंस्करण के बाद मनाया गया। बी) विरल fibroblast परिणाम एक 70 वर्षीय दाता और 11 घंटे 45 मिनट पोस्टमार्टम के अंतराल से सात दिनों के बाद प्रसंस्करण। सी) 13 दिनों एक 88 वर्षीय दाता और 24 घंटे के पोस्टमार्टम के अंतराल से विच्छेदन के बाद तानिका fibroblast परिणाम। डी) मिला हुआ तानिका fibroblast संस्कृति एक T75 बर्तन में passaged। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Immunost तानिका के लिए aining, सेल, तंत्रिका स्टेम सेल, और न्यूरॉन मार्कर स्टेम। ए) fibroblast मार्कर SERPINH1 (हरे रंग के लिए immunofluorescence धुंधला) और स्टेम सेल मार्कर Sox2 (लाल)। SERPINH1 सब गिना सेल नाभिक में व्यक्त की गई थी। स्टेम सेल मार्कर Sox2 इन leptomeninges संस्कृति में पता नहीं था। बी) तानिका विशिष्ट मार्कर फ़ाइब्रोनेक्टिन (हरा) और तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर Nestin (लाल) के लिए immunofluorescence धुंधला। गिना सेल नाभिक की 52.1% दोनों Nestin और fibronectin के लिए सकारात्मक थे। सी) SERPINH1 (हरे रंग के लिए immunofluorescence धुंधला) और neuronal मार्कर TUJ1 (लाल)। गिना नाभिक के 6.9% SERPINH1 और TUJ1 के लिए सकारात्मक थे। कोशिका गिनती डेटा ImageJ पर मैनुअल सेल काउंटर मल्टी चुनने के लिए उपकरण का उपयोग करके निर्धारित किया गया है। एकल दाग छवियों प्रतिशत में प्रत्येक मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की तुलना में DAPI पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा मूल्यांकन किया गया।दुबला "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दिन अपेक्षित परिणाम
3-9 पहले तानिका fibroblasts के परिणाम।
7-18 तानिका fibroblasts का विस्तार, और संस्कृति सघन हो जाता है। 2 एमएल हर दूसरे दिन के मीडिया बदलें।
18-25 6 अच्छी तरह से थाली, मिला हुआ हो जाता है एक बार तानिका fibroblasts मिला हुआ हैं (1 पर मार्ग: 3 1: 4) एक T75 संस्कृति फ्लास्क में तीन कुओं गठबंधन।
26-45 5-7 करोड़ कोशिकाओं में एक मिला हुआ T75 संस्कृति फ्लास्क का परिणाम है। 1 लाख कोशिकाओं / शीशी में तानिका fibroblasts cryopreserve।

टैबLe 1: सेलुलर परिणाम की टाइमलाइन।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक मस्तिष्क दान के साथ संयोजन के रूप में एकत्र मानव पोस्टमार्टम leptomeninges से एक तानिका fibroblast संस्कृति प्राप्त करने के लिए एक सरल और मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन है। वहाँ प्रोटोकॉल का बहुत कुछ विवरण पोस्टमार्टम मानव सामग्री से सेल संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं। दो अध्ययनों त्वचा व्युत्पन्न fibroblast संस्कृतियों 7, 8, 9, एक अध्ययन में ड्यूरा नमूने 10 का वर्णन का वर्णन है, और एक अन्य गैर-cryopreserved जमे हुए ड्यूरा नमूने 11 वर्णन करता है।

हमारे पास पर्याप्त परिणाम और विस्तार cryopreservation से पहले सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक कुएं में 2-3 ऊतक टुकड़े (लगभग 3 मिमी x 3 मिमी) के साथ दो 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि तानिका टुकड़े कोमल एक बाँझ गिलास को कवर पर्ची ऊतक के टुकड़े पर उन्हें जगह में धारण करने के लिए दबाकर संस्कृति पकवान से जुड़े होते हैं है। एक coverslip के बिना, तानिका टुकड़े कोई इच्छाटी संस्कृति डिश के तल को देते हैं। सफल परिणाम ही मनाया जाता है जब ऊतक टुकड़े प्लास्टिक के नीचे के साथ सीधे संपर्क में हैं। ऊतक के टुकड़े संस्कृति मीडिया में तैरने लगते हैं, ऊतक से कोई सेल परिणाम मनाया जाता है। इस बारे में 500 विकास की μL मीडिया के साथ किया जाना चाहिए नमूने बाहर सूखी नहीं करने के लिए और उसके बाद पोत को विकास मीडिया के 1 एमएल को जोड़ें। इसे आगे भी जगह में कवर फिसल जाता है धारण करने के लिए सिलिकॉन का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है।

टुकड़े छोटे से कम 3 मिमी x 3 मिमी हैं, तो परिणाम धीमी है और कुछ मामलों में कोई मिला हुआ संस्कृतियों की स्थापना की जा सकती है। यह बहुत विरल कोशिकाओं को विकसित नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है और हम 1 के एक विभाजन अनुपात की सिफारिश: 3 करने के लिए 1: 4। व्यक्तिगत छोटे कुओं बेहतर प्रबंध संभावित प्रदूषण के लिए अनुमति देते हैं। वेल्स को व्यक्तिगत रूप से खिलाया जा सकता है और pipettes कुओं के बीच परिवर्तित किया जाना चाहिए।

हम सफलतापूर्वक एक पुलिस के साथ 9 पोस्टमार्टम के नमूनों से तानिका fibroblasts ली गई है10-24 घंटे के अंतराल के बीच stmortem। दाताओं वर्ष की आयु 70 और 88 के बीच के थे और 8-31 साल के बीच पार्किंसंस रोग के रोग durations है। हम पहले पहली कोशिकाओं बाहर हो जाना (9 दिनों के लिए) है कि एक लंबे समय तक पोस्टमार्टम अंतराल के साथ ऊतकों में लंबा समय लग नोटिस। कम पोस्टमार्टम के अंतराल के साथ नमूनों में, हम जितनी जल्दी तैयार करने के बाद 3 दिन के रूप में परिणाम निरीक्षण करते हैं। हम दाता की उम्र के आधार पर विकास में कोई फर्क नहीं देखा है, लेकिन हम केवल दाताओं> 70 साल की थी।

विधि के महत्व पार्किंसंस रोग है, जो केवल वर्तमान में शव परीक्षण 12 पर बात की पुष्टि की जा सकती है, 13, की तरह एक छिटपुट neurodegenerative रोग के लिए एक प्राथमिक सेल संस्कृति की व्युत्पत्ति है 14 के बाद से वहाँ कोई पूरी तरह से नैदानिक विशेषताओं, इमेजिंग तकनीक या बायोमार्कर कि कर सकते हैं परिभाषित कर रहे हैं जीवन के दौरान 15 एक निश्चित निदान प्रदान करते हैं। हम पहले से है एच.डी.मुख्य रूप से पार्किंसंस रोग 16 वर्ष की आनुवंशिक रूप से इस बात की पुष्टि के मामलों के लिए त्वचा बायोप्सी से fibroblasts की व्युत्पत्ति के लिए एक प्रोटोकॉल loped जो हमें प्रेरित pluripotent स्टेम सेल रोग तंत्र 17, 18 पैदा करते हैं और अध्ययन करने के लिए अनुमति दी है, लेकिन इस नए प्रोटोकॉल सीधे नयूरोपथोलोगिकल परिवर्तनों की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण होगा छिटपुट पार्किंसंस रोग के लिए इन विट्रो में निष्कर्षों के साथ। हमारे ज्ञान करने के लिए, यह पहली प्रोटोकॉल पोस्टमार्टम मानव leptomeninges से तानिका fibroblasts पाने है।

तानिका fibroblast संस्कृतियों सीधे बीमारी या चोट करने के लिए या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल या छिटपुट पार्किंसंस रोग या अन्य neurodegenerative विकारों 19 के लिए उन्नत preclinical मॉडल के रूप में neuronal संस्कृतियों में प्रत्यक्ष रूपांतरण में परमाणु reprogramming के लिए एक स्रोत के रूप में संबंधित आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये हूआदमी रोगी व्युत्पन्न मॉडल आधार प्रदान करते हैं और व्यक्तिगत और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में प्रगति में तेजी लाने के।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Petri dishes Fisher Scientific 351029
Nunc 6-well plate Fisher Scientific 14-832-11
15-mm cover slips Fisher Scientific 12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15 Miltex 4-415
Curved precision tip forceps Fisher Scientific 16-100-122
Serological pipettes Fisher Scientific 13-678-11E
Pasteur pipettes Fisher Scientific 22-230490
Gelatin Sigma G1890-100G
Phosphate Buffer Saline Fisher Scientific SH30264.02
Corning 500 mL filter unit Fisher Scientific 430770 Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2  Thermo Scientific 178883
Name Company Catalog Number Comments
Growth Media
Hyclone DMEM Fisher Scientific SH30081.02
Hyclone FBS Fisher Scientific SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140-050
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher 35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher 11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) Fisher Scientific BP264520
Bambanker Freeze 120 mL Fisher Scientific NC9582225
Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides  Fisher Scientific 1256518
20% paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100  Sigma T8787
100% Glycerol  BioRad 9455
100% normal goat serum  Fisher Scientific 101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1] Abcam ab32419 1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1 Sigma S5950-200ul 1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2 Millipore MAB4343 1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin Millipore MAB5326 1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1 Covance MMS-435P 1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit Thermo Fisher A11029 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) 
Alexa Fluor 555 anti-mouse Thermo Fisher A21424 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) 
Hoechst 33342 stain Thermo Fisher H3570 dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
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References

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शवपरीक्षा मानव मस्तिष्क दाताओं से Leptomeninges explant संस्कृतियों की व्युत्पत्ति
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Lee, K., Saetern, O. C., Nguyen, A., … More

Lee, K., Saetern, O. C., Nguyen, A., Rodriguez, L., Schüle, B. Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors. J. Vis. Exp. (119), e55045, doi:10.3791/55045 (2017).

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