Summary
Den leptomeninges eksplantering kultur protokoll fra menneskelige postmortem hjerne er en teknisk robust og enkel måte å utlede fibronektin-positive meningeale fibroblaster innen 6-8 uker, og fryse ned omtrent 20-30 millioner celler.
Abstract
Selv om store fremskritt har blitt gjort i den kliniske karakteriseringen av Parkinsons sykdom, flere studier rapporterer at diagnosen av Parkinsons sykdom ikke er patologisk bekreftet i opp til 25% av klinisk diagnostisert Parkinsons sykdom. Derfor vev hentet fra klinisk diagnostiserte pasienter med idiopatisk Parkinsons sykdom kan ha en høy grad av feildiagnostisering; derav in vitro studier fra slike vev for å studere Parkinsons sykdom som en preklinisk modell kan bli forgjeves.
Ved å samle post mortem menneskelige leptomeninges med en bekreftet nevropatologiske diagnose av Parkinsons sykdom og preget av nigrostriatal celle tap og intracellulære protein slutninger kalt Lewy-legemer, kan man være sikker på at klinisk observert parkinsonisme ikke er forårsaket av en annen underliggende sykdomsprosess (f.eks tumor, arteriosklerose).
Denne protokollen gavets disseksjon og utarbeidelse av post mortem menneskelige leptomeninges for avledning av en meningeal fibroblast kultur. Denne fremgangsmåte er robust og har en høy suksessrate. Utfordringen av kulturen er sterilitet som hjernen innkjøp er vanligvis ikke utføres under sterile forhold. Derfor er det viktig å supplere kulturmediet med en cocktail av penicillin, streptomycin og amfotericin B.
Avledning av meningeale fibroblaster fra obduksjonsbekreftede tilfeller med Parkinsons sykdom gir grunnlag for in vitro modellering av Parkinsons sykdom. Meningeale fibroblaster vises 3-9 dager etter prøveopparbeidelse og ca 20-30 millioner celler, kan fryses ned i 6-8 uker. Den meningeal fibroblast kultur er homogen og cellene uttrykker fibronektin, en markør som vanligvis brukes til å identifisere hjernehinnene.
Introduction
Hjernehinnene består av tre membraner som beskytter hjernen: dura mater, arachnoid og pia mater. Mer nylig har det blitt erkjent at hjernehinnene også spille en viktig rolle i utvikling av hjernen og hjerne homeostase 1. Hjernehinnene blir utledet fra mesenchymale og neural crest-avledede celler og interessant, er det blitt vist at stamceller som befinner seg i hjernehinnene kan gi opphav til neuroner in vitro og in vivo etter transplantasjon to, tre, fire. Hjernehinnene kulturer har også blitt brukt med hell som mater lag, da de har stromal celle-avledede induserende aktivitet for differensiering av embryoniske stamceller i dopaminerge neuroner 5. Videre leptomeninges har potensial til direkte å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter i henhold iskemiske tilstander 6.
For denne protokollen er menneskepostmortem meninges prøver samlet inn fra arachnoid og pia mater, kollektivt kalt leptomeninges, og er anskaffet som en del av en menneskelig hjerne donasjon til forskningsformål. Disseksjon av hjernen blir utført i løpet av 24 timer til død og den leptomeninges prøven legges i kaldt vekstmedier for ytterligere behandling i løpet av de neste 6-8 timer som illustrert her i denne protokollen.
Denne protokollen beskriver disseksjon og fremstillingen av humane meninges prøver for utvikling av pasienten primære leptomeninges cellekultur. Vevet blir kuttet i 25-30 stykker av omtrent 3 mm x 3 mm kvadrater. Tre stykker er plassert i hver 6-brønnen gelatin-belagt godt og holdt nede med runde dekkglass. Den hjernehinnene disseksjon tar ca 25-35 min. Den største utfordringen med denne kulturen er sterilitet som hjernen innkjøp, transport, og disseksjon blir vanligvis ikke utført under sterile betingelser. Therefore, er det viktig å supplere kulturmediet med en cocktail av penicillin, streptomycin og amfotericin B og bruke multi-brønn skåler for separat kultur vev stykker.
Utvekst av meningeale fibroblaster oppstår vanligvis i løpet av den første uken. Media blir endret hver to til tre dager før cellene er konfluent og cellene blir enzymatisk passeres. De meningeale fibroblaster er oppbevart på 1 million celler per ml / hetteglass i nedfrysing media. Med denne protokollen kan 20-30 millioner meningeale fibroblaster utledes i 6-8 uker for nedfrysing. Nedstrøms anvendelser av disse meningeale fibroblaster er primære kulturer for sykdom forskning, direkte neuronal differensiering eller avledning av induserte pluripotente stamceller fra leptomeninges for forståelse av sykdomsmekanismer og for legemiddelutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hjernen donasjon registrering inneholder dokumentasjon av registranten av deres hensikt å donere. Obduksjonen tillatelse til vev gjenfinning er levert av pårørende som er tillatt ved lov. Undersøkelser ved hjelp av innsamlede obduksjons prøvene gjennomgås av Institutional Review Board (IRB) for å sikre samsvar med helseforsikring bærbarhet og Accountability Act (HIPAA) forskrifter.
MERK: leptomeninges prøver er innsamlet av hjernen dissector eller nevropatologen under en hjerne disseksjon og lagres i 50 ml koniske rør som inneholder 25-30 ml hjernehinnene vekstmedier. Prøven blir lagret ved 4 ° C inntil prøvepreparering. Behandlingen bør utføres så snart som mulig som levedyktigheten av celler avtar med tiden post mortem.
1. Set-up før Starte leptomeninges Dissection
MERK: Trinn 01.01 til 01.03 skal utføres innenfor et biosikkerhet skap.
- Forbered hjernehinnene vekstmedier ved å kombinere 375 ml Dulbeccos modifiserte Eagles Media, 100 ml føtalt bovint serum, 5 ml 10 mM ikke-essensielle aminosyrer, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamin, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, 5 ml 10 000 U / ml penicillin / streptomycin og 5 ml 250 ug / ml amfotericin B i 500 ml filterenhet. Filter og bland. Bruk media for opptil fire uker.
- Legg alle materialer i biosikkerhet kabinettet før du starter disseksjon: 4x petriskåler, 2x 6-brønners plater, 2x skalpeller, 15-20 steriliserte 15 mm dekkglass, fosfatbuffer saltvann (PBS), serologiske pipetter, aspirere pipetter.
- Tilsett 1 ml steril-autoklaveres 0,1% gelatin-løsning til hver brønn av en 6-brønns plate. Setter platen til side i 30-60 min. Forbered 2x seks-brønns plater.
2. Utarbeidelse av leptomeninges Sample
MERK: Trinn 02.01 til 02.03 skal utføres innenfor et biosikkerhet skap.
- Tilsett ca. 10 ml PBS for åen steril 10-cm vev kultur tallerken og legg hjernehinnene prøven i fatet. Bruk pinsett, forsiktig vaske leptomeninges med PBS for å fjerne blod.
- Overfør hjernehinnene inn i en ny 10-cm vevskultur skål inneholdende 10 ml av frisk PBS og fortsette vasking. Gjenta som er nødvendig for å fjerne så mye blod som mulig.
- Ved hjelp av to skalpeller, skåret leptomeninges vevet inn i en ca 6 cm x 6 cm stort stykke.
- Plasser lokket på en kultur tallerken og overføring til en dissekere mikroskop i en horisontal laminær hette.
3. Disseksjon av leptomeninges Tissue
MERK: Trinn 03.01 til 03.03 skal utføres i en horisontal laminær hetten med en dissekere mikroskop.
- Fjern blodkar fra en region på den leptomeninges stykket (trinn 2.3) stor nok til å skape minst 20-25 3 mm x 3 mm stykker. Hold leptomeninges på plass med en skalpell og med den andre, bruk en mild og grunne skraping mosjon for å skille skipene.
- Skjær små firkanter av vev fra forberedt regionen. Skjær i en trinnvis prosess ved først å lage større stykker og deretter ha klippet dem opp i mindre deler.
- Bruke en skalpell for å holde vevet i sted og en annen skalpell for å skjære vevet med en vuggende bevegelse. På grunn av konsistensen av vev, er det vanskelig å skyve skalp mot hverandre. Dette vil bare rive vev fra hverandre og fører til frynsete kanter.
- Fortsett å kutte bitene i to til det er ca 20-25 3 mm x 3 mm stykker.
4. Overføring av dissekert hjernehinnene Pieces på vevskulturplater
NOTE: Trinn 4 skal utføres inne i en biosikkerhet skap.
- Aspirer gelatin fra 6-brønns plate (fra trinn 1.3). Tilsett 1 ml meninges vekstmedium til hver brønn. Ved hjelp av steril tang, legg 3-4 biopsi stykker i hver brønn.
5. Plassering av dekkglass enn Meninges Pieces
MERK: Trinn 05.01 til 05.02 skal utføres i en horisontal laminær hetten med en dissekere mikroskop.
- Dekk bitene med 1-2 sterile 15 mm-sirkulære Dekk per brønn.
- Trykk godt ned med tang for å sikre brikkene berøre bunnen av tallerkenen. Dette tillater binding av vev stykker til bunnen av brønnen.
- Plasser 6-brønns plate i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
6. Cell Culture Vedlikehold
MERK: Trinn 06.01 til 06.03 skal utføres innenfor et biosikkerhet skap. Håndtak kultur retter med forsiktighet ettersom Dekk ikke skal flytte og ta bort hjernehinnene stykker.
- Etter 2 dager i kultur, legger ytterligere 1 ml av fersk hjernehinnene vekstmedier til hver brønn.
- På dag 7, omhyggelig aspirere mediet og tilsett 2 ml friskt medium til hver brønn.
- Etter Dag 9, fortsette å endre vekstmedier hverannen dag til kultur blir sammenflytende.
7. aging
MERK: Alle trinn skal utføres i et biosikkerhet skap. Når meningeale fibroblaster har migrert ut av meningeale vev stykkene og begynner å vokse mot kantene av dyrkings-beholderen, ekspandere meningeale fibroblaster inn i større kulturskål.
- Før du starter aging, frakk kulturen fatet med 1% gelatin for 15-30 min.
- Sug media fra 6-brønners skål og vaske cellene med 2 ml PBS.
- Tilsett 1 ml trypsin / EDTA til hver brønn og inkuber ved 37 ° C i 5-10 min. Det er ikke nødvendig å fjerne dekkglass eller meningeal vev for dette trinnet.
- Når cellene er avrundet og begynner å løsne, tilsett 2 ml av kulturmedier.
- Pipette celler opp og ned for å fullstendig ødelegge alle klumper og overføre celleløsning til større kulturskål.
- Bruker et forhold på 1: 3 til 1: 4 for å kombinere celler fra tre 6-brønners skåler itil en T75 kultur parabolen.
- Når meningeale fibroblaster cellene er konfluente i T75 kulturflasker, trypsineres cellene, og fryse ned i nedfrysing media på 1x10 6 celler / ml per hetteglass. En T75 kultur kolbe med konfluente meningeale fibroblaster inneholder ca 5-7 millioner celler.
8. Karakterisering av meningeal fibroblaster ved Farging
MERK: Før start av fremgangsmåten, fremstille 4% paraformaldehydløsning, 5% normalt geiteserum i PBS (blokkeringsbuffer), 0,3% Triton X-100 i PBS (permeabiliseringsbuffer), primære og sekundære antistoffløsninger, og 1 pg / ml Hoechst 33342 fortynnet i PBS fra 10 mg / ml lager.
- Seed 15.000 til 30.000 meningeale fibroblaster i 8-brønn kammer lysbilde belagt med 0,1% gelatin.
- Etter 24 timer når cellene er festet, fikse-celler i 100 pl 4% paraformaldehyd per brønn i 10 minutter ved romtemperatur. Vask brønnene 3 ganger med 1 x PBS.
- Permeabilisere cellene med 150 ul av 0,3% Triton X-100 i 5 minutter ved romtemperatur. Vask brønnene 3 ganger med 1 x PBS.
- Tilsett 200 ul blokkeringsoppløsning (PBS + 5% normalt geiteserum) i 1 time ved romtemperatur.
- Aspirer blokkeringsoppløsningen, og tilsett 150 ul av de ønskede primære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning. For dobbel-flekker, utarbeide arbeids fortynninger av primære antistoffer i separate sentrifugerør på is som følger:
- Forbered 1: 300 fortynning av anti-fibronektin + 1: 200 fortynning av anti-nestin i blokkerende oppløsning. Forbered 1: 250 fortynning av anti-SERPINH1 + 1: 1000 fortynning av anti-TUJ1 i blokkering løsning. Forbered 1: 250 fortynning av anti-SERPINH1 + 1: 100 fortynning av anti-SOX2 i blokkeringsløsning
- Inkuber ved 4 ° C over natten.
- Vask brønnene 3 ganger med 1 x PBS.
- Forbered en arbeidsgruppe 1: 400 fortynning av fluorescensmerkede sekundære antistoffer geit anti-kanin (grønn, Ex / Em 2 2) i blokkerende oppløsning og tilsett 100 ul til hver brønn. Inkuberes i 1 time i mørke ved romtemperatur. Deretter vaskes brønnene gang med 1x PBS.
- Tilsett 100 ul av 1 mg / ml Hoechst 33342 (blå, Ex / Em 358/461 nm 2) oppløsning til hver brønn og inkuber i mørke i 3 min. Vask brønner 3 ganger med 1x PBS, drar i den endelige 1x PBS vask i brønnen, og dekker lysbilde med aluminiumsfolie.
- Analyser cellene under fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når leptomeninges behandling protokollen har vært vellykket, er utvekst av meningeale fibroblaster først observert tre til ni dager etter disseksjon, selv om dette kan være avhengig av lengden på post-mortem intervall for hjernen. Figur 1 viser meningeale fibroblast kulturer av fire forskjellige givere. Figur 1A viser en leptomeninges stykke holdt nede av et glass dekkglass (mørk diagonal linje) og fibroblast utvekst rundt vevet fire dager etter behandlingen fra en 88-åring donor med 10 t 20 min post-mortem intervall. Figur 1B viser sparsom fibroblast utvekst sju dager etter behandling fra en 70-åring donor og 11 t 45 min post-mortem intervall. Figur 1C viser fibroblast utvekst 13 dager etter disseksjon fra en 88-åring donor og 24 timer post-mortem intervall. Figur 1D viser en konfluent kultur som ble passert i en T75 Vessel og celler, kan fryses ned på dette stadiet.
Meningeale fibroblaster er bipolar eller multipolar og har forlenget eller uregelmessig form (figur 2). De er karakterisert ved ekspresjonen av glykoprotein fibronektin og fibroblast-markør SERPINH som er lokalisert til det endoplasmatiske retikulum (figurene 2A-2C). Meningeale fibroblaster er ikke immunreaktive for transkripsjonsfaktor SRY (sex tetsbestemende region Y) -Box 2 (SOX2), som er en markør for udifferensierte stamceller (figur 2A). Imidlertid er en undergruppe av leptomeningeal fibroblaster positiv for type VI mellomliggende filament nestin, et neural stamcelle markør (figur 2B), og neuron-spesifikk klasse III-beta-tubulin (TUJ1) (figur 2C).
Figur 1.Eksempler på utvekst av meningeale fibroblaster fra fire forskjellige givere. A) leptomeninges vev arb holdes nede av et glass dekkglass (mørk diagonal linje) og fibroblast utvekst rundt vev ble observert fire dager etter behandlingen fra en 88-åring donor med 10 t 20 min post-mortem intervall. B) Sparse fibroblast utvekst sju dager etter behandling fra en 70-åring donor og 11 t 45 min post-mortem intervall. C) Meningeal fibroblast utvekst 13 dager etter disseksjon fra en 88-åring donor og 24 timer post-mortem intervall. D) Confluent meningeal fibroblast kultur passert i en T75 fartøy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Immunost innelukker for hjernehinnene, stamcelle, nevrale stamceller og nevroner markører. A) immunfluorescens farging for fibroblast markører SERPINH1 (grønn) og stamcelle markør SOX2 (rød). SERPINH1 ble uttrykt i alle tellet cellekjerner. Stamcelle markør SOX2 ble ikke påvist i disse leptomeninges kultur. B) immunfluorescens farging for hjernehinnene-spesifikke markør fibronektin (grønn) og nevrale stamcelle markør nestin (rød). 52,1% av regnet cellekjerner var positive for både nestin og Fibronektin. C) immunfluorescens farging for SERPINH1 (grønn) og neuronal markør TUJ1 (rød). 6,9% av regnet kjerner var positive for SERPINH1 og TUJ1. Celletall ble bestemt ved å bruke manuell Cell Counter Multi-markeringsverktøyet på ImageJ. Enkelt farget bilde ble vurdert ved å telle antallet av DAPI-positive celler i forhold til antall celler positive for hver markør i prosenter.mager "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Dag | Forventede resultater | |||||
| 3-9 | Utvekst av første meningeal fibroblaster. | |||||
| 7-18 | Meningeal fibroblaster utvide, og kultur blir tettere. Media endring av 2 ml annenhver dag. | |||||
| 18-25 | 6-brønns plate blir sammenflytende, når meningeale fibroblaster er konfluent kombinere tre brønner inn i en T75 kulturflaske (passasje på 1: 3 til 1: 4). | |||||
| 26-45 | En sammenflytende T75 kultur kolbe resultater i 5-7 millioner celler. Fryse ned meningeale fibroblaster på 1 million celler / hetteglass. | |||||
Table 1: Tidslinje av mobilnettet utvekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en enkel og robust protokoll for å utlede en meningeal fibroblast kultur fra humane postmortem leptomeninges samlet i forbindelse med en hjerne donasjon. Det er svært få beskrivelser av protokoller for å utlede cellekulturer fra postmortem humant materiale. To studier beskriver hud-avledede fibroblastkulturer 7, 8, 9, beskriver en studie dura prøvene 10, og en annen beskriver ikke-cryopreserved frosset dura prøvene 11.
Vi forbereder to seks-brønns plater med 2-3 vev biter (ca 3 mm x 3 mm) i hver brønn for å sikre tilstrekkelig utvekst og utvidelse før nedfrysing. Det er viktig at meninges stykkene er festet til kulturskålen ved forsiktig å trykke et sterilt glass dekkglass på vevet stykkene for å holde dem på plass. Uten et dekkglass, hjernehinnene brikkene vil ingent festes til bunnen av kulturskålen. Vellykket utvekst blir bare observert når vevet bitene er i direkte kontakt med plastbunn. Hvis vevet stykkene flyter i kulturmediet, er det ikke celleutvekst fra vevet observeres. Dette bør utføres med ca 500 mL av vekstmedier for å ikke tørke ut prøvene og deretter legge opp til 1 ml vekstmedier til fartøyet. Det er ikke nødvendig å ytterligere silikon for å holde dekkglass på plass.
Hvis stykkene er mindre enn 3 mm x 3 mm, er den utvekst langsommere, og i noen tilfeller ingen løpende kulturer kan etableres. Det er viktig å ikke dyrke cellene for tynt og vi anbefaler et delingsforhold på 1: 3 til 1: 4. Individuelle små brønner gi bedre styring potensiell forurensning. Brønner kan mates hver for seg og pipetter skal skiftes mellom brønnene.
Vi har med hell hentet meningeale fibroblaster fra 9 postmortem prøver med en postmortem intervallet mellom 10-24 timer. Giverne var mellom 70 og 88 år og har sykdomsvarighet på Parkinsons sykdom mellom 8-31 år. Vi legger merke til at vev med en lengre post-mortem intervall ta lengre tid før de første cellene vokse ut (opp til 9 dager). I prøver med kortere post-mortem intervall, observerer vi utvekst så snart 3 dager etter tilberedning. Vi har ikke merket en forskjell i vekst basert på alder av donor, men vi hadde bare givere> 70 år.
Betydningen av metoden er avledning av en primær cellekultur for en sporadisk nevrodegenerativ sykdom som Parkinsons sykdom, som kan bare tiden bli bekreftet ved obduksjon 12, 13, 14 siden det er ingen fullstendig definere kliniske kjennetegn, bildeteknikker eller biomarkører som kan gi en sikker diagnose i løpet av livet 15. Vi har tidligere developed en protokoll for avledning av fibroblaster fra hud biopsier primært for genetisk bekreftede tilfeller av Parkinsons sykdom 16 som har tillatt oss å generere induserte pluripotente stamceller og studere sykdomsmekanismer 17, 18, men denne nye protokollen vil være avgjørende for å direkte sammenligne nevropatologiske endringer med funnene in vitro for sporadisk Parkinsons sykdom. Så vidt vi vet, er dette den første protokollen som stammer meningeale fibroblaster fra obduksjons menneskelige leptomeninges.
Meningeale fibroblastkulturer kan direkte brukes til å studere molekylære mekanismer relatert til sykdom eller skade, eller som en kilde for nukleær omprogrammering inn i induserte pluripotente stamceller eller direkte omdannelse til nevronale kulturer som avanserte prekliniske modeller for sporadiske Parkinsons sykdom eller andre nevrodegenerative lidelser 19. disse humann pasient avledet modeller gir grunnlaget og akselerere fremskritt i personlig og regenerativ medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1,000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
