तैयारी और प्रौढ़ और वृद्ध मनुष्यों के कंकाल की मांसपेशी से Myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं / प्राथमिक myoblasts की संस्कृति

Summary

इस प्रोटोकॉल वयस्क और वृद्ध लोगों के कंकाल की मांसपेशी से अलगाव और myoblast पूर्वज कोशिकाओं की संस्कृति का एक मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सरल विधि का वर्णन है। यहां इस्तेमाल की मांसपेशियों पैर और पैर की मांसपेशियों में शामिल हैं। यह दृष्टिकोण कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्राथमिक myoblasts की एक समृद्ध आबादी के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी homeostasis मांसपेशियों की वृद्धि (अतिवृद्धि), शोष और उत्थान पर निर्भर करता है। उम्र बढ़ने के दौरान और कई रोगों में, मांसपेशी बर्बाद होता है। मांसपेशियों और समारोह के नुकसान की मांसपेशी फाइबर प्रकार शोष, फाइबर प्रकार स्विचिंग, दोषपूर्ण मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं, मांसपेशियों में स्टेम सेल, और अन्य pathophysiological प्रक्रियाओं की शिथिलता के साथ जुड़े उत्थान के साथ जुड़ा हुआ है। इन परिवर्तनों intracellular में परिवर्तन के साथ ही स्थानीय और प्रणालीगत niches के साथ जुड़े रहे हैं। मांसपेशियों में उम्र बढ़ने के सबसे अधिक इस्तेमाल किया कृंतक मॉडल के अलावा, मांसपेशियों homeostasis अध्ययन करने के लिए एक की जरूरत है और मानव मॉडल है, जो नैतिक प्रभाव के कारण, इन विट्रो संस्कृतियों का मुख्य रूप से मिलकर बनता है का उपयोग कर बर्बाद कर रहे। मानव Myogenic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (MPCs) और myogenesis में प्राथमिक myoblasts के व्यापक उपयोग के बावजूद, वहाँ आणविक तंत्र उम्र जुड़े मुसलमानों के विभिन्न पहलुओं को विनियमित अध्ययन करने के लिए मानव प्राथमिक myoblast और myotube संस्कृतियों के प्रयोग पर सीमित डेटा हैCLE बर्बाद, उम्र बढ़ने कृंतक मांसपेशियों में प्रस्तावित के तंत्र के सत्यापन में सहायता। मानव MPCs, प्राथमिक myoblasts और myotubes वयस्क और वृद्ध लोगों से अलग, का उपयोग मांसपेशियों की वृद्धि, शोष और उत्थान के साथ जुड़े प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र की एक physiologically प्रासंगिक मॉडल उपलब्ध कराता है। myoblasts और myotubes enzymatic पाचन का उपयोग करते हुए मानव मांसपेशियों के नमूनों से - यहाँ हम विस्तार से अलगाव और मानव MPCs और उनकी संतान के रखरखाव के लिए एक मजबूत, सस्ती, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन। इसके अलावा, हम बीतने संख्या, जिस पर वयस्क और वृद्ध लोगों से प्राथमिक myoblasts इन विट्रो संस्कृति में वार्धक्य गुजरना निर्धारित किया है। अंत में, हम इन myoblasts transfect करने की क्षमता और उनके proliferative और भेदभाव क्षमता विशेषताएँ और myogenesis और मांसपेशियों में इन विट्रो में बर्बाद कर के आणविक तंत्र के कार्यात्मक अध्ययन के प्रदर्शन के लिए उनकी उपयुक्तता का प्रस्ताव करने की क्षमता दिखा।

Introduction

दोष में कंकाल की मांसपेशियों और समारोह के परिणामों के रोग और उम्र से संबंधित प्रगतिशील हानि, आयु वर्ग के लोगों के जीवन की गुणवत्ता में शक्ति और कमी में गिरावट। कंकाल की मांसपेशी लगभग 40% शरीर द्रव्यमान ¹ के लिए खातों। वसा और फाइब्रोसिस की घुसपैठ के कारण अलग-अलग myofibers और मांसपेशियों में गुणवत्ता की कमी के प्रगतिशील शोष उम्र बढ़ने और रोग, के दौरान होता है ^{1, 2, 3, 4, 5, 6।} हाल ही में, यह प्रस्ताव किया गया है कि कंकाल की मांसपेशी की उम्र बढ़ने में प्रजातियों विशिष्ट मतभेद होते हैं, विशेष रूप से उस मांसपेशी फाइबर नुकसान कृन्तकों में होने वाली है, मनुष्य ⁷ में नहीं हो सकता है। फिर भी, वृद्ध स्तनधारियों की शेष मांसपेशी फाइबर की क्षति और बिगड़ा उत्थान के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता की विशेषता है वयस्क मांसपेशियों की मरम्मत और रखरखाव के लिए उपग्रह कोशिकाओं ^{9, 10} द्वारा मध्यस्थता है। मांसपेशी की चोट और अन्य प्रासंगिक संकेतों पर, उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय और पैदा हो जाते हैं। कोशिकाओं के एक सबसेट मौन राज्य के लिए रिटर्न और शेष myoblasts (Myogenic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं - MPCs) में प्रगति। ये मौजूदा myofiber ¹¹ की मरम्मत के लिए योगदान करते हैं। उपग्रह कोशिकाओं की कार्यक्षमता पेशी उत्थान की सफलता और उम्र बढ़ने प्रदर्शन किया गया है ^{12, 13, 14, 15} के साथ उपग्रह सेल उपलब्धता में परिवर्तन निर्धारित करता है। इसके अलावा, पुराने मानव और मूषक की पेशी से उपग्रह कोशिकाओं एक ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफ़ाइल स्विच दिखाने के लिए और पुनर्योजी क्षमता को कम कर ^{16, 17, 18, 19।} वर्ष चूहों और इंसानों से पेशी के सैटेलाइट कोशिकाओं को भी अपने सीमित कार्यक्षमता ²⁰ में जिसके परिणामस्वरूप वार्धक्य गुजरना करने के लिए दिखाया गया है।

सबसे स्थापित सेल लाइन पेशी homeostasis के अध्ययन को सक्षम murine C2C12 सेल लाइन ²¹ है। अध्ययन का एक महत्वपूर्ण राशि भी murine प्राथमिक myoblasts ²² का इस्तेमाल किया है। इन संस्कृतियों murine और कशेरुकी myogenesis के रूप में अच्छी तरह से मांसपेशियों उत्थान, myotube / myofiber शोष, और मांसपेशियों की बीमारी के दौरान होने वाली और ^{23, 24, 25, 26} की उम्र बढ़ने अतिवृद्धि प्रक्रियाओं की एक महत्वपूर्ण समझ के लिए नेतृत्व किया है। हाल ही में, कई समूहों myogenesis और मांसपेशियों में उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए मानव प्राथमिक myoblasts का उपयोग कर का वर्णन किया है। हालांकि, वहाँ रैगर के साथ आम सहमति की कमी हैवयस्क और वृद्ध मनुष्य ^{27, 28, 29, 30, 31} की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक myoblasts के बीच अंतर करने के लिए डी एस। प्रणालीगत और स्थानीय पर्यावरण विकास के दौरान होने वाली है, बुढ़ापे और बीमारी ^{6, 32, 33, 34,} में विशेषता मतभेदों के बावजूद इन विट्रो myoblast और myotube संस्कृतियों मांसपेशियों के विकास, विकास और शोष के साथ जुड़े आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए सबसे सुलभ उपकरण रहते हैं। इसके अतिरिक्त, इन अध्ययनों से न केवल एक मजबूत प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी विट्रो उपकरण में एक अपेक्षाकृत जल्दी, सस्ती और उच्च throughput। इसके अलावा, मानव मांसपेशियों के अध्ययन के साथ जुड़े नैतिक प्रभाव कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति की जोड़तोड़ से जुड़े प्रयोगों के लिए इसका मतलब यह

यहाँ, हम प्राथमिक myoblasts, या MPCs की मजबूत, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने अलगाव के लिए एक सरल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, वयस्क और वृद्ध लोगों की पेशी से दिखाने के लिए और इन विट्रो संस्कृति (चित्रा 1) के मानकीकृत की स्थिति का वर्णन है। पेशी से प्राथमिक संस्कृतियों आमतौर पर myoblasts के अलावा fibroblasts शामिल हैं, तो हम बेहतर पवित्रता और प्राथमिक myoblasts की गुणवत्ता में लक्ष्य एक Preplating कदम सलाह देते हैं। संक्षेप में, हम एक प्रोटोकॉल कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने अलगाव, संस्कृति और वयस्क और वृद्ध लोगों के कंकाल की मांसपेशी से समृद्ध और कार्यात्मक MPCs / प्राथमिक myoblasts के कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है की स्थापना की है।

Protocol

मानव ऊतक यहाँ बताया शामिल सभी प्रयोग अग्रिम में लिवरपूल विश्वविद्यालय, विश्वविद्यालय अस्पताल Aintree अस्पताल और दक्षिण पश्चिम वेल्स अनुसंधान आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (अनुमोदन नहीं: 13 / वाशिंगटन / 0374) और प्रयोगों अच्छा अभ्यास मार्गदर्शन के अनुसार प्रदर्शन किया गया। लिवरपूल विश्वविद्यालय के रूप में काम किया नैतिकता इस अध्ययन के लिए प्रायोजक। सभी दानदाताओं इस अध्ययन के नामांकन के लिए सूचित सहमति दे दी है। मांसपेशियों लोगों से अलग थे (बीएमआई <25): वयस्क: 30 ± 2.8 साल पुरानी है और वृद्ध: 69 ± 5 साल पुराना है।

1. संस्कृति के लिए तैयारी

1. संस्कृति की कोटिंग laminin के साथ सतहों
   1. 10 माइक्रोग्राम / 1x DPBS में laminin एमएल (Dulbecco फॉस्फेट खारा बफर) के एक काम समाधान तैयार है।
   2. पूरी तरह से सतह पर जो कोशिकाओं को चढ़ाया जा करने के लिए (तालिका 1) जा रहे हैं कवर करने के लिए laminin समाधान की एक न्यूनतम राशि पिपेट। टी सेतेचढ़ाना कोशिकाओं से पहले वह संस्कृति पकवान एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस में कम से कम 30 मिनट, 5% सीओ ₂ इनक्यूबेटर। laminin सावधानी से संभालना, भंवर के प्रयोग से परहेज। 10 माइक्रोग्राम / एमएल laminin के काम समाधान DPBS में पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और कई बार फिर से इस्तेमाल किया।
   3. (2 x 10 सेमी ²⁾ प्रति ~ 18 6 अच्छी तरह से थाली में एक 60 मिमी (20 सेमी ²⁾ पेट्री डिश या 2 कुओं का प्रयोग करें - कंकाल की मांसपेशी के 19 मिलीग्राम की कोशिकाओं (कुल 5.50 x 10 ⁴ कोशिकाओं) थाली करने के लिए। जब कार्यात्मक अध्ययन के लिए चढ़ाना कोशिकाओं को हर समय सेल गिनती प्रदर्शन करना।
      नोट: नमूने मूल रूप से महिला रोगियों (30 ± 2.8 वर्ष की उम्र: 69 ± 5 वर्ष, बीएमआई <25 वयस्क) के पैर की सर्जरी (extensor digitorum ब्रेविस, tibialis पूर्वकाल या फुसलाकर halluces मांसपेशियों) से प्राप्त किया गया।
2. एंजाइमी समाधान की तैयारी
   1. 10 एमएल 1x DPBS में शेयर ₂ CaCl की 277 मिलीग्राम: 250 मिमी ₂ CaCl काम कर समाधान तैयार है। तो फिल्टर4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली और दुकान के साथ lution।
   2. 1.5 यू / collagenase डी एमएल, 2.4 यू / Dispase द्वितीय के एमएल और सीरम मुक्त DMEM में 2.5 मिमी ₂ CaCl (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) (तालिका 2) के एक काम समाधान तैयार है।
   3. अच्छी तरह मिक्स और नसबंदी के लिए एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली के माध्यम से एंजाइमी समाधान फ़िल्टर। अग्रिम में एंजाइमी समाधान तैयार है और नीचे फ्रीज (-20 डिग्री सेल्सियस) भविष्य में उपयोग के लिए aliquots में।

2. ऊतक पाचन: मैकेनिकल और enzymatic पृथक्करण

1. नमूना संग्रह के बाद, पाचन तक DPBS में 4 डिग्री सेल्सियस पर पेशी रहते हैं। _{कोलैजिनेज़-Dispase-2} CaCl प्रति 18 समाधान के 2 एमएल की एक न्यूनतम मात्रा तैयार - मांसपेशियों के ऊतकों के 19 मिलीग्राम और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए यह ऊतक हदबंदी से पहले गर्म।
2. संक्षेप में 70% इथेनॉल में पेशी बायोप्सी विसर्जित कर दिया, ताजा DPBS से धो लें और enzymatic के 1 एमएल के साथ एक नया पेट्री डिश पर ऊतक जगहउपाय।
3. जितना संभव हो उतना fibrotic और वसा ऊतकों को त्यागें और छोटी लेकिन अलग पहचाना टुकड़ों में जल्दी लेकिन धीरे मांसपेशियों आंसू (लगभग> 0.5 मिमी ²⁾ बाँझ कैंची या एक शल्य छुरी (ब्लेड नहीं, 10) के साथ।
4. _{कोलैजिनेज़-Dispase-2} CaCl के शेष 1 एमएल के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में नमूना हस्तांतरण।
5. 40 मिनट - 30 से ऊपर 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते हैं। 10 मिनट - धीरे ट्यूब हर 5 आंदोलन से मांसपेशियों के ऊतकों को ले जाएँ।
6. कोट मीडिया के साथ pipettes pipettes की प्लास्टिक की दीवारों के लिए जारी की कोशिकाओं के आसंजन से बचने के लिए। बाँझ मध्यम विकास के 2 संस्करणों, जैसे, DMEM 20% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम), 1% एल glutamine और 1% पी / एस (पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 4 एमएल, पाचन को रोकने के लिए जोड़ें।
7. Pipet और एक 5 एमएल विंदुक के साथ नीचे कई बार मांसपेशी फाइबर से कोशिकाओं की रिहाई में मदद करने के लिए।
   नोट: नमूना आम तौर पर पूरी तरह से अपने छोटे आकार के कारण अलग है। एचowever, अगर पेशी के टुकड़े अभी भी बने हुए हैं, पेशी के शेष टुकड़े के साथ और नए सिरे से एंजाइमी समाधान के साथ एक दूसरे ऊष्मायन का उपयोग करें।
8. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पेशी समाधान फ़िल्टर। झरनी के माध्यम से अधिक मीडिया और फिल्टर के साथ शेष कोशिकाओं को धो लें।
9. आरटी पर 5 मिनट के लिए 443 XG पर अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला ध्यान त्यागें।
10. F-12 मीडिया (हाम F-12 पोषक तत्व मिश्रण), 20% FBS, में गोली भंग 10% एच एस (हार्स सीरम), 1% पी / एस, 1% α glutamine और 2.5 एनजी / FGF-बी के एमएल ( संयोजक मानव बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक)। इधर, प्रति 60 मिमी पेट्री डिश मीडिया के 4 एमएल का उपयोग करें।

3. प्रकोष्ठों के सीडिंग

1. पहले से इनक्यूबेटर (धारा 1.1) से 10 माइक्रोग्राम / एमएल laminin साथ लेपित संस्कृति पोत लीजिए।
2. ध्यान से संस्कृति पकवान से laminin से अधिक दूर, और सतह को छूने से बचें (या यह प्रोटीन संरचना परेशान नहीं करेगा)। धुलाईDPBS (वैकल्पिक) के साथ संस्कृति पकवान।
3. कोशिकाओं laminin लेपित पोत पर सीधे प्लेट और एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂ इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए सेते हैं।
4. उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप (100x कुल बढ़ाई) के तहत अगले दिन कोशिकाओं कल्पना। राउंड छोटे कोशिकाओं की सतह से जुड़ी है और शेष मलबे संस्कृति मीडिया में देखा जा सकता है।
5. 20% FBS, 10% एच एस, 1% पी / एस, 1% α glutamine और 2.5 एनजी / FGF-बी के एमएल के साथ पूरित ताजा एफ 12 मीडिया के लिए मीडिया को बदलें।

4. संस्कृति और प्रकोष्ठों के Passaging

1. मीडिया बदलें हर 2 - 3 डी और व्यवस्था सहज से बचने के लिए कोशिकाओं को विभाजित जैसे ही कोशिकाओं के समूह (, 100X कुल बढ़ाई, चित्रा 2 में उदाहरण के लिए, आयु वर्ग के लोगों से कोशिकाओं, पारित होने के बाद 7 0 डी) खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहे हैं भेदभाव।
2. पहले बीतने (P1) में उच्च ग्लूकोज DMEM 20% FBS, 10% एच एस, 1% से पूरित करने के लिए मीडिया को बदलनापी / एस, 1% α-glutamine। इस बिंदु से FGF-बी के प्रयोग से बचें, के रूप में FGF एक शक्तिशाली माइटोजन और संस्कृति की शुरुआत में महत्वपूर्ण कारक है, लेकिन यह fibroblast अतिवृद्धि यदि संस्कृति में लंबे समय तक इस्तेमाल किया प्रोत्साहित कर सकते हैं।
3. सेल passaging के लिए:
   1. मीडिया निकालें और DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
   2. 0.25% EDTA-trypsin की एक न्यूनतम मात्रा कोशिकाओं की सतह को कवर करने के लिए जोड़ें। धीरे रॉक सुनिश्चित करने के लिए सभी कोशिकाओं टुकड़ी समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं, कमरे के तापमान पर 10 सेकंड के लिए सेते हैं, और इसे हटा दें।
   3. एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को सेते हैं, 3 के लिए 5% सीओ ₂ इनक्यूबेटर - 5 मिनट। धीरे नल और उज्ज्वल प्रकाश माइक्रोस्कोप (100x कुल बढ़ाई) कि कोशिकाओं गोल कर रहे हैं, लेकिन पूरी तरह से सतह से अलग नहीं तहत की जाँच करें। कोई परिवर्तन नहीं कोशिकाओं में मनाया जाता है, 5 और अधिक मिनट के लिए सेते हैं।
   4. जोड़ें 5 ग्रोथ की मिलीलीटर मध्यम कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए (उच्च ग्लूकोज DMEM 20% FBS, 10% एच एस, 1% पी / एस, 1% α glutamine के साथ पूरक), मिश्रणअच्छी तरह से और एक T75 फ्लास्क में नए मीडिया के साथ कोशिकाओं को हस्तांतरण। मध्यम विकास की एक और 5 एमएल के साथ इस कदम (एक T75 कुप्पी के लिए कुल 10 एमएल) दोहरा शेष कोशिकाओं को धो लें।
   5. (पहले पारित होने पर बेहतर) preplate करने के लिए, 5% सीओ ₂ 40 मिनट के लिए इनक्यूबेटर एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को सेते हैं। कोशिकाओं है कि एक नई T75 फ्लास्क में देते हैं और सेते नहीं किया था उनके साथ सतह पर तैरनेवाला लीजिए। यह myoblasts में संस्कृति को समृद्ध करना चाहिए क्योंकि fibroblasts की सबसे पहली फ्लास्क में संलग्न किया जाना चाहिए था।
4. मीडिया बदलें हर 2 - 3 डी और 4 के लिए कोशिकाओं 1 विभाजित जैसे ही वे एक अधिकतम उपज के लिए 70% confluency तक पहुँचने।
5. उच्च ग्लूकोज DMEM 2% एच एस, 1% पी / एस, 1% α glutamine के साथ पूरक: 80% confluency, भेदभाव माध्यम (डीएम) के लिए संस्कृति के माध्यम से बदल - भेदभाव के लिए, कोशिकाओं एक बार 70 पर पहुंच गया। 7 डी गुणवत्ता और myoblast ग की शुद्धता पर निर्भर करता है - कोशिकाओं के भीतर 5 भेदभाव किया जाना चाहिएulture।

5. transfections प्रोटोकॉल

1. बीज 50,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से म्यूचुअल फंड में 20, वार्धक्य और व्यवहार्यता assays के लिए 12 अच्छी तरह से थाली। कवर फिसल जाता है पर या laminin साथ लेपित एक थाली में संस्कृति कोशिकाओं। Ki67 धुंधला के लिए, 25,000 कोशिकाओं को एक 12 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह / बीज।
2. transfections के लिए, 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ निर्माता के प्रक्रिया अभिकर्मक अभिकर्मक के 5 μL, नियंत्रण microRNA नकल या अवरोध के 100 एनएम, microRNA नकल या अच्छी तरह से प्रति microRNA अवरोध करनेवाला के 100 एनएम के 100 एनएम का उपयोग, का पालन करें।
3. अभिकर्मक के बाद भेदभाव माध्यम 6 घंटे के लिए बदलें (उच्च ग्लूकोज DMEM 2% एच एस, 1% पी / एस, 1% α glutamine के साथ पूरक)। प्रसार प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद 2 डी दाग; वार्धक्य के लिए, 7 डी अभिकर्मक के बाद; और MF20 धुंधला के लिए, सात दिनों अभिकर्मक के बाद।

6. प्रकोष्ठों के Immunostaining

1. Ki67, Myod और म्यूचुअल फंड 20 immunostaining
   1. तैयार ब्लॉक 1 (10% एच एस और पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स) और पीबीएस) समाधान में 2 (10% एच एस और 0.05% ट्राइटन एक्स ब्लॉक। 12 अच्छी तरह से थाली के लिए अच्छी तरह से प्रति अभिकर्मक के 500 μL का प्रयोग करें।
      नोट: ऊष्मायन चरणों के लिए एक प्रकार के बरतन का उपयोग कर निम्न चरणों का प्रदर्शन।
   2. कोशिकाओं से मीडिया निकालें।
   3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
   4. एक घुमाव पर 10 मिनट के लिए ठंड मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
   5. कोशिकाओं से मेथनॉल निकालें और 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस के साथ 3x कुल्ला।
   6. ब्लॉक 1 घंटे के लिए आरटी पर एक घुमाव पर 1 समाधान जोड़ें और कोशिकाओं को सेते हैं।
   7. जोड़े प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान: Ki67 धुंधला के लिए, Ki67 को खरगोश एमएबी का उपयोग (1: 1,000 ब्लॉक में कमजोर पड़ने 2); Myod के लिए, MyoD1 (D8G3) XP खरगोश एमएबी का उपयोग (1: ब्लॉक में 100 कमजोर पड़ने 2); म्यूचुअल फंड 20 धुंधला, उपयोग MYH1E (एमएफ 20) प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए (DSHB, 1: 1,000 ब्लॉक में कमजोर पड़ने 2)।
   8. एक घुमाव पर हे 1 घंटे (आरटी) / एन (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
   9. प्राथमिक एबी (इसे फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, तो कई बार एसटू लीजिएलाल 4 डिग्री सेल्सियस पर)।
   10. कुल्ला कोशिकाओं पीबीएस, 5 मिनट प्रत्येक समय के साथ 3x।
   11. उचित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें: Ki67 या Myod धुंधला, बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + L) माध्यमिक एंटीबॉडी, के लिए एलेक्सा स्त्राव 488 साधना (1: 1,000 पीबीएस में कमजोर पड़ने); (: 1,000 पीबीएस में कमजोर पड़ने 1) म्यूचुअल फंड 20 धुंधला, बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + L) माध्यमिक एंटीबॉडी, एलेक्सा स्त्राव 488 साधना के लिए।
   12. कोशिकाओं से युक्त प्लेट लपेटें और आरटी पर एक घुमाव पर अंधेरे में 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं।
   13. कुल्ला कोशिकाओं 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस के साथ 3x।
   14. (: पीबीएस में 1,000 कमजोर पड़ने 1) कोशिकाओं पर और 5 के लिए आरटी पर घुमाव पर सेते - 10 मिनट DAPI समाधान जोड़ें।
   15. कुल्ला कोशिकाओं 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस के साथ 3x।
   16. ताजा पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
   17. बढ़ते समाधान में कवर फिसल जाता है पर कोशिकाओं माउंट या Parafilm के साथ पीबीएस में कोशिकाओं से युक्त वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लेट सील।
   18. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
   19. साथ कोशिकाओं कल्पनाप्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी जितनी जल्दी हो सके (कोई बाद में 2 से सप्ताह)।
2. व्यवहार्यता परख
   1. कोशिकाओं से मीडिया निकालें।
   2. पीबीएस में कोशिकाओं कुल्ला।
   3. 1,000 ethidium ब्रोमाइड और 1: 1,000 acridine नारंगी पीबीएस में पतला 1 जोड़ें।
      सावधानी: ख्याल रखना और स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों के भीतर काम - ethidium ब्रोमाइड एक कैसरजन है।
   4. धुंधला समाधान में कोशिकाओं से युक्त प्लेट लपेटें और 5 मिनट के लिए घुमाव पर आरटी पर सेते हैं।
   5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की छवियों लें: acridine नारंगी के लिए ग्रीन चैनल; ethidium ब्रोमाइड के लिए लाल चैनल।

Representative Results

MPCs / प्राथमिक myoblasts laminin लेपित सतह (चित्रा 2) पर दिखाई दे 24 घंटे के बाद बोने होना चाहिए। कोशिकाओं को एक धुरी के आकार की तरह अपनाना चाहिए और पारित होने में अब भी 4 Myod व्यक्त करना चाहिए (चित्रा 1 ए, बी)। Fibroblasts अपने स्टार की तरह आकृति विज्ञान और Myod (चित्रा 1 बी, सी) की अभिव्यक्ति की कमी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। एक बार कोशिकाओं अगले दिन पर जुड़े होते हैं, मीडिया ताजा bFGF मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। संस्कृति मीडिया हर 48 घंटे प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।

प्रतिनिधि परिणाम यहाँ दिखाया गया है और हमारी प्रयोगशाला ²² उद्देश्य से प्रकाशित आंकड़ों हमारे अलगाव और संस्कृति प्रोटोकॉल का समर्थन और विभिन्न तकनीकों है कि मानव प्राथमिक myoblasts के कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करने के लिए। Myoblast प्रसार Ki67 immunostaining और व्यवहार्यता का उपयोग कर stainin का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकतासेल व्यवहार्यता परख के लिए जी (चित्रा 3)। भेदभाव के लिए, संस्कृति मीडिया भेदभाव मीडिया को बदला जाना चाहिए। Myotubes में 5 फार्म चाहिए - 7 डी और भारी श्रृंखला सकारात्मक (चित्रा 3) मायोसिन हो। नोट myotube गठन के कम कुशल हो सकता है कि जब myoblasts आयु वर्ग के लोगों (चित्रा 3) की मांसपेशियों से अलग कर रहे हैं। बुढ़ापा (एसए β-galactosidase) धुंधला भी आदेश संस्कृति में वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिशत की स्थापना के लिए (चित्रा 3) में प्रदर्शन किया जा सकता है। हमने देखा है कि अब संस्कृतियों (चित्रा 3, मार्ग 4) के साथ, अधिक आयु वर्ग के लोगों की मांसपेशियों से अलग myoblasts वार्धक्य दिखा।

कार्यात्मक अध्ययन के लिए, जीन और microRNA अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति वैक्टर, siRNAs, microRNA mimics और antimiRs (चित्रा 4) के lipophilic अभिकर्मक अभिकर्मकों की मध्यस्थता वितरण का उपयोग चालाकी से किया जा सकता है। यह 40 के लिए अनुमति देता है -जीन / microRNA स्तर को ऊपर होने के साथ 70% अभिकर्मक दक्षता या एक शारीरिक सीमा (चित्रा 4; ²²⁾ के भीतर नीचे विनियमित।

संस्कृति पोत	लगभग। क्षेत्र (प्रति अच्छी तरह से)	10 माइक्रोग्राम / एमएल laminin की मात्रा
35 मिमी पकवान	10 सेमी 2	1 एमएल
60 मिमी पकवान	20 सेमी 2	2 एमएल
100 मिमी पकवान	60 सेमी 2	4 एमएल
24 अच्छी तरह से थाली	2 सेमी 2	200 μL / अच्छी तरह से
12 अच्छी तरह से थाली	4 सेमी 2	500 μL / अच्छी तरह से
6 अच्छी तरह से थाली	10 सेमी 2	1 एमएल / अच्छी तरह से
T25	25 सेमी 2	3 एमएल
T75	75 सेमी 2	5 एमएल

तालिका 1। कोटिंग संस्कृति की सतह के लिए Laminin-DPBS समाधान (10 माइक्रोग्राम / एमएल) की सिफारिश की न्यूनतम मात्रा।

	विशिष्ट गतिविधि / दाढ़ द्रव्यमान	अंतिम एकाग्रता	मास या मात्रा 10 एमएल समाधान के लिए आवश्यक
कोलेजिनेस डी	0.15 यू / मिलीग्राम	10 मिलीग्राम / एमएल (1.5 यू / एमएल)	100 मिलीग्राम
Dispase द्वितीय	0.5 यू / मिलीग्राम	4.8 मिलीग्राम / एमएल (2.4 यू / एमएल)	48 मिलीग्राम
250 मिमी 2 CaCl	110.98 जी / मोल	2.5 मिमी	100 μL

तालिका 2 मांसपेशी पाचन के लिए एंजाइम तैयारी।

चित्रा 1. ग्राफिकल सार प्रोटोकॉल के कदम का सारांश। कैंची से या एक शल्य छुरी (मैं) के साथ मानव मांसपेशियों बायोप्सी की हदबंदी। 40 मिनट (द्वितीय) - 30 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमी समाधान के साथ ऊष्मायन। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में वृद्धि मीडिया को जोड़ने और एक 70 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान छानने के माध्यम से पाचन के अंत (तृतीय)। 5 मिनट (चतुर्थ) के लिए 443 XG पर centrifugation। सतह पर तैरनेवाला discarding और विकास 2.5 एनजी / एमएल FGF (वी) युक्त मीडिया में resuspending। 10 के साथ लेपित एक डिश पर चढ़ाना कोशिकाओं81; g / laminin और 24 एच (छठे) के बाद मीडिया को बदलने की एमएल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2 myoblasts विभिन्न मार्ग पर प्रौढ़ और वृद्ध मनुष्यों की पेशी से अलग किया। एक। (69 ± 5 वर्ष, बीएमआई <25: 30 ± 2.8 वर्ष, वृद्ध वयस्क) छवियाँ myoblasts प्रसारिणी digitorum ब्रेविस, tibialis पूर्वकाल या फुसलाकर halluces महिला रोगियों की मांसपेशियों से अलग प्रतिनिधित्व करते हैं। पारित होने पर 0 और चढ़ाया जा रहा है की 5 दिनों के बाद, कोशिकाओं को अभी भी गोल और छोटे, लेकिन उज्ज्वल प्रकाश माइक्रोस्कोप (ए) के तहत दिखाई दे रहे हैं। Myoblasts फिर, एक लम्बी आकार अपनाना होगा पारित होने के 2 (ए) में दिखाया गया है जैसे। Myod fibroblasts में myoblasts में व्यक्त किया, लेकिन नहीं किया गया है (बी)। Myod पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा दिखाया गया है; त्रुटि सलाखों के मानक विचलन दिखाने; एन = 3 (बी)। प्रतिनिधि छवि myoblast और fibroblast आकृति विज्ञान (सी) के बीच मतभेद का प्रदर्शन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3. मानव प्राथमिक myoblasts विभिन्न धुंधला तकनीक का प्रयोग होती जा सकता है। कक्षों की व्यवहार्यता सेल व्यवहार्यता assays के लिए धुंधला का उपयोग कर देखे जा सकते हैं, प्रसार Ki67 immunostaining का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, भेदभाव MF20 का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है (मायोसिन भारी श्रृंखला) immunostaining और वार्धक्य वार्धक्य जुड़े बीटा galactosidase का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं (एसए β-galactosidase ) धुंधला हो जाना। ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4. मानव प्राथमिक myoblasts स्नायु Homeostasis इन विट्रो में कार्यात्मक अध्ययन के लिए किया जा सकता। ए MF20 (मायोसिन भारी श्रृंखला) myotube आकार और संख्या पर overexpression या मीर 378 के निषेध का प्रभाव दिखा वयस्क मनुष्यों से अलग-अलग प्राथमिक myotubes के immunostaining। बी qPCR मीर 378 और Igf1r, पुष्टि मीर 378 लक्ष्य जीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति, मीर 378 overexpression या मानव प्राथमिक myoblasts में निषेध निम्नलिखित दिखा। Rnu -6 और β-2-माइक्रोग्लोब्युलिन को अभिव्यक्ति रिश्तेदार, क्रमशः, दिखाया गया है। त्रुटि सलाखों SEM दिखाने; एन = 3, * - पी <0.05, छात्र टी परीक्षण।जेपीजी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम प्रसारिणी digitorium ब्रेविस, tibialis पूर्वकाल या फुसलाकर halluces मांसपेशियों से वयस्क और वृद्ध मनुष्यों से मांसपेशी कोशिकाओं पूर्वज / प्राथमिक myoblasts अलग-थलग करने का एक सरल, मजबूत, सस्ती, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कुशल तरीका मौजूद है। इस प्रोटोकॉल वयस्क और वृद्ध मनुष्यों से मानव प्राथमिक myoblasts का उपयोग अध्ययन की अनुमति देने के लिए करना है, खासकर जब इस तरह के FACS- या एमएसीएस-छँटाई के रूप में और अधिक परिष्कृत तरीकों, संभव या व्यावहारिक नहीं नहीं कर रहे हैं।

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत अलगाव विधि लगभग 2 घंटे लगते हैं। मांसपेशियों में अलगाव के दौरान, मांसपेशियों आदेश संक्रमण से बचने के लिए 70% इथेनॉल में धोया गया था। मांसपेशियों की हदबंदी enzymatic करने से पहले, यह छोटा लेकिन दिखाई टुकड़ों में मांसपेशियों में कटौती, और बहुत अधिक नख़रेबाज़ से कोशिका क्षति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। myofibers की हदबंदी और उपग्रह कोशिकाओं और myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं की रिहाई में पाचन का परिणाम है। कंकाल की मांसपेशी के ~ 20 मिलीग्राम, एक 60 मिमी के लिए हमारे मामले में(20 सेमी ²⁾ पेट्री डिश कोशिकाओं की कटाई के लिए सबसे उपयुक्त सतह क्षेत्र था। एक बड़ा सतह पर चढ़ाया कोशिकाओं, कम प्रसार से पता चला है, जबकि कोशिकाओं चढ़ाया पर एक छोटे सतह कोशिका मृत्यु और समूहन वृद्धि हुई दिखाया।

अलगाव पर, कोशिकाओं सुसंस्कृत थे और laminin से ढके प्लेटों पर विस्तार किया। के गैर लेपित सतहों उपयोग अलगाव की सफलता में कमी हो जाती थी। इस कारण से, कोशिकाओं अधिमानतः सीधे अलगाव के बाद एक पूर्व लेपित सतह पर काटा जा सकता है। Fibroblasts समृद्ध संस्कृतियों myoblasts व्युत्पन्न कोशिकाओं के बजाय प्रबल कोशिकाओं को सीधे अलगाव के बाद एक गैर लेपित सतह पर काटा जाता है, तो होगा। इसके अलावा laminin से, इस तरह के Matrigel और कोलेजन आधारित अभिकर्मकों के रूप में अन्य सेल लगाव समाधान के उपयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कोटिंग के समाधान के विकास के कारकों और अन्य यौगिकों कि सेल के विकास को बढ़ावा देंगे शामिल हो सकते हैं, लेकिन इन सेल व्यवहार और इसलिए प्रयोगात्मक परिणामों को बदल सकता है। मेंहमारे अनुभव, 10 माइक्रोग्राम / एमएल laminin इष्टतम एकाग्रता और उपग्रह कोशिकाओं और myoblast लगाव और प्रसार के लिए उचित कोटिंग अभिकर्मक के रूप में यह किसी भी वृद्धि कारक या अन्य पूरक का अभाव है। इसके अलावा, laminin आधारी पटल, सीधे sarcolemma, जो कंकाल की मांसपेशी फाइबर के माध्यम से उपग्रह सेल लगाव और प्रवास में एक महत्वपूर्ण समारोह निभाता से जुड़े में स्वाभाविक रूप से मौजूद है।

संस्कृति मीडिया की खुराक भी प्राथमिक myoblast के व्यवहार पर एक हानिकारक प्रभाव हो सकता है। ऐसे FGFs या IGFs के रूप में उदाहरण के विकास का पहलू समूहों के लिए, FGF -2 दोनों mitogenic और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु प्रतिक्रिया ³¹ को नियंत्रित करने के साथ, प्राथमिक myoblast संस्कृतियों पर pleiotropic प्रभाव है। इसलिए यह कड़ाई से संस्कृति की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से, क्योंकि वयस्क और वृद्ध लोगों की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक myoblasts के व्यवहार में अंतर पवित्रता ओ के कारण बहुत ही होने की संभावना हैसंस्कृतियों और लंबी अवधि संस्कृतियों ³⁵ के दौरान संस्कृति में myoblasts घोषणाओं fibroblasts की संभावना च। हम आदेश fibroblasts के साथ संस्कृतियों के संक्रमण को कम करने के लिए एक गैर-लेपित सतह पर पहली बंटवारे के दौरान कोशिकाओं के 1 घंटे पूर्व चढ़ाना इस्तेमाल किया है।

विधि का वर्णन हम दोनों वयस्क और वृद्ध मनुष्य की मांसपेशियों से myogenic पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त है। के रूप में myogenic कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत ने संकेत (Myod अभिव्यक्ति और myogenic गुण आंकड़े 1 में MF20 immunostaining द्वारा कल्पना और 2) और प्रक्रियाओं के कार्यात्मक अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता पृथक सेल कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि myogenic आबादी के होते हैं पेशी homeostasis के साथ जुड़े।

पिछले अध्ययनों से अलगाव और गुण में मतभेद, या उसके अभाव, मानव प्राथमिक myoblasts से विशेषता हैवयस्क और वृद्ध लोगों ^{6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 से 6, 37, 38।} बुढ़ापे की और / या गैर कार्यात्मक मानव MPCs के अस्तित्व ⁶ प्रदर्शन किया गया ^{है, 20, 22।} हालांकि, हौसले से अलग मानव MPCs के व्यवहार में कोई अंतर भी ²⁷ दिखाया गया है। हमारी प्रोटोकॉल प्राथमिक myoblasts, इस तरह के आयु वर्ग के लोगों की मांसपेशियों से अलग प्राथमिक myoblasts की proliferative संभावित या वार्धक्य को कम कर के रूप में है कि कम से कम आंशिक रूप से उनके phenotype बनाए रखने के अलगाव के लिए अनुमति देता है और इनमें से उपयोग की अनुमतिउम्र बढ़ने के दौरान मांसपेशियों ²² homeostasis के आणविक तंत्र के कार्यात्मक अध्ययन के लिए कोशिकाओं।

प्राथमिक विधि यहाँ वर्णित का उपयोग कर अलग myoblasts myogenic भेदभाव के अध्ययन के लिए ही नहीं बल्कि इस तरह के उम्र बढ़ने के दौरान मानव myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं में होने वाली जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के रूप में intracellular परिवर्तन, जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, परिवर्तन है कि लंबे समय तक पूर्व vivo संस्कृति के दौरान कोशिकाओं में पाए जाते हैं जब उम्र बढ़ने के दौरान होने वाली प्ररूपी और genotypic परिवर्तन का विश्लेषण विचार किया जाना चाहिए। हम इस उद्देश्य के लिए हौसले से अलग कक्षों का उपयोग करना चाहिये।

इसके अलावा, प्राथमिक myoblast संस्कृति विधि यहाँ वर्णित मजबूत इन विट्रो कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है, विस्तार और मानव प्राथमिक myoblasts की अपेक्षाकृत लंबी अवधि संस्कृति के लिए अनुमति देता है। हम पहले से पता चला है कि myogenic पूर्वज हमारे विधि का उपयोग कर अलग कोशिकाओं दोनों अभिव्यक्ति की रूपरेखा और फू के लिए इस्तेमाल किया जा सकतामांसपेशियों में उम्र बढ़ने के साथ जुड़े ²² प्रक्रियाओं के nctional अध्ययन करता है। इस विधि को भी वयस्क और पुराने मूषक की मांसपेशियों के लिए लागू है और है कि उम्र बढ़ने और कार्यात्मक अध्ययन ²² के दौरान आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन की रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता myoblasts की एक समृद्ध संस्कृति के अलगाव के लिए अनुमति देता है। इस विधि की सीमाओं का उपयोग करते हैं, कुछ हद तक शामिल हैं, उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी के बजाय कोशिकाओं की मिश्रित आबादी है, जो और अधिक परिष्कृत प्रकाशित तरीकों ^{6, 28, 29, 39, 40, 41, 42} का उपयोग कर प्राप्त ^किया जा सकता है ^43।

हम वयस्क और वृद्ध से प्राथमिक myoblasts कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक, सरल, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुतमनुष्य। हमारे अनुभव में, (उपग्रह कोशिकाओं से हल FACS ऐसे MACS- या के रूप में) अलगाव और मानव प्राथमिक myoblasts की संस्कृति के उपलब्ध है, और अधिक परिष्कृत तरीके ऐसी कोशिकाओं में transcriptomic या प्रोटिओमिक परिवर्तनों की रूपरेखा के रूप में अध्ययन के कुछ प्रकार, के लिए आदर्श होते हैं। हालांकि, इन तरीकों महंगे हैं, विशेषज्ञता के कम से कम कुछ स्तर की आवश्यकता होती है, और शुद्ध प्राथमिक myoblast संस्कृतियों और myoblasts overgrowing fibroblasts की कम proliferative दर की वजह से मुश्किल साबित हो सकता है।

हम एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल है कि कार्यात्मक अध्ययन में उपयोग के लिए सरल अलगाव और मानव प्राथमिक myoblasts की संस्कृति परमिट प्रस्तुत करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम laminin ⁴² के उपयोग और सीमित एक सफल संस्कृति ⁴⁴ के लिए महत्वपूर्ण कारक के रूप में bFGF के उपयोग का प्रस्ताव है। हम भी जब कोशिकाओं को विभाजित करने और पारित होने के पहले ⁴⁵ में से एक पूर्व चढ़ाना कदम centrifugation द्वारा उत्पन्न तनाव से बचने का प्रस्ताव। संक्षेप में, हम हैअलगाव और वयस्क और वृद्ध मनुष्य की मांसपेशियों को भी मूषक की मांसपेशियों के लिए लागू है और अभिव्यक्ति और मांसपेशियों homeostasis के कार्यात्मक अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है कि प्राथमिक से myoblasts / MPCs की संस्कृति के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल अनुकूलित।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri dishes	Greiner Bio One	628160	Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS.
Cell culture plates (6-well)	Sigma-Aldrich	CLS3516	Corning Costar cell culture plates. 6-well, flat bottom (Individually wrapped) .
Cell culture plates (12-well)	Greiner bio-one	657 160	Cellstar Cell culture Multiwell Plates.
Culture flasks	Greiner Bio One	690175 (25 cm2); 658175 (75 cm2).	Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks.
Standard Disposable Scalpel	Granton	91310	Sterile stainless steel blade, pattern: 10.
Pipettes	Greiner bio-one	606 180 (5 mL); 607 180 (10 mL); 760 180 (25 mL)	Cellstar Serological Pipettes.
Pasteur plastic pipettes	Starlab	E1414-0311	3.0 mL Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped.
Syringe	BD	300613	20 mL BD eccentric tip syringe.
0.2 µm filters	Gilson	ALG422A	Sterile Syringe Filters CA 0.2 µm 33 mm Pk50.
Cell strainers	Fisher Scientific	11597522	Cell culture strainer sterile individually packed 70 µm polypropylene.
Collagenase D	Roche	11088882001	Collagenase D; Activity: ≥0.15 U/mg
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693	Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 U/mg solid.
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709	Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1 mg/mL.
DMEM-high glucose	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose. With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate.
F-12 media	Gibco	21765029	Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine.
FGF-b	PetroTech	100-18B	Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Fetal Bovine Serum.
Horse serum (HS)	Sigma-Aldrich	H1270	Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered.
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered.
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered.
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered.
TrypLE Express	Gibco	12604-013	TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red.
DPBS (cell culture)	Sigma-Aldrich	D8537	Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride.
PBS (immunostaining)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Phosphate-buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4).
Methanol	Fisher	M/4000/PC17	Methanol Analytical Reagent Grade
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 for molecular biology.
anti-MF 20 antibody	DSHB	MF20-c 2ea 211 µg/ml.	MYH1E (MF 20) Mouse mAb.
anti-MyoD antibody	Cell Signaling Technology	13812P	MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb.
anti-Ki67 antibody	Abcam	ab16667	Rabbit mAb to Ki67 [SP6].
Anti-mouse 488 secondary antibody	Invitrogen	A-11029	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
Anti-rabbit 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11034	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate.
DAPI	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)
Senescence β-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860	Senescence β-Galactosidase Staining kit.
DMSO	Sigma-Aldrich	41639	Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC).
Acridine Orange	Sigma-Aldrich	A8097	Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O.
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Lipofectamine 2000 Transfection Reagent
Scramble control for transfections	Qiagen	1027271	miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol)
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay	Qiagen	218300	Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor	Qiagen	219300	Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
Megafuge 2.0 R Centrifuge	Heraeus	75003085	n/a
Centrifuge rotor	Heraeus	3360	Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm.
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System	Nikon	n/a	Eyepieces: CFI 10X/22; Total magnification: 100X (MF20, Live/dead and Ki67).
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25; Total magnification: 100X (Senescence β-Galactosidase Staining).
Axiovert 25 inverted microscope	Carl Zeiss	n/a	Eyepieces: E-PL 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope	Nikon	n/a	Eyepiece: CFWN 10X/20. Total magnification: 100X (bright field).
Hydromount	National Diagnostics	HS-106	Hydromount

References

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