Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

טיפוח Published: December 12, 2016 doi: 10.3791/55048
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Summary

אנו מציגים שיטה פשוטה לבנות מערכות טיפוח נמטודות 3D נקרא NGT-3D ו NGB-3D. אלה יכולים לשמש כדי לחקור כושר נמטודות והתנהגויות בבתי גידול, כי הם יותר דומים לאזורים מחית elegans Caenorhabditis הטבעית מאשר צלחות תרבות elegans המעבדה ג 2D הסטנדרטיות.

Protocol

1. הכינו פתרונות עבור NGT-3D ו NGB-3D

  1. הכן את הפתרונות סטרילי הבאים: 1 ליטר של 0.1454 פתרון M NaCl, 1 ליטר של 1 M CaCl 2, 1 ליטר של 1 M MgSO 4, מרק Lysogeny (LB), 1 ליטר של 1 M KPO 4 חיץ (108.3 גרם של KH 2 4 PO ו 35.6 גרם של K 2 HPO 4, ולמלא H 2 O ל L 1). הפקה של NGM באמצעות פתרונות אלה ניתן למצוא בפרוטוקול קודם 10.
  2. פתרונות חיטוי ב 121 ° C, 15 דקות.
  3. הכן 50 מ"ל של פתרון 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול סטרילי. בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, לערבב 0.25 גרם של כולסטרול ו -50 מ"ל של אתנול 99.99% ומערבבים היטב. אל חיטוי. לעקר את הפתרון כולסטרול באמצעות מזרק 50 מ"ל עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. זה יהיה גם להסיר כל כולסטרול שלא נמס.
  4. (אופציונלי) הכן 10 מ"ל של 150 מ"מ של 2'-deoxy-5-fluorouridine המניות (FUDR). בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, לערבב 0.3693 גרםשל FUDR ו -10 מ"ל מים מזוקקים. נער היטב.

2. כן תרבות חיידקים עבור NGT-3D ו NGB-3D

  1. לחסן 10 מ"ל מרק LB עם חיידקים. החיידקים הסטנדרטיים המשמשים עבור אלגנס האכלה הוא OP50 זן החיידק.
  2. תרבות חיסון החיידקים על 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת הלילה.
  3. לקראת דילול סדרתי, aliquot 9 מ"ל של פתרון NaCl לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל סטרילי. לדוגמה, aliquot 9 מ"ל לתוך סך של 7 צינורות לבצע דילול 10 -7 של E. coli זן OP50.
  4. בעזרת פיפטה 1,000 μl סטרילי, pipet 1 מ"ל של תרבית החיידקים או התרבות חיידקים בדילול לתוך הצינור החדש סטרילי עם 9 מ"ל של תמיסת NaCl ו מערבולת את התערובת 10 מ"ל היטב. חזור על הפעולה עד דילול חיידקי הרצוי הוא הגיע.
    ההערה: דילול החיידקים הרצוי תלוי בסוג והמצב של חיידקים, כמו גם את תנאי ניסוי המדויקים.לדוגמה, 10 -6 - 10 -8 דילול של זן OP50 E. coli היה מספיק כדי להפיק מן 1 - 200 מושבות חיידקים לכל 6.5 מ"ל צינור NGT-3D. תולעים שפותחו באופן מהימן ומתרבים בדרך כלל כאשר מספר מושבות היה מעל גיל 60, שאירע בשעת דילול של 10 -6 - 10 -7. לקבלת NGB-3D, השתמש דילול של 10 -8.

3. ביצוע NGT-3D ו NGB-3D (200 מ"ל)

  1. לאחר הכנת תרבית החיידקים, לערבב 0.6 גרם NaCl, 1 גרם אגר מגורען, ו -0.5 גרם peptone בבקבוק 500 מ"ל. הכנס בר ומערבבים מגנטיים לתוך הבקבוק.
  2. להוסיף 195 מ"ל מים מזוקקים לכסות את הפה של הבקבוק עם רדיד אלומיניום.
  3. C חיטוי 121 מעלות במשך 15 דקות.
  4. מניחים את הבקבוק autoclaved חם על צלחת ומערבבים, ומערבבים במהירות בינונית במשך שעה לפחות 2. מצננים את הבקבוק עד 40 ° C. הקפד לקרר מספיק כממשיך מכאן בטמפרטורות גבוהות עלול להוביל ערפול של אגר המוגמר.עם זאת, בטמפרטורות נמוכות עלולות לגרום התקשות המוקדמת של אגר.
    1. (אופציונלי) כדי להאיץ את תהליך הקירור, הנח את הבקבוק בתוך 15 דקות באמבט מים 40 ° C לפני הצבת בצלחת ומערבבים.
  5. כאשר הטמפרטורה של התקשורת אגר מגיע 40 ° C, להוסיף 200 μl 1 M CaCl 2, 200 μl של 5 מ"ג / פתרון כולסטרול מ"ל, 200 μl 1 M MgSO 4 ו -5 מ"ל 1 M KPO 4 חיץ כפתרון ממשיכה לעורר לריכוזים סופי של 1 2 מ"מ CaCl, 5 כולסטרול מיקרוגרם / מ"ל, 1 מ"מ 4 MgSO, 1 מ"מ KPO 4.
    1. (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים NGT-3D להוסיף 80 μl של 150 מ"מ FUDR לריכוז סופי של 120 מיקרומטר 12.
  6. הוסף 6 מ"ל של 10 מ"ל מדולל תרבית החיידקים משלב 2.4 לתוך הבקבוק ישירות.
    1. (אופציונלי) עבור NGT-3D, להסיר 6 מ"ל של התקשורת אגר לפני שלב 3.6 ו לשמור אותו חם בנפרד. מדיה זה ישמש את החיידקים ללאשכבה עליונה.
  7. בעזרת הליכים סטרילי, לוותר התקשורת לתוך תא תרבות סטרילי. ודא שהמכסה של החדר נסגרת בחוזקה.
    1. (אופציונאלי) כדי למנוע מושבות חיידקים מ טביעה על פני השטח העליונים של אגר, ליצור שכבה של תקשורת אגרה חיידקים ללא משלב 3.6.1 בחלק העליון בפני התקשורת משלב 3.7 מתקשה לחלוטין. פעולה זו תיצור אזור חיידקים ללא בחלק העליון של NGT-3D.
    2. לקבלת NGT-3D, יוצקים 6.5 מ"ל התקשורת לתוך מבחנות פלסטיק 8 מ"ל ברור ליצור שכבה אגר חיידקים, ובזהירות לוותר 200 μl של התקשורת חיידקים חינם על גבי מדיה 3D קשוח למחצה לעשות bacteria- דק שכבה חינם על העליונה.
    3. לקבלת NGB-3D, יוצקים 65 מ"ל של המדיה לתוך בקבוק תרבית תאים 25 ס"מ 2 פלסטיק שקוף. סכום זה צריך למלא את הגוף של בקבוק תרבות 25 ס"מ 2 תאים.
  8. השאר תאים אנכיים בטמפרטורת חדר למשך שבוע כדי לאפשר מושבות חיידקים לגדוללגודל ניכר מ"מ קוטר 1 לפחות.
    1. (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים ב NGT-3D, תאי מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה לאור FUDR.

4. כושר מדוד אוכלוסין תולעת על NGT-3D (Assay גודל יחסית Brood)

  1. פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לקטוף העברה בצלחת NGM חיידקים חינם. אפשר תולעת לנוע בחופשיות במשך כמה דקות כדי להסיר חיידקים מחוברים לגוף שלה.
  2. חזור על שלב 4.1 וודא כי התולעת היא ללא חיידקים. באופן כללי, ולשני שידורים חוזרים של 4.1 הם מספיק.
  3. בזהירות במקום התולעת הנקיה על פני השטח של תקשורת 3D במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D.
  4. סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, אבל מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה.
  5. דגירה של 96 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר 4 ימים, לסגור את העפעפיים בחוזקה והמקוםNGT-3D תא תרבות לתוך אמבט מים 88 ° C כדי להמיס את אגר. החום הורג תולעים אך גופם נותרו על כנן.
    הערה: שימוש 8 מ"ל צינורות עבור NGT-3D, 20 - 30 הדגירה דקות בדרך כלל מספיק.
  7. בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את התקשורת מומסת על צלחת פטרי פלסטיק 9 ס"מ. טפטפות פלסטיק לא מומלצות, כמו תולעים לעתים קרובות יכולים להידבק אליהם.
  8. באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור, לספור את מספר תולעים בבית L3, L4, ושלבי מבוגר. אל תסמכו תולעים כי הם בשלב L2 וצעיר, במרוצת הדורות F1 ו- F2 יכול להתבלבל כאן. לפיכך, assay זה הוא assay גודל להרהר ביחס ולא assay גודל גוזל הכולל.

תמונה 5. והתנהגות תולעת שיא על NGB-3D

  1. פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לאסוף ולהסיר כל חיידקים תקועים אל פני השטח על ידי העברה לצלחת חיידקים ללא NGM ומאפשר לו לנוע בחופשיות במשך כמה דקות.
  2. חזור על שלב 5.1 לוודא ווrm הוא ללא חיידקים.
  3. בזהירות במקום התולעת הנקיה על גבי במרכז השטח אגר של NGB-3D ליד הצוואר של הבקבוק במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D.
  4. סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, תוך מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה.
  5. תמונה או להקליט את התולעת תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור. התאם את המיקוד כתולעת עוברת דרך מטריקס 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניית NGT-3D היא פרוטוקול פשוט וברור שתוצאתה הוא מבחנה המלאה אגרה עם מושבות חיידקים קטנות במרווחים לאורך (איור 1 א) אגר. תולעים יכולים לנוע בחופשיות דרך מטריקס אגר, מציאה וממצים את מושבות חיידקים. כדי לברר האם אלגנס יכולים להתרבות ולגדול בדרך כלל NGT-3D, השווינו פוריות התפתחות הזחל ב -3 D עם צלחות 2D NGM סטנדרטיים. ב assay הגודל גוזל יחסית, מבוגר C. elegans הרמפרודיטים ב NGT-3D לשחזר בדיוק כמו הרמפרודיטים צלחות NGM 2D הרגילות כאשר מושבות חיידקים נמצאות בשפע עם 60 מושבות לפחות (איור 1B). יתר על כן, התפתחות זחל ב NGT-3D גם ממשיכה בדרך כלל כאשר יש שפע של מושבות חיידקים עם רוב התולעים במדינת המבוגר לאחר 96 שעות (איור 1 ג). עם זאת, אם מושבות חיידקים הם דלילותבמטריצה 3D, הן בגודל גוזלים יחסית (איור 1B, בר משמאל) התפתחות הזחל (תרשים 1C, בסרגל הימני) מושפעים באופן שלילי.

כדי לבדוק אם למגורי ב -3 D יש השפעה כלשהי על הפיזיולוגיה לטווח ארוך של התולעת, ערכנו assay תוחלת החיים השוואת NGT-3D ו NGM צלחות. תוחלת החיים הממוצעת של תולעים על NGT-3D היה 15.6 ± 3.6 ימים לעומת 14.8 ± 3.1 ימים עבור צלחות NGM סטנדרטיים. עקומות תוחלת החיים עבור תולעים חיים על NGT-3D ו NGM היו כמעט זהות. לפיכך, נראה כי תולעים לשרוד באותה מידה בתנאי 3D ו 2 ד.

ייצור NGB-3D הוא גם לא קשה וצריך לגרום בקבוק תרבות ברור, מלא אגר כזה שניתן לראות באיור 2 א. כדי בקלות להציג את מושבות החיידקים, שהבענו deoxyviolacein, מטבוליט חיידקים סגול כהה 11, ב OP50זן E. coli (איורים 2A, 2B; זן זמין על פי בקשה). תולעים חי יכול להיות צילמו תחת מיקרוסקופ סטריאו לנתח הילוכים (תרשים 2B, משלימה סרט 1).

אחסון של NGT-3D ו NGB-3D בטמפרטורת החדר הוא מספיק כדי לשמור על שניהם לתאי תרבות אלה עד חודש 1. התייבשות של אגר אינה חשובה לאף NGT-3D או NGB-3D אם כובע תוספת סוג או בורג-סוג שמתאים הצינור או הבקבוק מוחל.

איור 1
איור 1: פיתוח, פוריות ואת תוחלת חיים של סי אלגנס טפח NGT-3D להתחרות בעלות של NGM 2D הסטנדרטי. תמונות (א) של NGT-3D בכמה דילולים של חיידקים. שמאלההימני מכיל דילול 5 x 10 -7, ואת האמצעי הוא דילול 1 x 10 -7. (ב) גודל גוזל יחסית של wild-type תולעים ב NGT-3D כדי פחות מ -60 מושבות OP50 (n = 24), גדול או שווה ל 60 מושבות (n = 14), או על צלחות 2D NGM (n = 29). ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. (ג) אחוז תולעים F1 דור ב L3, L4 או לשלב ההתפתחותי הבוגרת NGT-3D עם פחות מ -60 מושבות OP50, גדול או שווה ל -60 מושבות, או על צלחות NGM 2D. (ד) עקומת הישרדות של elegans wild-type ג בצלחות NGT-3D או NGM. NS מצביעה לא מחושב שונה באופן משמעותי על ידי מבחן log-rank. דמות זו שונתה מ- Lee 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 איור 2: הדמיה C. elegans ב 3D באמצעות NGB-3D. (A, B) תמונות של NGB-3D; תמונות (C) של elegans מבוגר ג ליד מושבה של זן OP50 E. coli המבטא את deoxyviolacein פיגמנט סגול כהה. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
סרט 1 משלים: elegans למבוגרים ג להתקרב E. coli OP50-violace במושבה ב NGB-3D. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טיפוח המעבדה של C. elegans באמצעות צלחות תקשורת צמיחת נמטודות הקלסיות היה חיוני למאות תגליות חשובות כי המחקר ב C. elegans ספקה. כאן, אנו מציגים שיטות חדשות לטפח סי אלגנס בסביבה בצורה מדויקת יותר משקפת גידול תלת מימדי הטבעי שלהם. למרות שיטות אחרות שימשו להתבונן אלגנס ב 3D 13, זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר טיפוח תולעים במטריצה 3D מוצק. שתי השיטות שמוצגות כאן, NGT-3D ו NGB-3D, לאפשר למדענים לשאול שאלות של כושר, התפתחות וצמיחה בטיפוח 3D, וגם תמונה ולהקליט את התולעים 3D. למרות NGT-3D ו NGB-3D יש כמה הבדלים על צלחות NGM 2D הרגילות, הם דומים שיטה מקורית זו ומותאם רק להוסיף טיפוח תולעת ציר z. לפיכך, אנו מוצאים כי פיתוח, פוריות תוחלת חיים להמשיך בדרך כלל בתנאים שלנו. ההמטרה היתה ליצור פרוטוקול שכל מעבדה יכול להעסיק למחקריהם. שיטות אלה פשוט מאוד, לשחזור בקלות ובעלות נמוכה מאוד, מאפשרות התאמה של פרוטוקולים כדי להתאים את הניסויים הספציפיים של המשתמשים.

למרות כל הצעדים בפרוטוקול חשובים, הצעד הקריטי בהפיכת NGT-3D ו NGB-3D היא טמפרטורת הקירור של אגר לאחר מעוקר ב צעדי 3.4 כדי 3.6 בפרוטוקול. אם הטמפרטורה מתקררת נמוכות מדי (כמה מעלות מתחת ל -40 מעלות צלזיוס), אגר יתחיל להקשיח ואת הפתרונים הוסיפו לא יהיו לערבב היטב לתוך אגר. עם זאת, אם הקירור אינו מספיקות (כמה מעלות מעל 40 מעלות צלזיוס), החיידקים הוסיפו עלולות למות ופתרון הכולסטרול הוסיף עלולה להעיב על אגר אגר טיוח חסר התועלת עבור ניסויים. בנוסף, על שטח של זהירות הוא בשלב 4.6. כאשר המסת אגר NGT-3D באמבט מים, הקפד לסגור את העפעפיים בחוזקה כדי לסייע ההיתוך. עם זאת, החום עלול לגרוםכמוסות מסוכנות "פופ" מפעם לפעם להפוך קליע. למטרות בטיחות עדיף לכסות את באמבט מים. חלקים רבים של הפרוטוקול ניתן להתאמה למדי למשתמש. למשל, השתמשנו מבחנה פלסטיק ברורה NGT-3D ובקבוק תרבית תאים ברור 25 ס"מ 2 (מחזיקה בסך הכל 65 מ"ל) עבור NGB-3D. סוגים אחרים של צינורות ברורים או בקבוקי לרשות המשתמש צריכים גם לעבוד. כמו כן, התפתחות חיידקים היא מתכווננת. OP50 coli זן E. לוקח בדרך כלל כשבוע לגדול לפחות מ"מ 1, אשר הועדף לניסויים שלנו. מניסיוננו, מעט קצרות ואפילו הרבה פעמי צמיחה כבר לחיידקים לא נראו להשפיע על צמיחת תולעת או פוריות. התאמת הריכוז אגר, עם זאת, תשפיע תנועת תולעת. ריכוזים נמוכים של אגר לגרום תולעים מראים תנועה שחייה דמוית, וריכוזים גבוהים יותר יכולים לעכב תנועה כוללת.

מקור לדאגה אחד NGB-3D היה הנושא של עיבויוהצטברות מים. כמו אגר נוזלים חמים מתקשה, באופן בלתי נמנע כמה עיבוי מתפתח לאורך זמן, במיוחד על הממשק של הבקבוק ואת אגר. זה יכול להוות בעיה עבור התולעת, אשר מציגה התנהגויות שחיו בנוזלים 14 ואת התפתחותם של חיידקים, אשר יכול להתפשט ברחבי הבקבוק על ידי הנוזל. מניעת העיבוי קשה. שני פתרונות אפשריים קיימים לכך. ראשית, אנו מוודאים כי התולעת יכולה להיכנס אגרה בקלות על ידי הצבתו במרכז השטח אגר על צוואר הבקבוק. שנית, אנחנו בכוונה לשמור על ריכוז חיידקים נמוכים NGB-3D, ובכך מצמצמים את הסיכוי מושבה גדלה על הממשק של נוזלים אגרו.

חשש נוסף הוא הדמיה של תולעים NGB-3D. כדי להגדיל את הבהירות ואיכות תמונות של תולעי 3D, מושבות צריכות להיות קרובות אל פני השטח אבל נשארות שקועות לחלוטין אגר. ניסינו לגדל מושבות מוטבעות רק ליד surface ידי צבת שכבה דקה של אגר חיידקים המכילים על פני השטח, ואת התקשורת הנותרת היה חיידקים חינם. עם זאת, הנושא לא נפתר במלואה על ידי שיטה זו. במקום זאת, החלטנו לייצר בקבוקי NGB-3D רבים בבת אחת, ולהשתמש רק את אלה המכילים מוטבעים מושבות קרובות לפני השטח, ובכך מגדיל את הסיכוי כי תולעת תעבור מושבה הקרובה לפני השטח. אפשרות אחת שאנחנו לא בחנו משנה את התקשורת המוצקה למטריצה ​​מלבד אגרתי המגורען אנחנו מעסיקים כאן. הדמית תולעים בכיוון ציר z יכול גם להיות מאתגרת. אנו עושים זאת על ידי העלאה ידנית והוריד להתמקד הגס, אבל אם תכנית מעקב אוטומטית קיימת לכך, זה יכול להיות מועיל למדי.

התקווה היא כי הטכניקות שהוצגו כאן לגידול של C. elegans ב 3D יהיה בשימוש נרחב על ידי ביולוגים נמטודות. שאלות רבות נותרו על ביולוגית תולעת, כולל הזדקנות והתנהגויות ב -3 D, והאם מה שמדענים להתבונן ב2D רלוונטי עבור תולעת 3D. ואכן, במחקר קודם באמצעות NGT-3D הראה את ההשפעה על כושר רבייה שטיפוח 3D לבש מוטציה חושית מתרבה בדרך כלל בתנאי 2D 9. בנוסף, מחקר אחד הראה התנהגויות תנועה שינו ב -3 D לעומת 2D 15. לבסוף, מערכת זו יכולה לשמש כדי להתחיל לענות על שאלות של אם תנאים מסוימים, מוטציות או מניפולציות להעניק יתרונות כושר לבעל החיים בסביבת 3D המקורית שלו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי ניו החוקר גרנט [2014R1A1A1005553] מן קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) כדי ג'יל; ומענק אתגר העתיד אוניברסיטת Yonsei המנהיג [2015-22-0133] כדי ג'יל

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 224620
Sodium chloride DAEJUNG 7548-4400 58.44 MW
Agar, Granulated Difco 214530
Peptone Bacto 211677
Calcium chloride, dihydrate Bio Basic CD0050 2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol Bio Basic CD0122 386.67 MW
Ethyl alcohol B&J RP090-1 99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous Bio Basic MN1988 120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous Bio Basic PB0445 136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine Tokyo Chemical Industry D2235 246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous Bio Basic PB0447 174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes Stockwell Scientific ST.8570 8 ml
Test Tube Closures Stockwell Scientific ST.8575
Cell Culture Flask SPL Lifescience 70125 25 cm2
Research Stereo Microscope Nikon SMZ18
High-Definition Color Camera Head Nikon DS-Fi2
PC-Based Control Unit Nikon DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software Nikon MQS32000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056 (2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564 (2015).

Tags

פרוטוקולים בסיסיים גיליון 118, נמטודות כושר הרבייה 3D בשלושה ממדים התנהגות טיפוח נמטודות
טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I.… More

Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I. Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory. J. Vis. Exp. (118), e55048, doi:10.3791/55048 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter