Summary
Nós apresentamos um método simples para a construção de sistemas de cultivo nematóide 3D chamado NGT-3D e NGB-3D. Estas podem ser usadas para estudar a aptidão nematóide e comportamentos em habitats que são mais semelhantes aos naturais Caenorhabditis elegans habitats do que as placas padrão 2D cultura elegans laboratório C..
Protocol
1. Prepare Soluções para NGT-3D e NGB-3D
- Preparar as seguintes soluções esterilizadas: 1 L de solução de NaCl a 0,1454 M, 1 L de 1 M de CaCl2, 1 L de 1 M de MgSO4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 H KPO tampão 4 (108,3 g de KH 2 PO 4 e 35,6 g de K 2 HPO 4, e preencher H2O a 1 L). Produção de NGM usando essas soluções podem ser encontradas em um protocolo anterior 10.
- soluções autoclave a 121 ° C, 15 min.
- Preparar 50 ml de uma solução estéril a 5 mg / ml de colesterol. Em um tubo cónico de 50 mL, misturar 0,25 g de colesterol e 50 ml de 99,99% de etanol e misture bem. Não autoclave. Esterilizar a solução colesterol utilizando uma seringa de 50 ml com um filtro de seringa de 0,45 um. Isso também irá remover qualquer colesterol não dissolvido.
- (Opcional) Preparar 10 ml de uma 150 mM de 2'-desoxi-5-fluorouridina estoque (FUdR). Em um tubo cónico de 15 ml, 0,3693 g misturarde FUdR e 10 ml de água destilada. Agite bem.
2. Prepare Cultura das bactérias para NGT-3D e NGB-3D
- Inocular 10 ml de caldo LB com bactérias. As bactérias comuns usados para a C. elegans alimentação é a estirpe de E. coli OP50.
- Cultura a inoculação bacteriana a 37 ° C num incubador com agitação durante a noite.
- Na preparação para uma diluição em série, alíquotas de 9 ml da solução de NaCl em 15 ml estéreis tubos cónicos. Por exemplo, alíquotas de 9 ml em um total de 7 tubos para obter uma diluição de 10 -7 estirpe de E. coli OP50.
- Utilizando uma pipeta estéril de 1.000 ul, pipeta de 1 ml da cultura bacteriana ou cultura bacteriana diluída para o novo tubo estéril com 9 ml de solução de NaCl e agitar com vortex a mistura de 10 ml bem. Repita até a diluição bacteriana desejada é atingida.
NOTA: A diluição bacteriana desejada depende do tipo e condição de bactérias, bem como as condições experimentais exactos.Por exemplo, um 10 -6 - diluição da estirpe de E. coli OP50 10 -8 era suficiente para produzir a partir de 1 - 200 colónias bacterianas por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms desenvolvido e reproduzidos normalmente quando o número de colónias foi superior a 60, o que ocorreu a uma diluição de 10 -6 fiavelmente - 10 -7. Para NGB-3D, usar uma diluição de 10 -8.
3. Fazer NGT-3D e NGB-3D (200 ml)
- Depois de preparar a cultura bacteriana, misturar 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, e 0,5 g de peptona, em um balão de 500 ml. Inserir uma barra de agitação magnética para o balão.
- Adicione 195 ml de água destilada e cobrir a boca do balão com folha de alumínio.
- Autoclave de 121 ° C durante 15 min.
- Colocar o balão autoclavada quente sobre uma placa de agitação, e agitar a uma velocidade moderada durante pelo menos 2 h. Arrefece-se o balão a 40 ° C. Certifique-se de arrefecer o suficiente como continuar a partir daqui a altas temperaturas pode levar a opacificação do agar acabado.No entanto, as temperaturas mais baixas podem resultar no endurecimento prematuro do agar.
- (Opcional) Para acelerar o processo de resfriamento, colocar o balão em um 40 ° C banho de água 15 min antes de colocar em uma placa de agitação.
- Quando a temperatura do meio de ágar atinge 40 ° C, adicionar 200 ul de 1 M de CaCl2, a 200 ul de 5 mg de solução de colesterol / ml, 200 ul de 1 M de MgSO 4 e 5 ml de 1 M de KPO tampão 4, tal como a solução continua a agitar para concentrações finais de 1 mM de CaCl2, 5 ug / ml de colesterol, MgSO 4 1 mM, KPO4 1 mM.
- (Opcional) Para o ensaio do tempo de vida NGT-3D adicionar 80 ul de FUdR a 150 mM para uma concentração final de 120 pM 12.
- Adicionar 6 ml de 10 ml de cultura bacteriana diluído do passo 2.4 para dentro do frasco directamente.
- (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de ágar antes do passo 3.6 e mantê-lo aquecido separadamente. Este suporte vai ser utilizado para os livre de bactériascamada superior.
- Usando procedimentos de esterilização, dispensar a mídia em uma câmara de cultura estéril. Verifique se a tampa da câmara fecha hermeticamente.
- (Opcional) Para evitar a formação de colónias de bactérias na superfície superior do ágar, fazer uma camada de meio de ágar livre de bactérias a partir do passo 3.6.1 em cima antes que o material a partir do passo 3.7 endurece completamente. Isto irá criar uma zona livre de bactérias no topo da NGT-3D.
- Para NGT-3D, despeje 6,5 ml de meio em 8 ml tubos de ensaio de plástico claras para fazer uma camada de agar de bactérias, e dispensar cuidadosamente 200 ul de meios de comunicação sem bactérias na parte superior do meio de cultura semi-endurecido 3D para fazer uma fina bacteria- camada livre no topo.
- Para NGB-3D, despeje 65 ml de mídia na 25 centímetros garrafa de cultura celular 2 clara de plástico. Esta quantidade deve encher o corpo da garrafa de 25 centímetros de cultura 2 de células.
- Deixar câmaras verticalmente à temperatura ambiente durante uma semana para permitir que as colónias bacterianas a crescerpara um tamanho considerável de pelo menos 1 mm de diâmetro.
- (Opcional) Para o ensaio vida na NGT-3D, câmaras cubra com papel alumínio para evitar a degradação luz do FUdR.
4. Medida da aptidão da População Sem-fim na NGT-3D (Brood Relativa Tamanho Assay)
- Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina pegar e transferência em uma placa NGM sem bactérias. Permitir worm para mover-se livremente ao redor por alguns minutos para remover bactérias aderidas ao corpo.
- Repita o passo 4.1 e certificar-se de que o worm é livre de bactérias. Geralmente, duas repetições de 4.1 são suficientes.
- Com cuidado, coloque o worm limpo na superfície da mídia 3D com uma picareta fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D.
- Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, mas impedindo a secagem do ágar.
- Incubar durante 96 horas a 20 ° C.
- Após 4 dias, a fechar as tampas hermeticamente e colocar ocâmara de cultura NGT-3D em um banho de água a 88 ° C para fundir o ágar. O calor mata vermes, mas seus corpos permanecem intactos.
NOTA: Usando 8 ml tubos para NGT-3D, 20 - 30 minutos de incubação é geralmente suficiente. - Usando uma pipeta de vidro, transferir os meios derretido sobre de 9 cm de prato de petri de plástico. pipetas de plástico não são aconselhados, como vermes pode muitas vezes ficar com eles.
- Usando um microscópio de dissecação transmissão estéreo, contar o número de vermes no L3, L4, e estágios adultos. Não conte vermes que estão fase L2 e mais jovens, como as gerações F1 e F2 podem ser confundidos aqui. Assim, este ensaio é um ensaio tamanho da ninhada em relação ao invés de um ensaio total de tamanho da ninhada.
5. Imagem e registrar o comportamento Worm na NGB-3D
- Escolha um verme estágio L4 usando um fio de platina escolher e remover qualquer bactéria coladas à superfície através da transferência a uma placa NGM sem bactérias e permitindo-lhe mover-se livremente para alguns min.
- Repita o passo 5.1 para garantir que o worm é livre de bactérias.
- Cuidadosamente colocar o verme limpo para o centro da superfície de agar do NGB-3D perto do gargalo da garrafa com uma escolha de fio de platina. O worm deve eventualmente entrar no agar agar para a matriz 3D.
- Feche a tampa solta permitindo um pouco de ar para entrar no tubo, evitando a secagem do ágar.
- Imagem ou gravar o worm sob um microscópio de dissecação transmissão estéreo. Ajuste o foco como o worm se move através da matriz 3D.
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Representative Results
A construção de NGT-3D é um protocolo simples e directo que resulta em um tubo de ensaio de agar-enchido com pequenas colónias bacterianas espaçadas ao longo do ágar (Figura 1A). Worms pode circular livremente através da matriz de agar, encontrar e consumir as colónias de bactérias. Para confirmar se o C. elegans podem se reproduzir e crescer normalmente na NGT-3D, comparou fertilidade e desenvolvimento larval em 3D com placas padrão 2D NGM. No ensaio de tamanho da ninhada relativo, adulto C. elegans hermafroditas em NGT-3D reproduzem tão bem como hermafroditas nas placas padrão 2D NGM quando as colónias bacterianas são abundantes com pelo menos 60 colônias (Figura 1B). Além disso, o desenvolvimento larval no NGT-3D também prossegue normalmente quando há uma abundância de colônias bacterianas com a maioria dos vermes no estado adulto após 96 horas (Figura 1C). No entanto, se colônias bacterianas são escassosna matriz 3D, ambos tamanho relativo ninhada (Figura 1B, bar à esquerda) e desenvolvimento larval (Figura 1C, bar à esquerda) são impactados negativamente.
Para testar se a habitação em 3D tem qualquer efeito sobre a fisiologia de longo prazo do worm, foi realizado um ensaio de tempo de vida comparando placas NGT-3D e NGM. O tempo médio para a worms no NGT-3D foi de 15,6 ± 3,6 dias em comparação com 14,8 ± 3,1 dias para placas NGM padrão. As curvas de expectativa de vida para os vermes que vivem na NGT-3D e NGM foram quase idênticos. Assim, parece que os vermes sobreviver igualmente bem em condições em 3D e em 2D.
Fabrico do NGB-3D também não é difícil e deve resultar em um frasco de cultura claro, preenchida com agar como o observado na Figura 2A. Para visualizar facilmente as colónias de bactérias, temos expressas deoxyviolacein, um metabólito bacteriana roxo escuro 11, no OP50estirpe de E. coli (Figuras 2A, 2B; estirpe disponível quando solicitado). Vermes vivos podem ser visualizados sob um microscópio de transmissão-dissecando estéreo (Figura 2B, Supplemental Filme 1).
Armazenamento de NGT-3D e NGB-3D à temperatura ambiente é suficiente para manter ambas estas câmaras de cultura para a até 1 mês. Dessecação do agar não é uma preocupação para qualquer NGT-3D ou NGB-3D, se um tipo de plugue ou do tipo parafuso que se encaixa o tubo ou garrafa é aplicada.
Figura 1: Desenvolvimento, fertilidade e vida útil de C. elegans cultivada em NGT-3D é comparável com a do padrão NGM 2D. (A) Imagens de NGT-3D em várias diluições de bactérias. à esquerda edireito contém uma diluição 5 x 10 -7, eo meio é uma diluição de 1 x 10 -7. (B) Dimensão relativa ninhada de tipo selvagem vermes em NGT-3D, para menos de 60 colónias OP50 (n = 24), maior ou igual a 60 colónias (n = 14), ou em placas de 2D NGM (n = 29). As barras de erro indicam o erro padrão. (C) Percentagem de vermes geração F1 na L3, L4 ou adultos em fase de desenvolvimento NGT-3D com menos de 60 colónias OP50, maior do que ou igual a 60 colónias, ou em placas NGM 2D. Curva (D) Sobrevivência do tipo selvagem C. elegans em placas NGT-3D ou NGM. NS não indica significativamente diferente calculado pelo teste de log-rank. Este valor foi modificado a partir Lee 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de C. elegans em 3D usando NGB-3D. (A, B) Imagens de NGB-3D; (C) Imagens de adultos de C. elegans perto de uma colônia de tensão OP50 E. coli que expressam a deoxyviolacein pigmento roxo escuro. barra de escala é de 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme Suplementar 1: Adulto C. elegans se aproximam de uma coli OP50-violacé E. em colônia em NGB-3D. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
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Discussion
O cultivo laboratorial de C. elegans utilizando as placas de meio de crescimento nematóide clássicos foi crucial para as centenas de descobertas importantes que a pesquisa em C. elegans tem prestado. Aqui, nós apresentamos novos métodos de cultivar C. elegans em um ambiente que reflete com mais precisão seus habitats tridimensionais naturais. Embora outros métodos têm sido utilizados para observar C. elegans em 3D 13, este é o primeiro protocolo que permite a cultura de vermes numa matriz 3D sólido. Os dois métodos mostrados aqui, NGT-3D e NGB-3D, permitem aos cientistas fazer perguntas de fitness, desenvolvimento e crescimento no cultivo 3D, e também de imagem e gravar os vermes em 3D. Embora NGT-3D e NGB-3D tem algumas diferenças para as placas de padrão de 2D NGM, que são semelhantes a este método original e apenas ajustado para adicionar cultivo sem-fim no eixo z. Assim, vemos que o desenvolvimento, fertilidade e vida útil prosseguir normalmente em nossas condições. oobjetivo era criar um protocolo que qualquer laboratório pode empregar para a sua pesquisa. Estes métodos são muito simples, facilmente reproduzível em um custo muito baixo, e permitir o ajuste de protocolos para caber experiências específicas dos usuários.
Embora todos os passos do protocolo são importantes, o passo crítico no sentido de tornar NGT-3D e NGB-3D é a temperatura de arrefecimento do agar após a autoclavagem nos Passos 3.4 a 3.6 do protocolo. Se a temperatura demasiado baixa (arrefece vários graus abaixo de 40 ° C), o agar irá começar a endurecer e as soluções adicionados não se misturar adequadamente no agar. No entanto, se o arrefecimento for insuficiente (vários graus acima de 40 ° C), as bactérias podem morrer adicionados e a solução adicionada de colesterol podem obscurecer o agar agar render o inútil para experiências. Além disso, uma área de cautela é a etapa 4.6. Quando derreter o agar NGT-3D no banho de água, certifique-se de fechar as pálpebras com força para ajudar na fusão. No entanto, o calor pode fazer com que otampas para perigosamente "pop" off e se tornar um projétil. Para fins de segurança, é melhor para cobrir o banho de água. Muitas partes do protocolo são bastante adaptável para o utilizador. Por exemplo, usamos um tubo transparente de ensaio de plástico para NGT-3D e uma garrafa de cultura de células claras 25 cm2 (com um total de 65 ml) para a NGB-3D. Outros tipos de tubos transparentes ou garrafas disponíveis para o usuário também deve funcionar. Além disso, o crescimento bacteriano é ajustável. A estirpe de E. coli OP50 geralmente leva cerca de uma semana a crescer a pelo menos 1 mm, o qual foi preferido para as nossas experiências. Em nossa experiência, os tempos de crescimento mais longos ligeiramente mais curtos e até mesmo tanto para as bactérias não parecem afetar o crescimento worm ou fertilidade. Ajuste da concentração de agar, no entanto, vai afetar o movimento sem-fim. menores concentrações de agar resultar em vermes que mostram um movimento de natação-like, e as concentrações mais elevadas podem inibir o movimento geral.
Uma área de preocupação na NGB-3D foi a questão da condensaçãoe acumulação de água. À medida que o ágar líquido quente endurece, inevitavelmente alguma condensação desenvolve ao longo do tempo, particularmente na interface entre a garrafa e o ágar. Isto pode constituir um problema para o sem-fim, que mostra os comportamentos de natação em líquidos 14 e o crescimento de bactérias, o que pode espalhar por toda a garrafa pelo líquido. A prevenção da condensação é difícil. Existem duas soluções possíveis para isso. Em primeiro lugar, temos a certeza que o sem-fim pode facilmente introduzir o agar, colocando-o no centro da superfície de agar no gargalo da garrafa. Em segundo lugar, manter a concentração de intencionalmente baixas em bactérias NGB-3D, diminuindo assim a possibilidade de que uma colónia cresce na interface do líquido e do agar.
Outra preocupação é a imagem de vermes em NGB-3D. Para aumentar a clareza e qualidade das imagens de vermes em 3D, as colónias devem estar perto da superfície, mas permanecem totalmente incorporado no agar. Temos uma tentativa para crescer apenas colônias embutidos perto do surface, colocando uma camada fina de agar contendo bactérias à superfície, e os meios remanescentes era livre de bactérias. No entanto, o problema não foi totalmente resolvido por este método. Em vez disso, decidimos produzir muitas garrafas NGB-3D de uma só vez, e usar apenas os que contêm colônias próximas à superfície incorporados, aumentando assim a chance de que um worm irá se mover para uma colônia perto da superfície. Uma opção que não têm explorado está mudando os meios sólidos a uma matriz que não seja o ágar granulado nós empregamos aqui. Imagiologia vermes na direção do eixo z também pode ser um desafio. Fazemos isso, levantando e abaixando o foco grosso manualmente, mas se existe um programa de monitoramento automatizado para isso, ele pode ser bastante útil.
A esperança é que as técnicas aqui apresentadas para o cultivo de C. elegans em 3D será amplamente utilizado por biólogos nematóides. Muitas questões permanecem sobre a biologia verme, incluindo envelhecimento e comportamentos em 3D, e se o que os cientistas observar em2D é relevante para o worm em 3D. De fato, um estudo anterior, utilizando NGT-3D mostrou que o impacto sobre a aptidão reprodutiva que o cultivo 3D teve em um mutante sensorial que reproduz normalmente em condições 2D 9. Além disso, um estudo mostrou comportamentos movimento alterados em 3D em comparação com 2D 15. Finalmente, este sistema pode ser usado para começar a responder a questões sobre se certas condições, mutantes ou manipulações conferir vantagens de fitness para o animal em seu ambiente 3D nativa.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma nova Investigator Grant [2014R1A1A1005553] da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) para JIL; e uma Universidade Yonsei líder futuro Desafio Grant [2015-22-0133] para JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
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