Summary
Vi præsenterer en simpel metode til at konstruere 3D-nematode dyrkningssystemer kaldet NGT-3D og NGB-3D. Disse kan anvendes til at studere nematode fitness og adfærd i habitater, der er mere ligner naturlige Caenorhabditis elegans levesteder end de standard 2D laboratorium C. elegans dyrkningsplader.
Protocol
1. Forbered Løsninger til NGT-3D og NGB-3D
- Forbered følgende sterile opløsninger: 1 l 0,1454 M NaCl-opløsning, 1 liter 1 M CaCl2, 1 I 1 M MgSO4, lysogeni Broth (LB), 1 I 1 M KPO 4 puffer (108,3 g KH 2 PO 4 og 35,6 g K 2 HPO 4, og fyld H2O til 1 liter). Produktion af NGM hjælp af disse løsninger kan findes i en tidligere protokol 10.
- Autoclave opløsninger ved 121 ° C, 15 min.
- Forbered 50 ml af en steril 5 mg / ml cholesterol opløsning. I et 50 ml konisk rør, blandes 0,25 g kolesterol og 50 ml 99,99% ethanol og bland godt. Må ikke autoklaveres. Steriliser cholesterol opløsning anvendelse af en 50 ml sprøjte med en 0,45 um sprøjtefilter. Dette vil også fjerne uopløst kolesterol.
- (Valgfrit) Forbered 10 ml af en 150 mM 2'-deoxy-5-fluoruridin (FUdR) lager. I et 15 ml konisk rør, blandes 0,3693 gaf FUdR og 10 ml destilleret vand. Ryst godt.
2. Forbered Bakterier Kultur for NGT-3D og NGB-3D
- Inokulere 10 ml LB-bouillon med bakterier. Standard bakterier anvendes til C. elegans fodring er E. coli stamme OP50.
- Kultur den bakterielle inokulering ved 37 ° C i en rysteinkubator natten over.
- Som forberedelse til en seriel fortynding, alikvote 9 ml NaCl-opløsningen i sterile 15 ml koniske rør. For eksempel for at alikvot 9 ml i alt 7 rør lave en 10 -7 fortynding af OP50-stamme E. coli.
- Ved hjælp af en steril 1.000 pi pipette, pipette 1 ml af bakteriekulturen eller fortyndet bakteriekultur i den sterile nye rør med 9 ml NaCl-opløsning og vortex blandingen 10 ml godt. Gentag, indtil den ønskede bakterielle fortynding er nået.
BEMÆRK: Den ønskede bakteriel fortynding afhænger af typen og tilstanden af bakterier samt de nøjagtige forsøgsbetingelser.For eksempel en 10 -6 - 10 -8 fortynding af OP50 stamme E. coli var tilstrækkelig til at frembringe fra 1 - 200 bakteriekolonier pr 6,5 ml NGT-3D rør. Orme pålideligt udviklet og gengivet normalt, når antallet af kolonier var over 60, som fandt sted ved en fortynding på 10 -6 - 10 -7. For NGB-3D, skal du bruge en fortynding på 10 -8.
3. Gør NGT-3D og NGB-3D (200 ml)
- Efter tilberedning af bakteriekulturen, blandes 0,6 g NaCl, 1 g granuleret agar og 0,5 g pepton i en 500 ml kolbe. Sæt en magnetisk omrører i kolben.
- Tilføj 195 ml destilleret vand og dækker mundingen af kolben med aluminiumsfolie.
- Autoklave 121 ° C i 15 min.
- den varme autoklaveret kolben anbringes på en omrøringsplade, og der omrøres ved en moderat hastighed i mindst 2 timer. Kolben afkøles til 40 ° C. Vær sikker på at køle tilstrækkeligt som fortsætter fra her ved høje temperaturer kan medføre uklarhed af det færdige agar.Imidlertid kan lavere temperaturer resultere i for tidlig hærdning af agaren.
- (Valgfrit) Hvis du vil fremskynde køleprocessen, kolben anbringes i et 40 ° C vandbad 15 minutter før anbringelse på en røre plade.
- Når temperaturen af den agarmedier når 40 ° C, tilsættes 200 pi 1 M CaCl2, 200 pi af 5 mg / ml cholesterol opløsning, 200 pi 1 M MgSO4 og 5 ml 1 M KPO 4 buffer som opløsningen fortsætter omrøre til slutkoncentrationer på 1 mM CaCl2, 5 ug / ml cholesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM KPO 4.
- (Valgfrit) For NGT-3D levetid assay tilsættes 80 ul 150 mM FUdR til en endelig koncentration på 120 uM 12.
- Tilsæt 6 ml af 10 ml fortyndet bakteriekultur fra trin 2.4 til kolben direkte.
- (Valgfrit) For NGT-3D, fjerne 6 ml agar medier før trin 3.6 og holde den varm separat. Dette medie vil blive anvendt til de bakteriefriøverste lag.
- Under anvendelse af sterile procedurer, dispensere mediet i en steril kultur kammer. Sørg for, at dækslet af kammeret lukker tæt.
- (Valgfrit) For at forhindre bakteriekolonier fra danner øverst overflade af agar, gøre et lag af bakteriefrit agar medier fra trin 3.6.1 på toppen før mediet fra trin 3.7 helt hærder. Dette vil skabe en bakteriefri zone i toppen af NGT-3D.
- For NGT-3D, hæld 6,5 ml af medier i 8 ml gennemsigtige plast reagensglas for at gøre en bakterie agar lag, og omhyggeligt dispensere 200 pi af bakteriefrit medier oven på den semi-hærdet 3D medier til at gøre en tynd bakterie fri lag ovenpå.
- For NGB-3D, hæld 65 ml medier i de 25 cm 2 klar plast cellekultur flaske. Dette beløb skal fylde kroppen af 25 cm2 cellekultur flaske.
- Efterlad kamre lodret ved stuetemperatur i en uge for at tillade bakteriekolonier at voksetil en betydelig størrelse på mindst 1 mm i diameter.
- (Valgfrit) For levetid assay i NGT-3D, dække kamre med aluminiumsfolie for at forhindre lys nedbrydning af FUdR.
4. Mål Fitness af Worm Befolkning på NGT-3D (Relativ Brood Size Assay)
- Vælg en L4 etape orm ved hjælp af en platintråd vælge og overførsel på en bakterie-fri NGM plade. Tillad orm til frit at bevæge sig rundt i et par minutter for at fjerne bakterier knyttet til sin krop.
- Gentag trin 4.1 og sørg for, at ormen er fri for bakterier. Almindeligvis to gentagelser af 4,1 er nok.
- Læg forsigtigt ren orm på overfladen af 3D medier med en platintråd pick. Ormen bør i sidste ende ind i agar i 3D agar matrix.
- Luk dækslet løst tillade nogle luft at komme ind i røret, men forhindrer tørring af agarmedier.
- Inkuber i 96 timer ved 20 ° C.
- Efter 4 dage lukke lågene stramt og placereNGT-3D kultur kammer til et 88 ° C vandbad for at smelte agar. Varmen dræber orme, men deres kroppe forbliver intakte.
BEMÆRK: Brug af 8 ml rør til NGT-3D, 20 - 30 minutters inkubering er normalt tilstrækkeligt. - Ved hjælp af et glas pipette, overføre smeltede medier på en 9 cm plastik petriskål. Plastic pipetter er ikke anbefales, da orme ofte kan holde sig til dem.
- Ved hjælp af en transmission stereo dissektionsmikroskop, tælle antallet af orme på L3, L4 og voksne stadier. Må ikke regne orme, der er L2 fase og yngre, da F1 og F2 generationer kan forveksles her. Dette assay er således en relativ kuld størrelse assay snarere end en total kuld størrelse assay.
5. Billede og Record Worm Opførsel ved NGB-3D
- Vælg en L4 etape orm ved hjælp af en platintråd vælge og fjerne eventuelle bakterier sidder fast til overfladen ved at overføre til en bakterie-fri NGM plade og lade det bevæge sig frit i et par minutter.
- Gentag trin 5.1 for at sikre, worm er fri for bakterier.
- Læg forsigtigt ren orm på midten af agaroverfladen af NGB-3D nær flaskens hals med en platintråd pick. Ormen bør i sidste ende ind i agar i 3D agar matrix.
- Luk dækslet løst tillader lidt luft at komme ind i røret, samtidig forhindre tørring af agar medier.
- Billede eller optage ormen under en transmission stereo dissektionsmikroskop. Juster fokus som ormen bevæger sig gennem 3D-matrix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktionen af NGT-3D er en enkel og ligetil protokol, som resulterer i en agar-fyldte reagensglas med små bakteriekolonier fordelt i hele agar (figur 1A). Orme kan frit bevæge sig gennem agar matrix, finde og forbruge de bakterielle kolonier. For at bekræfte, om C. elegans kan reproducere og vokse normalt i NGT-3D, vi sammenlignet frugtbarhed og larve udvikling i 3D med standard 2D NGM plader. I den relative yngel størrelse assay voksen C. elegans hermafroditter i NGT-3D reproducere lige såvel som hermafroditter i faste 2D NGM plader når bakteriekolonier er rigeligt med mindst 60 kolonier (figur 1b). Endvidere larveudviklingen i NGT-3D forløber normalt også når der er masser af bakteriekolonier med hovedparten af orme i den voksne tilstand efter 96 timer (figur 1C). Men hvis bakteriekolonier er sparsei 3D-matrix, er både relative kuld størrelse (figur 1B, venstre bar) og larver udvikling (figur 1C, venstre bar) negativt påvirket.
For at teste, om beboelse i 3D har nogen virkning på den langsigtede fysiologi af ormen, gennemførte vi en levetid assay sammenligner NGT-3D og NGM plader. Den gennemsnitlige levetid for orme på NGT-3D var 15,6 ± 3,6 dage sammenlignet med 14,8 ± 3,1 dage for standard NGM plader. Levetiden kurverne for orme, der lever på NGT-3D og NGM var næsten identiske. Det ser således ud, at orme overlever lige godt i 3D og 2D betingelser.
Fremstilling af NGB-3D er heller ikke vanskeligt og bør resultere i en klar, agar-fyldte kultur flaske som det ses i figur 2A. For nemt at se de bakterielle kolonier, har vi givet udtryk deoxyviolacein, en mørk lilla bakteriel metabolit 11, i OP50stammen E. coli (figur 2A, 2B, belastning efter anmodning). Levende orme kan afbildes under en transmission stereo-dissektionsmikroskop (figur 2B, Supplemental Movie 1).
Opbevaring af NGT-3D og NGB-3D ved stuetemperatur er tilstrækkelig til at opretholde begge disse kultur kamre i op til 1 måned. Udtørring af agaren er ikke et problem for enten NGT-3D eller NGB-3D, hvis en plug-type eller skruelukningen der passer til rør eller flaske anvendes.
Figur 1: Udvikling, frugtbarhed og levetiden for C. elegans dyrket i NGT-3D er sammenlignelig med den standard 2D NGM. (A) Billeder af NGT-3D på flere fortyndinger af bakterier. Venstre ogret indeholder en 5 x 10 -7 fortynding, og den midterste er en 1 x 10 -7 fortynding. (B) Relativ kuld størrelse vildtype orme i NGT-3D til færre end 60 OP50 kolonier (n = 24), er større eller lig med 60 kolonier (n = 14), eller på 2D NGM plader (n = 29). Fejlsøjler indikerer standardafvigelser. (C) Procent af F1 generation orme i L3, L4 eller voksen udviklingsstadiet i NGT-3D med færre end 60 OP50 kolonier, større end eller lig med 60 kolonier, eller på 2D NGM plader. (D) Overlevelse kurve af vildtype C. elegans i NGT-3D eller NGM plader. NS indikerer ikke signifikant forskellig beregnes ved log-rank test. Dette tal er blevet ændret fra Lee 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billedbehandling C. elegans i 3D ved hjælp af NGB-3D. (A, B) Billeder af NGB-3D; (C) Billeder af voksne C. elegans nær en koloni af OP50 stammen E. coli, der udtrykker den mørke lilla pigment deoxyviolacein. Scale bar er 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: Voksen C. elegans nærmer en E. coli-OP50-violace i koloni i NGB-3D. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laboratoriet dyrkning af C. elegans ved hjælp af de klassiske nematode vækstmedier plader var afgørende for de hundredvis af vigtige opdagelser, som forskning i C. elegans har givet. Her præsenteres nye metoder til at dyrke C. elegans i et miljø, der mere præcist afspejler deres naturlige tredimensionale levesteder. Selv om andre metoder er blevet anvendt til at observere C. elegans i 3D 13, er dette den første protokol, der tillader dyrkning af orme i en fast 3D matrix. De to metoder, der er vist her, NGT-3D og NGB-3D, give forskerne at stille spørgsmål til fitness, udvikling og vækst i 3D-dyrkning, og også billed- og registrere orme i 3D. Selvom NGT-3D og NGB-3D har nogle forskelle i forhold til de almindelige 2D NGM plader, er de ligner denne oprindelige metode og kun justeret for at tilføje ormen dyrkning i z-aksen. Således finder vi, at udvikling, fertilitet og levetid fortsætte normalt i vores betingelser. DetMålet var at skabe en protokol, som enhver lab kan anvende for deres forskning. Disse metoder er meget enkel, let reproducerbar til en meget lav pris, og giver mulighed for justering af protokoller til at passe til brugerens specifikke eksperimenter.
Selv om alle trinene i protokollen er vigtige, det kritiske skridt i at gøre NGT-3D og NGB-3D er den køle temperaturen i agar efter autoklavering i trin 3.4 til 3.6 i protokollen. Hvis temperaturen køler (under 40 ° C flere grader) for lavt, vil agaren begynde at hærde og de tilføjede løsninger vil ikke blande korrekt i agaren. Men hvis afkølingen er utilstrækkelig (flere grader over 40 ° C), kan de tilsatte bakterier dør og den tilsatte kolesterol opløsningen kan dugge agaren rendering agaren ubrugelig for eksperimenter. Desuden et område med forsigtighed i trin 4.6. Når smelte NGT-3D agar i vandbadet, så sørg for at lukke lågene tæt til støtte i smeltningen. Imidlertid kan varmen forårsagecaps til faretruende "pop" off og blive et projektil. Af sikkerhedsgrunde er det bedst at dække vandbad. Mange dele af protokollen er ganske passende for brugeren. For eksempel har vi brugt en klar plast test rør til NGT-3D og en 25 cm 2 klar cellekultur flaske (rummer i alt 65 ml) til NGB-3D. Andre typer af klare rør eller flasker til rådighed for brugeren bør også arbejde. Også bakterievækst er justerbar. E. coli stamme OP50 generelt tager omkring en uge at vokse til mindst 1 mm, som blev foretrukket til vores eksperimenter. Det er vores erfaring, gør lidt kortere og endda meget længere vækst tider for bakterier ikke ud til at påvirke orm vækst eller fertilitet. Tilpasning af agar koncentration vil imidlertid påvirke ormen bevægelse. Lavere koncentrationer af agar medføre orme udviser en swimming-lignende bevægelse, og højere koncentrationer kan inhibere samlede bevægelse.
Et område af bekymring i NGB-3D var spørgsmålet om kondensog vand ophobning. Som det varme flydende agar hærder, uundgåeligt nogle kondens udvikler sig over tid, især ved grænsefladen af flasken og agaren. Dette kan give problemer for ormen, som viser svømning adfærd i væsker 14 og væksten af bakterier, der kan spredes i hele flasken af væsken. Forebyggelse af kondens er vanskelig. To mulige løsninger findes for dette. Først sikrer vi, at ormen let kan komme ind i agar ved at anbringe den i midten af agaroverfladen på flaskens hals. For det andet vi bevidst holde koncentrationen af bakterier lavt NGB-3D, hvilket mindsker risikoen for, at en koloni vokser ved grænsefladen mellem væske og agar.
En anden bekymring er billeddannelse af orme i NGB-3D. For at øge klarheden og kvaliteten af billeder af orme i 3D, skal kolonier være tæt på overfladen, men forbliver helt indlejret i agar. Vi har forsøgt at vokse kun indlejrede kolonier nær Surface ved at anbringe et tyndt lag af bakterieholdigt agar ved overfladen, og de resterende medier var bakteriefrit. Imidlertid blev problemet ikke fuldstændigt løst ved denne fremgangsmåde. I stedet besluttede vi at producere mange NGB-3D flasker på én gang, og brug kun dem, der indeholder indlejrede kolonier tæt på overfladen, hvilket øger chancen for, at en orm vil flytte til en koloni nær overfladen. En mulighed, vi ikke har udforsket ændrer de faste medier til en anden end den granulerede agar beskæftiger vi her matrix. Billeddannelse orme i z-aksens retning kan også være udfordrende. Det gør vi ved manuelt at hæve og sænke den grove fokus, men hvis der findes en automatiseret sporing program for dette, kan det være ganske nyttigt.
Håbet er, at de teknikker, der præsenteres her for dyrkning af C. elegans i 3D vil blive udbredt af nematode biologer. Mange spørgsmål er stadig om ormen biologi, herunder aldring og adfærd i 3D, og om hvad forskerne observere i2D er relevant for orm i 3D. Faktisk en tidligere undersøgelse med NGT-3D viste indvirkningen på reproduktive fitness, at 3D dyrkning havde på en sensorisk mutant, der gengiver normalt i 2D vilkår 9. Derudover en undersøgelse viste ændret bevægelsesadfærd i 3D sammenlignet med 2D 15. Endelig kan dette system anvendes til at begynde at besvare spørgsmål om, hvorvidt visse betingelser mutanter eller manipulationer giver fitness fordele til dyret i dets native 3D-miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en ny Investigator Grant [2014R1A1A1005553] fra Grundforskningsfonden Korea (NRF) til JIL; og en Yonsei Universitet Future Leader Challenge Grant [2015-22-0133] til JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
- Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
- Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
- Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
- Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056 (2015).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
- Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564 (2015).
