Summary
Nous présentons une méthode simple pour construire 3D systèmes de culture de nématodes appelés NGT-3D et NGB-3D. Ceux - ci peuvent être utilisées pour étudier le nématode fitness et des comportements dans des habitats qui sont plus semblables à Caenorhabditis elegans naturelles habitats que les laboratoires C. plaques de culture elegans 2D standard.
Protocol
1. Préparer des solutions pour NGT-3D et NGB-3D
- Préparer les solutions stériles suivantes: 1 L de solution 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl 2, 1 L de 1 M MgSO 4, Lysogénie Broth (LB), 1 L de 1 M KPO 4 tampon (108,3 g de KH 2 PO 4 et 35,6 g de K 2 HPO 4 et H 2 O compléter à 1 L). Production de NGM utilisant ces solutions peuvent être trouvées dans un précédent protocole 10.
- Solutions autoclave à 121 ° C, 15 min.
- Préparer 50 ml d'une / ml de solution stérile, 5 mg de cholestérol. Dans un tube conique de 50 ml, mélanger 0,25 g de cholestérol et de 50 ml de 99,99% d'éthanol et bien mélanger. Ne pas autoclaver. Stériliser la solution de cholestérol à l'aide d'une seringue de 50 ml avec un filtre à seringue de 0,45 um. Cela permettra également de supprimer tout le cholestérol non dissous.
- (Facultatif) Préparer 10 ml d'une 150 mM de 2'-désoxy-5-fluorouridine (FUdR) stock. Dans un tube conique de 15 ml, mélanger 0,3693 gde FUdR et 10 ml d'eau distillée. Bien agiter.
2. Préparer les bactéries de la culture pour NGT-3D et NGB-3D
- Inoculer 10 ml LB bouillon avec des bactéries. Les bactéries standards utilisés pour C. elegans alimentation est la souche E. coli OP50.
- La culture d'inoculation bactérienne à 37 ° C dans un incubateur avec agitation pendant une nuit.
- Dans la préparation d'une dilution en série, aliquotes de 9 ml de la solution de NaCl dans 15 ml tubes coniques stériles. Par exemple, aliquote 9 ml dans un total de 7 tubes pour obtenir une dilution de la souche 10 -7 OP50 E. coli.
- À l'aide d'une pipette stérile 1000 ul, pipette 1 ml de la culture bactérienne ou d'une culture bactérienne diluée dans le nouveau tube stérile avec 9 ml de solution de NaCl et bien vortexer le mélange de 10 ml. Répétez jusqu'à ce que la dilution bactérienne désirée soit atteinte.
REMARQUE: La dilution bactérienne souhaitée dépend du type et de l'état des bactéries, ainsi que les conditions expérimentales précises.Par exemple, un 10 -6 - 10 -8 dilution de la souche OP50 de E. coli a été suffisante pour produire à partir de 1 - 200 colonies bactériennes par 6,5 ml Tube NGT-3D. Worms fiable développé et reproduit normalement lorsque le nombre de colonies était de plus de 60, qui a eu lieu à une dilution de 10 -6 à 10 -7. Pour NGB-3D, utiliser une dilution de 10 -8.
3. Faire NGT-3D et NGB-3D (200 ml)
- Après la préparation de la culture bactérienne, mélanger 0,6 g de NaCl, 1 g de granulé de la gélose et la peptone 0,5 g dans un flacon de 500 ml. Insérez une barre d'agitation magnétique dans le ballon.
- Ajouter 195 ml d'eau distillée et couvrir la bouche de la fiole avec une feuille d'aluminium.
- Autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
- Placer le ballon autoclavé chaud sur une plaque d'agitation, et agiter à une vitesse modérée pendant au moins 2 h. Refroidir le ballon à 40 ° C. Assurez-vous de refroidir suffisamment en continuant d'ici à des températures élevées peut conduire à opacification de l'agar fini.Cependant, des températures plus basses peuvent conduire à un durcissement prématuré de la gélose.
- (Facultatif) Pour accélérer le processus de refroidissement, placer le ballon dans un 40 ° C bain d'eau 15 min avant de le placer sur une plaque d'agitation.
- Lorsque la température du milieu gélose atteint 40 ° C, ajouter 200 pi de 1 M CaCl2, 200 ul de 5 mg / ml de solution de cholestérol, 200 pi de 1 M MgSÛ4 et 5 ml de 1 M KPO 4 tampon que la solution continue d'agiter à des concentrations finales de 1 mM de CaCl2, 5 ug / ml de cholestérol, 1 mM de MgSO 4, 1 mM KPO 4.
- (Facultatif) Pour l' essai de durée de vie NGT-3D ajouter 80 ul de mM FUdR 150 à une concentration finale de 120 uM 12.
- Ajouter 6 ml des 10 ml de culture bactérienne diluée à l'étape 2.4 dans le ballon directement.
- (Facultatif) Pour NGT-3D, retirez 6 ml de milieu agar avant l'étape 3.6 et le garder au chaud séparément. Ce média sera utilisé pour les bactéries librescouche supérieure.
- En utilisant des procédures stériles, distribuer les médias dans une chambre de culture stérile. Assurez-vous que le couvercle de la chambre se ferme hermétiquement.
- (Facultatif) Pour éviter des colonies bactériennes de se former à la surface supérieure de la gélose, faire une couche de bactéries libres-média agar de l'étape 3.6.1 sur le dessus avant que les médias de l'étape 3.7 durcit complètement. Cela va créer une zone exempte de bactéries dans le haut de la NGT-3D.
- Pour NGT-3D, versez 6,5 ml de milieu dans les 8 ml claires tubes à essai en plastique pour faire une couche de gélose bactéries, et distribuer soigneusement 200 pi des médias exempt de bactéries sur le dessus du support semi-durci 3D pour faire une aux bactéries mince couche libre sur le dessus.
- Pour NGB-3D, versez 65 ml de milieu dans les 25 cm 2 plastique transparent flacon de culture cellulaire. Ce montant doit remplir le corps de la 25 cm 2 de culture cellulaire bouteille.
- Laissez chambres verticalement à la température ambiante pendant une semaine pour permettre des colonies bactériennes de croîtred'une taille considérable d'au moins 1 mm de diamètre.
- (Facultatif) Pour l'essai de durée de vie dans NGT-3D, les chambres de couverture avec une feuille d'aluminium pour empêcher la dégradation de la lumière de FUdR.
4. Mesurer Fitness de la population de Ver sur NGT-3D (Brood relative Taille Assay)
- Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et transfert sur une plaque NGM exempt de bactéries. Laisser un ver de se déplacer librement autour pendant quelques minutes pour éliminer les bactéries attachées à son corps.
- Répétez l'étape 4.1 et assurez-vous que le ver est exempt de bactéries. En règle générale, deux répétitions de 4,1 suffisent.
- Placez délicatement le ver propre sur la surface du support 3D avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l'agar dans la matrice d'agar 3D.
- Fermez le couvercle permettant lâche un peu d'air d'entrer dans le tube, mais empêchant le séchage du milieu agar.
- Incuber pendant 96 heures à 20 ° C.
- Après 4 jours, fermez le couvercle hermétiquement et placer lechambre de culture NGT-3D dans un bain d'eau C 88 ° pour faire fondre l'agar-agar. La chaleur tue les vers mais leurs corps restent intacts.
NOTE: L'utilisation de 8 ml tubes pour NGT-3D, 20 - 30 minutes d'incubation est généralement suffisant. - En utilisant une pipette en verre, transférer les médias fondus sur un plat en plastique de Pétri de 9 cm. pipettes en plastique ne sont pas informés, que les vers peuvent souvent tenir à eux.
- En utilisant un microscope à dissection transmission stéréo, compter le nombre de vers à la L3, L4 et stades adultes. Ne pas compter les vers qui sont stade L2 et les plus jeunes, les générations F1 et F2 peuvent être confondus ici. Ainsi, cette analyse est une analyse de la taille des couvées par rapport au lieu d'un dosage de la taille totale du couvain.
5. image et enregistrement Worm Comportement sur NGB-3D
- Choisissez un ver de stade L4 en utilisant un fil de platine sélectionner et éliminer toutes les bactéries collées à la surface par le transfert à une plaque NGM exempt de bactéries et de lui permettre de se déplacer librement pendant quelques minutes.
- Répétez l'étape 5.1 pour vous assurer que le worm est exempt de bactéries.
- Placez délicatement le ver propre sur le centre de la surface de la gélose de la NGB-3D à proximité du col de la bouteille avec un pic de fil de platine. Le ver devrait finalement entrer dans l'agar dans la matrice d'agar 3D.
- Fermez le couvercle permettant lâche un peu d'air d'entrer dans le tube, tout en empêchant le séchage du milieu agar.
- Image ou enregistrer le ver sous un microscope binoculaire transmission stéréo. Réglez la mise au point que le ver se déplace à travers la matrice 3D.
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Representative Results
La construction de NGT-3D est un protocole simple et direct qui se traduit par un tube d'essai d' agar-rempli avec de petites colonies bactériennes espacées tout au long de l'agar - agar (figure 1A). Les vers peuvent se déplacer librement à travers la matrice d'agar, la recherche et la consommation des colonies bactériennes. Pour vérifier si C. elegans peuvent se reproduire et se développer normalement dans NGT-3D, nous avons comparé la fertilité et le développement larvaire en 3D avec des plaques 2D NGM standard. Dans l'essai de taille relative de la couvée, adulte C. elegans hermaphrodites dans NGT-3D reproduisent aussi bien que hermaphrodites dans les plaques 2D NGM standards lorsque les colonies bactériennes sont abondantes avec au moins 60 colonies (figure 1B). En outre, le développement larvaire dans NGT-3D se déroule aussi normalement quand il y a beaucoup de colonies bactériennes avec la majorité des vers dans l'état adulte après 96 heures (Figure 1C). Cependant, si des colonies bactériennes sont raresdans la matrice 3D, à la fois la taille relative du couvain (Figure 1B, barre de gauche) et le développement larvaire (figure 1C, barre de gauche) sont impactés négativement.
Pour tester si l'habitation en 3D a un effet sur la physiologie à long terme du ver, nous avons effectué un essai de durée de vie comparant les plaques NGT-3D et NGM. La durée de vie moyenne pour les vers sur NGT-3D a été de 15,6 ± 3,6 jours par rapport à 14,8 ± 3,1 jours pour les plaques NGM standard. Les courbes de durée de vie pour les vers qui vivent sur NGT-3D et NGM étaient presque identiques. Ainsi, il semble que les vers survivent aussi bien dans des conditions 3D et 2D.
La fabrication du NGB-3D est également pas difficile et devrait se traduire par un, l' agar-remplie culture bouteille transparente comme celle observée dans la figure 2A. Pour voir facilement les colonies bactériennes, nous avons exprimées deoxyviolacein, un métabolite bactérien violet foncé 11, dans le OP50souche E. coli (Figures 2A, 2B; souche disponible sur demande). Vers vivants peuvent être visualisés sous un microscope stéréo-disséquant transmission (Figure 2B, Supplemental Film 1).
Stockage des NGT-3D et NGB-3D à la température ambiante est suffisante pour maintenir ces deux chambres de culture pendant 1 mois. La dessiccation de la gélose est pas une préoccupation pour les deux NGT-3D ou NGB-3D si un type de prise ou de type bouchon à vis qui convient le tube ou le flacon est appliqué.
Figure 1: Développement, la fertilité et la durée de vie de C. elegans cultivées en NGT-3D est comparable à celle de la norme 2D NGM. (A) Images de NGT-3D à plusieurs dilutions de bactéries. gauche etcontient droite une dilution de 5 x 10 -7, et le milieu est une dilution de 1 x 10 -7. (B) la taille relative de la couvée des vers de type sauvage dans NGT-3D à moins de 60 colonies de OP50 (n = 24), supérieur ou égal à 60 colonies (n = 14), ou sur des plaques 2D NGM (n = 29). Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard. (C) Pourcentage des vers de la génération F1 dans le L3, L4 ou adulte stade de développement dans le NGT-3D avec moins de 60 colonies de OP50, supérieures ou égales à 60 colonies, ou sur des plaques 2D NGM. (D) Courbe de survie de type sauvage C. elegans dans des plaques NGT-3D ou NGM. NS indique pas significativement différent calculé par le test du log-rank. Ce chiffre a été modifié depuis Lee 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Imagerie C. elegans en 3D à l' aide de NGB-3D. (A, B) Images de NGB-3D; (C) Images de C. elegans adultes près d' une colonie de la souche OP50 E. coli exprimant le violet foncé pigment deoxyviolacein. La barre d'échelle est de 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film supplémentaire 1: Adulte C. elegans approche d' un E. coli OP50-Violace en colonie en NGB-3D. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La culture en laboratoire de C. elegans en utilisant les plaques de milieu de croissance des nématodes classiques était cruciale pour les centaines de découvertes importantes que la recherche en C. elegans a fourni. Ici, nous présentons de nouvelles méthodes pour cultiver C. elegans dans un environnement qui reflète plus fidèlement leurs habitats naturels en trois dimensions. Bien que d' autres méthodes ont été utilisées pour observer C. elegans 13 en 3D, ceci est le premier protocole qui permet la culture de vers dans une matrice solide 3D. Les deux méthodes présentées ici, NGT-3D et NGB-3D, permettent aux scientifiques de poser des questions de santé, de développement et de croissance dans la culture 3D, ainsi que l'image et enregistrer les vers en 3D. Bien que NGT-3D et NGB-3D ont quelques différences par rapport aux plaques 2D NGM standard, elles sont similaires à cette méthode originale et seulement ajusté pour ajouter la culture du ver dans l'axe z. Ainsi, nous constatons que le développement, la fertilité et la durée de vie se déroulent normalement dans nos conditions. leobjectif était de créer un protocole que tout laboratoire peut utiliser pour leurs recherches. Ces méthodes sont très simples, facilement reproductible à un coût très faible, et permettent un ajustement des protocoles pour adapter des expériences spécifiques des utilisateurs.
Bien que toutes les étapes du protocole sont importants, l'étape critique dans la fabrication NGT-3D et NGB-3D est la température de refroidissement de la gélose après autoclavage dans les étapes 3.4 à 3.6 du protocole. Si la température se refroidit trop bas (plusieurs degrés au-dessous de 40 ° C), l'agar-agar va commencer à durcir et les solutions ajoutées ne se mélangera pas correctement dans l'agar-agar. Cependant, si le refroidissement est insuffisant (plusieurs degrés au-dessus de 40 ° C), les bactéries ajoutées peuvent mourir et la solution de cholestérol ajoutée peuvent brouiller la gélose rendant l'agar inutile pour des expériences. En outre, une zone de prudence est à l'étape 4.6. Lorsque la fusion de la gélose NGT-3D dans le bain d'eau, assurez-vous de fermer les paupières étroitement pour aider à la fusion. Cependant, la chaleur peut provoquer lebouchons dangereusement "pop" off et devenir un projectile. Pour des raisons de sécurité, il est préférable de couvrir le bain d'eau. De nombreuses parties du protocole sont tout à fait adaptables à l'utilisateur. Par exemple, nous avons utilisé un tube à essai en plastique clair pour NGT-3D et une claire bouteille de culture cellulaire 25 cm 2 (détient un total de 65 ml) pour la NGB-3D. D'autres types de tubes transparents ou des bouteilles disponibles à l'utilisateur devraient également travailler. En outre, la croissance bactérienne est réglable. La souche E. coli OP50 dure généralement environ une semaine pour atteindre au moins 1 mm, ce qui est préférable pour nos expériences. Dans notre expérience, un peu plus courtes et même beaucoup plus longs temps de croissance pour les bactéries ne semblent pas affecter la croissance du ver ou la fertilité. Ajustement de la concentration d'agar, cependant, aura une incidence sur le mouvement sans fin. Des concentrations plus faibles de l'agar se traduisent par des vers montrant un mouvement de natation-like, et des concentrations plus élevées peuvent empêcher le mouvement d'ensemble.
Un sujet de préoccupation dans NGB-3D a été la question de la condensationet l'accumulation d'eau. Comme l'agar liquide chaud durcit, inévitablement une certaine condensation se développe au fil du temps, en particulier à l'interface de la bouteille et l'agar-agar. Cela peut poser des problèmes pour le ver, qui montre des comportements de natation dans les liquides 14 et la croissance des bactéries, qui peut se propager dans toute la bouteille par le liquide. Prévention de la condensation est difficile. Deux solutions possibles existent pour cela. Tout d'abord, nous nous assurons que le ver peut facilement entrer dans l'agar-agar en le plaçant dans le centre de la surface de la gélose au niveau du col de la bouteille. D'autre part, nous gardons intentionnellement la concentration des bactéries à faible teneur en NGB-3D, ce qui réduit ainsi le risque qu'une colonie se développe à l'interface du liquide et d'agar.
Une autre préoccupation est l'imagerie des vers dans NGB-3D. Pour augmenter la clarté et la qualité des images de vers en 3D, des colonies devrait être proche de la surface, mais restent entièrement noyés dans l'agar-agar. Nous avons essayé de ne cultiver que des colonies noyées près de la surfaCE en plaçant une mince couche d'agar de bactéries contenant à la surface, et les médias restants était exempt de bactéries. Cependant, la question n'a pas été complètement résolu par cette méthode. Au lieu de cela, nous avons décidé de produire beaucoup de bouteilles NGB-3D en une seule fois, et utiliser seulement celles qui contiennent des colonies proches de la surface intégrés, ce qui augmente les chances qu'un ver se déplace vers une colonie près de la surface. Une option que nous avons pas exploré est en train de changer les milieux solides à une matrice autre que l'agar granulé nous employons ici. Imagerie vers dans la direction de l'axe z peut aussi être difficile. Nous faisons cela en élevant et en abaissant la mise au point grossière manuellement, mais si un programme de suivi automatisé existe pour cela, il peut être très utile.
L'espoir est que les techniques présentées ici pour la culture de C. elegans en 3D seront largement utilisés par les biologistes de nématodes. De nombreuses questions subsistent quant à vis sans fin de la biologie, y compris le vieillissement et les comportements en 3D, et si ce que les scientifiques observent dans2D est pertinent pour le ver en 3D. En effet, une étude antérieure utilisant NGT-3D a montré l'impact sur la capacité de reproduction que la culture 3D a eu sur un mutant sensorielle qui reproduit normalement dans des conditions 2D 9. En outre, une étude a montré des comportements de mouvement modifiés en 3D par rapport à 2D 15. Enfin, ce système peut être utilisé pour commencer à répondre aux questions de savoir si certaines conditions, des mutants ou des manipulations confèrent des avantages de conditionnement physique à l'animal dans son environnement 3D natif.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un nouveau chercheur Grant [2014R1A1A1005553] de la National Research Foundation de Corée (NRF) à JIL; et un futur chef de l'Université Yonsei Défi Grant [2015-22-0133] pour JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
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