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Biology

की खेती Published: December 12, 2016 doi: 10.3791/55048
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Summary

हम एक सरल तरीका मौजूद है 3 डी निमेटोड की खेती प्रणाली एनजीटी-3 डी और 3 डी NGB-निर्माण करने के लिए कहा जाता है। ये निमेटोड फिटनेस और निवास है कि अधिक मानक 2 डी प्रयोगशाला एलिगेंस संस्कृति प्लेटों की तुलना में प्राकृतिक Caenorhabditis एलिगेंस निवास के समान हैं में व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

1. एनजीटी-3 डी और 3 डी के लिए NGB-समाधान तैयार

  1. बाँझ समाधान निम्न तैयार: 0.1454 एम NaCl समाधान के 1 एल, एम 1 2 CaCl, 1 एम MgSO 4 के 1 एल के 1 एल, Lysogeny शोरबा (पौंड), 1 एम केपीओ 4 बफर (108.3 के.एच. 2 जी के 1 एल पीओ 4 और कश्मीर 2 की 35.6 छ HPO 4, और भरने के एच 2 ओ एल 1 के लिए)। एन जी एम का उत्पादन इन समाधान का उपयोग कर पिछले एक प्रोटोकॉल 10 में पाया जा सकता है।
  2. 121 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट में आटोक्लेव समाधान।
  3. एक बाँझ 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल समाधान के 50 मिलीलीटर की तैयारी। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, मिश्रण कोलेस्ट्रॉल के 0.25 जी और 99.99% इथेनॉल के 50 मिलीग्राम और अच्छी तरह मिलाएँ। आटोक्लेव मत करो। एक 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ एक 50 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कोलेस्ट्रॉल समाधान जीवाणुरहित। यह भी किसी भी undissolved कोलेस्ट्रॉल को दूर करेगा।
  4. (वैकल्पिक) 2'-Deoxy-5-fluorouridine (FUDR) स्टॉक की एक 150 मिमी की 10 मिलीलीटर की तैयारी। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, मिश्रण 0.3693 जीFUDR और आसुत जल के 10 मिलीलीटर की। अच्छी तरह से हिलाना।

2. एनजीटी-3 डी और 3 डी NGB-के लिए बैक्टीरिया संस्कृति तैयार

  1. टीका लगाना बैक्टीरिया के साथ 10 मिलीलीटर लेग शोरबा। मानक खिला एलिगेंस के लिए इस्तेमाल किया बैक्टीरिया ई कोलाई तनाव OP50 है।
  2. संस्कृति एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया का टीका।
  3. एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए तैयार करने में, विभाज्य 9 बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सोडियम क्लोराइड समाधान के मिलीलीटर। उदाहरण के लिए, विभाज्य 9 मिलीलीटर 7 ट्यूबों के कुल में OP50 तनाव ई कोलाई के एक 10 -7 कमजोर पड़ने बनाने के लिए।
  4. NaCl समाधान के 9 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ 1,000 μl पिपेट, pipet जीवाणु संस्कृति के 1 मिलीलीटर या बाँझ नया ट्यूब में पतला जीवाणु संस्कृति का प्रयोग और अच्छी तरह से 10 मिलीलीटर मिश्रण भंवर। दोहराएँ जब तक वांछित बैक्टीरियल कमजोर पड़ने पर पहुंच गया है।
    नोट: वांछित बैक्टीरियल कमजोर पड़ने के प्रकार और बैक्टीरिया की शर्त के रूप में अच्छी तरह से सटीक प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है।उदाहरण के लिए, एक 10 -6 - 200 प्रति 6.5 मिलीलीटर एनजीटी-3 डी ट्यूब जीवाणु कॉलोनियों - OP50 तनाव ई कोलाई का 10 -8 कमजोर पड़ने 1 से निर्माण करने के लिए पर्याप्त था। कीड़े मज़बूती से विकसित की है और सामान्य रूप से reproduced जब कालोनियों की संख्या 60 से अधिक हो गया था, जो 10 -6 के कमजोर पड़ने पर हुई - 10 -7। NGB-3D के लिए, 10 -8 के कमजोर पड़ने का उपयोग करें।

3. बनाना एनजीटी-3 डी और 3 डी NGB-(200 मिलीलीटर)

  1. जीवाणु संस्कृति तैयार करने के बाद, मिश्रण 0.6 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 1 ग्राम दानेदार अगर, और एक 500 मिलीलीटर फ्लास्क में 0.5 ग्राम peptone। कुप्पी में एक चुंबकीय हलचल बार डालें।
  2. 195 मिलीलीटर आसुत पानी जोड़ें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कुप्पी के मुंह को कवर किया।
  3. 15 मिनट के लिए आटोक्लेव 121 डिग्री सेल्सियस।
  4. एक हलचल थाली पर गर्म autoclaved कुप्पी प्लेस, और कम से कम 2 घंटे के लिए एक मध्यम गति से हलचल। 40 डिग्री सेल्सियस के लिए कुप्पी कूल। उच्च तापमान पर यहां से जारी समाप्त अगर की झाई युक्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में पर्याप्त रूप से शांत करने के लिए सुनिश्चित करें।हालांकि, कम तापमान अगर की समय से पहले सख्त में परिणाम हो सकता है।
    1. (वैकल्पिक) ठंडा करने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, एक हलचल प्लेट पर रखने से पहले एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान 15 मिनट में कुप्पी जगह है।
  5. अगर मीडिया का तापमान 40 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, 200 μl 1 एम 2 CaCl, 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल समाधान के 200 μl, 200 μl 1 एम MgSO 4 और 5 मिलीलीटर 1 एम केपीओ 4 बफर जोड़ने के रूप में समाधान हलचल जारी है 1 मिमी CaCl 2, 5 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल, 1 मिमी MgSO 4, 1 मिमी केपीओ 4 के अंतिम सांद्रता।
    1. (वैकल्पिक) एनजीटी-3D उम्र परख के लिए 120 माइक्रोन के 12 अंतिम एकाग्रता के लिए 150 मिमी FUDR के 80 μl जोड़ें।
  6. सीधे फ्लास्क में 2.4 कदम से जीवाणु संस्कृति पतला 10 मिलीलीटर के 6 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. (वैकल्पिक) एनजीटी 3 डी के लिए, 3.6 कदम से पहले अगर मीडिया के 6 मिलीलीटर हटाने और यह गर्म अलग रहते हैं। यह मीडिया के लिए इस्तेमाल किया जाएगा बैक्टीरिया मुक्तऊपरी परत।
  7. बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करना, एक बाँझ संस्कृति कक्ष में मीडिया को बांटना। सुनिश्चित करें कि चैम्बर के कवर कसकर बंद कर देता है बनाओ।
    1. (वैकल्पिक) अगर की ऊपर की सतह पर बनाने से बैक्टीरियल कालोनियों को रोकने के लिए कदम से मीडिया को पूरी तरह से 3.7 मज़बूत बनाता से पहले शीर्ष पर कदम 3.6.1 से बैक्टीरिया मुक्त अगर मीडिया की एक परत बना। इस एनजीटी 3 डी के शीर्ष पर एक बैक्टीरिया मुक्त क्षेत्र का निर्माण करेगा।
    2. एनजीटी 3 डी के लिए, एक बैक्टीरिया अगर परत बनाने के लिए, और ध्यान से एक पतली bacteria- बनाने के लिए अर्द्ध कठोर 3 डी मीडिया के शीर्ष पर बैक्टीरिया मुक्त मीडिया के 200 μl बांटना 8 मिलीलीटर स्पष्ट प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब में 6.5 मिलीलीटर मीडिया डालना शीर्ष पर मुक्त परत।
    3. NGB-3D के लिए, 25 सेमी 2 स्पष्ट प्लास्टिक सेल संस्कृति बोतल में मीडिया के 65 मिलीलीटर डालना। यह राशि 25 सेमी 2 सेल संस्कृति बोतल के शरीर भरना चाहिए।
  8. एक सप्ताह के लिए खड़ी कमरे के तापमान पर कक्षों छोड़ दो बैक्टीरियल कालोनियों विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिएकम से कम 1 मिमी व्यास की काफी आकार के लिए।
    1. (वैकल्पिक) एनजीटी-3 डी में उम्र परख के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर कक्षों FUDR की रोशनी गिरावट को रोकने के लिए।

एनजीटी-3 डी (सापेक्ष चिंता आकार परख) पर कीड़ा जनसंख्या का 4 उपाय स्वास्थ्य

  1. एक L4 मंच एक प्लैटिनम तार का उपयोग कीड़ा गुमनाम रहने के लिए और एक बैक्टीरिया मुक्त एन जी एम थाली पर स्थानांतरण। कीड़ा स्वतंत्र रूप से अपने शरीर से जुड़ी बैक्टीरिया को दूर करने के लिए कुछ मिनट के लिए चारों ओर स्थानांतरित करने की अनुमति दें।
  2. 4.1 कदम दोहराएँ और सुनिश्चित करें कि कीड़ा बैक्टीरिया से मुक्त है। आम तौर पर, 4.1 से दो दोहराता पर्याप्त हैं।
  3. ध्यान से एक प्लैटिनम तार लेने के साथ 3 डी मीडिया की सतह पर साफ कीड़ा जगह है। कीड़ा अंत में 3 डी अग्रवाल मैट्रिक्स में अगर दर्ज करना चाहिए।
  4. बंद कवर शिथिल कुछ हवा ट्यूब में प्राप्त करने की अनुमति है, लेकिन अगर मीडिया के सूखने को रोकने।
  5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 96 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. 4 दिनों के बाद, कसकर पलकों को बंद करने और जगहएक 88 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एनजीटी 3 डी संस्कृति कक्ष अगर पिघला। गर्मी कीड़े मारता है, लेकिन अपने शरीर को बरकरार रहेगा।
    नोट: एनजीटी-3 डी के लिए 8 मिलीलीटर ट्यूबों का प्रयोग, 20 - 30 मिनट ऊष्मायन आमतौर पर पर्याप्त है।
  7. एक गिलास पिपेट का उपयोग करना, एक 9 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश पर पिघल मीडिया हस्तांतरण। प्लास्टिक pipettes, सलाह नहीं दी जाती रूप में कीड़े अक्सर उन्हें छड़ी कर सकते हैं।
  8. एक संचरण स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, L3, L4 में कीड़े, और वयस्क चरणों की संख्या गिनती। , कीड़े कि एल 2 मंच और युवा हैं गिनती के रूप में F1 और F2 पीढ़ियों यहाँ भ्रमित किया जा सकता है क्या नहीं। इस प्रकार, इस परख एक रिश्तेदार चिंता आकार परख के बजाय कुल चिंता आकार परख है।

5. छवि और NGB-3 डी पर रिकार्ड कृमि व्यवहार

  1. एक प्लैटिनम तार का उपयोग कर एक L4 मंच कीड़ा गुमनाम रहने के लिए और एक बैक्टीरिया मुक्त एन जी एम थाली को स्थानांतरित और यह स्वतंत्र रूप से कुछ मिनट के लिए स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देकर सतह के लिए अटक किसी भी बैक्टीरिया को हटा दें।
  2. दोहराएँ 5.1 कदम सुनिश्चित करने के लिए woआरएम बैक्टीरिया से मुक्त है।
  3. ध्यान से एक प्लैटिनम तार लेने के साथ बोतल की गर्दन के पास NGB 3 डी का अगर सतह के केंद्र पर साफ कीड़ा जगह है। कीड़ा अंत में 3 डी अग्रवाल मैट्रिक्स में अगर दर्ज करना चाहिए।
  4. बंद कवर शिथिल करते हुए अगर मीडिया के सूखने को रोकने, कुछ हवा ट्यूब में शामिल होने की अनुमति देता है।
  5. छवि या एक संचरण स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कीड़ा रिकॉर्ड है। के रूप में कीड़ा 3 डी मैट्रिक्स के माध्यम से चलता ध्यान समायोजित करें।

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Representative Results

एनजीटी 3 डी का निर्माण एक सरल और सीधा प्रोटोकॉल है कि छोटे जीवाणु अगर (चित्रा 1 ए) भर दूरी कालोनियों के साथ एक आगर-भरा टेस्ट ट्यूब में परिणाम है। कीड़े स्वतंत्र रूप से अगर मैट्रिक्स के माध्यम से स्थानांतरित कर सकते हैं, लग रहा है और बैक्टीरियल कालोनियों लेने वाली। इस बात की पुष्टि करने के लिए एलिगेंस प्रतिलिपि और एनजीटी-3 डी में सामान्य रूप से विकसित कर सकते हैं, हम प्रजनन और मानक 2 डी एन जी एम प्लेटों के साथ 3 डी में लार्वा विकास की तुलना में। रिश्तेदार चिंता आकार परख में, वयस्क सी एनजीटी-3 डी में hermaphrodites बस के रूप में अच्छी तरह से पुन: पेश मानक 2 डी एन जी एम प्लेटों में hermaphrodites के रूप में जब जीवाणु कॉलोनियों में कम से कम 60 कालोनियों (चित्रा 1 बी) के साथ भरपूर मात्रा में हैं एलिगेंस। इसके अलावा, एनजीटी-3 डी में लार्वा विकास भी सामान्य रूप से आय जब वहाँ 96 घंटे (चित्रा 1 सी) के बाद वयस्क अवस्था में कीड़े के बहुमत के साथ बैक्टीरियल कालोनियों के बहुत सारे हैं। हालांकि, बैक्टीरियल कालोनियों विरल हैं, तो3 डी मैट्रिक्स में, दोनों रिश्तेदार चिंता आकार (चित्रा 1 बी, बाएं बार) और लार्वा विकास (चित्रा 1C, बाईं पट्टी) नकारात्मक प्रभावित कर रहे हैं।

3 डी में बस्ती कृमि के लिए लंबी अवधि के शरीर क्रिया विज्ञान पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है कि क्या परीक्षण करने के लिए, हम एक जीवन परख एनजीटी-3 डी और एन जी एम प्लेटों की तुलना का आयोजन किया। एनजीटी 3 डी पर कीड़े के लिए औसत उम्र मानक एन जी एम प्लेटों के लिए 14.8 ± 3.1 दिनों की तुलना में 15.6 ± 3.6 दिन था। एनजीटी-3 डी और एन जी एम पर रहने वाले कीड़े के लिए उम्र घटता लगभग समान थे। इस प्रकार, यह लगता है कि कीड़े 3 डी और 2 डी की स्थिति में समान रूप से अच्छी तरह से जीवित रहते हैं।

विनिर्माण NGB-3D भी मुश्किल नहीं है और चित्रा 2A में देखा है कि जैसे एक स्पष्ट, आगर-भरा संस्कृति बोतल में परिणाम चाहिए। आसानी से बैक्टीरियल कालोनियों, हम deoxyviolacein, एक गहरे बैंगनी बैक्टीरियल मेटाबोलाइट 11 व्यक्त की है, OP50 में देखने के लिएतनाव ई कोलाई (आंकड़े 2A, 2 बी, तनाव अनुरोध पर उपलब्ध है)। लाइव कीड़े एक संचरण स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी, पूरक मूवी 1) के तहत imaged किया जा सकता है।

कमरे के तापमान पर एनजीटी-3 डी और 3 डी-NGB का भंडारण अप करने के लिए 1 महीने के लिए इन संस्कृति कक्षों के दोनों बनाए रखने के लिए पर्याप्त है। अगर की सुखाना या तो एनजीटी-3 डी या NGB-3 डी के लिए एक चिंता का विषय है, तो एक प्लग-प्रकार या पेंचदार प्रकार टोपी है कि ट्यूब या बोतल फिट बैठता लागू किया जाता है नहीं है।

आकृति 1
चित्रा 1: विकास, प्रजनन और सी एनजीटी 3 डी में खेती की एलिगेंस की उम्र मानक 2 डी एन जी एम के साथ तुलनीय है। (ए) बैक्टीरिया के कई dilutions पर एनजीटी 3 डी की छवियाँ। वाम औरसही एक 5 x 10 -7 कमजोर पड़ने होता है, और बीच में एक 1 एक्स 10 -7 कमजोर पड़ने है। (बी) के सापेक्ष चिंता जंगली प्रकार के कीड़े के एनजीटी-3 डी में कम से कम 60 OP50 कालोनियों (एन = 24) को आकार, अधिक से अधिक या 60 कालोनियों (एन = 14), या 2 डी एन जी एम प्लेटों (एन = 29) पर करने के लिए बराबर है। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि संकेत मिलता है। (सी) से कम 60 OP50 कालोनियों से अधिक या 60 कालोनियों के बराबर, या 2 डी एन जी एम प्लेटों पर साथ एनजीटी-3 डी में L3, L4 या वयस्क विकास के चरण में F1 पीढ़ी कीड़े का प्रतिशत। एनजीटी-3 डी या एन जी एम प्लेटों में जंगली प्रकार एलिगेंस (डी) अस्तित्व वक्र। एन एस नहीं इंगित करता है काफी अलग लॉग-रैंक परीक्षण द्वारा गणना की। यह आंकड़ा ली 9 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2 चित्रा 2: 3 डी में इमेजिंग एलिगेंस NGB 3 डी का उपयोग कर। (ए, बी) NGB 3 डी की छवियों; (सी) गहरे बैंगनी वर्णक deoxyviolacein व्यक्त OP50 तनाव ई कोलाई की एक कॉलोनी के पास वयस्क एलिगेंस की छवियाँ। स्केल बार 500 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
अनुपूरक फिल्म 1: वयस्क एलिगेंस NGB-3 डी में कॉलोनी में एक ई कोलाई OP50-violace दृष्टिकोण। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

शास्त्रीय निमेटोड विकास मीडिया प्लेट का उपयोग एलिगेंस की प्रयोगशाला खेती महत्वपूर्ण खोजों के सैकड़ों एलिगेंस में अनुसंधान प्रदान की गई है के लिए महत्वपूर्ण था। यहाँ, हम नए तरीकों को पेश एक वातावरण है कि अधिक सही उनके प्राकृतिक तीन आयामी आवासों को दर्शाता में एलिगेंस खेती करने के लिए। हालांकि अन्य तरीकों 3 डी 13 में एलिगेंस निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह पहली प्रोटोकॉल है कि एक ठोस 3 डी मैट्रिक्स में कीड़े की खेती की अनुमति देता है। यहाँ दिखाए गए दो तरीकों, एनजीटी-3 डी और 3 डी-NGB, वैज्ञानिकों की छवि 3 डी खेती में फिटनेस, विकास और विकास का सवाल है, और यह भी चाहते हैं और 3 डी में कीड़े रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देते हैं। एनजीटी-3 डी और 3 डी NGB-मानक 2 डी एन जी एम प्लेटों के लिए कुछ मतभेद हैं, वे इस मूल विधि के समान है और केवल z अक्ष में कीड़ा खेती जोड़ने के लिए समायोजित कर रहे हैं। इस प्रकार, हम पाते हैं कि विकास, प्रजनन और उम्र हमारी परिस्थितियों में सामान्य रूप से आगे बढ़ें।लक्ष्य के लिए एक प्रोटोकॉल है कि किसी भी प्रयोगशाला में उनके अनुसंधान के लिए काम कर सकते हैं बनाने के लिए किया गया था। इन तरीकों में बहुत ही सरल, आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए एक बहुत कम कीमत पर कर रहे हैं, और उन की विशिष्ट प्रयोगों फिट करने के लिए प्रोटोकॉल के समायोजन के लिए अनुमति देते हैं।

हालांकि प्रोटोकॉल में कदम के सभी महत्वपूर्ण हैं, एनजीटी-3 डी और 3 डी NGB-बनाने में महत्वपूर्ण कदम ठंडा प्रोटोकॉल का 3.6 करने के लिए कदम 3.4 में autoclaving के बाद अगर के तापमान है। तापमान (40 डिग्री सेल्सियस से नीचे कई डिग्री) बहुत कम ठंडा है, तो अगर कड़ा करने के लिए शुरू हो जाएगा और कहा कि समाधान अगर में ठीक से मिश्रण नहीं होंगे। हालांकि, अगर ठंडा अपर्याप्त (ऊपर 40 डिग्री सेल्सियस कई डिग्री) है, कहा बैक्टीरिया मर सकते हैं और कहा कि कोलेस्ट्रॉल समाधान अगर प्रयोगों के लिए बेकार प्रतिपादन अगर बादल हो सकते हैं। इसके अलावा, सावधानी के एक क्षेत्र 4.6 कदम में है। जब नहाने के पानी में एनजीटी 3 डी अग्रवाल पिघलने, पिघलने में सहायता करने के लिए कसकर पलकों को बंद करने के लिए सुनिश्चित करें। हालांकि, गर्मी पैदा कर सकता हैटोपियां खतरनाक तरीके से बंद "पॉप" करने के लिए और एक फेंकने हो जाते हैं। सुरक्षा उद्देश्यों के लिए इसे पानी से स्नान कवर करने के लिए सबसे अच्छा है। प्रोटोकॉल के कई हिस्सों में उपयोगकर्ता के लिए काफी निभा रहे हैं। उदाहरण के लिए, हम एनजीटी-3 डी के लिए एक स्पष्ट प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब और एक 25 सेमी 2 स्पष्ट सेल संस्कृति बोतल (65 मिलीलीटर की कुल रखती है) NGB-3 डी के लिए इस्तेमाल किया है। स्पष्ट ट्यूब या उपयोगकर्ता के लिए उपलब्ध बोतलों के अन्य प्रकार के भी काम करना चाहिए। इसके अलावा, जीवाणु वृद्धि समायोज्य है। ई कोलाई तनाव OP50 आम तौर पर कम से कम 1 मिमी, जो हमारे प्रयोगों के लिए पसंद किया गया था करने के लिए विकसित करने के लिए एक सप्ताह के बारे में लेता है। हमारे अनुभव में, बैक्टीरिया के लिए थोड़ा कम है और यहां तक ​​कि बहुत लंबे समय तक विकास बार कीड़ा विकास या प्रजनन क्षमता को प्रभावित करने के लिए नहीं लगती। अगर एकाग्रता का समायोजन, हालांकि, कीड़ा आंदोलन को प्रभावित करेगा। अगर की कम सांद्रता एक स्विमिंग आंदोलन की तरह दिखा कीड़े में परिणाम है, और उच्च सांद्रता समग्र आंदोलन को बाधित कर सकते हैं।

NGB-3 डी में चिंता का एक क्षेत्र संक्षेपण का मुद्दा थाऔर पानी के संचय। गर्म तरल अगर मज़बूत बनाता है के रूप में, विशेष रूप से अनिवार्य रूप से कुछ संघनन की बोतल और अगर की इंटरफेस में समय के साथ विकसित करता है। यह कीड़ा है, जो तरल पदार्थ 14 में तैराकी व्यवहार और बैक्टीरिया का विकास है, जो बोतल भर में तरल से फैल सकता है पता चलता है के लिए समस्या पैदा कर सकते हैं। संघनन की रोकथाम मुश्किल है। दो संभव उपचार इस लिए मौजूद हैं। सबसे पहले, हमें यकीन है कि कीड़ा आसानी से बोतल की गर्दन पर अगर सतह के केंद्र में रखकर अगर प्रवेश कर सकते हैं। दूसरे, हम जानबूझकर NGB-3 डी में कम बैक्टीरिया की एकाग्रता रखने के लिए, जिससे मौका है कि एक कॉलोनी तरल और अगर की इंटरफेस में बढ़ता ह्रासमान।

एक और चिंता NGB 3 डी में कीड़े की इमेजिंग है। स्पष्टता और 3 डी में कीड़े की छवियों की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए, कालोनियों की सतह के करीब होना चाहिए लेकिन पूरी तरह से अगर में एम्बेडेड रहते हैं। हम surfa के पास केवल एम्बेडेड कालोनियों बढ़ने का प्रयाससतह पर बैक्टीरिया युक्त अगर की एक पतली परत रखने, और शेष मीडिया द्वारा सीई बैक्टीरिया मुक्त किया गया था। हालांकि, इस मुद्दे को पूरी तरह से इस विधि से हल नहीं किया गया था। इसके बजाय, हम एक समय में कई NGB-3D बोतलों का उत्पादन, और ही हैं कि एम्बेडेड होते सतह के करीब कालोनियों, जिससे संभावना है कि एक कीड़ा सतह के पास एक बस्ती के लिए कदम होगा बढ़ते उपयोग करने का निर्णय लिया। एक विकल्प के लिए हम खोज नहीं की है दानेदार अगर हम यहाँ रोजगार के अलावा किसी अन्य मैट्रिक्स के लिए ठोस मीडिया बदल रहा है। जेड अक्ष दिशा में कीड़े इमेजिंग भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। हम स्वयं को ऊपर उठाने और मोटे ध्यान केंद्रित को कम करके इस करते हैं, लेकिन अगर एक स्वचालित ट्रैकिंग कार्यक्रम इस के लिए मौजूद है, यह काफी मददगार हो सकता है।

आशा है कि यहाँ 3 डी में एलिगेंस की खेती के लिए प्रस्तुत तकनीक का व्यापक रूप से निमेटोड जीव द्वारा इस्तेमाल किया जाएगा। कई सवाल उम्र बढ़ने और 3 डी में व्यवहार सहित कीड़ा जीव विज्ञान, के बारे में बने हुए हैं, और वैज्ञानिकों में क्या पालन कि क्या2 डी से 3 डी में कृमि के लिए प्रासंगिक है। दरअसल, एनजीटी 3 डी का उपयोग कर पिछले एक अध्ययन प्रजनन स्वास्थ्य पर प्रभाव है कि 3 डी खेती एक संवेदी उत्परिवर्ती कि 2 डी की स्थिति 9 में सामान्य रूप से reproduces पर पड़ा दिखाया। इसके अलावा, एक अध्ययन में 2 डी 15 की तुलना में 3 डी में बदल आंदोलन व्यवहार दिखाया। अंत में, इस प्रणाली को कुछ शर्तों, म्यूटेंट या जोड़तोड़ अपने मूल 3 डी वातावरण में पशु के लिए फिटनेस लाभ प्रदान कि क्या के सवालों के जवाब के लिए शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थित किया गया एक नया अन्वेषक अनुदान [2014R1A1A1005553] जेआईएल के लिए कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) से; और एक Yonsei विश्वविद्यालय भविष्य के नेता चैलेंज अनुदान [2015-22-0133] जेआईएल के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 224620
Sodium chloride DAEJUNG 7548-4400 58.44 MW
Agar, Granulated Difco 214530
Peptone Bacto 211677
Calcium chloride, dihydrate Bio Basic CD0050 2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol Bio Basic CD0122 386.67 MW
Ethyl alcohol B&J RP090-1 99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous Bio Basic MN1988 120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous Bio Basic PB0445 136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine Tokyo Chemical Industry D2235 246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous Bio Basic PB0447 174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes Stockwell Scientific ST.8570 8 ml
Test Tube Closures Stockwell Scientific ST.8575
Cell Culture Flask SPL Lifescience 70125 25 cm2
Research Stereo Microscope Nikon SMZ18
High-Definition Color Camera Head Nikon DS-Fi2
PC-Based Control Unit Nikon DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software Nikon MQS32000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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बेसिक प्रोटोकॉल अंक 118, निमेटोड प्रजनन स्वास्थ्य 3 डी तीन आयामों व्यवहार निमेटोड खेती
की खेती<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</emप्रयोगशाला में तीन आयामों में&gt;
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Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I.… More

Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I. Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory. J. Vis. Exp. (118), e55048, doi:10.3791/55048 (2016).

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