Summary
Vi presentiamo un metodo semplice per la costruzione di sistemi di coltivazione nematode 3D chiamati NGT-3D e NGB-3D. Questi possono essere utilizzati per studiare nematode fitness e comportamenti in habitat che sono più simili a naturali Caenorhabditis elegans habitat rispetto alle laboratorio C. elegans piastre di coltura 2D standard.
Protocol
1. Preparare Soluzioni per NGT-3D e NGB-3D
- Preparare le seguenti soluzioni sterili: 1 L di soluzione 0,1454 M di NaCl, 1 L di 1 M CaCl 2, 1 L di 1 M MgSO 4, lisogenia Broth (LB), 1 L di 1 M KPO 4 tampone (108,3 g di KH 2 PO 4 e 35,6 g di K 2 HPO 4, e riempire H 2 O a 1 L). Produzione di NGM utilizzando queste soluzioni può essere trovato in un precedente protocollo 10.
- Le soluzioni autoclave a 121 ° C, 15 min.
- Preparare 50 ml di 5 mg / ml soluzione colesterolo sterile. In una provetta conica da 50 ml, mescolare 0,25 g di colesterolo e 50 ml di etanolo 99,99% e mescolare bene. Non sterilizzare in autoclave. Sterilizzare la soluzione di colesterolo utilizzando una siringa da 50 ml con un filtro a siringa da 0,45 micron. Questo sarà anche eliminare ogni colesterolo non disciolto.
- (Opzionale) Preparare 10 ml di una 150 mm di 2'-desossi-5-fluorouridina (FUDR) stock. In un tubo conico da 15 ml, mescolare 0,3693 gdi FUDR e 10 ml di acqua distillata. Agitare bene.
2. Preparare Coltura dei batteri per NGT-3D e NGB-3D
- Inoculare 10 ml di brodo LB con i batteri. I batteri standard utilizzati per la C. elegans alimentazione è ceppo di E. coli OP50.
- Cultura l'inoculazione batterica a 37 ° C in un incubatore agitazione durante la notte.
- In preparazione per una diluizione seriale, aliquote 9 ml di soluzione NaCl in sterili 15 ml provette coniche. Ad esempio, aliquota 9 ml in un totale di 7 tubi per fare una diluizione 10 -7 del ceppo OP50 E. coli.
- Usando una pipetta sterile, 1.000 ml, pipetta 1 ml di coltura batterica o coltura batterica diluito nella nuova provetta sterile con 9 ml di soluzione di NaCl e vortice bene il composto 10 ml. Ripetere fino a raggiungere la diluizione batterica desiderato.
NOTA: La diluizione batterica desiderata dipende dal tipo e dalle condizioni di batteri e le condizioni sperimentali esatti.Ad esempio, a 10 -6 - diluizione del ceppo OP50 E. coli 10 -8 era sufficiente a produrre da 1 - 200 colonie batteriche per 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms affidabile sviluppati e riprodotti normalmente quando il numero delle colonie era finita 60, avvenuta ad una diluizione di 10 -6 - 10 -7. Per NGB-3D, usare una diluizione di 10 -8.
3. Fare NGT-3D e NGB-3D (200 ml)
- Dopo preparazione della coltura batterica, miscela 0,6 g di NaCl, 1 g granulato agar, e 0,5 g di peptone in un pallone da 500 ml. Inserire una ancoretta magnetica nel pallone.
- Aggiungere 195 ml di acqua distillata e coprire la bocca del pallone con un foglio di alluminio.
- Autoclave 121 ° C per 15 min.
- Porre il pallone in autoclave a caldo su un piatto mescolare, e mescolare a velocità moderata per almeno 2 ore. Raffreddare il pallone a 40 ° C. Assicurati di raffreddare sufficientemente come si continua da qui a temperature elevate può portare a opacità del agar finito.Tuttavia, temperature più basse possono provocare il rapido indurimento di agar.
- (Facoltativo) Per accelerare il processo di raffreddamento, mettere il pallone in un 40 ° C bagnomaria 15 minuti prima di mettere su un piatto mescolare.
- Quando la temperatura del supporto agar raggiunge 40 ° C, aggiungere 200 ml 1 M CaCl 2, 200 ml di 5 mg / soluzione colesterolo ml, 200 ml 1 M MgSO 4 e 5 ml 1 M KPO 4 buffer come la soluzione continua a mescolare a concentrazioni finali di 1 mM CaCl 2, 5 ug / ml di colesterolo, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO 4.
- (Opzionale) per test di durata della vita NGT-3D aggiungere 80 ml di 150 mm FUDR ad una concentrazione finale di 120 micron 12.
- Aggiungere 6 ml di 10 ml diluiti coltura batterica dal punto 2.4 nel pallone direttamente.
- (Opzionale) per NGT-3D, rimuovere le 6 ml di terreni di coltura prima del punto 3.6 e tenere in caldo separatamente. Questo supporto sarà utilizzato per i batteri senzastrato superiore.
- Utilizzando le procedure sterili, erogare i media in una camera di cultura sterile. Assicurarsi che il coperchio della camera si chiude ermeticamente.
- (Opzionale) Per evitare colonie batteriche formazione sulla superficie superiore della agar, fare uno strato di priva di batteri agar dal punto 3.6.1 sulla sommità prima che il supporto dal punto 3.7 completamente indurisce. Ciò creerà una zona libera da batteri nella parte superiore della NGT-3D.
- Per NGT-3D, versare 6,5 ml supporti nelle provette di plastica trasparenti 8 ml di fare uno strato di batteri agar, e dispensare accuratamente 200 ml di mezzi di comunicazione priva di batteri sulla parte superiore del supporto semi-indurito 3D per fare un sottile bacteria- strato libero sulla parte superiore.
- Per NGB-3D, versare 65 ml di media nel 25 centimetri bottiglia coltura cellulare 2 plastica trasparente. Tale importo deve riempire il corpo della bottiglia 25 centimetri cultura 2 cellule.
- Lasciare camere verticalmente a temperatura ambiente per una settimana per consentire colonie batteriche di crescerenotevoli dimensioni del diametro minimo di 1 mm.
- (Opzionale) per test di durata della vita in NGT-3D, camere di coprire con un foglio di alluminio per evitare il degrado luce di FUDR.
4. Misurare Fitness di Worm Popolazione al NGT-3D (Brood dimensione relativa del saggio)
- Scegliere un verme L4 fase utilizzando un filo di platino raccogliere e trasferire su un piatto NGM senza batteri. Lasciare verme di spostarsi liberamente per alcuni minuti per rimuovere batteri attaccati al suo corpo.
- Ripetere il passaggio 4.1 e fare in modo che il worm è esente da batteri. In generale, due repliche di 4.1 sono sufficienti.
- posizionare con cura il verme pulita sulla superficie del supporto 3D con un pick filo di platino. Il worm dovrebbe finalmente entrare l'agar agar nella matrice 3D.
- Chiudere il coperchio senza bloccare consentendo una certa aria nel tubo, ma impedendo l'essiccazione dei media agar.
- Incubare per 96 ore a 20 ° C.
- Dopo 4 giorni, chiudere ermeticamente i coperchi e posizionare ilNGT-3D camera di cultura in un bagno d'acqua C 88 ° per sciogliere l'agar. Il calore uccide i vermi, ma i loro corpi rimangono intatti.
NOTA: L'utilizzo 8 ml tubi per NGT-3D, 20 - 30 minuti di incubazione è di solito sufficiente. - Usando una pipetta di vetro, trasferire i mezzi fuso su un piatto di plastica 9 centimetri di Petri. pipette di plastica non sono invitati, come i vermi possono spesso bastone a loro.
- Utilizzando un microscopio stereoscopico dissezione trasmissione, contare il numero di vermi al L3, L4 e stadi adulti. Non contare i vermi che sono L2 fase e più giovani, come le generazioni F1 e F2 possono essere confusi qui. Così, questo test è un test relativo dimensione covata piuttosto che un dosaggio totale dimensioni covata.
5. Immagine e Record Worm Comportamento NGB-3D
- Scegli uno stadio verme L4 utilizzando un filo di platino raccogliere e rimuovere i batteri attaccati alla superficie trasferendo ad una piastra NGM senza batteri e permettendo di muoversi liberamente per alcuni minuti.
- Ripetere il passaggio 5.1 per assicurarsi che il worm è esente da batteri.
- posizionare accuratamente il verme pulito sul centro della superficie agar del NGB-3D vicino al collo della bottiglia con un pick filo di platino. Il worm dovrebbe finalmente entrare l'agar agar nella matrice 3D.
- Chiudere il coperchio senza bloccare consentendo una certa aria nel tubo, evitando l'asciugatura dei media agar.
- Immagine o registrare il verme sotto una dissezione stereo microscopio di trasmissione. Regolare la messa a fuoco come il verme si muove attraverso la matrice 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La costruzione di NGT-3D è un protocollo semplice e lineare che si traduce in una provetta agar-riempita con piccole colonie batteriche distanziati tutto il agar (Figura 1A). Worms possono muoversi liberamente attraverso la matrice agar, trovare e consumare le colonie batteriche. Per confermare se C. elegans possono riprodursi e di crescere normalmente in NGT-3D, abbiamo confrontato la fertilità e lo sviluppo larvale in 3D con piastre standard 2D NGM. Nel saggio dimensioni nidiata relativa, adulto C. elegans ermafroditi in NGT-3D riproducono bene come ermafroditi nelle piastre standard 2D NGM quando colonie batteriche sono abbondanti con almeno 60 colonie (Figura 1B). Inoltre, lo sviluppo larvale in NGT-3D procede anche normalmente quando ci sono un sacco di colonie batteriche con la maggioranza dei vermi nello stato adulto dopo 96 ore (Figura 1C). Tuttavia, se le colonie batteriche sono scarsinella matrice 3D, sia per la dimensione relativa covata (Figura 1B, barra a sinistra) e lo sviluppo larvale (Figura 1C, barra di sinistra) sono negativamente influenzati.
Per verificare se l'abitazione in 3D ha alcun effetto sulla fisiologia a lungo termine del worm, abbiamo condotto un test di durata a confronto piatti NGT-3D e NGM. La vita media per i vermi su NGT-3D è stato di 15,6 ± 3,6 giorni, rispetto a 14,8 ± 3,1 giorni per piastre standard NGM. Le curve di durata della vita per i vermi che vivono sul NGT-3D e NGM erano quasi identici. Quindi, sembra che i vermi sopravvivere ugualmente bene in condizioni 3D e 2D.
Fabbricazione Il NGB-3D non è anche difficile e dovrebbe tradursi in un chiaro, bottiglia cultura agar-riempita come quello visto nella figura 2A. Per visualizzare facilmente le colonie batteriche, abbiamo espresso deoxyviolacein, un viola scuro metabolita batterica 11, nella OP50ceppo di E. coli (figure 2A, 2B; ceppo a richiesta). Vermi vivi possono essere esposte in una trasmissione stereo microscopio-dissezione (Figura 2B, supplementare Film 1).
Stoccaggio di NGT-3D e NGB-3D a temperatura ambiente è sufficiente a mantenere entrambe le camere di coltura per un massimo di 1 mese. Essiccazione del agar non è una preoccupazione sia per NGT-3D o NGB-3D se viene applicato un plug-tipo o tappo a vite che si inserisce il tubo o bottiglia.
Figura 1: Sviluppo, la fertilità e la durata della vita di C. elegans coltivate in NGT-3D è paragonabile a quella della NGM standard di 2D. (A) Immagini di NGT-3D in diverse diluizioni di batteri. a sinistra econtiene proprio una diluizione 5 x 10 -7, e la metà è una diluizione 1 x 10 -7. (B) Dimensione relativa nidiata di wild-type vermi in NGT-3D a meno di 60 colonie OP50 (n = 24), maggiore o uguale a 60 colonie (n = 14), o su piastre 2D NGM (n = 29). Le barre di errore indicano l'errore standard. (C) Percentuale di vermi F1 generazione in L3, L4 o adulto stadio di sviluppo in NGT-3D con meno di 60 colonie OP50, maggiori o uguali a 60 colonie, o su piastre NGM 2D. Curva (D) Sopravvivenza di wild-type C. elegans in piastre NGT-3D o NGM. NS non indica significativamente diversa calcolato log-rank test. Questa cifra è stata modificata da Lee 9. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging C. elegans in 3D utilizzando NGB-3D. (A, B) Immagini di NGB-3D; (C) Immagini di adulti C. elegans vicino a una colonia di ceppo OP50 E. coli che esprimono la viola pigmento deoxyviolacein scuro. barra della scala è di 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film supplementare 1: Adulto C. elegans si avvicinano un E. coli OP50-violacé in colonia NGB-3D. Clicca qui per scaricare il file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La coltivazione laboratorio di C. elegans utilizzando le piastre di terreni di crescita nematode classici è stato fondamentale per le centinaia di importanti scoperte che la ricerca in C. elegans ha fornito. Qui, vi presentiamo i nuovi metodi per coltivare C. elegans in un ambiente che rifletta più accuratamente i loro naturale habitat tridimensionali. Sebbene altri metodi sono stati usati per osservare C. elegans in 3D 13, questo è il primo protocollo che permette la coltivazione di vermi in una matrice solida 3D. I due metodi qui illustrati, NGT-3D e NGB-3D, permettono agli scienziati di porre domande di idoneità, lo sviluppo e la crescita in coltura 3D, e anche di immagini e registrare i vermi in 3D. Anche se NGT-3D e NGB-3D hanno alcune differenze con le piastre standard 2D NGM, essi sono simili a questo metodo originale e regolata solo per aggiungere la coltivazione a vite senza fine in asse z. Così, troviamo che lo sviluppo, la fertilità e la durata della vita procedono normalmente nelle nostre condizioni. Ilobiettivo era quello di creare un protocollo che ogni laboratorio può utilizzare per le loro ricerche. Questi metodi sono molto semplici, facilmente riproducibile ad un costo molto basso, e permettono la regolazione di protocolli per adattarsi esperimenti specifici degli utenti.
Anche se tutti i passaggi nel protocollo sono importanti, il passo fondamentale nel rendere NGT-3D e NGB-3D è la temperatura di raffreddamento del agar dopo la sterilizzazione in autoclave a passaggi 3.4 a 3.6 del protocollo. Se la temperatura si raffredda troppo basse (parecchi gradi al di sotto di 40 ° C), l'agar inizierà a indurirsi e le soluzioni aggiunti non si mescolerà correttamente nel agar. Tuttavia, se il raffreddamento è insufficiente (parecchi gradi superiori a 40 ° C), i batteri aggiunti possono morire e la soluzione colesterolo aggiunto possono offuscare l'agar agar rendendo l'inutile per gli esperimenti. Inoltre, un'area di cautela al passo 4.6. Durante la fusione l'agar NGT-3D nel bagno d'acqua, assicurarsi di chiudere i coperchi strettamente per aiutare nella fusione. Tuttavia, il calore può causaretappi per pericolosamente "pop" off e diventare un proiettile. Per motivi di sicurezza è preferibile coprire il bagno d'acqua. Molte parti del protocollo sono abbastanza adattabili all'utente. Per esempio, abbiamo utilizzato una chiara provetta di plastica per NGT-3D e 25 cm 2 chiaro bottiglia coltura cellulare (detiene un totale di 65 ml) per il NGB-3D. Altri tipi di tubi trasparenti o bottiglie disponibili per l'utente dovrebbe anche funzionare. Inoltre, la crescita batterica è regolabile. Ceppo di E. coli OP50 richiede generalmente circa una settimana a crescere fino a almeno 1 mm, che è stato preferito per i nostri esperimenti. Nella nostra esperienza, un po 'più corti e anche molto più lunghi tempi di crescita per i batteri non sembrano influenzare la crescita worm o la fertilità. Regolazione della concentrazione di agar, tuttavia, influenzerà il movimento senza fine. Concentrazioni inferiori di agar determinano vermi mostrano un movimento nuoto simile, e concentrazioni più elevate possono inibire movimento complessivo.
Un motivo di preoccupazione in NGB-3D è stato il problema di condensae l'accumulo di acqua. Come la calda agar liquido indurisce, inevitabilmente si forma della condensa nel tempo, soprattutto in corrispondenza dell'interfaccia della bottiglia e l'agar. Questo può comportare problemi per il verme, che mostra comportamenti nuoto in liquidi 14 e la crescita di batteri, che possono diffondere nel flacone dal liquido. Prevenzione della condensa è difficile. Esistono due possibili rimedi per questo. Innanzitutto, facciamo in modo che la vite senza fine può facilmente inserire l'agar ponendolo nel centro della superficie agar al collo della bottiglia. In secondo luogo, abbiamo volutamente mantenere la concentrazione di batteri basso in NGB-3D, diminuendo così la probabilità che una colonia cresce all'interfaccia di liquido e agar.
Un'altra preoccupazione è la formazione immagine di vermi in NGB-3D. Per aumentare la chiarezza e la qualità delle immagini di vermi in 3D, colonie dovrebbe essere vicino alla superficie, ma rimangono completamente incorporato nel agar. Abbiamo cercato di far crescere colonie incorporati solo vicino al surface ponendo un sottile strato di agar batteri contenenti la superficie, e la carta residua era priva di batteri. Tuttavia, il problema non è stato completamente risolto da questo metodo. Invece, abbiamo deciso di produrre molte bottiglie NGB-3D in una sola volta, e utilizzare solo quelli che contengono colonie vicino alla superficie incorporati, aumentando così la possibilità che un worm si sposterà a una colonia vicino alla superficie. Una possibilità che non abbiamo esplorato sta cambiando i media solidi a una matrice diversa da quella agar granulato impieghiamo qui. Imaging vermi nella direzione dell'asse Z può anche essere difficile. Facciamo questo alzando e abbassando la messa a fuoco grossolana manualmente, ma se un programma automatizzato di monitoraggio esiste per questo, può essere molto utile.
La speranza è che le tecniche qui presentate per la coltivazione di C. elegans in 3D saranno ampiamente utilizzati dai biologi nematodi. Molte domande rimangono circa la biologia verme, tra cui l'invecchiamento e comportamenti in 3D, e se ciò che gli scienziati osservano in2D è rilevante per il verme in 3D. In effetti, un precedente studio con NGT-3D ha mostrato l'impatto sul fitness riproduttiva che la coltivazione 3D ha avuto su un mutante sensoriale che riproduce normalmente in condizioni 2D 9. Inoltre, uno studio ha dimostrato comportamenti di movimento alterati in 3D rispetto al 2D 15. Infine, questo sistema può essere usato per iniziare a rispondere a domande se certe condizioni, mutanti o manipolazioni, vantaggi idoneità per l'animale nel suo ambiente nativo 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un nuovo investigatore di Grant [2014R1A1A1005553] dalla Fondazione Nazionale delle Ricerche di Corea (NRF) per JIL; e Università di Yonsei Future Leader sovvenzione sfida [2015-22-0133] per JIL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 224620 | |
| Sodium chloride | DAEJUNG | 7548-4400 | 58.44 MW |
| Agar, Granulated | Difco | 214530 | |
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Calcium chloride, dihydrate | Bio Basic | CD0050 | 2*H2O; 147.02 MW |
| Cholesterol | Bio Basic | CD0122 | 386.67 MW |
| Ethyl alcohol | B&J | RP090-1 | 99.99%; 46.07 MW |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Bio Basic | MN1988 | 120.37 MW |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous | Bio Basic | PB0445 | 136.09 MW |
| 2'-Deoxy-5-fluorouridine | Tokyo Chemical Industry | D2235 | 246.19 MW |
| Potassium phosphate, dibasic, anhydrous | Bio Basic | PB0447 | 174.18 MW |
| Multi-Purpose Test Tubes | Stockwell Scientific | ST.8570 | 8 ml |
| Test Tube Closures | Stockwell Scientific | ST.8575 | |
| Cell Culture Flask | SPL Lifescience | 70125 | 25 cm2 |
| Research Stereo Microscope | Nikon | SMZ18 | |
| High-Definition Color Camera Head | Nikon | DS-Fi2 | |
| PC-Based Control Unit | Nikon | DS-U3 | |
| NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software | Nikon | MQS32000 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
- Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
- Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
- Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
- Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056 (2015).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
- Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564 (2015).
