Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

dyrking av Published: December 12, 2016 doi: 10.3791/55048
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Summary

Vi presenterer en enkel metode for å konstruere 3D-nematode dyrkingssystemer kalt NGT-3D og NGB-3D. Disse kan brukes til å studere nematode fitness og atferd i habitater som er mer lik naturlige Caenorhabditis elegans habitater enn standard 2D-laboratoriet C. elegans kulturplater.

Protocol

1. Forbered Løsninger for NGT-3D og NGB-3D

  1. Fremstille de følgende sterile løsninger: 1 l 0,1454 M NaCl-oppløsning, 1 liter 1 M CaCl2, 1 liter 1 M MgSO4, lysogeni-buljong (LB), 1 liter 1 M KPO 4 buffer (108,3 g KH 2 PO 4 og 35,6 g K 2 HPO 4, og fylle H 2 O til en L). Produksjon av NGM hjelp av disse løsningene kan bli funnet i en tidligere protokoll 10.
  2. Autoclave løsninger ved 121 ° C, 15 min.
  3. Fremstille 50 ml av en steril 5 mg / ml kolesterol oppløsning. I et 50 ml konisk rør, bland 0,25 g kolesterol og 50 ml 99,99% etanol og bland godt. Ikke autoklaver. Steriliser kolesterol løsning ved hjelp av en 50 ml sprøyte med en 0,45 um sprøytefilter. Dette vil også fjerne uoppløst kolesterol.
  4. (Valgfritt) Forbered 10 ml av en 150 mM av 2'-deoksy-5-fluorouridin (FUdR) lager. I en 15 ml konisk rør, bland 0,3693 gav FUdR og 10 ml destillert vann. Riste godt.

2. Forbered bakteriekultur for NGT-3D og NGB-3D

  1. Vaksinere 10 ml LB buljong med bakterier. Standard bakterier som brukes for C. elegans fôring er E. coli-stamme OP50.
  2. Kultur bakterie inokulering ved 37 ° C i en risteinkubator over natten.
  3. I forberedelse for en seriefortynning, alikvoter 9 ml NaCl-oppløsning inn i sterile 15 ml koniske rør. For eksempel, for å alikvoter 9 ml i et totalt 7 rør lage en 10 -7 fortynning av OP50 stammen E. coli.
  4. Ved hjelp av en steril 1000 ul pipette, pipette 1 ml av bakteriekultur eller fortynnet bakteriekultur til det sterile nytt rør med 9 ml NaCl-oppløsning og vortex 10 ml blandingen godt. Gjenta til ønsket bakteriell fortynning er nådd.
    MERK: Den ønskede bakterie fortynning avhenger av type og tilstand av bakterier samt nøyaktig eksperimentelle forhold.For eksempel, en 10 -6 - 10 -8 fortynning av OP50 stammen E. coli var tilstrekkelig til å gi fra 1 - 200 bakteriekolonier pr 6,5 ml NGT-3D-rør. Worms pålitelig utviklet og reproduseres normalt når antall kolonier var over 60, som skjedde ved en fortynning på 10 -6 til 10 -7. For NGB-3D, bruk en utvanning av 10 -8.

3. Å gjøre NGT-3D og NGB-3D (200 ml)

  1. Etter fremstilling av bakteriekultur, bland 0,6 g NaCl, 1 g granulert agar, og 0,5 g pepton i en 500 ml kolbe. Sett inn en magnetisk oppsikt bar i flasken.
  2. Legg 195 ml destillert vann og dekker munningen av kolben med aluminiumsfolie.
  3. Autoklaven 121 ° C i 15 min.
  4. Plasser den varme autoklaveres kolben på en røreplate, og rør til en moderat hastighet i minst 2 timer. Avkjøl kolben til 40 ° C. Pass på å kjøle tilstrekkelig som fortsetter herfra ved høye temperaturer kan føre til uklarhet på det ferdige agar.Imidlertid kan lavere temperaturer fører til for tidlig herding av agar.
    1. (Valgfritt) Hvis du fremskynde kjøleprosessen, plasser kolbe i en 40 ° C vannbad 15 minutter før du legger på et rør plate.
  5. Når temperaturen i agarmediet når 40 ° C tilsettes 200 pl 1 M CaCl2, 200 ul av 5 mg / ml kolesterol-løsning, 200 pl 1 M MgSO4 og 5 ml 1 M KPO 4 buffer som løsningen fortsetter å røre til sluttkonsentrasjoner på 1 mM CaCl2, 5 ug / ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM KPO 4.
    1. (Valgfritt) For NGT-3D levetid analysen legge 80 mL 150 mM FUdR til en endelig konsentrasjon på 120 mikrometer 12.
  6. Tilsett 6 ml av 10 ml fortynnet bakteriekultur fra trinn 2,4 i kolben direkte.
    1. (Valgfritt) For NGT-3D, fjerne 6 ml agar media før trinn 3,6 og holde den varm for seg. Dette mediet skal brukes for bakterier-freeøverste lag.
  7. Ved hjelp av sterile prosedyrer, dispensere medier i en steril kultur kammer. Kontroller at dekselet av kammeret lukkes tett.
    1. (Valgfritt) For å hindre bakteriekolonier fra forming på toppen overflaten av agar, lage et lag av bakterier-free agar media fra trinn 3.6.1 på toppen før media fra trinn 3.7 helt stivner. Dette vil skape en bakterie-fri sone på toppen av NGT-3D.
    2. For NGT-3D, hell 6,5 ml media til de 8 ml klar plast prøverør for å gjøre en bakterier agar lag, og nøye dispensere 200 ul av bakteriefrie media på toppen av de semi-herdet 3D media å lage en tynn bakterie- gratis lag på toppen.
    3. For NGB-3D, hell 65 ml av media, og i 25 cm 2 klar plast cellekultur flaske. Denne mengde skal fylle kroppen på 25 cm2 cellekulturflaske.
  8. La kamrene vertikalt ved værelsetemperatur i en uke for å tillate bakterielle kolonier å voksetil en tilstrekkelig størrelse til en diameter på minst 1 mm.
    1. (Valgfritt) For levetid analysen i NGT-3D, for å dekke kamre med aluminiumsfolie hindre lys degradering av FUdR.

4. Mål Trenings av Worm Befolkning på NGT-3D (Relative Brood Size analyse)

  1. Plukk en L4 scenen ormen bruker en platinatråd velge og overføring på et bakteriefritt NGM plate. Tillat ormen å fritt bevege seg rundt i noen minutter for å fjerne bakterier festet til kroppen sin.
  2. Gjenta trinn 4,1 og sørg for at ormen er fri for bakterier. Vanligvis to ganger i 4.1 er nok.
  3. Plasser forsiktig ren ormen på overflaten av 3D media med en platinatråd hakke. Ormen bør etter hvert gå inn i agar inn i 3D-agar matrise.
  4. Lukk dekselet løst slik at litt luft å komme inn i røret, men hindrer uttørking av agar media.
  5. Inkuber i 96 timer ved 20 ° C.
  6. Etter 4 dager, lukke lokkene tett og plasserNGT-3D kultur kammer inn i et 88 ° C vannbad for å smelte agar. Varmen dreper ormer, men kroppene deres forblir intakte.
    MERK: Ved hjelp av 8 ml rør for NGT-3D, 20 - er vanligvis tilstrekkelig 30 min inkubasjon.
  7. Ved hjelp av en glass pipette, overføre smeltet media på en 9 cm plast petriskål. Plastpipetter er ikke anbefales, som ormer kan ofte holde seg til dem.
  8. Ved hjelp av en overføring stereo dissekere mikroskop, telle antall ormer på L3, L4 og voksne stadier. Ikke telle ormer som er L2 scenen og yngre, som F1 og F2 generasjoner kan bli forvirret her. Således er denne analysen en relativ kullstørrelse bestemmelse heller enn en total kullstørrelse-analyse.

5. Bilde og Record Worm Opptreden på NGB-3D

  1. Plukk en L4 scenen ormen bruker en platinatråd velge og fjerne eventuelle bakterier fast til overflaten ved å overføre til en bakteriefritt NGM plate og la det fritt bevege seg for et par min.
  2. Gjenta trinn 5.1 for å sikre at worm er fri for bakterier.
  3. Plasser forsiktig ren orm på midten av agar overflaten av NGB-3D nær halsen av flasken med en platinatråd hakke. Ormen bør etter hvert gå inn i agar inn i 3D-agar matrise.
  4. Lukk dekselet løst slik at litt luft å komme inn i røret, samtidig som det hindrer uttørking av agar media.
  5. Bilde eller ta ormen under en overføring stereo dissekere mikroskop. Juster fokus som ormen beveger seg gjennom 3D-matrise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konstruksjonen av NGT-3D er en enkel og grei protokoll som fører til en agar-fylt reagensrør med små bakteriekolonier avstand fra hverandre over hele agar (figur 1A). Worms kan fritt bevege seg gjennom agar matrise, finne og forbruker bakteriekolonier. For å bekrefte om C. elegans kan reprodusere og vokse normalt i NGT-3D, sammenlignet vi fruktbarhet og larveutvikling i 3D med standard 2D NGM plater. I den relative kullstørrelse assay elegans voksen C. hermaphrodites i NGT-3D reprodusere like godt som hermaphrodites i standard 2D NGM plater når bakteriekolonier er rikelig med minst 60 kolonier (figur 1B). Videre larveutvikling i NGT-3D fortsetter også normalt når det er nok av bakteriekolonier med de fleste av ormer i voksen tilstand etter 96 timer (figur 1C). Men hvis bakteriekolonier er sparsomi 3D-matrise, er begge relativt kullstørrelse (figur 1B, venstre bar) og larveutvikling (figur 1C, venstre bar) negativt påvirket.

For å teste om bosetting i 3D har noen effekt på den langsiktige fysiologi av ormen, gjennomførte vi en levetid analyse som sammenligner NGT-3D og NGM plater. Gjennomsnittlig levetid for ormer på NGT-3D var 15,6 ± 3,6 dager sammenlignet med 14,8 ± 3,1 dager for standard NGM plater. Levetiden kurver for ormer lever på NGT-3D og NGM var nesten identiske. Dermed virker det som ormer overleve like godt i 3D og 2D forhold.

Produksjon av NGB-3D er heller ikke vanskelig og bør resultere i en klar, agar-fylt kultur flaske sånn sett i figur 2A. For å enkelt vise bakteriekolonier, har vi uttrykt deoxyviolacein, en mørk lilla bakteriell metabolitt 11, i OP50stamme E. coli (2A, 2B, belastning tilgjengelig på forespørsel). Levende ormer kan avbildes under en overføring stereo-dissekere mikroskop (figur 2B, Supplemental Movie 1).

Lagring av NGT-3D og NGB-3D ved værelsetemperatur er tilstrekkelig til å holde begge disse kulturkamre i opptil en måned. Uttørking av agar er ikke en bekymring for enten NGT-3D eller NGB-3D hvis en plug-type eller skrulokk som passer røret eller flasken er brukt.

Figur 1
Figur 1: Utvikling, fruktbarhet og levetid C. elegans dyrket i NGT-3D er sammenlignbar med den standard 2D NGM. (A) Bilder av NGT-3D på flere fortynninger av bakterier. venstre oghøyre inneholder en 5 x 10 -7 fortynning, og midten er en 1 x 10 -7 fortynning. (B) Relative kullstørrelse av vill-type ormer i NGT-3D til færre enn 60 OP50 kolonier (n = 24), er større eller lik 60 kolonier (n = 14), eller på 2D NGM plater (n = 29). Feilfelt indikere standard feil. (C) Prosent av F1 generasjon ormer i L3, L4 eller voksen utviklingsstadiet i NGT-3D med færre enn 60 OP50 kolonier, større enn eller lik 60 kolonier, eller om 2D NGM plater. (D) Overlevelse kurve av vill-type C. elegans i NGT-3D eller NGM platene. NS indikerer ikke signifikant forskjellig beregnes ved log-rank test. Dette tallet har blitt forandret fra Lee 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 Figur 2: Imaging C. elegans i 3D ved hjelp av NGB-3D. (A, B) Bilder av NGB-3D; (C) Bilder av voksne C. elegans nærheten en koloni av OP50 stamme E. coli som uttrykker mørk lilla pigment deoxyviolacein. Scale bar er 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Supplerende Movie 1: Voksen C. elegans nærme en E. coli OP50-violace i koloni i NGB-3D. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Laboratoriet dyrking av C. elegans med de klassiske nematode vekstmedie platene var avgjørende for de hundrevis av viktige funn som Research In C. elegans har gitt. Her presenterer vi nye metoder for å dyrke C. elegans i et miljø som mer nøyaktig gjenspeiler deres naturlige tredimensjonale habitater. Selv om andre metoder har vært brukt for å observere C. elegans i 3D 13, er dette den første protokoll som tillater dyrking av ormer i en fast 3D-matriks. De to metodene som er vist her, NGT-3D og NGB-3D, tillate forskere å stille spørsmål til fitness, utvikling og vekst i 3D-dyrking, og også bilde og registrere ormer i 3D. Selv om NGT-3D og NGB-3D har noen forskjeller til de vanlige 2D NGM plater, de ligner på denne opprinnelige metoden og bare justert for å legge til ormen dyrking i z-aksen. Derfor finner vi at utviklingen, fruktbarhet og levetid fortsette som normalt i vårt forhold. DeMålet var å lage en protokoll som helst lab kan bruke for sin forskning. Disse fremgangsmåter er meget enkel, lett reproduserbar ved en meget lav kostnad, og tillater justering av protokoller for å passe til brukerens spesifikke eksperimenter.

Selv om alle trinnene i protokollen er viktig, er det avgjørende skritt i å gjøre NGT-3D og NGB-3D kjøletemperatur på agar etter autoklave i trinn 3.4 til 3.6 av protokollen. Hvis temperaturen kjøler for lav (noen grader under 40 ° C), vil agar begynner å herde og de tilsatte løsninger vil ikke blandes skikkelig inn i agaren. Men hvis kjølingen er utilstrekkelig (flere grader over 40 ° C), kan de tilsatte bakterier dør og det tilsatt kolesterol oppløsningen kan sky agar hvilket gjør agar ubrukelig for eksperimenter. I tillegg er et område av forsiktighet i trinn 4.6. Når smelter NGT-3D agar i vannbadet, må du lukke lokkene tett til hjelp i smelte. Imidlertid kan varme forårsakecaps til farlig "pop" av og bli et prosjektil. For sikkerhets skyld er det best å dekke vannbad. Mange deler av protokollen er ganske tilpasses brukeren. For eksempel har vi brukt en klar plast prøverør for NGT-3D og en 25 cm 2 klart cellekultur flaske (rommer totalt 65 ml) for NGB-3D. Andre typer klare rør eller flasker tilgjengelig for brukeren bør også fungere. Dessuten er bakterievekst justerbar. E. coli-stamme OP50 vanligvis tar omtrent en uke for å vokse til minst 1 mm, som ble foretrukket for våre eksperimenter. I vår erfaring, litt kortere og enda mye lengre vekst ganger for bakterier ikke ut til å påvirke orm vekst eller fruktbarhet. Justering av agar-konsentrasjon, vil imidlertid påvirke orm bevegelse. Lavere konsentrasjoner av agar resultere i ormer som viser et svømme-lignende bevegelse, og høyere konsentrasjoner kan hemme samlet bevegelse.

Et område av bekymring i NGB-3D var spørsmålet om kondensog vannansamling. Ettersom den varme væske agar stivner, uunngåelig noe kondensasjon utvikler seg over tid, spesielt ved grenseflaten mellom flasken og agar. Dette kan skape problemer for ormen, som viser svømme atferd i væsker 14 og veksten av bakterier, som kan spre seg over hele flasken med væske. Forebygging av kondens er vanskelig. To mulige løsninger finnes for dette. Først må vi sørge for at ormen kan lett gå inn i agar ved å plassere den i midten av agaroverflaten i halsen av flasken. For det andre, vi forsettlig holde konsentrasjonen av bakterier i lav NGB-3D, for derved å minske sjansen for at en koloni dyrkes ved grenseflaten mellom væske og agar.

En annen bekymring er avbildning av ormer i NGB-3D. For å øke klarheten og kvaliteten av bilder av ormer i 3D, bør kolonier være tett opp til overflaten, men forblir fullstendig innleiret i agaren. Vi forsøkte å vokse bare innebygde kolonier nær Surface ved å anbringe et tynt lag av bakterieholdig agar ved overflaten, og de resterende media var bakteriefrie. Men problemet ble ikke fullstendig løst ved denne metoden. I stedet bestemte vi oss for å produsere mange NGB-3D-flasker på en gang, og bruker bare de som inneholder innebygde kolonier nær overflaten, og dermed øke sjansen for at en orm vil flytte til en koloni nær overflaten. Ett alternativ har vi ikke utforsket endrer de faste medier til en annen enn den granulerte agar vi bruker her matrise. Imaging ormer i z-akseretningen kan også være utfordrende. Vi gjør dette ved å manuelt heve og senke den grove fokus, men hvis en automatisert sporing program som finnes for dette, kan det være ganske nyttig.

Håpet er at de teknikkene som presenteres her for dyrking av C. elegans i 3D vil bli mye brukt av nematode biologer. Mange spørsmål gjenstår om ormen biologi, inkludert aldring og atferd i 3D, og ​​om hva forskerne observere i2D er relevant for ormen i 3D. Faktisk, en tidligere studie med NGT-3D viste effekt på reproduktive fitness som 3D dyrking hadde på en sensorisk mutant som reproduserer vanligvis i 2D forhold 9. I tillegg viste en studie endrede bevegelsesatferd i 3D i forhold til 2D 15. Endelig kan dette systemet brukes til å begynne å svare på spørsmål om hvorvidt visse betingelser, mutanter eller manipulasjoner konferere fitness fordeler til dyret i det opprinnelige 3D-miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en New Investigator Grant [2014R1A1A1005553] fra National Research Foundation of Korea (NRF) til JIL; og Yonsei-universitetet Future Leader Challenge Grant [2015-22-0133] til JIL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 224620
Sodium chloride DAEJUNG 7548-4400 58.44 MW
Agar, Granulated Difco 214530
Peptone Bacto 211677
Calcium chloride, dihydrate Bio Basic CD0050 2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol Bio Basic CD0122 386.67 MW
Ethyl alcohol B&J RP090-1 99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous Bio Basic MN1988 120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous Bio Basic PB0445 136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine Tokyo Chemical Industry D2235 246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous Bio Basic PB0447 174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes Stockwell Scientific ST.8570 8 ml
Test Tube Closures Stockwell Scientific ST.8575
Cell Culture Flask SPL Lifescience 70125 25 cm2
Research Stereo Microscope Nikon SMZ18
High-Definition Color Camera Head Nikon DS-Fi2
PC-Based Control Unit Nikon DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software Nikon MQS32000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056 (2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484 (2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564 (2015).

Tags

Grunnleggende Protokoller , Nematode reproduktiv helse 3D tre dimensjoner atferd nematode dyrking
dyrking av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensjoner i laboratoriet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I.… More

Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I. Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory. J. Vis. Exp. (118), e55048, doi:10.3791/55048 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter