Abstract
على الرغم من وجود تعميم الحمض النووي خالية من الخلايا في البلازما أو مصل وقد تبين على نطاق واسع أن تكون مصدر مناسب من المؤشرات الحيوية لأنواع عديدة من السرطان، وركزت بعض الدراسات على إمكانية استخدام (UCF) الحمض النووي البول خالية من الخلايا. بدءا من الفرضيات أن الخلايا أفكارك العادية تنتج الحمض النووي مجزأة للغاية وأن الخلايا السرطانية الإفراج أطول الحمض النووي، والدور المحتمل للUCF سلامة الحمض النووي تم تقييم باعتباره علامة التشخيص المبكر قادرة على التمييز بين المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا أو المثانة والأفراد الأصحاء.
ويقترح تحليل سلامة UCF الحمض النووي على أساس أربعة تقارير إنجاز المشروعات في الوقت الحقيقي الكمية من أربعة سلاسل أطول من 250 سنة مضت: ج-MYC، BCAS1، HER2، وAR. وقد تم اختيار تسلسل أن يكون في كثير من الأحيان زيادة عدد نسخ الحمض النووي في المثانة وسرطان البروستاتا لتحليل، ولكن الأسلوب هو مرن، ويمكن أن تكون بديلا هذه الجينات مع جينات أخرى من الأسواق العالمية ضغطهاراحة. وقد تم بالفعل أظهرت إمكانية الاستفادة من UCF الحمض النووي كمصدر من المؤشرات الحيوية للالأورام الخبيثة المسالك البولية، مما يمهد الطريق لمزيد من الدراسات حول توصيف UCF الحمض النووي. وUCF اختبار سلامة الحمض النووي لديها ميزة كونها غير الغازية، سريعة، وسهلة لأداء، مع عدد قليل فقط ملليلتر من البول اللازمة لإجراء التحليل.
Introduction
يمكن الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في الدم والبول نتيجة لموت الخلايا عن طريق آليات أفكارك أو الميتة. الحمض النووي خالية من الخلايا في الدم وقد درس على نطاق واسع لأغراض التشخيص والنذير في مختلف الأمراض، خاصة سرطان 1. ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن دور (UCF) الحمض النووي البولية خالية من الخلايا. UCF الحمض النووي قد تنشأ من مرور الدم من خلال نظام الترشيح الكبيبي أو من الخلايا التي تأتي مباشرة في اتصال مع هذه السوائل في الجسم 2 (على سبيل المثال، خلايا الظهارة البولية أو خلايا البروستاتا). بصورة رئيسية تم التحقيق في استخدام UCF الحمض النووي كمصدر من المؤشرات الحيوية للتشخيص المبكر للالكلى والمثانة، وسرطان البروستاتا ويرجع ذلك إلى نسبة عالية من الحمض النووي UCF القادمة مباشرة من خلايا المسالك البولية 3،4.
لا يعرف الكثير عن UCF الحمض النووي وأفضل الطرق لعزل وتوصيف ذلك. وبالنظر إلى فرضية أن الخلايا السرطانية تطلق شظايا الحمض النووي أطول من الخلايا الطبيعية، وتقييمالنزاهة الحمض النووي خالية من الخلايا وقد درس في محاولة لإلقاء الضوء على أصل الحمض النووي في الدورة الدموية 5. وقد أظهرت بعض الدراسات أن خالية من الخلايا سلامة الحمض النووي في الدم تمثل اختبارا جيدا لأنواع عديدة من السرطان 6 التشخيص، وقد اقترحت نفس الفرضية فيما يتعلق البول 7-9.
وتصف هذه الورقة طريقة جديدة لتحليل سلامة UCF الحمض النووي مع التطبيق المحتمل لكشف المثانة وسرطان البروستاتا. على وجه الخصوص، وسلامة UCF الحمض النووي شظايا تم اختبار أطول من 250 نقطة أساس في 4 مناطق المعروف أن زيادة عدد نسخ الحمض النووي في الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطان البروستاتا وسرطان المثانة: ج-MYC (8q24.21)، HER2 (17q12.1 )، BCAS1 (20q13.2)، وAR (Xq12) 10-14. والجينات المسرطنة محددة، بدلا من تسلسل عشوائي المختار، لزيادة احتمال العثور عليهم في جزء خالية من الخلايا لمرضى السرطان. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه مرن ويمكن أيضا اختيار أن المناطق الأخرى على أساس نوع الورم وخصائصها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع بروتوكول للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث الإنسان IRST.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونحن عزل الحمض النووي من عينات البول لإجراء تحليل سلامة UCF الحمض النووي. واستخدمت Lncap والخلايا MRC خطوط لبناء المعايير. تم تنفيذ تقنيات مثل استخراج الحمض النووي، وتحديد الحمض النووي (معمل وفي الوقت الحقيقي PCR لجين السيطرة، STOX1)، والوقت الحقيقي PCR لالمسرطنة محددة (الشكل 1).
1. جمع البول ومعالجة
- الحصول على تنظيف الصيد صباح أول عينة البول في جاف، كوب نظيف، البلاستيك. جمع لا يقل عن 50 مل من عينة البول.
- الحفاظ على البول عند 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 ساعة وإرسالها إلى المختبر في نفس درجة الحرارة.
- خلط كل عينة عن طريق عكس ذلك مرتين فور وصوله في المختبر ونقل الى قسمين 50 مل أنابيب البولي بروبلين القاع المخروطية.
- أنابيب الطرد المركزيفي 850 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة.
- نقل بعناية 10 مل من الجزء العلوي من طاف البول إلى أنبوبين 5 مل، وترك ما لا يقل عن 2 مل من طاف فوق بيليه الخلية.
ملاحظة: نقل الجزء العلوي من طاف يقلل من خطر التلوث من الخلايا أو الحطام الخلوي. ليس هناك تحديد واضح بين الأجزاء العلوية والسفلية. - تجاهل بيليه وتجميد فورا طاف في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. عزل الحمض النووي من طاف البول وخطوط الخلية
ملاحظة: عزل الحمض النووي من خط الخلية (على سبيل المثال، Lncap لسرطان البروستاتا أو MRC للكشف عن سرطان المثانة) باستخدام طقم التجارية وباتباع إرشادات الشركة المصنعة. يجب أن يتم تنفيذ عزل الحمض النووي من طاف البول باستخدام بروتوكول تجاري أو تعديل على النحو التالي:
- ذوبان الجليد قسامة واحدة من طاف البول في درجة حرارة الغرفة. </ لى>
- دوامة وخلط عينة البول ونقل 1 مل من طاف البول إلى واضح أنبوب 5 مل. تجميد البول المتبقية في -80 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميكرولتر من بروتين ك مباشرة للعينة.
- إضافة 1 مل من العازلة AL إلى عينة وتخلط جيدا من قبل pipetting.
- إغلاق أنابيب واحتضان العينات عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- أثناء الحضانة، وإعداد عمود واحد لكل عينة وإعداد مخازن غسل، AW1 وAW2، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (إضافة المبلغ المشار إليه من الإيثانول بنسبة 100٪).
- جلب العينات إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة 1 مل من الايثانول المطلق. تماما مزيج من قبل pipetting.
- إضافة 650 ميكرولتر من خليط حصلت عليه في الخطوة 2.7 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي أنه في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال وضع عمود في أنبوب جمع جديدة ونظيفة. كرر الخطوات من 2.8 و 2.9 حتى تم استخدام كل من خليط العينة (5 مرات).
- إضافة 500 &# 181؛ L العازلة AW1 دون ترطيب حافة العمود. أجهزة الطرد المركزي أنه في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال واستبدالها أنبوب مجموعة جديدة ونظيفة.
- إضافة 500 ميكرولتر من AW2 عازلة بدون ترطيب حافة العمود. أجهزة الطرد المركزي لذلك بأقصى سرعة (20000 x ج) لمدة 3 دقائق.
- تجاهل الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال واستبدالها أنبوب مجموعة جديدة ونظيفة.
- كرر الخطوة 2.12 لإزالة أي غسل العازلة المتبقية.
- وضع عمود في أنبوب 1.5 مل نظيف. إضافة 50 ميكرولتر من شطف العازلة AE وانتظر 7 دقائق للتأكد من أن يبلل عازلة العمود.
- أجهزة الطرد المركزي أنه في 8000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- ماصة شاطف من الخطوة 2.15 في العمود صغيرة وأجهزة الطرد المركزي أنه في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لضمان أقصى قدر من الانتعاش من الحمض النووي.
3. الحمض النووي الكمي والتخفيف
- باستخدام مقياس الطيف الضوئي، أداء الكمي من الحمض النووي من بوتح خط الخلية وعينات البول طاف. استخدام 2 ميكرولتر من العينة على مقعد بين كبار طيف، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تمييع عينات UCF الحمض النووي للحصول على تركيز من 1 نانوغرام / ميكرولتر وتخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية حتى تحليل سلامة الحمض النووي.
ملاحظة: إذا كانت كمية الحمض النووي ليست كافية للمضي قدما في الوقت الحقيقي PCR (لا يقل عن 100 نانوغرام)، نفذ عملية عزل الحمض النووي الجديدة. - تمييع DNA من عينات خط الخلية للحصول على ستة معايير بتراكيز مختلفة: 0.001، 0.01، 0.1، 1، 0.5، و 2 نانوغرام / ميكرولتر، لكل منها حجم 100 ميكرولتر (ST1، ST2، ST3، ST4، ST5، و ST6). تخزين معايير الحمض النووي خط خلية في -20 درجة مئوية حتى تحليل سلامة الحمض النووي.
4. DNA النزاهة إختبار - PCR
- ذوبان الجليد الاشعال (تركيز يعتمد على نوع الفحص)، SUPERMIX الأخضر، والمعايير الحمض النووي خط الخلية، وعينات من الحمض النووي UCF المخفف على الجليد.
- إعداد أنابيب الشريط في لوحة وأو القرص الدوار 72-جيدا. قسامة 10 ميكرولتر من نسختين لكل معيار وعينة المخفف و 10 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه للسيطرة سلبية.
- إعداد مزيج من 1 ميكرولتر من كل التمهيدي (يشار إلى التركيزات في الجدول 1)، 12.5 ميكرولتر من SUPERMIX الأخضر، و 6.5 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه لكل عينة. عند إعداد هذا المزيج، واستخدام الرقم التالي من العينات: 6 معايير ل2 مكررات، وعدد من العينات لمدة 2 مكررات، سيطرة سلبية لمدة 2 مكررات، و 2 عينات اضافية.
- قسامة 15 ميكرولتر من المزيج في كل بئر. لا ماصة أو تدور الأنابيب.
- بدء تشغيل بروتوكول مع الظروف PCR هو مبين في الجدول رقم 1.
ملاحظة: للحصول على قيمة UCF الحمض النووي، تم تجهيز 29 عينات من الحمض النووي لكل تجربة في الوقت الحقيقي باستخدام 72-جيدا الدوار القرص: 29 × 2 عينات + 6 × 2 معايير + السلبية السيطرة × 2 = 72 (القيمة UCF DNA).
ملاحظة: بروتوكول لتحليل سلامة UCF الحمض النووي يمكن أن يكون أيضاتتم باستخدام PCR الوقت الحقيقي أداة أخرى (عند استخدام جهاز آخر، قد تحتاج إلى إضافة ROX صبغة).
5. الحمض النووي النزاهة إختبار - تحليل وتفسير البيانات
ملاحظة: قيمة UCF الحمض النووي لكل عينة تم الحصول عليها من قبل في الوقت الحقيقي برامج النظام أداة الكشف باستخدام بناء المنحنى القياسي لكل تقييم الجينات PCR الفردية واستخدام الاستيفاء منحنى قياسي، كما هو موضح سابقا 7-9 (الشكل 2).
- تقييم مكررات. يعيد عينة مع الفرق ≥1 يجب التخلص منها ط م وإعادة تقييمها في التجربة الثانية.
- حساب متوسط ط م لكل عينة والنظر في العينات مع قيمة ط م ≤ 36.
- تقييم خصوصية المنتجات PCR باستخدام التحليل ذوبان.
- تقييم تركيز كل amplicon قبل الاستيفاء مع المنحنى القياسي. الحصول على قيمة تركيز (نانوغرام / ميكرولتر) لكل amplicon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان مجموع تركيز الحمض النووي مجانية للقياس بواسطة القياس الطيفي لجميع العينات التي تم تحليلها، مما يدل على مدى يتراوح بين 1.51 و 138 نانوغرام / ميكرولتر. استخدمت خمس عينات الرقابة على استنساخ البيانات: تم إجراء تجربتين في الوقت الحقيقي مستقلة لج-MYC، HER2، BCAS1، AR، وSTOX1. ثم تم حساب معاملات الاختلاف (CV) لكل جينة (الجدول 2)، مع وجود درجة جيدة من التكاثر بين اثنين من تجارب مستقلة (الجدول 2).
تم تحليل تسلسل STOX1 125-BP لاستبعاد وجود مثبطات PCR. إذا أظهرت العينات من التضخيم STOX1، تم إجراء اختبار سلامة UCF الحمض النووي. وعدم وجود تضخيم يعني أن كمية الحمض النووي لم تكن كافية لإجراء اختبار سلامة UCF الحمض النووي، مما يدل على الحاجة إلى تكرار رانه التحليل مع مجموعة البول الجديد. كما أن هناك القليل من المعلومات المتاحة عن التضخيم أو حذف STOX1 في المثانة وسرطان البروستاتا، وهذا الجين يمكن أن تستخدم سلسلة التحكم لهذه الأنواع السرطانية. وأخيرا، تم إجراء تقييم سلامة UCF الحمض النووي عن طريق جمع القيم التي تم الحصول عليها عن الجينات المسرطنة الثلاثة (الشكل 3).
وقد اقترح استخدام مجموع الجينات ج-MYC، HER2، وBCAS1 للكشف عن سرطان المثانة 9، في حين تم اقتراح ج-MYC، AR، وHER2 لسرطان البروستاتا 7،8. أفضل القيم قطع المحددة للالمثانة والكشف عن سرطان البروستاتا هي 0.1 نانوغرام / ميكرولتر و 0.04 نانوغرام / ميكرولتر، على التوالي. باستخدام هذه القيم قطع، والحصول على حساسية 73٪ وخصوصية 84٪ في الكشف عن سرطان المثانة مقابل الأفراد أعراض، بينما حساسية 58٪ و 44٪ محددةوقد لوحظت إيتي في الكشف عن سرطان البروستاتا مقابل المرضى الذين يعانون من حميدة أمراض الجهاز البولي التناسلي 7-9. وفي الختام، واختبار سلامة UCF الحمض النووي هو مرن، لذلك يمكن أن تكون بديلا الجينات المستخدمة في هذه الدراسة مع تسلسل طويلة الأخرى ذات الاهتمام، وهذا يتوقف على المرض.
الشكل 1. البول خالية من خلية الحمض النووي النزاهة سير العمل والجدول الزمني. وينقسم العمل في طريقة إلى خطوات وأوقات مختلفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تقرير لتحليل Amplicon ج-MYC. مثال على تحليل ذوبان، مؤامرة التضخيمويقال المنحنى القياسي لتقييم ج-MYC. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. UCF الحمض النووي النزاهة تحليل سير العمل. وذكر سير عمل بسيط لتحليل سلامة الحمض النووي UCF. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| جينة | تسلسل المرجعية | إلى الأمام التمهيدي | عكس التمهيدي | طول Amplicon (بي بي) | بروتوكول الوقت الحقيقي |
| MYC (ج MYC) (V-Myc على الطيور ورام نقوي الفيروسية الجين الورمي Homolog، موضع 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 45 دورات في 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية، 56 درجة مئوية لمدة 40 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. |
| ERBB2 (HER2) (إرب-B2 مستقبلات التيروزين كيناز 2، موضع 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (سرطان الثدي أسهب تسلسل 1، موضع 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| AR (الاندروجين، موضع Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead Box1، موضع 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية تليها 45 دورات في 94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية و 54 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. |
الجدول 1. التمهيدي متواليات وشروط الفحص.
| عينة | HER2 | السيرة الذاتية (٪) | BCAS1 | السيرة الذاتية (٪) | ج -MYC | السيرة الذاتية (٪) | AR | السيرة الذاتية (٪) | STOX1 | السيرة الذاتية (٪) | |||||
| Repli-كيت 1 * | Repli-كيت 2 * | Repli-كيت 1 * | Repli-كيت 2 * | Repli-كيت 1 * | Repli-كيت 2 * | Repli-كيت 1 * | Repli-كيت 2 * | Repli-كيت 1 * | Repli-كيت 2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | 0.6 | 0.5 | 29.1 | 0.6 | 0. 8 | 4.5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.9 | 1.5 | 28.6 | 0.1 | 0.1 | 22.0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0.4 | 0.2 | 17.0 | 0.1 | 0.1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0.0 | NE | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | NE |
| 5 | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | NE | 0.0 | NE | 0.1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | NE |
الجدول 2. في الوقت الحقيقي PCR استنساخ لكل جين.
* ذكرت نتائج نانوغرام / ميكرولتر
السيرة الذاتية، معامل الاختلاف. NE، وليس للتقييم
| جينات UCF سلامة الحمض النووي | ديسسهولة | مرضى السرطان (ن) | ضوابط (ن) | قطع (نانوغرام / ميكرولتر) | معدل حساسية (95٪ CI) | معدل خصوصية (95٪ CI) | مرجع |
| MYC HER2 BCAS1 | سرطان المثانة | 52 | 46 الأفراد بأعراض 32 أشخاص أصحاء | 0.1 | 0.73 (0،61-0،85) | 0.83 (0،72-0،94) | Casadio الخامس وآخرون. 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | سرطان البروستات | 29 | 25 أشخاص أصحاء | 0.04 | 0.79 (0،62-0،90) | 0.84 (0،65-0،94) | Casadio الخامس وآخرون. 2013 8 |
| ج-MYC AR BCAS1 | سرطان البروستات | 67 | 64 المرضى الذين يعانون من أمراض حميدة في الجهاز البولي التناسلي | 0.04 | 0.58 (0،46-0،73) | 0.44 (0،30-0،58) | سالفي S وآخرون. 2015 7 |
الجدول 3. ملخص للنتائج التي يتم الحصول عليها في التشخيص المبكر لسرطان البروستاتا والمثانة السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UCF تحليل سلامة الحمض النووي هو أسلوب جديد، غير الغازية لتقييم سلامة الحمض النووي في البول. واقترح مؤخرا انها لتشخيص مبكر من المثانة (9) وسرطان البروستات 7،8. وتناقش عدد من مزايا وعيوب اختبار سلامة UCF الحمض النووي هنا، جنبا إلى جنب مع آفاق المستقبل.
والميزة الرئيسية لهذا النهج هو أنه يقدم، طريقة غير مكلفة غير الغازية وبروتوكول بسيط لدراسة البول كمصدر محتمل من المؤشرات الحيوية، الأمر الذي يتطلب فقط معرفة أساسية من تقنيات البيولوجيا الجزيئية. اختبار سريع على القيام بها، والنتائج، والمتاحة بعد أيام 2 العمل (الشكل 1)، ويمكن بسهولة أن تفسر بدون مساعدة من الطبيب. تتكون من عمليات عزل الحمض النووي الوحيد و 2 تقارير إنجاز المشروعات في الوقت الحقيقي، لديه النهج أيضا نسبة جيدة التكلفة والعائد. من حيث الدقة، UCF سلامة الحمض النووي لديها حساسية عالية (73٪) والنوعية (84٪) في الكشف عنسرطان المثانة في المرضى الذين يعانون من أعراض 9. وأخيرا، فإن هذه الطريقة مرنة، ويمكن بسهولة أن تكون بديلا الجينات المقترحة مع الجينات الأخرى ذات الاهتمام، طالما أنها أطول من 250 سنة مضت.
لديه اختبار أيضا عددا من القيود. أولا، الأسلوب الكمي الحمض النووي طيفية غالبا ما يكون غير دقيق ويمكن استبدالها، أكثر دقة، والنهج فلوروميتريك أخرى (على سبيل المثال، و qubit أو picogreen). نوعية الحمض النووي هو أيضا الفقراء بدلا من ذلك، كما يدل على ذلك في كثير من الأحيان منخفضة 260/280 و260/230 النسب. وعلاوة على ذلك، في واحدة من الدراسات لدينا، وقد لوحظ نوعية منخفضة جدا (44٪) في المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا مقابل المرضى الذين يعانون من أمراض حميدة في الجهاز البولي التناسلي 7، والذي كان على الأرجح نتيجة للخلايا الميتة التهابات حميدة الإفراج عن المزيد من الحمض النووي سليمة في الدورة الدموية. هذه مسألة خطيرة، لأن كلا من مرضى سرطان البروستاتا والمصابين بأمراض حميدة قد يكون عنصرا التهابات في ش بهمخلايا rinary. وهكذا، في إطار تشخيص المبكر لسرطان البروستاتا، والنتائج من تحليل سلامة UCF الحمض النووي يمكن أن يكون مضللا.
تم تقييم UCF سلامة الحمض النووي في 314 عينة البول من المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا أو سرطان المثانة، الأفراد الأصحاء وأعراض، والمرضى الذين يعانون من أمراض حميدة في الجهاز البولي التناسلي. وهناك حاجة إلى دراسة استطلاعية على سلسلة القضية أكبر لتحديد أفضل لدور هذا النهج باعتباره علامة للتشخيص المبكر لسرطان الجهاز البولي التناسلي.
وعلى الرغم من قلة ما تم نشره حول هذا الموضوع من الحمض النووي UCF كمصدر من المؤشرات الحيوية للسرطان، مصلحة في هذا المجال آخذ في الازدياد. في الآونة الأخيرة، Togneri وآخرون. 4 نشرت ورقة مثيرة للاهتمام التي الحمض النووي خالية من الخلايا المستخرجة من طاف البول من مرضى سرطان المثانة أظهرت وجود ورم عبء الجينوم أعلى من الحمض النووي الخلوي معزولة عن بيليه البول، مما يشير إلى أن دراسة جزء خالية من الخلايامن الحمض النووي في البول يمكن أن تكون مفيدة لوصف السرطان المسالك البولية.
في تجربتنا، فإن اختبار سلامة UCF الحمض النووي لا يثبت أنه جيد اختبارا مبكرا لتشخيص سرطان البروستاتا. على العكس من ذلك، أنها أظهرت إمكانية كعلامة للكشف المبكر عن سرطان المثانة عند استخدامها في تركيبة مع علم الخلايا البول التقليدية. ويجري حاليا التخطيط لدراسة تأكيدية على أكبر سلسلة من الحالات المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
