Abstract
हालांकि प्लाज्मा या सीरम में सेल मुक्त डीएनए घूम की उपस्थिति में व्यापक रूप से कैंसर के कई प्रकारों के लिए बायोमार्कर का एक उपयुक्त स्रोत होना दिखाया गया है, कुछ अध्ययनों मूत्र सेल मुक्त (UCF) डीएनए की क्षमता का उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है। परिकल्पना है कि सामान्य apoptotic कोशिकाओं उच्च खंडित डीएनए का उत्पादन और कहा कि कैंसर की कोशिकाओं से शुरू रिलीज अब डीएनए, UCF डीएनए अखंडता की संभावित भूमिका के लिए एक प्रारंभिक नैदानिक प्रोस्टेट या मूत्राशय के कैंसर और स्वस्थ व्यक्तियों के साथ मरीजों के बीच भेद करने में सक्षम मार्कर के रूप में मूल्यांकन किया गया था।
सी-MYC, BCAS1, HER2, और एआर: एक UCF डीएनए विश्लेषण अखंडता 250 बीपी की तुलना में अब चार दृश्यों के चार मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के आधार पर प्रस्तावित है। दृश्यों कि अक्सर मूत्राशय और प्रोस्टेट कैंसर में एक वृद्धि की डीएनए की नकल संख्या है विश्लेषण के लिए चुना गया था, लेकिन विधि लचीला है, और इन जीनों inte के अन्य जीन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता हैआराम। बायोमार्कर का एक स्रोत के रूप में UCF डीएनए के संभावित उपयोगिता पहले से ही urologic कैंसर के लिए प्रदर्शन किया गया है, इस प्रकार UCF डीएनए लक्षण वर्णन पर आगे की पढ़ाई के लिए रास्ता साफ हो गया। UCF डीएनए परीक्षण अखंडता गैर इनवेसिव, तेजी से, और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, मूत्र का केवल कुछ मिलीलीटर विश्लेषण बाहर ले जाने की जरूरत के साथ होने का फायदा है।
Introduction
सेल मुक्त डीएनए apoptotic या परिगलित तंत्र द्वारा रक्त और कोशिका मृत्यु के कारण मूत्र में पाया जा सकता है। रक्त में सेल मुक्त डीएनए व्यापक रूप से विभिन्न रोगों में नैदानिक और शकुन प्रयोजनों के लिए, विशेष रूप से कैंसर 1 के लिए अध्ययन किया गया है। हालांकि, कम मूत्र सेल मुक्त (UCF) डीएनए की भूमिका के बारे में जाना जाता है। UCF डीएनए glomerular छानने का काम प्रणाली के माध्यम से या कोशिकाओं है कि यह शरीर के तरल पदार्थ 2 (जैसे, urothelial कोशिकाओं या प्रोस्टेट कोशिकाओं) के साथ संपर्क में सीधे आने से खून गुजर से उत्पन्न हो सकता है। बायोमार्कर का एक स्रोत के रूप में UCF डीएनए का उपयोग मुख्य रूप से UCF डीएनए के उच्च प्रतिशत मूत्र पथ कोशिकाओं 3,4 से सीधे आने के कारण गुर्दे, मूत्राशय, और प्रोस्टेट कैंसर का जल्दी निदान के लिए जांच की गई है।
लिटिल UCF डीएनए और अलग-थलग करने और इसे निस्र्पक के लिए सर्वोत्तम तरीकों के बारे में जाना जाता है। परिकल्पना है कि ट्यूमर कोशिकाओं को सामान्य कोशिकाओं की तुलना में अब डीएनए टुकड़े रिलीज दिया, मूल्यांकनसेल मुक्त डीएनए अखंडता के रक्त परिसंचरण 5 में डीएनए की उत्पत्ति को स्पष्ट करने की कोशिश में अध्ययन किया गया है। कुछ अध्ययनों से दिखा दिया है कि सेल मुक्त खून में डीएनए अखंडता कैंसर 6 के कई प्रकार के लिए एक अच्छा नैदानिक परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है, और एक ही परिकल्पना मूत्र 7-9 के संबंध में प्रस्ताव किया गया है है।
इस पत्र मूत्राशय और प्रोस्टेट कैंसर का पता लगाने के लिए एक संभावित आवेदन के साथ UCF डीएनए अखंडता विश्लेषण के लिए एक नई विधि का वर्णन करता है। विशेष रूप से, UCF डीएनए की अखंडता टुकड़े अब 250 से बीपी 4 नाम से जाना जाता क्षेत्रों में परीक्षण किया गया था प्रोस्टेट और मूत्राशय के कैंसर सहित ठोस ट्यूमर, में एक वृद्धि की डीएनए की नकल संख्या है: सी-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), और एआर (Xq12) 10-14। विशिष्ट ओंकोजीन, बजाय यादृच्छिक दृश्यों, उन्हें कैंसर के रोगियों के सेल मुक्त अंश में पाने की संभावना बढ़ाने के लिए चुने गए हैं। का मुख्य लाभ में से एकइस विधि यह है कि यह लचीला है और कहा कि अन्य क्षेत्रों में भी ट्यूमर के प्रकार और विशेषताओं के आधार पर चुना जा सकता है।
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Protocol
प्रोटोकॉल IRST मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन करती है।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम डीएनए मूत्र के नमूने से एक UCF डीएनए अखंडता विश्लेषण करने के लिए अलग। Lncap और एमआरसी सेल लाइनों मानकों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया। इस तरह के डीएनए निष्कर्षण, डीएनए मात्रा का ठहराव (स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और वास्तविक समय पीसीआर नियंत्रण जीन के लिए, STOX1), और विशिष्ट ओंकोजीन के लिए वास्तविक समय पीसीआर के रूप में तकनीक (चित्रा 1) प्रदर्शन किया गया।
1. मूत्र संग्रह और प्रसंस्करण
- एक साफ, सूखे, प्लास्टिक के कप में एक साफ-पकड़ पहली सुबह मूत्र का नमूना प्राप्त करते हैं। मूत्र नमूने के लिए कम से कम 50 एमएल लीजिए।
- 3 घंटे की एक अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मूत्र बनाए रखें और प्रयोगशाला के लिए यह एक ही तापमान पर भेज सकते हैं।
- प्रयोगशाला और हस्तांतरण में आगमन पर दो बार इसे तुरंत inverting दो 50 एमएल शंक्वाकार तली polypropylene ट्यूबों में से प्रत्येक नमूना मिक्स।
- ट्यूबों अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 850 XG पर।
- ध्यान से दो 5 मिलीलीटर ट्यूब में मूत्र सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी भाग के 10 एमएल हस्तांतरण, सेल गोली ऊपर सतह पर तैरनेवाला के छोड़ने में कम से कम 2 एमएल।
नोट: सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी भाग स्थानांतरण कोशिकाओं या सेलुलर मलबे से संक्रमण के जोखिम को कम करता है। वहाँ ऊपरी और निचले हिस्सों के बीच कोई स्पष्ट चित्रण है। - गोली त्यागें और तुरंत उपयोग करें जब तक डिग्री सेल्सियस -80 पर तैरनेवाला फ्रीज।
2. मूत्र तैरनेवाला और सेल लाइनों से डीएनए अलगाव
ध्यान दें: एक सेल लाइन से डीएनए अलग (जैसे, प्रोस्टेट कैंसर या मूत्राशय के कैंसर के लिए एमआरसी के लिए Lncap) एक वाणिज्यिक किट का उपयोग और निर्माता के निर्देशों का पालन। मूत्र सतह पर तैरनेवाला से डीएनए के अलगाव, संशोधित रूप में इस प्रकार वाणिज्यिक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए:
- कमरे के तापमान पर मूत्र सतह पर तैरनेवाला के एक विभाज्य पिघलना। </ Li>
- भंवर और मूत्र का नमूना मिश्रण और एक स्पष्ट 5 मिलीलीटर ट्यूब में मूत्र सतह पर तैरनेवाला के 1 एमएल हस्तांतरण। -80 डिग्री सेल्सियस पर अवशिष्ट मूत्र रुक।
- proteinase कश्मीर के 100 μL सीधे नमूना करने के लिए जोड़ें।
- अल बफर के 1 एमएल नमूना में जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
- ट्यूब बंद करें और 15 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
- ऊष्मायन के दौरान, प्रत्येक नमूना के लिए एक स्तंभ तैयार करने और धोने buffers, AW1 और AW2, निर्माता के निर्देशों के अनुसार (100% इथेनॉल के संकेत राशि जोड़) तैयार करते हैं।
- नमूने वापस कमरे के तापमान को ले आओ और पूर्ण इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें। pipetting द्वारा पूरी तरह से मिलाएं।
- मिश्रण स्तंभ के लिए कदम 2.7 में प्राप्त की 650 μL जोड़ें और 1 मिनट के लिए 6000 XG पर यह अपकेंद्रित्र।
- प्रवाह के माध्यम से युक्त ट्यूब त्यागें और एक नया, साफ संग्रह ट्यूब पर स्तंभ जगह है। दोहराएँ 2.8 और 2.9 कदम जब तक नमूना मिश्रण के सभी इस्तेमाल किया गया है (5 बार)।
- 500 &# 181; स्तंभ के रिम गीला बिना बफर AW1 के एल। 1 मिनट के लिए 6000 XG पर यह अपकेंद्रित्र।
- प्रवाह के माध्यम से युक्त ट्यूब त्यागें और एक नया, स्वच्छ संग्रह ट्यूब के साथ बदलें।
- स्तंभ के रिम गीला बिना बफर AW2 के 500 μL जोड़ें। 3 मिनट के लिए पूरी गति (20,000 XG) पर यह अपकेंद्रित्र।
- प्रवाह के माध्यम से युक्त ट्यूब त्यागें और एक नया, स्वच्छ संग्रह ट्यूब के साथ बदलें।
- दोहराएँ कदम 2.12 किसी भी अवशिष्ट धोने बफर हटा दें।
- स्तंभ एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। के क्षालन बफर एई 50 μL जोड़ें और 7 मिनट इंतजार है कि बफर wets स्तंभ सुनिश्चित करने के लिए।
- 1 मिनट के लिए 8000 XG पर यह अपकेंद्रित्र।
- मिनी स्तंभ में कदम 2.15 से eluent पिपेट और 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से यह अपकेंद्रित्र डीएनए की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए।
3. डीएनए मात्रा और कमजोर पड़ने
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग, बीओटी से डीएनए की मात्रा का ठहराव के लिए प्रदर्शनज सेल लाइन और मूत्र के नमूने सतह पर तैरनेवाला। , एक बेंच शीर्ष स्पेक्ट्रोमीटर पर नमूना के 2 μL का प्रयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
- 1 एनजी / μL की एकाग्रता प्राप्त करने और डीएनए विश्लेषण अखंडता जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए डीएनए UCF डीएनए नमूने पतला।
नोट: डीएनए मात्रा के साथ वास्तविक समय पीसीआर (कम से कम 100 एनजी) आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो एक नए डीएनए अलगाव की प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं। - विभिन्न सांद्रता के साथ छह मानकों प्राप्त करने के लिए सेल लाइन के नमूनों से डीएनए पतला: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, और 2 एनजी / μL, 100 μL की मात्रा (st1, st3, ST4, ST5 ST2 के साथ एक, और st6)। -20 डिग्री सेल्सियस डीएनए विश्लेषण अखंडता जब तक सेल लाइन डीएनए मानकों स्टोर।
4. डीएनए टेस्ट वफ़ादारी - पीसीआर
- प्राइमरों (एकाग्रता परख के प्रकार पर निर्भर करता है), हरे Supermix, सेल लाइन डीएनए मानकों, और बर्फ पर UCF डीएनए नमूने पतला गला लें।
- प्लेट च में पट्टी ट्यूबों तैयारया 72-अच्छी तरह से रोटर डिस्क। अशेष प्रत्येक मानक और पतला नमूना और नकारात्मक नियंत्रण के लिए RNase मुक्त पानी की 10 μL के लिए दो प्रतियों में 10 μL।
- प्रत्येक प्राइमर के 1 μL का एक मिश्रण तैयार करें, हरे Supermix 12.5 μL प्रत्येक नमूना के लिए RNase मुक्त पानी की 6.5 μL (सांद्रता तालिका 1 में संकेत कर रहे हैं), और। 2 प्रतिकृति, 2 प्रतिकृति के लिए नकारात्मक नियंत्रण, और 2 अतिरिक्त नमूने के लिए 2 प्रतिकृति के लिए 6 मानकों, नमूनों की संख्या: जब मिश्रण की तैयारी, नमूने के निम्नलिखित संख्या का उपयोग करें।
- अशेष 15 प्रत्येक कुएं में मिश्रण के μL। पिपेट या ट्यूब स्पिन नहीं है।
- पीसीआर की स्थिति तालिका 1 में संकेत के साथ प्रोटोकॉल शुरू करो।
नोट: 29 x 2 नमूने + 6 एक्स 2 मानकों + नकारात्मक नियंत्रण एक्स 2 = 72 (UCF डीएनए मूल्य): UCF डीएनए मूल्य के लिए, 29 डीएनए नमूने प्रत्येक वास्तविक समय 72-अच्छी तरह से रोटर डिस्क का उपयोग प्रयोग के लिए प्रोसेस किया गया।
नोट: UCF डीएनए अखंडता विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल भी हो सकता हैएक और पीसीआर वास्तविक समय साधन (जब एक और डिवाइस का उपयोग कर, Rox डाई जोड़े जाने की जरूरत हो सकती है) का उपयोग किया।
5. डीएनए टेस्ट वफ़ादारी - डेटा विश्लेषण और व्याख्या
नोट: प्रत्येक नमूना के लिए UCF डीएनए मूल्य, एक वास्तविक समय साधन-प्रणाली का पता लगाने के लिए प्रत्येक व्यक्ति पीसीआर जीन मूल्यांकन के लिए एक मानक वक्र निर्माण का उपयोग कर और मानक वक्र प्रक्षेप का उपयोग सॉफ्टवेयर द्वारा प्राप्त किया गया था के रूप में पहले 7-9 (चित्रा 2) में वर्णित है।
- प्रतिकृति का मूल्यांकन; नमूना एक अंतर के साथ प्रतिकृति ≥1 सीटी खारिज किया जाना चाहिए और एक दूसरे प्रयोग में फिर से मूल्यांकन किया है।
- प्रत्येक नमूना के लिए औसत सीटी की गणना और 36 ≤ एक सीटी मूल्य के साथ नमूनों पर विचार करें।
- पिघलने विश्लेषण का उपयोग पीसीआर उत्पादों की विशिष्टता का मूल्यांकन।
- मानक की अवस्था के साथ प्रक्षेप द्वारा प्रत्येक amplicon की एकाग्रता का मूल्यांकन; प्रत्येक amplicon के लिए एक एकाग्रता के मूल्य (एनजी / μL) प्राप्त करते हैं।
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Representative Results
के लिए सभी नमूनों का विश्लेषण 1.51 और 138 के बीच एनजी / μL की एक श्रृंखला दिखा कुल मुक्त डीएनए एकाग्रता Spectrophotometry द्वारा मात्रात्मक था। पांच नियंत्रण नमूने डेटा के reproducibility के लिए इस्तेमाल किया गया: दो स्वतंत्र वास्तविक समय प्रयोगों सी-MYC, HER2, BCAS1, ए.आर., और STOX1 के लिए प्रदर्शन किया गया। भिन्नता (सीवी) के गुणांक फिर, प्रत्येक जीन (तालिका 2) के लिए गणना की गई दो स्वतंत्र प्रयोगों के बीच reproducibility का एक अच्छा डिग्री (तालिका 2) के साथ।
125-बीपी STOX1 अनुक्रम पीसीआर अवरोधकों की उपस्थिति को बाहर करने का विश्लेषण किया गया था। नमूने STOX1 के एक प्रवर्धन से पता चला है, तो UCF डीएनए अखंडता का परीक्षण किया गया था। प्रवर्धन की कमी का मतलब है कि डीएनए मात्रा टी दोहराने की जरूरत का संकेत UCF डीएनए अखंडता का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त नहीं था,वह एक नया मूत्र संग्रह के साथ विश्लेषण। कम जानकारी प्रवर्धन या मूत्राशय और प्रोस्टेट कैंसर में STOX1 का विलोपन के बारे में उपलब्ध नहीं है अत: इस जीन इन ट्यूमर प्रकार के लिए एक नियंत्रण दृश्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, UCF डीएनए अखंडता मूल्यांकन एक साथ तीन मूल्यों ओंकोजीन (चित्रा 3) के लिए प्राप्त जोड़कर प्रदर्शन किया गया था।
सी-MYC, HER2, और BCAS1 जीन की राशि के उपयोग, मूत्राशय कैंसर का पता लगाने के लिए 9 प्रस्तावित किया गया है, जबकि सी-MYC, ए.आर., और HER2 प्रोस्टेट कैंसर के 7.8 के लिए सुझाव दिया गया है। सबसे अच्छा कट-ऑफ मूत्राशय और प्रोस्टेट कैंसर का पता लगाने के लिए पहचान मूल्यों 0.1 एनजी / μL और 0.04 एनजी / μL, क्रमशः रहे हैं। इन कट ऑफ मूल्यों का प्रयोग, 73% की संवेदनशीलता और 84% की एक विशिष्टता, रोगसूचक व्यक्तियों बनाम मूत्राशय के कैंसर का पता लगाने में प्राप्त किया गया है, जबकि 58% संवेदनशीलता और 44% विशिष्टअल्पसंख्यक सौम्य मूत्रजननांगी पथ रोगों 7-9 के साथ रोगियों की तुलना में प्रोस्टेट कैंसर का पता लगाने में मनाया गया। अंत में, UCF डीएनए परीक्षण अखंडता लचीला है, इसलिए वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल जीन हित के अन्य लंबे दृश्यों, रोग पर निर्भर करता है के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
चित्रा 1. मूत्र सेल मुक्त डीएनए वफ़ादारी कार्यप्रवाह और समय। विधि के कार्यप्रवाह विभिन्न चरणों और समय में बांटा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2 सी-MYC Amplicon विश्लेषण के लिए रिपोर्ट। पिघलने विश्लेषण, प्रवर्धन साजिश का एक उदाहरणऔर मानक वक्र सी-MYC मूल्यांकन के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. UCF डीएनए विश्लेषण वफ़ादारी कार्यप्रवाह। UCF डीएनए अखंडता विश्लेषण के लिए एक सरल कार्यप्रवाह सूचना दी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| जीन | संदर्भ अनुक्रम | प्राइमर आगे | प्राइमर रिवर्स | Amplicon लंबाई (बीपी) | रीयल टाइम प्रोटोकॉल |
| MYC (सी-MYC) (वि Myc एवियन Myelocytomatosis वायरल ओंकोजीन Homolog, ठिकाना 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 3 मिनट 40 सेकंड, 40 सेकंड के लिए 56 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 45 चक्र द्वारा पीछा के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। |
| ErbB2 (HER2) (Erb-बी 2 रिसेप्टर tyrosine kinase 2, ठिकाना 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (स्तन कार्सिनोमा प्रवर्धित अनुक्रम 1, ठिकाना 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| एआर (एण्ड्रोजन रिसेप्टर, ठिकाना Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead Box1, ठिकाना 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 40 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 45 चक्र और 1 मिनट के लिए 54 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा 90 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। |
तालिका 1 प्राइमर दृश्यों और परख शर्तों।
| नमूना | HER2 | सीवी (%) | BCAS1 | सीवी (%) | ग -MYC | सीवी (%) | एआर | सीवी (%) | STOX1 | सीवी (%) | |||||
| Repli-केट 1 * | Repli-केट 2 * | Repli-केट 1 * | Repli-केट 2 * | Repli-केट 1 * | Repli-केट 2 * | Repli-केट 1 * | Repli-केट 2 * | Repli-केट 1 * | Repli-केट 2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | 0.6 | 0.5 | 29.1 | 0.6 | 0. 8 | 4.5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.9 | 1.5 | 28.6 | 0.1 | 0.1 | 22.0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0.4 | 0.2 | 17.0 | 0.1 | 0.1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0.0 | NE | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | NE |
| 5 | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | NE | 0.0 | NE | 0.1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | NE |
तालिका 2 प्रत्येक जीन के लिए वास्तविक समय पीसीआर Reproducibility।
* परिणाम के रूप में एनजी / μL सूचना दी
सीवी, विभिन्नता का गुणांक; पूर्वोत्तर, मूल्यांकित नहीं
| UCF डीएनए अखंडता के लिए जीन | जिलेआराम | कैंसर रोगियों (एन) | नियंत्रण (एन) | कट (एनजी / μL) | संवेदनशीलता दर (95% सीआई) | विशिष्टता दर (95% सीआई) | संदर्भ |
| MYC HER2 BCAS1 | ब्लैडर कैंसर | 52 | 46 लक्षण व्यक्तियों 32 स्वस्थ व्यक्तियों | 0.1 | 0,73 (0.61-0.85) | 0,83 (0.72-0.94) | Casadio वी एट अल। 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | प्रोस्टेट कैंसर | 29 | 25 स्वस्थ व्यक्तियों | 0.04 | 0,79 (.62-0.90) | 0,84 (0.65-0.94) | Casadio वी एट अल। 2013 8 |
| सी-MYC एआर BCAS1 | प्रोस्टेट कैंसर | 67 | मूत्रजननांगी पथ का सौम्य रोगों के साथ 64 रोगियों | 0.04 | 0,58 (0.46-0.73) | 0,44 (0.30-0.58) | सालवी एस एट अल। 2015 7 |
3 तालिका के प्रोस्टेट और मूत्राशय के कैंसर के शीघ्र निदान के लिए प्राप्त परिणामों सारांश।
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Discussion
UCF डीएनए अखंडता विश्लेषण एक नया, मूत्र में डीएनए अखंडता का आकलन करने के लिए गैर इनवेसिव विधि है। यह हाल ही में मूत्राशय 9 और प्रोस्टेट कैंसर के 7.8 के शीघ्र निदान के लिए प्रस्तावित किया गया था। फायदे और UCF डीएनए परीक्षण अखंडता के नुकसान के एक नंबर यहाँ चर्चा कर रहे हैं, एक साथ भविष्य की संभावनाओं के साथ।
दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह एक सस्ती, गैर इनवेसिव विधि और बायोमार्कर का एक संभावित स्रोत, केवल आणविक जीव विज्ञान तकनीक की एक बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता के रूप में मूत्र अध्ययन करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदान करता है। परीक्षण करने के लिए जल्दी है, और परिणाम, 2 काम दिन के बाद उपलब्ध (छवि। 1), आसानी से एक चिकित्सक की सहायता के बिना व्याख्या की जा सकती है। केवल डीएनए अलगाव प्रक्रियाओं और 2 वास्तविक समय PCRs से मिलकर, दृष्टिकोण भी एक अच्छा लागत लाभ अनुपात है। शुद्धता के मामले में, UCF डीएनए अखंडता का पता लगाने में उच्च संवेदनशीलता (73%) और विशिष्टता (84%) हैप्रतीक रोगियों 9 में मूत्राशय कैंसर। अंत में, विधि लचीला है, और प्रस्तावित जीन आसानी से, के रूप में लंबे समय के रूप में वे 250 बीपी से रह रहे हैं हित के अन्य जीन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
परीक्षण भी सीमाओं की एक संख्या है। सबसे पहले, डीएनए spectrophotometric मात्रा का ठहराव विधि अक्सर imprecise है और अन्य, अधिक सटीक, fluorometric दृष्टिकोण (जैसे, qubit या PicoGreen) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। डीएनए गुणवत्ता के रूप में अक्सर कम 260/280 और 260/230 अनुपात के द्वारा प्रदर्शन किया, बल्कि गरीब भी है। इसके अलावा, हमारे अध्ययन में से एक में, बहुत कम विशिष्टता (44%) प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों में मूत्रजननांगी पथ 7, जो शायद सौम्य भड़काऊ परिगलित संचलन में अधिक बरकरार डीएनए को रिहा कोशिकाओं का परिणाम था की सौम्य बीमारियों के साथ रोगियों की तुलना में मनाया गया। यह एक महत्वपूर्ण मुद्दा है क्योंकि दोनों प्रोस्टेट कैंसर रोगियों और सौम्य रोगों के साथ व्यक्तियों को अपने यू में एक भड़काऊ घटक हो सकता हैrinary कोशिकाओं। इस प्रकार, प्रोस्टेट कैंसर के शीघ्र निदान के संदर्भ में, एक UCF डीएनए अखंडता विश्लेषण से परिणाम को गुमराह किया जा सकता है।
UCF डीएनए अखंडता प्रोस्टेट या मूत्राशय कैंसर, स्वस्थ और रोगसूचक व्यक्तियों, और मूत्रजननांगी पथ का सौम्य बीमारियों के साथ रोगियों के साथ रोगियों से 314 मूत्र के नमूने में मूल्यांकन किया गया था। एक बड़े मामले श्रृंखला पर एक भावी अध्ययन बेहतर मूत्रजननांगी पथ के कैंसर के लिए एक प्रारंभिक नैदानिक मार्कर के रूप में इस दृष्टिकोण की भूमिका को परिभाषित करने की जरूरत है।
हालांकि कम ही कैंसर के लिए बायोमार्कर का एक स्रोत के रूप में UCF डीएनए के विषय पर प्रकाशित किया गया है, इस क्षेत्र में दिलचस्पी बढ़ रही है। हाल ही में, Togneri एट अल। 4 एक दिलचस्प पत्र में सेल मुक्त डीएनए मूत्राशय कैंसर के रोगियों के मूत्र सतह पर तैरनेवाला से निकाला मूत्र गोली से अलग सेलुलर डीएनए की तुलना में एक उच्च ट्यूमर जीनोम बोझ से पता चला प्रकाशित, सुझाव है कि सेल मुक्त अंश का अध्ययनमूत्र में डीएनए के मूत्र संबंधी के कैंसर को चिह्नित करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
हमारे अनुभव में, UCF डीएनए परीक्षण अखंडता को साबित नहीं किया प्रोस्टेट कैंसर के लिए एक अच्छा प्रारंभिक नैदानिक परीक्षण किया जाना है। इसके विपरीत, यह मूत्राशय के कैंसर का जल्दी पता लगाने के लिए एक मार्कर के रूप में संभावित पता चला जब पारंपरिक मूत्र कोशिका विज्ञान के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया। एक बड़ा संभावित मामले श्रृंखला पर एक पुष्टि अध्ययन वर्तमान में योजना बनाई जा रही है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
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