Abstract
Embora a presença de ADN de circulação livre de células no plasma ou soro tem sido amplamente demonstrado ser uma fonte adequada de biomarcadores para muitos tipos de cancro, poucos estudos têm-se centrado na utilização potencial de ADN isento de células de urina (UCF). A partir das hipóteses de que as células em apoptose normais produzem DNA altamente fragmentado e que as células cancerosas liberam mais DNA, o papel potencial da integridade do DNA UCF foi avaliada como um marcador diagnóstico precoce capaz de distinguir entre os pacientes com câncer de próstata ou câncer de bexiga e indivíduos saudáveis.
Uma análise da integridade do ADN UCF é proposta com base em quatro reacções de PCR quantitativo em tempo real de quatro sequências mais longas do que 250 pb: c-myc, BCAS1, HER2, e AR. As sequências que têm frequentemente um aumento do número de cópias de ADN na bexiga e cancros da próstata foram escolhidos para análise, mas o método é flexível, e estes genes podem ser substituídos por outros genes de intedescansar. A utilidade potencial de DNA UCF como fonte de biomarcadores já foi demonstrado para neoplasias urológicas, abrindo assim o caminho para novos estudos sobre a caracterização DNA UCF. O teste de integridade do DNA UCF tem a vantagem de ser não-invasivo, rápido, e fácil de executar, com apenas alguns mililitros de urina necessários para levar a cabo a análise.
Introduction
ADN livre de células pode ser detectado no sangue e na urina devido a morte celular por mecanismos apoptóticos ou necróticos. DNA livre de células no sangue tem sido amplamente estudada para fins de diagnóstico e prognóstico em várias doenças, especialmente câncer 1. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do DNA urinário livre de células (UCF). DNA UCF podem ser originários de passagem de sangue através do sistema de filtração glomerular ou a partir de células que entram em contacto directo com este corpo fluido 2 (por exemplo, células uroteliais ou células prostáticas). A utilização de ADN UCF como uma fonte de biomarcadores tem sido principalmente investigado para o diagnóstico precoce de doença renal, da bexiga, e cancro da próstata, devido à elevada percentagem de ADN UCF vindo directamente a partir de células do tracto urinário 3,4.
Pouco se sabe sobre DNA UCF e os melhores métodos para isolar e caracterizar-lo. Tendo em conta a hipótese de que as células tumorais libertar fragmentos de ADN mais longos do que as células normais, a avaliaçãoda integridade do ADN isento de células foi estudada na tentativa de elucidar a origem de ADN na circulação sanguínea 5. Alguns estudos demonstraram que a integridade do ADN isento de células no sangue representa um bom teste de diagnóstico para muitos tipos de cancro 6, e a mesma hipótese tem sido proposta em relação à urina 7-9.
Este artigo descreve um novo método para a análise de integridade do DNA UCF com um potencial de aplicação para detecção de bexiga e câncer de próstata. Em particular, a integridade do ADN UCF fragmentos superiores a 250 pb foi testado em 4 regiões conhecidas por terem um aumento do número de cópias de ADN em tumores sólidos, incluindo o da próstata e cancro da bexiga: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) e AR (Xq12) 10-14. oncogenes específicos, em vez de seqüências aleatórias, foram escolhidos para aumentar a probabilidade de encontrá-los na fração livre de células de pacientes com câncer. Uma das principais vantagens deeste método é que é flexível e que outras regiões podem também ser seleccionada com base no tipo de tumor e características.
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Protocol
O protocolo segue as orientações do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos IRST.
NOTA: Neste protocolo, isolado DNA a partir de amostras de urina para realizar uma análise de integridade do DNA UCF. LNCaP e células MRC linhas foram utilizados para construir padrões. Técnicas tais como a extracção de ADN, a quantificação de ADN (espectrofotómetro e PCR em tempo real para o gene de controlo, STOX1), e PCR em tempo real para oncogenes específicos foram realizados (Figura 1).
1. Recolha de urina e Processamento
- Obter uma de urina limpa primeira manhã amostra de urina em um copo limpo e seco, de plástico. Recolher pelo menos 50 ml da amostra de urina.
- Manter a urina, a 4 ° C durante um máximo de 3 h e enviá-lo para o laboratório, à mesma temperatura.
- Misture cada amostra invertendo-lo duas vezes imediatamente após a chegada no laboratório e transferência em dois tubos de polipropileno de fundo cónico de 50 ml.
- Centrifugar os tubosa 850 xg durante 10 min a 4 ° C ou à temperatura ambiente.
- transferir cuidadosamente 10 ml de a parte superior do sobrenadante de urina em dois tubos de 5 mL, deixando, pelo menos, 2 ml do sobrenadante acima da pelete de células.
NOTA: Transferir a parte superior do sobrenadante reduz o risco de contaminação por células ou detritos celulares. Não há nenhuma clara delimitação entre as partes superior e inferior. - Desprezar o pelete e congelar imediatamente o sobrenadante a -80 ° C até à sua utilização.
2. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina e linhas celulares
NOTA: Isolar o ADN a partir de uma linha celular (por exemplo, LNCaP de cancro da próstata ou cancro da bexiga para MRC) usando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante. Isolamento de ADN a partir do sobrenadante de urina deve ser realizado utilizando o protocolo comercial, modificado como se segue:
- Descongelar uma alíquota do sobrenadante de urina, à temperatura ambiente. </ Li>
- Vortex e misturar a amostra de urina e transferir 1 ml de sobrenadante a urina para um tubo de 5 mL claro. Congelar a urina residual à temperatura de -80 ° C.
- Adicionar 100 ul de proteinase K directamente para a amostra.
- Adicionar 1 mL de tampão AL à amostra e misturar bem por pipetagem.
- Feche os tubos e incubar as amostras a 56 ° C durante 15 min.
- Durante a incubação, preparar uma coluna para cada amostra e preparação dos tampões de lavagem, e AW1 AW2, conforme instruções do fabricante (adicionar a quantidade indicada de 100% de etanol).
- Trazer as amostras de volta à temperatura ambiente e adicionar 1 ml de etanol absoluto. Misturar completamente por pipetagem.
- Adicionar 650 ul da mistura obtida no passo 2.7 para a coluna e centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min.
- Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e colocar a coluna em um tubo de recolha de novo, limpo. Repita os passos 2.8 e 2.9 até que toda a mistura de amostra foi usado (5 vezes).
- Adicionar 500 &# 181; ul de tampão AW1 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo a 6,000 xg durante 1 min.
- Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo.
- Adicionar 500 ul de tampão de AW2 sem molhar a borda da coluna. Centrifugar-lo à velocidade máxima (20000 x g) durante 3 min.
- Descartar o tubo contendo o fluxo de passagem e substituí-lo por um novo tubo de recolha, limpo.
- Repita o passo 2.12 para remover qualquer tampão de lavagem residual.
- Colocar a coluna para um tubo limpo de 1,5 mL. Adicionar 50 ul de tampão de eluição AE e esperar 7 min para assegurar que os molha tampão da coluna.
- Centrifugar a 8.000 xg lo durante 1 min.
- Pipetar o eluente do passo 2.15 para o mini-coluna e centrifugar-lo à velocidade máxima durante 1 min para assegurar a máxima recuperação do DNA.
3. DNA Quantificação e Diluição
- Usando um espectrofotómetro, realizar a quantificação do ADN de both, a linha de células e as amostras de urina sobrenadante. Use 2 ul de amostra num espectrómetro de bancada, de acordo com as instruções do fabricante.
- Diluir as amostras de DNA de UCF para obter uma concentração de 1 ng / mL e armazenar o ADN à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN.
NOTA: Se a quantidade de ADN não é suficiente para prosseguir com PCR em tempo real (pelo menos 100 ng), realizar um novo processo de isolamento de DNA. - Dilui-se o ADN a partir de amostras de linha de células para obter seis padrões com diferentes concentrações: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 e 2 ng / mL, cada uma com um volume de 100 uL (ST1, ST2, ST3, sT4, ST5, e ST6). Armazenar os padrões de ADN da linha de células à temperatura de -20 ° C até que a análise da integridade do ADN.
4. DNA Integrity Test - PCR
- Descongelar os iniciadores (a concentração depende do tipo de ensaio), Supermix verde, padrões de ADN da linha de células, e amostras de DNA UCF diluídos em gelo.
- Prepare tubos tira na placa de fou o disco do rotor 72 poços. Alíquota de 10 uL em duplicado para cada padrão e amostra diluída e 10 uL de água isenta de RNase para o controlo negativo.
- Prepara-se uma mistura de 1 mL de cada iniciador (as concentrações são indicadas na Tabela 1), 12,5 uL de Supermix verde, e 6,5 mL de água isenta de RNase para cada amostra. Ao preparar a mistura, utilize o seguinte número de amostras: 6 padrões para 2 repetições, número de amostras por 2 repetições, controle negativo para 2 repetições, e 2 amostras extras.
- Aliquota de 15 uL da mistura em cada cavidade. Não pipeta ou girar os tubos.
- Inicie o protocolo com as condições de PCR indicados na Tabela 1.
NOTA: Para obter o valor DNA UCF, 29 amostras de DNA foram processados para cada experimento em tempo real usando o disco do rotor 72 poços: 29 x 2 amostras + 6 x 2 padrões + control x 2 = 72 (valor de DNA UCF) negativo.
NOTA: O protocolo para a análise da integridade do ADN também pode ser UCFrealizada utilizando um outro instrumento de PCR em tempo real (quando se utiliza um outro dispositivo, ROX corante pode precisar de ser adicionado).
5. DNA Integrity Test - Análise de Dados e Interpretação
NOTA: O valor de ADN UCF para cada amostra foi obtida por um software de sistema de detecção de instrumento em tempo real, utilizando uma construção curva padrão para cada avaliação individual do gene por PCR e utilizando interpolação curva padrão, tal como anteriormente descrito 7-9 (Figura 2).
- Avaliar as repetições; amostra replica com uma diferença ≥1 Ct deve ser descartado e re-avaliado em um segundo experimento.
- Calcule o Ct mediana para cada amostra e considerar amostras com um valor de Ct ≤ 36.
- Avaliar a especificidade dos produtos de PCR por meio de análise de fusão.
- Avaliar a concentração de cada fragmento amplificado por interpolação com a curva padrão; obter um valor de concentração (ng / mL) para cada fragmento amplificado.
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Representative Results
A concentração total de ADN livre foi quantificado por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, mostrando uma gama de entre 1,51 e 138 ng / mL. Cinco amostras de controlo foram utilizados para a reprodutibilidade dos dados: duas experiências independentes em tempo real foram realizados para c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. Os coeficientes de variação (CV) foram então calculados para cada gene (Tabela 2), com um bom grau de reprodutibilidade entre os dois experimentos independentes (Quadro 2).
A sequência STOX1 125 pb foi analisado para excluir a presença de inibidores de PCR. Se as amostras demonstraram uma amplificação de STOX1, foi realizado o teste de integridade do DNA UCF. A falta de amplificação significa que a quantidade de DNA não foi suficiente para realizar o teste de integridade do DNA UCF, indicando a necessidade de repetir tele análise com uma nova coleta de urina. Como há pouca informação disponível sobre a amplificação ou a supressão de STOX1 no cancro da bexiga e próstata, este gene pode ser utilizado como uma sequência de controlo para estes tipos de tumores. Finalmente, a avaliação da integridade do ADN UCF foi realizada adicionando juntos os valores obtidos para os três oncogenes (Figura 3).
A utilização da soma dos genes c-myc, HER2, e BCAS1 tem sido proposto para detecção do cancro da bexiga 9, enquanto c-myc, AR, e HER2 tem sido sugerido para o cancro da próstata 7,8. Os melhores valores de corte identificados para bexiga e detecção do câncer de próstata são 0,1 ng / mL e 0,04 ng / ml, respectivamente. Usando esses valores de corte, uma sensibilidade de 73% e uma especificidade de 84% foram obtidos na detecção de cancro da bexiga contra indivíduos sintomáticos, enquanto a sensibilidade de 58% e 44% específicadade foram observadas na detecção de câncer de próstata contra pacientes com doenças do trato urogenital benignos 7-9. Em conclusão, o teste de integridade do ADN UCF é flexível, de modo que os genes usados no presente estudo podia ser substituído por outras sequências longas de interesse, dependendo da doença.
Figura 1. A urina DNA livre de celular Integridade Workflow e Timeline. O fluxo de trabalho do método é dividido em diferentes etapas e tempos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Relatório de Análise Amplicon c-MYC. Um exemplo da análise de fusão, lote amplificaçãoE curva padrão são relatados para a avaliação c-MYC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. UCF DNA Análise de Integridade Workflow. Um fluxo de trabalho simples para a análise de integridade do DNA UCF é relatado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Gene | sequência de referência | frente Primer | iniciador inverso | Comprimento amplicão (pb) | Protocolo de tempo real |
| MYC (c-MYC) (V-Myc Avian mielocitomatose Viral Oncogene homólogo, lócus 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95 ° C durante 3 minutos seguido de 45 ciclos a 94 ° C durante 40 segundos, 56 ° C durante 40 segundos e 72 ° C durante 1 minuto. |
| ERBB2 (HER2) (Erb-B2 receptor da tirosina quinase 2, lócus 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (Carcinoma de mama Amplified Sequência 1, lócus 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| AR (Receptor de andrógeno, lócus Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead Box1, lócus 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95 ° C durante 90 segundos seguido por 45 ciclos a 94 ° C durante 40 segundos e 54 ° C durante 1 minuto. |
Tabela 1. Primer Sequências e condições de ensaio.
| Amostra | HER2 | CV (%) | BCAS1 | CV (%) | c -MYC | CV (%) | AR | CV (%) | STOX1 | CV (%) | |||||
| Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | Repli-cate 1 * | Repli-cate 2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0,1 | 0,1 | 3.4 | 0,1 | 0,1 | 14,0 | 0,6 | 0,5 | 29,1 | 0,6 | 0. 8 | 4,5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0,9 | 1,5 | 28,6 | 0,1 | 0,1 | 22,0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0,4 | 0,2 | 17,0 | 0,1 | 0,1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11,6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0,7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0.0 | NE | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | NE |
| 5 | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0,1 | 0,1 | 14,0 | NE | 0.0 | NE | 0,1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | NE |
Tabela 2. PCR em tempo real A reprodutibilidade para cada gene.
* Os resultados relatados como ng / mL
CV, coeficiente de variação; NE, não avaliável
| Genes para a integridade do DNA UCF | Disfacilidade | Pacientes com Câncer (n) | Controles (n) | Cortar (ng / mL) | Taxa de sensibilidade (95% CI) | Taxa de especificidade (95% CI) | Referência |
| MYC HER2 BCAS1 | Câncer de bexiga | 52 | 46 indivíduos sintomáticos 32 indivíduos saudáveis | 0,1 | 0,73 (0,61-0,85) | 0,83 (0,72-0,94) | Casadio V et al. 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | Câncer de próstata | 29 | 25 indivíduos saudáveis | 0,04 | 0,79 (0,62-0,90) | 0,84 (0,65-0,94) | Casadio V et al. 2013 8 |
| c-MYC AR BCAS1 | Câncer de próstata | 67 | 64 pacientes com doenças benignas do trato urogenital | 0,04 | 0,58 (0,46-0,73) | 0,44 (0,30-0,58) | Salvi S et al. 2015 7 |
Tabela 3. Resumo dos resultados obtidos para o diagnóstico precoce do cancro da próstata e bexiga cancros.
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Discussion
UCF análise da integridade do ADN é um método novo, não invasivo para avaliar a integridade do ADN na urina. Recentemente, foi proposto para o diagnóstico precoce da bexiga e próstata 9 7,8. Um certo número de vantagens e desvantagens do teste de integridade do DNA UCF são discutidos aqui, juntamente com perspectivas futuras.
A principal vantagem do método é que ele oferece um método barato, não-invasivo e um protocolo simples para estudar urina como uma fonte potencial de biomarcadores, que requer apenas um conhecimento básico de técnicas de biologia molecular. O teste é rápido para executar, e os resultados, disponíveis após dias 2 de trabalho (Fig. 1), pode facilmente ser interpretada sem a ajuda de um médico. Composta de apenas processos de isolamento de DNA e 2 PCRs em tempo real, a abordagem também tem uma boa relação custo-benefício. Em termos de precisão, a integridade do DNA UCF tem uma sensibilidade elevada (73%) e especificidade (84%) em detectarcancro da bexiga em pacientes sintomáticos 9. Finalmente, o método é flexível, e os genes propostos podem ser facilmente substituídos por outros genes de interesse, desde que eles são mais longos do que 250 pb.
O ensaio tem também uma série de limitações. Em primeiro lugar, o método de quantificação espectrofotométrica de ADN é muitas vezes imprecisa e pode ser substituído por outras abordagens, fluorométricos, mais precisas (por exemplo, qubit ou PicoGreen). A qualidade do DNA também é bastante pobre, como demonstrado pelos frequentemente baixas 260/280 e 260/230 rácios. Além disso, em um dos nossos estudos, observou-se muito baixa especificidade (44%) em pacientes com cancro da próstata em relação pacientes com doenças benignas do tracto urogenital 7, que era provavelmente um resultado de células necróticas inflamatórias benignas de libertação de ADN mais intacta para a circulação. Esta é uma questão crítica, porque ambos os pacientes com câncer de próstata e indivíduos com doenças benignas pode ter um componente inflamatório em seu ucélulas rinary. Assim, dentro do âmbito do diagnóstico precoce do cancro da próstata, os resultados de uma análise da integridade do ADN UCF pode ser enganador.
integridade do DNA UCF foi avaliada em 314 amostras de urina de pacientes com cancro da próstata ou da bexiga, os indivíduos saudáveis e sintomáticos, e os pacientes com doenças benignas do trato urogenital. Um estudo prospectivo em uma série de casos maior é necessário para definir melhor o papel dessa abordagem como um marcador diagnóstico precoce de câncer do trato urogenital.
Embora pouco tem sido publicado sobre o assunto de DNA UCF como fonte de biomarcadores para o câncer, o interesse nesta área está a aumentar. Recentemente, Togneri et ai. 4 publicou um artigo interessante em que o ADN isento de células extraído a partir do sobrenadante de urina de pacientes com cancro da bexiga apresentou uma carga genoma do tumor mais elevada do que a do ADN celular isolado a partir do sedimento da urina, o que sugere que o estudo da fracção livre de célulasde ADN na urina pode ser útil para caracterizar os cancros urológicos.
Em nossa experiência, o teste de integridade do DNA UCF não provar ser um bom teste diagnóstico inicial de câncer de próstata. Por outro lado, mostrou potencial como um marcador para a detecção precoce de cancro da bexiga, quando usado em combinação com citologia de urina convencional. Um estudo confirmatório em uma maior série de casos potenciais está sendo planejada.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
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