Abstract
Aunque la presencia de ADN circulante libre de células en el plasma o suero ha sido ampliamente demostrado ser una fuente adecuada de biomarcadores para muchos tipos de cáncer, pocos estudios se han centrado en el uso potencial de ADN libre de células de orina (UCF). Partiendo de la hipótesis de que las células apoptóticas normales producen ADN muy fragmentado y que las células de cáncer de liberación más largo de ADN, el papel potencial de la integridad del ADN UCF se evaluó como un marcador de diagnóstico temprano capaz de distinguir entre pacientes con cáncer de próstata o cáncer de vejiga y los individuos sanos.
Se propone un análisis de la integridad del ADN UCF sobre la base de cuatro PCR cuantitativa en tiempo real de cuatro secuencias de más de 250 pares de bases: c-MYC, BCAS1, HER2, y AR. Las secuencias que con frecuencia tienen un número de copias de ADN aumentado en la vejiga y de próstata fueron elegidos para el análisis, pero el método es flexible, y estos genes pueden ser sustituidos con otros genes de intedescanso. La utilidad potencial de ADN UCF como fuente de biomarcadores ya ha sido demostrada para tumores malignos urológicos, preparando así el camino para nuevos estudios sobre la caracterización del ADN UCF. La prueba de la integridad del ADN UCF tiene la ventaja de ser no invasivo, rápido y fácil de realizar, con sólo unos pocos mililitros de orina necesarios para llevar a cabo el análisis.
Introduction
-Cell libre de ADN se puede detectar en la sangre y en la orina debido a la muerte celular por mecanismos apoptóticos o necróticos. ADN libre de células en la sangre se ha estudiado ampliamente para fines de diagnóstico y pronóstico en diversas enfermedades, especialmente el cáncer 1. Sin embargo, se sabe menos sobre el papel del ADN de orina libre de células (UCF). ADN UCF puede originarse de sangre que pasa a través del sistema de filtración glomerular o de células que entran directamente en contacto con este líquido cuerpo 2 (por ejemplo, células uroteliales o células prostáticas). El uso de ADN UCF como fuente de biomarcadores principalmente se ha investigado para el diagnóstico precoz de insuficiencia renal, la vejiga y el cáncer de próstata debido al alto porcentaje de ADN UCF procedentes directamente de las células del tracto urinario 3,4.
Poco se sabe sobre el ADN de la UCF y los mejores métodos para aislar y caracterizar ella. Dada la hipótesis de que las células tumorales liberan fragmentos de ADN más largos que las células normales, la evaluaciónde la integridad del ADN libre de células se ha estudiado en un intento de elucidar el origen del ADN en la circulación de la sangre 5. Algunos estudios han demostrado que la integridad del ADN libre de células en la sangre representa una buena prueba de diagnóstico para muchos tipos de cáncer 6, y la misma hipótesis ha sido propuesto en relación con la orina 7-9.
En este trabajo se describe un nuevo método para el análisis de la integridad del ADN UCF con una aplicación potencial para la detección de cáncer de vejiga y de próstata. En particular, la integridad del ADN UCF fragmentos más largos de 250 pb fue probado en 4 regiones sabe que tienen un número incrementado de copias de ADN en tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata y la vejiga: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), y AR (Xq12) 10-14. oncogenes específicos, en lugar de secuencias aleatorias, se eligieron para aumentar la probabilidad de encontrar en la fracción libre de células de pacientes con cáncer. Una de las principales ventajas deeste método es que es flexible y que otras regiones también se puede seleccionar sobre la base de tipo de tumor y características.
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Protocol
El protocolo sigue las directrices del Comité de Ética de Investigación Humanos RIMERA.
NOTA: En este protocolo, se aisló el ADN a partir de muestras de orina para realizar un análisis de la integridad del ADN UCF. LNCaP y células MRC líneas se utilizaron para construir estándares. Técnicas tales como la extracción de ADN, la cuantificación de ADN (espectrofotómetro y PCR en tiempo real para el gen de control, STOX1) y PCR en tiempo real para oncogenes específicos se realizaron (Figura 1).
1. Recolección de orina y Procesamiento
- Obtener una primera muestra de la mañana limpia de orina en un recipiente limpio y seco, de plástico. Recoge al menos 50 ml de la muestra de orina.
- Mantener la orina a 4 ° C durante un máximo de 3 h y enviarlo al laboratorio a la misma temperatura.
- Mezcle cada muestra invirtiendo dos veces inmediatamente después de su llegada en el laboratorio y la transferencia en dos tubos cónicos de polipropileno de fondo de 50 ml.
- Centrifugar los tubosa 850 xg durante 10 min a 4 ° C o a temperatura ambiente.
- transferir cuidadosamente 10 ml de la parte superior del sobrenadante de la orina en dos tubos de 5 ml, dejando al menos 2 ml del sobrenadante por encima del sedimento celular.
NOTA: La transferencia de la parte superior del sobrenadante reduce el riesgo de contaminación por células o restos celulares. No hay una clara delimitación entre las partes superior e inferior. - Se desecha el precipitado y congelar inmediatamente el sobrenadante a -80 ° C hasta su uso.
2. Aislamiento de ADN a partir del sobrenadante de la orina y las líneas celulares
NOTA: Aislar el DNA de una línea celular (por ejemplo, LNCaP de cáncer de próstata o MRC para cáncer de vejiga) utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante. Aislamiento de ADN a partir del sobrenadante de la orina debe ser realizada utilizando el protocolo comercial, modificado como sigue:
- Descongelar una alícuota del sobrenadante de la orina a temperatura ambiente. </ Li>
- Vortex y mezclar la muestra de orina y la transferencia de 1 ml del sobrenadante de la orina en un claro tubo de 5 ml. Congelar la orina residual a -80 ° C.
- Añadir 100 ml de proteinasa K a la muestra.
- Añadir 1 ml de tampón AL a la muestra y mezclar bien con la pipeta.
- Cerrar los tubos y se incuban las muestras a 56 ° C durante 15 min.
- Durante la incubación, preparar una columna para cada muestra y preparar los tampones de lavado, AW1 y AW2, según las instrucciones del fabricante (añada la cantidad indicada de etanol al 100%).
- Llevar las muestras a temperatura ambiente y se añade 1 ml de etanol absoluto. Mezclar completamente mediante pipeteo.
- Añadir 650 l de la mezcla obtenida en la etapa 2.7 a la columna y centrifugar al 6000 xg durante 1 min.
- Desechar el tubo que contiene el filtrado y coloque la columna en un nuevo tubo de recogida limpio. Repetir los pasos 2.8 y 2.9 hasta que toda la mezcla de la muestra se ha utilizado (5 veces).
- Añadir 500 y# 181; L de tampón AW1 sin mojar el borde de la columna. Se centrifuga a 6.000 xg que durante 1 min.
- Desechar el tubo que contiene el filtrado y sustituirla por una nueva, tubo de recogida limpio.
- Añadir 500 l de tampón AW2 sin mojar el borde de la columna. Centrifugar a toda velocidad (20.000 g) durante 3 min.
- Desechar el tubo que contiene el filtrado y sustituirla por una nueva, tubo de recogida limpio.
- Repita el paso 2.12 para remover todo el tampón de lavado residual.
- Colocar la columna en un tubo limpio de 1,5 ml. Añadir 50 l de tampón de elución AE y esperar 7 min para asegurar que los moja tampón de la columna.
- Se centrifuga a 8.000 xg que durante 1 min.
- Pipetear el eluyente de la etapa 2.15 en la mini-columna y centrifugar que a velocidad máxima durante 1 min para asegurar la máxima recuperación de ADN.
3. Cuantificación de ADN y dilución
- El uso de un espectrofotómetro, lleve a cabo la cuantificación de ADN de both la línea celular y las muestras de sobrenadante de la orina. Use 2 l de muestra en un espectrómetro de sobremesa, según las instrucciones del fabricante.
- Diluir las muestras de ADN UCF para obtener una concentración de 1 ng / l y almacenar el ADN a -20 ° C hasta que el análisis de la integridad del ADN.
NOTA: Si la cantidad de ADN no es suficiente para proceder con PCR en tiempo real (por lo menos 100 ng), lleve a cabo un nuevo proceso de aislamiento de ADN. - Diluir el ADN de muestras de líneas celulares para obtener seis estándares con diferentes concentraciones: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5, y 2 ng / l, cada uno con un volumen de 100 l (st1, ST2, ST3, ST4, ST5, y ST6). Almacenar los patrones de ADN de líneas celulares a -20 ° C hasta que el análisis de la integridad del ADN.
4. Prueba de ADN Integridad - PCR
- Descongelar los cebadores (la concentración depende del tipo de ensayo), Supermix verde, patrones de ADN de la línea celular, y muestras de ADN UCF diluidas en hielo.
- Prepare tiras de tubos en la placa fo el disco rotor 72 pocillos. Alícuota de 10 l por duplicado para cada estándar y muestra diluida y 10 l de agua libre de RNasa para el control negativo.
- Preparar una mezcla de 1 l de cada cebador (las concentraciones se indican en la Tabla 1), 12,5 l de supermix verde, y 6,5 l de agua libre de RNasa para cada muestra. En la preparación de la mezcla, utilice el siguiente número de muestras: 6 estándares para 2 repeticiones, el número de muestras de 2 repeticiones, control negativo de 2 repeticiones y 2 muestras adicionales.
- Alícuota de 15 l de la mezcla en cada pocillo. No pipetear o girar los tubos.
- Iniciar el protocolo con las condiciones de la PCR se indican en la Tabla 1.
NOTA: Para obtener el valor de ADN UCF, 29 muestras de ADN fueron procesados para cada experimento en tiempo real mediante el disco de rotor de 72 pocillos: 29 x 2 + 6 muestras x 2 + normas de regulación x 2 = 72 (valor ADN UCF) negativo.
NOTA: El protocolo para el análisis de la integridad del ADN también puede ser UCFrealizado utilizando otro instrumento PCR en tiempo real (cuando se utiliza otro dispositivo, puede ser necesario añadir colorante ROX).
5. Prueba de ADN Integridad - Análisis e interpretación de datos
NOTA: El valor ADN UCF para cada muestra se obtuvo mediante un software de sistema de instrumento de detección en tiempo real utilizando una construcción curva estándar para cada gen evaluación PCR individual y usando interpolación curva estándar, como se describe anteriormente 7-9 (Figura 2).
- Evaluar las repeticiones; la muestra se replica con una diferencia ≥1 Ct debe ser desechado y re-evaluado en un segundo experimento.
- Calcular la mediana de Ct para cada muestra y considerar las muestras con un valor de Ct ≤ 36.
- Evaluar la especificidad de los productos de PCR utilizando el análisis de fusión.
- Evaluar la concentración de cada uno de amplificación por interpolación con la curva estándar; obtener un valor de concentración (ng / l) para cada amplicón.
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Representative Results
La concentración total de ADN libre era cuantificable mediante espectrofotometría para todas las muestras analizadas, que muestra un intervalo de entre 1,51 y 138 ng / mL. Cinco muestras de control se utilizaron para la reproducibilidad de los datos: dos experimentos independientes en tiempo real se realizaron para c-MYC, HER2, BCAS1, AR, y STOX1. Los coeficientes de variación (CV) se calcularon entonces para cada gen (Tabla 2), con un buen grado de reproducibilidad entre los dos experimentos independientes (Tabla 2).
La secuencia STOX1 125-bp se analizó para excluir la presencia de inhibidores de la PCR. Si las muestras mostraron una amplificación de STOX1, se realizó la prueba de la integridad del ADN UCF. A falta de amplificación significa que la cantidad de ADN no era suficiente para realizar la prueba de la integridad del ADN UCF, lo que indica la necesidad de repetir tl análisis con una nueva colección de orina. Como hay poca información disponible acerca de la amplificación o deleción de STOX1 en el cáncer de vejiga y de próstata, este gen podría ser utilizado como una secuencia de control para estos tipos de tumores. Por último, la evaluación de la integridad de ADN UCF se realizó mediante la suma de los valores obtenidos para los tres oncogenes (Figura 3).
El uso de la suma de los genes c-MYC, HER2, y BCAS1 se ha propuesto para la detección del cáncer de vejiga 9, mientras que c-MYC, AR, y HER2 se han sugerido para el cáncer de próstata 7,8. Los mejores valores de corte identificados para la vejiga y la detección del cáncer de próstata son de 0,1 ng / l y 0,04 ng / l, respectivamente. Usando estos valores de corte, una sensibilidad del 73% y una especificidad del 84% se obtuvieron en la detección de cáncer de vejiga en comparación con los individuos sintomáticos, mientras que la sensibilidad del 58% y 44% específicadad se observaron en la detección de cáncer de próstata en comparación con los pacientes con enfermedades de las vías urogenitales benignos 7-9. En conclusión, la prueba de la integridad del ADN UCF es flexible, por lo que los genes utilizados en el presente estudio podría sustituirse con otras secuencias largas de interés, dependiendo de la enfermedad.
Figura 1. La orina de ADN libre de células Integridad de flujo de trabajo y la línea de tiempo. El flujo de trabajo del método se divide en diferentes pasos y tiempos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Informe de Análisis para el amplicón c-myc. Un ejemplo del análisis de fusión, gráfico de amplificaciónY la curva estándar se reportan para la evaluación de c-myc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de Integridad UCF ADN de flujo de trabajo. Se presenta un sencillo flujo de trabajo para el análisis de la integridad del ADN UCF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gene | secuencia de referencia | cebador directo | cebador inverso | La longitud de amplificación (pb) | Protocolo de tiempo real |
| MYC (c-MYC) (V-Myc aviar mielocitomatosis viral homólogo de oncogén, locus 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95 ° C durante 3 minutos seguido de 45 ciclos a 94 ° C durante 40 segundos, 56 ° C durante 40 segundos y 72 ° C durante 1 minuto. |
| ErbB2 (HER2) (Erb-B2 tirosina quinasa del receptor 2, locus 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (Carcinoma de mama Amplified Secuencia 1, locus 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| Arkansas (Receptor de andrógenos, locus Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead Recuadro 1, locus 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95 ° C durante 90 segundos seguido de 45 ciclos a 94 ° C durante 40 segundos y 54 ° C durante 1 minuto. |
Tabla 1. Secuencias de los Cebadores y Condiciones de ensayo.
| Muestra | HER2 | CV (%) | BCAS1 | CV (%) | c myc | CV (%) | Arkansas | CV (%) | STOX1 | CV (%) | |||||
| Repli-cado de 1 * | Repli-cado 2 * | Repli-cado de 1 * | Repli-cado 2 * | Repli-cado de 1 * | Repli-cado 2 * | Repli-cado de 1 * | Repli-cado 2 * | Repli-cado de 1 * | Repli-cado 2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0,1 | 0,1 | 3.4 | 0,1 | 0,1 | 14.0 | 0,6 | 0,5 | 29.1 | 0,6 | 0. 8 | 4.5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0,9 | 1.5 | 28.6 | 0,1 | 0,1 | 22.0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0,4 | 0,2 | 17.0 | 0,1 | 0,1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0,7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | nordeste | 1.1 | 1.0 | 3.0 | nordeste | 0.0 | nordeste | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | nordeste |
| 5 | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0,1 | 0,1 | 14.0 | nordeste | 0.0 | nordeste | 0,1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | nordeste |
Tabla 2.-PCR en tiempo real reproducibilidad para cada gen.
* Los resultados reportados como ng / l
CV: coeficiente de variación; NE, no evaluables
| Los genes para la integridad del ADN UCF | Disfacilitar | Los pacientes con cáncer (n) | Controles (n) | Cortar (ng / l) | Tasa de sensibilidad (95% CI) | Tasa de especificidad (95% CI) | Referencia |
| MYC HER2 BCAS1 | Cáncer de vejiga | 52 | 46 individuos sintomáticos 32 individuos sanos | 0,1 | 0,73 (0,61 a 0,85) | 0,83 (desde 0,72 hasta 0,94) | Casadio V et al. 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | Cancer de prostata | 29 | 25 individuos sanos | 0.04 | 0,79 (0,62 a 0,90) | 0,84 (0,65 a 0,94) | Casadio V et al. 2013 8 |
| c-MYC AR BCAS1 | Cancer de prostata | 67 | 64 pacientes con enfermedades benignas del tracto urogenital | 0.04 | 0,58 (0,46 hasta 0,73) | 0,44 (0,30-0,58) | Salvi S et al. 2015 7 |
Tabla 3. Resumen de los resultados obtenidos para el diagnóstico precoz de los cánceres de próstata y vejiga.
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Discussion
análisis de la integridad del ADN UCF es un método nuevo, no invasivo para la evaluación de la integridad del ADN en la orina. Se propuso recientemente para el diagnóstico precoz de la vejiga y de próstata 9 7,8. Se discute aquí una serie de ventajas y desventajas de la prueba de la integridad del ADN UCF, junto con las perspectivas de futuro.
La principal ventaja de este enfoque es que ofrece un método barato, no invasivo y un protocolo sencillo para estudiar la orina como una fuente potencial de biomarcadores, que sólo requiere un conocimiento básico de las técnicas de biología molecular. La prueba es rápida para llevar a cabo, y los resultados, disponibles después de 2 días de trabajo (Fig. 1), fácilmente se puede interpretar sin la ayuda de un médico. Consta de sólo procesos de aislamiento de ADN y 2 PCR en tiempo real, el enfoque también tiene una buena relación coste-beneficio. En cuanto a la exactitud, la integridad del ADN UCF tiene una alta sensibilidad (73%) y especificidad (84%) en la detección decáncer de vejiga en pacientes sintomáticos 9. Finalmente, el método es flexible, y los genes propuestos puede ser fácilmente sustituido con otros genes de interés, siempre y cuando son más de 250 pb.
La prueba también tiene una serie de limitaciones. En primer lugar, el método de cuantificación espectrofotométrica de ADN es a menudo imprecisa y podría ser reemplazado con otros enfoques, fluorométricos, más precisas (por ejemplo, qubit o PicoGreen). La calidad del ADN también es bastante pobre, como se demuestra por las frecuencia de bajo 260/280 y 260/230 ratios. Además, en uno de nuestros estudios, se observó muy baja especificidad (44%) en pacientes con cáncer de próstata frente a los pacientes con enfermedades benignas del tracto urogenital 7, que era probablemente un resultado de las células necróticas inflamatorias benignas liberación de más ADN intacto en la circulación. Este es un tema crítico, debido a que ambos pacientes con cáncer de próstata e individuos con enfermedades benignas pueden tener un componente inflamatorio en su urinary células. Por lo tanto, en el contexto de un diagnóstico precoz del cáncer de próstata, los resultados de un análisis de la integridad del ADN UCF podrían ser engañosa.
Se evaluó la integridad del ADN en la UCF 314 muestras de orina de pacientes con cáncer de próstata o cáncer de vejiga, los individuos sanos y asintomáticos, y los pacientes con enfermedades benignas del tracto urogenital. Se necesita un estudio prospectivo en una serie de casos más amplio para definir mejor el papel de este enfoque como un marcador de diagnóstico precoz de los cánceres del tracto urogenital.
Aunque poco se ha publicado sobre el tema del ADN UCF como fuente de biomarcadores para el cáncer, el interés en esta área es cada vez mayor. Recientemente, Togneri et al. 4 publicó un papel interesante en el que el ADN libre de células extraída del sobrenadante de la orina de pacientes con cáncer de vejiga demostró una mayor carga genoma tumor que la de ADN celular aislado a partir del sedimento de orina, lo que sugiere que el estudio de la fracción libre de célulasde ADN en la orina podría ser útil para caracterizar cánceres urológicos.
En nuestra experiencia, la prueba de la integridad del ADN UCF no resultó ser una buena prueba de diagnóstico precoz del cáncer de próstata. Por el contrario, mostró potencial como un marcador para la detección temprana de cáncer de vejiga cuando se utiliza en combinación con la citología de orina convencional. Actualmente se está planificando un estudio confirmatorio en una serie prospectiva caso más grande.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
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