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Genetics

एक GFP टैग TMEM184A का प्रयोग हेपरिन रिसेप्टर पहचान की पुष्टि के लिए निर्माण

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/55053
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Lehigh University, 2Department of Natural Science, DeSales University

Summary

carboxy टर्मिनस यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति के लिए डिजाइन पर एक GFP टैग के साथ एक निर्माण एन्कोडिंग TMEM184A, नाड़ी कोशिकाओं में एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की पहचान की पुष्टि करने के लिए डिज़ाइन किया गया assays में कार्यरत था।

Abstract

उपन्यास प्रोटीन समानता के आधार पर अलगाव और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के माध्यम से पहचान कर रहे हैं, वे अक्सर काफी हद तक uncharacterized हैं। भविष्यवाणी अनुक्रम के भीतर विशिष्ट पेप्टाइड्स के खिलाफ एंटीबॉडी कुछ स्थानीयकरण प्रयोगों अनुमति देते हैं। हालांकि, एंटीबॉडी के साथ अन्य संभावित बातचीत अक्सर बाहर नहीं किया जा सकता है। इस स्थिति में प्रोटीन अनुक्रम पर निर्भर assays का एक सेट विकसित करने का अवसर प्रदान किया। विशेष रूप से, एक निर्माण जीन अनुक्रम प्रोटीन के सी टर्मिनल अंत में GFP अनुक्रम कोडन करने के लिए मिलकर युक्त प्राप्त की और इन उद्देश्यों के लिए नियुक्त किया गया था। प्रयोगों स्थानीयकरण, ligand समानता को चिह्नित करने के लिए, और समारोह के लाभ मूल रूप से डिजाइन और बाहर ले एक हेपरिन रिसेप्टर 1 के रूप में TMEM184A की पहचान की पुष्टि करने के लिए किया गया। इसके अलावा, निर्माण झिल्ली टोपोलॉजी सवाल और विस्तृत प्रोटीन ligand बातचीत को संबोधित अध्ययन के लिए नियोजित किया जा सकता है। वर्तमान रिपोर्ट प्रस्तुत की गिरफ्तारीGFP-TMEM184A निर्माण नाड़ी कोशिकाओं में व्यक्त की है कि आसानी से अन्य उपन्यास प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है पर आधारित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का Ange।

Introduction

उपन्यास कार्यों के लिए उम्मीदवार प्रोटीन की पहचान अक्सर समानता के आधार पर अलगाव आंशिक अनुक्रम दृढ़ संकल्प के द्वारा पीछा प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है। नव पहचान प्रोटीन के हाल के उदाहरण transmembrane प्रोटीन 184A (TMEM184A), एक हेपरिन रिसेप्टर हेपरिन समानता बातचीत के बाद 1 की पहचान की है, और TgPH1, एक pleckstrin अनुरूपता डोमेन प्रोटीन है कि phosphoinositide पीआई (3,5) पी 2 2 बांधता शामिल हैं। अन्य उपन्यास प्रोटीन की पहचान ऐसी है कि विटामिन से, एट अल के रूप में पेप्टाइड्स के प्रत्यक्ष अनुक्रम विश्लेषण शामिल है। जो transmembrane पेप्टाइड्स इस्तेमाल किया पहले से uncharacterized जीन 3 से प्रोटीन उत्पादों की पहचान करने के लिए। इसी तरह, उपन्यास प्रोटीन दृश्यों की पहचान ऐसे नए 4TM प्रोटीन 4 की पहचान के रूप में पहले की विशेषता प्रोटीन परिवारों की खोज जैव सूचना विज्ञान का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। aquaporin परिवार जीन दृश्यों की परीक्षा अल हैइसलिए उपन्यास कार्यों 5 के साथ नए सदस्यों की पहचान के सामने आए। पहचान के बाद, प्रोटीन समारोह के विश्लेषण आम तौर पर एक अगला कदम है जो कभी कभी ऐसी aquaporin मामले के रूप में प्रोटीन समारोह की एक विशिष्ट परख का उपयोग कर जांच की जा सकती है।

जब संभव हो, एक नव पहचान प्रोटीन के समारोह में विशिष्ट enzymatic या इसी तरह इन विट्रो समारोह assays के साथ जांच की जा सकती है। क्योंकि उपन्यास प्रोटीन के कई कार्यों जटिल बातचीत है कि केवल बरकरार कोशिकाओं या जीवों में पाए जाते हैं, इन विट्रो assays में पर निर्भर हमेशा प्रभावी नहीं हैं। हालांकि, इन विवो assays के इस तरह है कि वे जीन क्रम पर निर्भर में तैयार किया जाना चाहिए। सेल संस्कृति, और / या साधारण मॉडल जीवों में, पछाड़ना प्रोटीन / समारोह पहचान 6 के लिए साक्ष्य का समर्थन प्रदान कर सकते हैं। पहचान के रूप में ऊपर उल्लेख किया उपन्यास प्रोटीन के साथ, यह समारोह पुष्टि करने के लिए अक्सर बस एक प्रोटीन नीचे दस्तक करने के लिए अपर्याप्त है एकविकास में विवो कार्यात्मक assays कि जीन क्रम पर निर्भर की डिजाइन उपन्यास प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है।

एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की हाल की पहचान (कि संवहनी चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में प्रसार modulates) आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और MALDI एमएस 1 का उपयोग, 7 assays के एक संग्रह को विकसित करने का अवसर पछाड़ना झुकेंगे पहचान के साथ अनुरूप परिणाम के बाद प्रदान की । हाल ही में एक समीक्षा पुष्टि की है कि हेपरिन कई वृद्धि कारक है, उनके रिसेप्टर्स, बाह्य मैट्रिक्स घटकों, कोशिका आसंजन रिसेप्टर्स, और अन्य प्रोटीन 8 के साथ विशेष रूप से सूचना का आदान प्रदान। नाड़ी तंत्र, हेपरिन और Heparan सल्फेट प्रोटेयोग्लाईकैन्स में (हेपरिन के लिए संरचना में समान Heparan सल्फेट चेन युक्त) कई सौ प्रोटीन 9 के साथ बातचीत। कार्यात्मक Tha पुष्टि करने के लिएटी TMEM184A हेपरिन तेज और बंधन के साथ शामिल किया गया था, तकनीक है कि TMEM184A के लिए जीन का निर्माण कार्यरत विकसित किए गए। वर्तमान रिपोर्ट एक GFP-TMEM184A पर आधारित assays का एक संग्रह एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की पहचान की पुष्टि के लिए उपयोग में निर्माण भी शामिल है।

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Protocol

1. एक GFP प्रोटीन निर्माण का डिजाइन

  1. खरीद, या डिजाइन और निर्माण, एक GFP टैग सवाल में प्रोटीन के आधार पर निर्माण।
    नोट: एक खरीदे निर्माण के लिए, मानक वैक्टर वाणिज्यिक प्रयोगशालाओं कि कुछ या निम्न सुझावों के सभी शामिल हैं से उपलब्ध हैं: एक झिल्ली प्रोटीन के लिए, GFP की एक सी टर्मिनल स्थान का चयन करें क्योंकि यह कम झिल्ली प्रोटीन की तस्करी के मामले में हस्तक्षेप करने की संभावना है। ब्याज की जीन और GFP अगर वहाँ प्रश्न में प्रोटीन की सी टर्मिनस दृढ़तापूर्वक प्रोटीन की एक डोमेन में जोड़ रहा है विश्वास करने का कारण है के बीच एक विस्तार पर विचार करें। सामान्य यूकेरियोटिक सेल अभिव्यक्ति के लिए निर्माण का चयन करें, लेकिन बैक्टीरियल प्रणालियों में उत्पादन का निर्माण अनुमति देते हैं। एक दरार साइट है जिसके द्वारा GFP यदि कुछ प्रयोगों जहां GFP प्रोटीन गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकता है के लिए वांछित हटाया जा सकता है (जैसे TEV प्रोटीज के लिए) के रूप में शामिल करें। अन्य सम्मिलित करता है इस तरह के स्थानीयकरण या में समानता के लिए एक अतिरिक्त टैग के रूप में जोड़ेteractions (जैसे, His6)। इस के साथ साथ वर्णित assays के लिए आवश्यक नहीं था, लेकिन अन्य assays की सुविधा हो सकता है, या उपयोगी सीधे जीन से सटे हो, GFP से पहले, GFP को हटाने के वांछित है।

2. नाड़ी कोशिकाओं में GFP-TMEM184A अभिव्यक्ति

  1. संस्कृति endothelial या के रूप में पहले से 1, 6, 7 सूचना 0.2% जिलेटिन लेपित टिशू कल्चर बर्तन पर संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं।
  2. 5 एमएल सेल संस्कृति trypsin समाधान जोड़ें (0.5% w / v) एक rinsed 100 मिमी, या बड़ा, कोशिकाओं का मिला हुआ डिश के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं सिर्फ थाली से जारी कर रहे हैं, और एक बाँझ polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण।
  3. के रूप में trypsin गतिविधि को सीमित करने के लिए, दिनचर्या संस्कृति में इस्तेमाल सेल / trypsin समाधान करने के लिए, एक trypsin अवरोध करनेवाला (जैसे, नियमित रूप से मध्यम संस्कृति के एक बराबर मात्रा) जोड़ें। approxim पर 5 मिनट के लिए गोली कोशिकाओंately 600 XG (या उचित गति और समय सिर्फ मानक टिशू कल्चर के लिए गोली कोशिकाओं के लिए)। सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  4. HeBS (Hepes बफर खारा) electroporation बफर के 1 एमएल में Resuspend कोशिकाओं, समय कोशिकाओं की मात्रा सीमित गोली या निलंबन में हैं। बर्फ पर सेल निलंबन की जगह और बर्फ पर बचे हुए चरणों को बाहर ले।
    नोट: गोली मेजबान से पहले HeBS के साथ एक बार धोया जा सकता है।
  5. GFP टैग TMEM184A प्लाज्मिड की पर्याप्त मात्रा कोशिकाओं को जोड़ने 20 माइक्रोग्राम / एमएल डीएनए के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए। एक GFP निर्माण के लिए एक समान प्रोटोकॉल का प्रयोग करें।
  6. एक electroporation क्युवेट में HeBS में सेल के समाधान के लिए लगभग 0.4 एमएल रखें। cuvettes का उपयोग करने से पहले प्री-ठंडा।
  7. निम्न शर्तों का उपयोग कोशिकाओं Electroporate: घातीय क्षय, 500 μF, ∞ ओम, और 170 वी
    नोट: एक दिया सेल प्रकार के लिए वोल्टेज अनुकूलित किया जाना चाहिए। endothelial और चिकनी पेशी सेल के साथ प्रारंभिक अध्ययनएल प्रकार इष्टतम वोल्टेज मूल्य यहाँ उल्लेख किया, जैसे 10 निर्धारित करने के लिए एक GFP-vinculin निर्माण के साथ पूरा किया गया।
    1. electroporation का अनुकूलन करने के लिए, उपकरण निर्माता की सिफारिशों (जो कुछ मानक प्रकार की कोशिकाओं के लिए शर्तों में शामिल है) के साथ शुरू करते हैं। वांछित निर्माण या एक नियंत्रण फ्लोरोसेंट प्रोटीन आकार और वांछित का निर्माण करने के लिए फ्लोरोसेंट विशेषताओं में इसी प्रकार के निर्माण का प्रयोग करें।
      नोट: छोटे न्यूक्लिक एसिड बड़े निर्माणों की तुलना में अधिक आसानी से कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए दिखाई देते हैं, तो केवल एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक निर्माण एक बड़ा एक से व्यक्त करने के लिए आसान हो सकता है।
    2. सेल व्यवहार्यता, जो कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट निर्माण 24 और 48 घंटे के बाद व्यक्त किया जाता है का प्रतिशत, और अभिव्यक्ति की तीव्रता का निर्धारण करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें।
      नोट: वोल्टेज और / या समय कम से थोड़ा यदि अस्तित्व कम है। कम से कम समय संस्कृति की सतह से कोशिकाओं की रिहाई और लौटने के बीच संभव के लिए निशाना लगाओसंस्कृति के लिए कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए। समय या एक दूसरे नाड़ी में मामूली वृद्धि का निर्माण तेज सुधार कर सकते हैं, तो अस्तित्व अधिक है और अभिव्यक्ति कम है। इष्टतम स्थिति और अभिव्यक्ति प्रकार की कोशिकाओं के बीच अलग अलग होंगे। निर्माण व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत अधिक है, लेकिन तीव्रता कम है, डीएनए एकाग्रता बढ़ती है और इष्टतम तीव्रता, जो प्रोटीन आधा जीवन के साथ ही अभिव्यक्ति के आधार पर अलग अलग होंगे लिए समय के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की निगरानी, ​​तीव्रता में सुधार हो सकता है। धुंधला तीव्रता, यदि आवश्यक हो तो, कुछ assays के लिए बढ़ाया जा सकता है विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ GFP के immunofluorescence धुंधला द्वारा
  8. electroporation के बाद, इमेजिंग के लिए या टिशू कल्चर बर्तन में coverslips के साथ छह 30 मिमी टिशू कल्चर कुओं में कोशिकाओं बीज। संस्कृति मानक सेल संस्कृति प्रक्रियाओं का उपयोग कोशिकाओं।
  9. वैकल्पिक: किसी भी HeBS electroporation बफर दूर करने के लिए 24 घंटे के बाद संस्कृति के माध्यम से बदलें।

3. GFP-TMEM का दृश्य184A स्थानीयकरण

  1. कम से कम 24 घंटे के लिए संवर्धन के बाद पीबीएस और कोमल झटकों के साथ कोशिकाओं कुल्ला। चमकदार रोशनी करने के लिए निवेश की सीमा GFP लुप्त होती बचने के लिए।
  2. कोमल झटकों के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। किसी भी मेथनॉल युक्त अभिकर्मकों जो कोशिकाओं permeabilize सकता प्रयोग से बचें। अगर यह आवश्यक ligand बातचीत का आकलन करने के लिए नहीं है मेथनॉल के साथ फिक्सेशन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    सावधानी: Paraformaldehyde विषैला होता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। एक धूआं हुड में प्रयोग करें, देखभाल के साथ, और ठीक से त्यागें।
  3. ऊपर के रूप में पीबीएस के साथ कुल्ला। एंटीबॉडी आधारित धुंधला के लिए, नीचे 3.6 देखें।
  4. माउंट Mowiol या अन्य उपयुक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग करने के लिए स्लाइड coverslips।
  5. छवि GFP उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ एक confocal या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइड। Confocal माइक्रोस्कोपी क्योंकि z विमान में नमूनों को अलग करने की क्षमता की वजह से पसंद किया जाता है। qu के लिए ग्रे स्केल में छवियों को बचानेTIF प्रारूप में antitation प्रयोजनों (चित्रों के लिए पूरे रंग छवियों के अलावा)।
  6. गुम्मट TMEM184A के साथ तुलना कोशिकाओं द्वारा व्यक्त के लिए, TMEM184A अनुक्रम से एक पेप्टाइड (एस) के लिए तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग immunofluorescence के लिए अन्य कोशिकाओं, जैसे तैयार 1। GFP-TEMEM184A की पहचान भी GFP के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। समान माइक्रोस्कोपी तकनीक से दोनों सेल के नमूने का मूल्यांकन।

4. rhodamine-हेपरिन बंधन और Colocalization GFP-TMEM184A ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ

  1. समझो 100 माइक्रोग्राम / एमएल rhodamine-हेपरिन के साथ GFP-TMEM184A व्यक्त कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से जोड़ा है, और कोशिकाओं समय की एक विशेष राशि, आम तौर पर A7r5 कोशिकाओं के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए सेते दें। कुल्ला और 3.1 और 3.2 के रूप में तय कर लो।
    नोट: इष्टतम समय और ligand की एकाग्रता सेल प्रतिक्रिया प्राप्त ligand और छवि तीव्रता के प्रतिदीप्ति तीव्रता पर निर्भर करते हैं। इस concentratहेपरिन के आयन क्योंकि यह अन्य assays के 11 में 50% से अधिक की प्रतिक्रिया में यह परिणाम कार्यरत था। यह एकाग्रता मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं, इसलिए इसे बढ़ाने के लिए आवश्यक नहीं था। कोशिकाओं में कम रोशनी में लेबल हटाया गया हेपरिन परिणामों के साथ rhodamine-हेपरिन के कमजोर पड़ने, इस प्रकार की छवि और यों तो और अधिक कठिन है।
  2. rhodamine-हेपरिन GFP-TMEM184A अभिकर्मक के कारण बाध्यकारी quantitate करने के लिए, ट्रांसफ़ेक्ट GFP-TMEM184A बिना समान कोशिकाओं तैयार करते हैं।
  3. छवि उचित GFP (488 एनएम) और rhodamine (543 एनएम) उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कोशिकाओं (500 - GFP के लिए 530 एनएम और rhodamine के लिए अधिक से अधिक 560 एनएम) मूल्यों सह स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए। कम से कम तीन अलग-अलग प्रयोगों से कम से कम 50 कोशिकाओं के चित्र प्राप्त करने के आँकड़े प्राप्त करने के लिए। प्रयोगों के भीतर समान सेटिंग्स को बनाए रखें, और वें (कोई उपचार के साथ जैसे, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं) एक नियंत्रण नमूना (ओं) को रोजगारपर कई प्रयोगों के विश्लेषण के लिए डेटा के मानकीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. एक कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग बंधन के quantitation के लिए प्रत्येक कोशिका में / तेज बाध्यकारी रिश्तेदार rhodamine निर्धारित करने के लिए छवियों की जांच करना।
    नोट: TIF छवियों के रूप में वे विश्लेषण के लिए सुविधाजनक हैं और कई कंप्यूटर प्रोग्राम में बड़े पैमाने ग्रे के लिए यदि वे शुरू में उस प्रारूप में बचाया नहीं थे परिवर्तित किया जा सकता नियोजित किया जाना चाहिए। छवि जम्मू (फ्रीवेयर) वर्तमान विश्लेषण में कार्यरत हैं और अनुमति देता क्षेत्र और पिक्सेल तीव्रता एक छवि में किसी भी उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्र के लिए मापा जा रहा था।
    1. एक फ्लोरोसेंट छवि के भीतर एक सेल चक्र और कहा कि अंतरिक्ष के भीतर तीव्रता का निर्धारण करने के उपाय के उपकरण का उपयोग करने के लिए एक उपकरण का उपयोग मुक्तहस्त।
      नोट: इन मापों एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित क्षेत्र (पूरे सेल, नाभिक, आदि) के विभिन्न geometries के साथ विभिन्न कोशिकाओं की तुलना करने के लिए एक तरीका प्रदान करने के लिए कुल तीव्रता गणना करने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं। मतलब पृष्ठभूमि के एक क्षेत्र में तीव्रता सूचित किया जा सकता है, और उस की सुविधाविश्लेषण के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता का संग्रह है।
    2. एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात क्षेत्र तीव्रता से गुणा गणना और क्षेत्र की है कि एक ही राशि के लिए पृष्ठभूमि घटाना। सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं / प्रयोग के लिए प्रतिदीप्ति / सेल औसत।

Rhodamine-हेपरिन को GFP-TMEM184A से 5. प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण

  1. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को तैयार है और 3.1 में के रूप में 200 माइक्रोग्राम / एमएल rhodamine टैग ligand के साथ सेते हैं। ध्यान दें कि फ्लोरोसेंट ligand के साथ ऊष्मायन समय सेल प्रकार निर्भर है। केवल पीएफए ​​के साथ फिक्स, और इमेजिंग के लिए स्लाइड माउंट।
  2. (-; झल्लाहट 685 एनएम 566) पहले, 405 एनएम और rhodamine उत्सर्जन के लिए छवि पर उत्तेजित। दूसरा, GFP (493 पर छवि - 530) के लिए 488 पर उत्तेजित, और तीसरा, (- 685 566 पर छवि) rhodamine के लिए 561 पर उत्तेजित। GFP-TMEM184A बिना या बिना rhodamine-हेपरिन नियंत्रण महत्वपूर्ण हैं।

6. rhodamine-Hepari का लाइव सेल इमेजिंगn तेज

  1. अलग-अलग रहते सेल इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया व्यंजन में GFP-TMEM184A ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं बीज और प्रोटोकॉल 3 के रूप में व्यवहार करते हैं।
    नोट: आवश्यक कोशिकाओं की संख्या सेल प्रकार और घनत्व वांछित पर निर्भर करता है। समय की राशि कोशिकाओं निलंबन में हैं कम से कम करने के लिए, कोशिकाओं की गिनती नहीं है। छह से 35 मिमी रहते इमेजिंग बर्तन में एक 100 मिमी मिला हुआ पकवान से बीज कोशिकाओं में 48 घंटे की कोशिकाओं के पास संगम प्राप्त करने के लिए।
  2. 48 घंटे के बाद, फिनोल लाल के बिना संस्कृति के माध्यम से मध्यम जगह।
  3. एक वार्मिंग मंच के साथ एक confocal खुर्दबीन के लिए कोशिकाओं की एक डिश हस्तांतरण तापमान को बनाए रखने, और माइक्रोस्कोप ध्यान दें।
  4. Pipet 100 माइक्रोग्राम / एमएल rhodamine-हेपरिन डिश में और धीरे मिश्रण।
  5. इसके तत्काल बाद लाइव छवियों रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। हेपरिन की कोई सेल तेज ध्यान में रखते हुए इस क्षेत्र के भीतर होता है, तो कम से कम एक हरे रंग की पुटिका rhodamine लेबल युक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए थोड़ा पकवान ले जाते हैं।
    नोट: इमेजिंग उत्तेजना और उत्सर्जन विशेष कर रहे हैंहेपरिन तेज प्रोटोकॉल (धारा 5) के रूप में ही। छवियों के बीच समय अवधि लगभग 16 एस था। प्रयोग और माइक्रोस्कोप की शर्तों को आम तौर पर जिस गति से छवियों प्राप्त किया जा सकता का निर्धारण करेगा।

संवर्धित कोशिकाओं से GFP-TMEM184A और GFP 7. अलगाव

  1. संस्कृति के माध्यम से दूर करने और पीबीएस के साथ rinsing के बाद, 2 एमएल 0.2% (w / v) CHAPS 1x पीबीएस (नियंत्रण बाध्यकारी assays के लिए) GFP-TMEM184A या GFP व्यक्त कोशिकाओं की एक 150 मिमी प्लेट के लिए प्रोटीज अवरोधकों के साथ समाधान जोड़ें। , पकवान से कोशिकाओं परिमार्जन बर्फ पर एक 15 एमएल polypropylene ट्यूब में कोशिकाओं / CHAPS समाधान जगह है, और दोहन से अच्छी तरह मिला लें। चमकदार रोशनी में सभी चरणों को पूरा सुनिश्चित करने के लिए GFP टैग नीचे बाध्यकारी परख के लिए प्रक्षालित है।
  2. विशेष रूप से बाध्य करने GFP-TMEM184A (या एक उपयुक्त GFP नियंत्रण), समाधान के लिए 2 माइक्रोग्राम / एमएल biotinylated विरोधी GFP एंटीबॉडी जोड़ें और कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  3. 500 μL जोड़ेकम से कम 5 एमएल 0.2% CHAPS / पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज पर लगभग 3 से 5 मिनट के लिए 600 XG को streptavidin-agarose मोतियों की। सतह पर तैरनेवाला निकालें। ताजा CHAPS / पीबीएस प्रत्येक समय के साथ दो बार दोहराएँ। एंटीबॉडी और सेल के समाधान के लिए मोती जोड़ें और मोती biotinylated विरोधी GFP GFP या GFP-TMEM184A के लिए बाध्य एंटीबॉडी के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देने के लिए कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  4. (7.3) के रूप में centrifuging द्वारा मोती गोली और अपार सामग्री को हटा दें। कम से कम 5 एमएल 0.2% CHAPS / पीबीएस / प्रोटीज अवरोधकों को धोने के लिए जोड़ें। दोहराएँ धोने और centrifugation कम से कम प्रभावी ढंग से किसी भी अपार प्रोटीन को हटाने के लिए 3x।
  5. अंतिम धोने के हटाने के बाद, 3 मिनट के लिए बर्फ पर (एचसीएल का उपयोग करने के लिए 2.0 पीएच) एंटीबॉडी GFP बाध्यकारी (मुक्त GFP-TMEM184A या मुफ्त में जिसके परिणामस्वरूप अलग कर देना पीबीएस में 0.2 एम ग्लाइसिन / 0.2% CHAPS के 1 एमएल के साथ मोती सेते GFP)। हर 30 एस दोहन से धीरे मिलाएं।
  6. अपकेंद्रित्र में लगभग 600 XG और शुद्ध पी युक्त सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण5 एमएल के 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (7 पीएच को लाने के लिए) के साथ तत्काल निराकरण के बाद एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब को rotein।
  7. नमूना 10,000 डाल्टन आणविक वजन कट ऑफ केन्द्रापसारक concentrator का उपयोग ध्यान (centrifugation गति आपूर्तिकर्ता द्वारा सिफारिश को रोजगार)। जब मात्रा लगभग 0.5 एमएल तक पहुँच जाता है, 0.2% CHAPS / पीबीएस जोड़ें। ध्यान दे और अधिक 0.2% CHAPS जोड़ने जारी / पीबीएस तक 0.2% CHAPS के कम से कम दस खंडों (बार प्रारंभिक नमूना मात्रा) / पीबीएस जोड़ा गया है।
  8. पृथक GFP या GFP टैग प्रोटीन की मात्रा के एक अनुमान का निर्धारण करने के लिए, 280 एनएम पर पढ़ने एक absorbance प्राप्त करने और एक ही बफर में गोजातीय सीरम albumin या अन्य नियंत्रण प्रोटीन से तैयार एक मानक वक्र की तुलना करें।
    नोट: विलुप्त होने के गुणांक मतभेद के कारण, इस एकाग्रता एक अनुमान है, लेकिन नमूना बर्बाद कर के बिना आगे के विश्लेषण की सुविधा के लिए एक अनुमानित प्रोटीन एकाग्रता प्रदान कर सकते हैं। सटीक प्रोटीन एकाग्रता रोकते जा सकती हैएक माइक्रो लौरी प्रोटीन नमूना के रूप में ही बफर में मानक प्रोटीन तैयार करने के लिए कुछ कर रही है परख का उपयोग खनन। पृथक प्रोटीन के आगे विश्लेषण पृथक प्रोटीन की भविष्यवाणी की आणविक वजन करने के लिए और तुलना (GFP के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने का उपयोग) के पश्चिमी सोख्ता द्वारा पूरा किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, TMEM184A एंटीबॉडी के उपयोग की भविष्यवाणी का निर्माण आकार के एक बैंड में परिणाम चाहिए, लेकिन यह भी एक गुम्मट TMEM184A बैंड में परिणाम हो सकता है यदि dimers (या उच्च आदेश oligomers) नमूने में मौजूद हैं। पवित्रता का अनुमान प्रारंभिक सामग्री के एक विभाज्य से अलग नमूना कुल प्रोटीन बनाम से कुल प्रोटीन के लिए एक धब्बा धुंधला द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

8. इन विट्रो हेपरिन बाध्यकारी परख

  1. 200 μL 0.2% CHAPS साथ / पीबीएस तीन बार 5 मिनट के लिए झटकों से धोने से एक काले रंग की avidin लेपित 96 अच्छी तरह से थाली तैयार करें। एक समान काला noncoated 96 अच्छी तरह से थाली में एक ही कपड़े धोने की प्रक्रिया को रोजगार के लिए तैयार करें। एक तैयार करेंप्रयोगात्मक के नमूने (तीन प्रतियों में) के लिए लेआउट परख के दौरान पालन करने के लिए। GFP के विरंजन पुष्टि करने के लिए हेपरिन बिना मानक हेपरिन सांद्रता, बफर नियंत्रण, और GFP के नमूनों के साथ कुओं के लिए कुओं को शामिल करें।
    नोट: अनुकूलित अलगाव या ligand बातचीत बफ़र्स प्रश्न में प्रोटीन के लिए अलग कर रहे हैं, तो प्लेट की तैयारियाँ और इष्टतम बफर सिस्टम के साथ कपड़े धोने की सब करते हैं।
  2. 60 pmol / अच्छी तरह से biotinylated विरोधी GFP के 100 μL avidin लेपित प्लेट में सभी कुओं जहां GFP बंधन वांछित है जोड़ें। एंटीबॉडी की राशि सिर्फ कुओं में उच्च आत्मीयता avidin तर करने के लिए पर्याप्त है।
    1. बफर केवल सभी कुओं नियंत्रण के प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है (कोई GFP या GFP-TMEM184A बंधन वांछित) में जोड़े। वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक थाली कवर के साथ कुओं सील। आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं, झटकों के साथ।
      नोट: खंड कुओं और ऊष्मायन बार करने के लिए जोड़ा प्रदाता से सिफारिशों के आधार पर कर रहे हैं।
  3. सभी कुओं तीन बार धोएं200 μL 0.2% CHAPS / पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए।
  4. 5 nmol / अच्छी तरह से GFP-TMEM184A या GFP के 100 μL avidin लेपित थाली में कुओं उचित और झटकों के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते में जोड़े। 8.3 के रूप में फिर से धो लें।
    नोट: प्रोटीन का यह एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए कि सभी साइटों के अतिरिक्त GFP या GFP-TMEM184A के साथ संतृप्त कर रहे थे चुना गया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रोटीन का एक ही राशि में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए बाध्य है महत्वपूर्ण है। प्रोटीन की कम मात्रा भी साइटों एक संभावना है कि अनबाउंड प्रोटीन थाली के साथ प्रोटीन की कई सांद्रता incubating और अपार प्रोटीन की तुलना और assays बाध्यकारी ligand के बाद शेष मूल्यांकन द्वारा जांच की जा सकता तर हो सकता है।
  5. Fluorescein लेबल हेपरिन के विभिन्न सांद्रता, तैयार करें जैसे, 10, 25, 50, 75, 100, 200 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.2% CHAPS में / पीबीएस। अंधेरे में यह सब और शेष काम करो।
    नोट: सांद्रता तैयारी के लिए पहले, दूसरे ligands के लिए विशिष्ट सांद्रता protei के लिए निर्धारित किया जाना चाहिएसवाल में n लक्ष्य। सबसे कम एकाग्रता प्लेट रीडर में पहचाने जाने होना चाहिए। इसलिए यह पहली श्रृंखला है कि नियोजित बफर सिस्टम में सही पता लगाया जा सकता है निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। तब सीमा दर्जे का बाध्यकारी प्राप्त करने की आवश्यकता का निर्धारण। 10 माइक्रोग्राम / एमएल नीचे fluorescein-हेपरिन की सांद्रता लगातार बफर की स्थिति कार्यरत तहत प्लेट रीडर में पंजीकृत नहीं किया। इसी प्रकार, जबकि rhodamine-हेपरिन जैसे अन्य assays में इस्तेमाल किया, प्लेट रीडर में देखे जा सकते हैं बफर की स्थिति में और बाध्यकारी के लिए आवश्यक मात्रा में, मानकों के लिए प्रतिदीप्ति रीडिंग कि fluorophore साथ reproducibly अलग नहीं थे।
  6. दोनों avidin में लिपटे और गैर-लेपित थाली में avidin लेपित प्लेट और एकाग्रता मानक कुओं में उचित परीक्षण कुओं को fluorescein-हेपरिन के 100 μL जोड़ें। झटकों के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। अंधेरे में प्लेटों रखें (या पन्नी कवर)।
  7. एक थाली वजह का प्रयोगder, दोनों प्लेटों और प्रारंभिक प्रतिदीप्ति (कुल) कुओं से स्थिर GFP-TMEM184A साथ avidin लेपित थाली में उत्सर्जन या GFP के नियंत्रण कुओं में हेपरिन से प्रारंभिक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन रिकॉर्ड है। यदि आवश्यक हो, निम्नतम और उच्चतम सांद्रता के बीच फ्लोरोसेंट हेपरिन का पता लगाने को सुनिश्चित करने के साधन लाभ को समायोजित।
    ध्यान दें: कुछ प्लेट पाठक ऊपर से कुओं पढ़ता है और कुओं में अधिकतम स्थान पर पढ़ता है कि अगर समायोज्य है। सवाल में अध्ययन के लिए, अधिकतम स्थान कुओं नीचे के बारे में 75% थी। सूचना प्लेट पाठक के साथ उपलब्ध सुझाव है कि काले प्लेटों में ही नमूने के assays पढ़ने के लिए प्रश्न में प्लेट पाठक के लिए अद्वितीय हैं प्रदान करना चाहिए।
  8. स्थिर GFP-TMEM184A या GFP के साथ कुओं से अपार फ्लोरोसेंट हेपरिन निकालें और गैर-लेपित काले रंग की थाली में इसी कुओं में जगह है। इसके तत्काल बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पढ़ें।
  9. 100 μL ताजा 0.2% CHAPS जोड़ें / पीबीएस वापस intओ कुओं से fluorescein-हेपरिन हटा दिया, और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पढ़ा था।
  10. 8.9 3x - दोहराएँ 8.8 कदम।
    नोट: लेपित थाली से ये रीडिंग fluorescein GFP या GFP-TMEM184A कुओं में शेष हेपरिन संकेत मिलता है। महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति तीसरे अपार नमूने में पाया जाता है, तो एक अतिरिक्त धोने हो जाना चाहिए। प्रतिदीप्ति प्रत्येक धोने में हटाया जा रहा है, ligand के बंधन आत्मीयता के कम हो सकता है, और शर्तों को फिर से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। अंतिम पढ़ने बाध्य हेपरिन पढ़ने का गठन किया।
  11. हटा दिया, अबाध, noncoated थाली में नमूने, प्रत्येक धोने के लिए संख्या प्राप्त करने से रिकार्ड प्रतिदीप्ति उत्सर्जन। ये "अनबाउंड" रीडिंग कर रहे हैं।
  12. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ा हेपरिन का सही स्तर पुष्टि करने के लिए 8.7 में प्राप्त कुल हेपरिन उत्सर्जन मूल्यों का प्रयोग करें। मूल्यों से औसत पृष्ठभूमि रीडिंग घटाएँ।
    नोट: वेल्स किसी भी fluorescein-हेपरिन बिना एंटीबॉडी, GFP और बफर के कारण पृष्ठभूमि के रूप में सेवा करते हैं। averagई पृष्ठभूमि पृष्ठभूमि मूल्य प्राप्त करने के लिए दोहराता है। बाध्य और अबाध रीडिंग से घटाना औसत पृष्ठभूमि रीडिंग वास्तविक मूल्यों को पाने के लिए।
  13. उत्सर्जन के एक भूखंड को रोजगार बनाम कुल fluorescein-हेपरिन उत्सर्जन बनाम हेपरिन की राशि के पैमाने निर्धारित करने के लिए कहा।
    नोट: एंटीबॉडी अकेले, या एंटीबॉडी और एंटीजन प्रतिदीप्ति के कुछ शमन में हुई। इसलिए, कुल हेपरिन कुल जोड़ा हेपरिन 8.7 में नोट के आधार पर निर्धारित किया गया था।
  14. दोनों GFP-TMEM184A मामले और GFP मामले में triplicates के लिए सही बाध्य हेपरिन बनाम जोड़ा हेपरिन प्लॉट।
  15. एक विशिष्ट एकाग्रता के लिए सभी washes से अपार रीडिंग जोड़कर मुक्त ligand निर्धारित करते हैं।

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Representative Results

जबकि, सिद्धांत रूप में, किसी भी डीएनए के अभिकर्मक कोशिकाओं lipophilic अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ पूरा किया जा सकता है में निर्माण, पिछली रिपोर्टों GFP के और अधिक प्रभावी अभिकर्मक electroporation 12 का उपयोग कर endothelial कोशिकाओं में constructs संकेत मिलता है। यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल आम तौर पर प्राथमिक व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का इस्तेमाल किया 80% से अधिक में अभिव्यक्ति GFP-निर्माण हासिल की। नियोजित निर्माण के डिजाइन एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली है कि इस निर्माण तेजी से पहुंचा सकता है इस्तेमाल किया। प्रमुख उद्देश्य का उपयोग, स्थान के मुद्दों, झिल्ली को इसलिए सही वितरण पर ध्यान केंद्रित किया गया इष्टतम यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति और निरंतर निर्माण उत्पादन प्राथमिक आधार के साथ साथ थे। अन्य कारणों में शामिल हो सकते हैं: एक सी टर्मिनस कि एक जोड़ क्षेत्र का हिस्सा है, wanti की संभावना के साथ अलग ढंग से स्थानीय प्रोटीन या प्रोटीन के लिए GFP के विभिन्न स्थानएनजी GFP (एक प्रोटीज दरार साइट को जोड़ने), और एक माध्यमिक समानता साइट हटा दें। उत्तरार्द्ध GFP निर्माण सफ़ाई और बाध्यकारी परख के लिए एक सतह पर यह स्थिर करने के वैकल्पिक तरीके प्रदान करेगा। TMEM184A के खिलाफ विभिन्न वाणिज्यिक एंटीबॉडी के लिए धुंधला पैटर्न पुष्टि करने के लिए, नाड़ी कोशिकाओं GFP-TMEM184A वाणिज्यिक एंटीबॉडी के साथ दाग समान कोशिकाओं की तुलना में थे। GFP-TMEM184A है, जो कम से कम 72 घंटे से अधिक जमा करने के लिए दिखाई दिया की अभिकर्मक प्रभावों वितरण के बाद समय की लंबाई। अभिकर्मक इष्टतम अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप के बाद समय की लंबाई सेल प्रकार से भिन्न होता है और प्रत्येक तकनीक के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। समय के साथ, और अधिक GFP लेबल पेरी परमाणु क्षेत्र में था। हैंडलिंग पर निर्भर करता है, GFP विरंजन भी हुई। परिणाम कोशिका की सतह पर और TMEM184A एंटीबॉडी धुंधला (चित्रा 1) के साथ मनाया स्थानीयकरण के समान पेरी परमाणु और अन्य पुटिका संरचनाओं में GFP TMEM184A संकेत दिया। में प्राथमिक कोशिकाओं चित्रा 5 जहां तकनीक को भी झिल्ली टोपोलॉजी का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था में दिखाया जाता है।

एक फ्लोरोसेंट ligand (rhodamine-हेपरिन) के उपयोग के समय के साथ ligand और रिसेप्टर के सह स्थानीयकरण के मूल्यांकन में मदद की है, और दो लेबल यह संभव बाहर रहते इमेजिंग (चित्रा 2 और मूवी 1) ले जाने के लिए बनाया है। चित्रा -2 सी 405 एनएम पर रोमांचक GFP से ली गई है, लेकिन rhodamine (मध्य चित्र) से उत्सर्जन पर कब्जा। GFP उत्तेजना 405 एनएम सीमित उत्सर्जन उपज के रूप में अच्छी तरह से सीमित है, लेकिन इस rhodamine की उत्तेजना और एक झूठी संकेत झल्लाहट रोका। इसी तरह, झल्लाहट inducएड rhodamine उत्सर्जन बेहोश हो गया था। केवल rhodamine-हेपरिन के साथ GFP-TMEM184A अभिव्यक्ति के साथ नियंत्रण है, लेकिन कोई rhodamine-हेपरिन, और दूसरों में 405 एनएम उत्तेजना के साथ कोई rhodamine उत्सर्जन वहां गया था। बाद में, कुल GFP (बाएं चित्र) और कुल rhodamine (सही चित्र) प्रत्येक fluorophore के लिए मानक / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके मापा गया था। सी में डेटा आगे ligand और GFP-TMEM184A के सह स्थानीयकरण समर्थन करते हैं। RAOEC में rhodamine-हेपरिन तेज अब ऊष्मायन के लिए आवश्यक A7r5 कोशिकाओं की तुलना में। झल्लाहट के लिए कोई सबूत नहीं rhodamine-हेपरिन के बिना या untransfected कोशिकाओं में कोशिकाओं में मनाया गया। एक आदर्श प्रयोग एक और सतह GFP-निर्माण है कि ligand के साथ कोई सह स्थानीयकरण होना चाहिए शामिल होगा।

अधिग्रहण या समारोह की वसूली भी GFP प्रोटीन निर्माणों और rhodamine-हेपरिन के साथ पूरा किया जा सकता है। यह अभिव्यक्ति के स्तर और ligand सह के लिए साक्ष्य के रूप में GFP का उपयोग करने का अवसर प्रदान कियास्थानीयकरण और बातचीत यों की। विशेष रूप से, हेपरिन तेज GFP-TMEM184A में वृद्धि की गई थी का निर्माण ट्रांसफ़ेक्ट A7r5 कोशिकाओं (चित्रा 3)। स्थिर पछाड़ना कोशिकाओं जो बहुत ही सीमित rhodamine-हेपरिन हाथ में ले लिया 1 उत्पादन किया गया था, और ये एक ऐसी प्रणाली है, जहां समारोह का लाभ मूल्यांकन किया जा सकता प्रदान की है। GFP-TMEM184A निर्माण के अभिकर्मक कोशिकाओं है कि फिर से जंगली प्रकार की कोशिकाओं या ऊपर (चित्रा 3) के स्तर पर rhodamine-हेपरिन भली सका में हुई। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि "कोई हेपरिन" छवि स्थिर पछाड़ना कोशिकाओं है, जो पछाड़ना निर्माण के लिए एक पत्रकार के रूप में GFP व्यक्त करते की है। के रूप में छवि में दिखाया गया में मनाया पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति इन कोशिकाओं में अधिक था।

यह ligand के साथ बातचीत के दौरान अन्य प्रोटीन की संभावना को कम करने के लिए ligand विशिष्टता के निर्धारण के लिए पृथक रिसेप्टर का उपयोग करने के लिए आम तौर पर उपयोगी है। एक GFP-protei का उपयोगn निर्माण GFP टैग प्रोटीन के अलगाव के लिए संभाल के रूप में सेवा कर सकते हैं के रूप में इस संबंध में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है और अतिरिक्त प्रोटीन के साथ एंटीबॉडी या अन्य आकर्षण अभिकर्मकों के संभावित बातचीत से बचा जाता है। GFP भी कोशिकाओं के समान आबादी में व्यक्त किया जा सकता है और एक ही GFP समानता प्रक्रिया का उपयोग कर अलग किया। इस ligand बातचीत के अध्ययन के लिए एक नियंत्रण प्रोटीन प्रदान करता है। TMEM184A प्रणाली में, GFP-TMEM184A का उपयोग कर एक विरोधी GFP एंटीबॉडी समानता प्रक्रिया विशिष्ट, saturable हेपरिन में हुई बंधन, जबकि नियंत्रण GFP किसी भी हेपरिन (चित्रा 4) के लिए बाध्य नहीं किया अलग।

आमतौर पर, निर्माणों पर GFP टैग एक प्रोटीन का एक छोर पर रखा जाता है। सी टर्मिनल स्थान एक झिल्ली को सही प्रोटीन की तस्करी की सुविधा। इसलिए, एक झिल्ली का एक विशेष पक्ष पर GFP की उपलब्धता एक झिल्ली प्रोटीन के विशिष्ट टोपोलॉजी के लिए सबूत प्रदान कर सकते हैं, तो तह और टोपोलॉजी नहीं एक हैंlready जाना जाता है। (जैसे चित्रा 5) के रूप में GFP के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सरल immunofluorescence धुंधला GFP स्थान गैर permeabilized कोशिकाओं में एंटीबॉडी का उपयोग पर आधारित का सबूत प्रदान कर सकते हैं। विरोधी GFP एंटीबॉडी भले ही प्रक्षालित GFP को पहचानते हैं। Immunofluorescent चित्रा 5 में दिखाया धुंधला GFP-TMEM184A ट्रांसफ़ेक्ट प्रारंभिक सबूत है कि प्लाज्मा झिल्ली में GFP कोशिकी है प्रदान कोशिकाओं के permeabilization के बिना महत्वपूर्ण विरोधी GFP धुंधला चलता है। जाहिर है, पुटिकाओं में intracellular प्रोटीन भी permeabilized कोशिकाओं में दाग हो जाता है। चित्रा -2 में झल्लाहट छवियों को इस प्रस्तावित टोपोलॉजी के साथ संगत कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: कोशिकाओं में GFP-TEMEM184A स्थानीयकरण पुष्टि TMEM184A स्थानीयकरण इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा निर्धारित की। GFP-TMEM1 साथ ए) BAOECs ट्रांसफ़ेक्ट84A 4% पीएफए ​​के साथ तय किया गया। Nontransfected कोशिकाओं या तो बहुत ठंडा मेथनॉल (MeOH) फिक्सिंग और permeabilization या 4% पीएफए ​​(के रूप में विख्यात) ट्राइटन X-100 permeabilization के द्वारा पीछा के साथ कार्रवाई कर रहे थे। nontransfected कोशिकाओं TMEM184A (सीटीडी) से एक सी टर्मिनल पेप्टाइड के खिलाफ एक एंटीबॉडी या TMEM184A (NTD) से एक एन टर्मिनल पेप्टाइड और एक माध्यमिक विरोधी खरगोश एंटीबॉडी TRITC के साथ टैग का उपयोग कर दाग रहे थे। बी) के क्लोन (A7r5 के उदाहरण) और प्राथमिक (BAOSMC) चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं इसी तरह प्रोसेस किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: rhodamine-हेपरिन के साथ GFP-TMEM184A की इमेजिंग। GFP-TMEM184A साथ ए) electroporated A7r5s के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल rhodamine-हेपरिन के साथ इलाज किया गयाकई बार संकेत दिया है और उसके बाद 4% पीएफए ​​के साथ तय की। छवियों दो अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। बी) A7r5 कोशिकाओं के साथ GFP-TMEM184A और rhodamine-हेपरिन तत्काल लाइव इमेजिंग के साथ जोड़ा गया था ट्रांसफ़ेक्ट थे। फिल्म के चयनित फ्रेम एक सफेद खड़ी बार एक GFP-लेपित rhodamine-हेपरिन युक्त पुटिका की प्रारंभिक स्थानीयकरण की ओर इशारा करते के साथ दिखाया गया है। GFP लेबल और rhodamine एक साथ चलते हैं। स्केल सलाखों = 2 माइक्रोन। सी) ए में के रूप में इलाज RAOECs, 405 (GFP पर रोमांचक द्वारा प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के लिए imaged थे झल्लाहट के लिए) और तुलना मानक सेटिंग करने के लिए, प्रोटोकॉल 3.5 देखें। पैनल, और बी में दो समय अंक, मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किए गए थे। प्यूघ, आरपी, एट अल। 1। कॉपीराइट जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी। वी के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

चित्र तीन
चित्रा 3: GFP-TMEM184A अभिकर्मक समारोह का लाभ प्रदान करता है। ए) गौरतलब rhodamine-हेपरिन के निचले स्तर पर जंगली प्रकार A7r5s की तुलना में स्थिर पछाड़ना A7r5 कोशिकाओं में देखा जाता है, उदाहरण के लिए छवियों को देखते हैं। "कोई हेपरिन" छवि स्थिर पछाड़ना कोशिकाओं है कि निर्माण उपस्थिति का एक मार्कर के रूप में व्यक्त GFP की है। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। बी) दोनों प्रकार के जंगली और स्थिर पछाड़ना कोशिकाओं में GFP-TMEM184A के अभिकर्मक काफी इन तीन स्वतंत्र प्रयोगों में 50 से अधिक कोशिकाओं / स्थिति के विश्लेषण के आधार पर कोशिकाओं में rhodamine-हेपरिन संकेत बढ़ जाती है। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। पी <0.0001 एक Tukey परीक्षण पर आधारित है। यह आंकड़ा मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। प्यूघ, आरपी, एट अल। 1। कॉपीराइट जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: पृथक GFP-TMEM184A बांध हेपरिन। GFP-TMEM184A या GFP पृथक और avidin लेपित परख प्लेटों के लिए बाध्य किया गया था। Fluorescein-हेपरिन 1.111 nmol के माध्यम से 0.056 nmol से सांद्रता में जोड़ा गया है। हेपरिन बाध्य 519 एनएम पर उत्सर्जन को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था। GFP-TMEM184A (वर्ग)। GFP नियंत्रण (हलकों)। यह आंकड़ा मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। प्यूघ, आरपी, एट अल। 1। कॉपीराइट जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी। _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: GFP-TMEM184A और झिल्ली टोपोलॉजी। GFP-TMEM184A ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं या तो 4% पीएफए ​​(ऊपर) के साथ तय की या 4% पीएफए ​​के साथ तय की और ट्राइटन X-100 (नीचे) का उपयोग permeabilized थे। प्रकोष्ठों विरोधी GFP प्राथमिक एंटीबॉडी और Cy3 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ हूबहू दाग रहे थे। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। दो अलग-अलग प्रयोगों से पता चला रहे हैं। माध्यमिक केवल सना हुआ कोशिकाओं अनिवार्य रूप से कोई धुंधला दिखाया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
पलोड करें / 55053 / movie.mp4 "लक्ष्य =" _blank "> फिल्म 1:।। rhodamine-हेपरिन के साथ GFP-TMEM184A का लाइव इमेजिंग (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) A7r5 कोशिकाओं चित्रा 2B में के रूप में इलाज किया गया फिल्म GFP- दिखाता है TMEM184A और एक साथ आगे बढ़ शीर्ष पर rhodamine-हेपरिन पुटिका। फिल्म के विलय संस्करण के अलावा अलग-अलग रंग संस्करणों दिखाए जाते हैं। GFP के साथ पुटिका और युक्त rhodamine परिक्रमा कर रहा है।

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Discussion

यहां बताया प्रोटोकॉल नाड़ी कोशिकाओं 1 में एक हेपरिन रिसेप्टर के रूप में TMEM184A की पहचान के लिए पुष्टि सबूत प्रदान करने के लिए डिजाइन किए गए थे। पछाड़ना तकनीक को नियमित उपन्यास प्रोटीन की पहचान की पुष्टि के लिए एक तंत्र के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, पछाड़ना के बाद कुछ कार्यात्मक हानि आमतौर पर पर्याप्त सबूत है कि एक उम्मीदवार प्रोटीन वास्तव में सही है रिसेप्टर (या अन्य कार्यात्मक प्रोटीन) नहीं है। यह भी सबूत है कि उम्मीदवार प्रोटीन वास्तव में समारोह दर्शाती है करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक उपन्यास GFP के साथ टैग जीन के लिए एक निर्माण को रोजगार समारोह प्रयोगों के लाभ में सक्षम बनाता है और GFP समानता के आधार पर टैग प्रोटीन के अलगाव की सुविधा। इस प्रोटोकॉल में कार्यरत electroporation निर्माण के बहुत उच्च अभिकर्मक दक्षता सुगम (कोशिकाओं के 80% से अधिक का निर्माण व्यक्त)। हालांकि, अन्य अभिकर्मक तंत्र यदि electroporation उपलब्ध है या नहीं वांछित नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता। वहाँ एक उपन्यास प्रोटीन समारोह की पुष्टि के लिए एक GFP टैग निर्माण का चयन करने के कई फायदे हैं। सबसे पहले, GFP अभिकर्मक और जीन अभिव्यक्ति के लिए एक पत्रकार के रूप में कार्य करता है और यह overexpression GFP के माध्यम से नजर रखी जा करने के लिए अगर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के बिना एक सेल लाइन उपलब्ध नहीं है की अनुमति देता है। दूसरा, GFP टैग प्रोटीन है कि या तो ligand संबंध या पेप्टाइड्स के खिलाफ एंटीबॉडी पर निर्भर नहीं करता है की शुद्धि के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। तीसरा, GFP टैग जटिल immunofluorescent स्थानीयकरण जांच करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन अनुक्रम में अद्वितीय पेप्टाइड्स के खिलाफ उत्पन्न एंटीबॉडी का उपयोग visualized लिए तय है कि वास्तविक जीन उत्पाद इसी तरह स्थानीय है एक उपकरण प्रदान करता है।

जीन निर्माणों के साथ समारोह assays के लाभ उपन्यास प्रोटीन समारोह 13 की पहचान के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग सहित प्रयोजनों के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। आदर्श रूप में, समारोह assays के लाभ एक अच्छी तरह से अध्ययन क्लोन सेल ली रोजगार होगाne कि प्रश्न में जीन (कोशिकाओं को अभी भी जीन उत्पादों है कि नव व्यक्त जीन के कार्य की अनुमति सहयोग व्यक्त करना चाहिए) व्यक्त नहीं करता है। वर्तमान assays में के रूप में एक विशिष्ट GFP टैग निर्माण का उपयोग करते हैं, यह कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए जो में GFP प्रोटीन कार्य कर सकते हैं महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, कोशिकाओं की पसंद समारोह पर निर्भर करता है और, अधिक संभावना है, सेल प्रकार जो इस समारोह में सामान्य रूप से सुनिश्चित करने के लिए सहयोग प्रोटीन मौजूद हैं घटित होता है। GFP-टैगिंग मामले में जहां GFP टैग प्रोटीन की प्रतिदीप्ति एक कार्यात्मक परख के हिस्से के रूप में पीछा किया जा सकता निगरानी समारोह का एक अतिरिक्त तरीका अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, आंकड़े 2 और वहाँ 3)। इन अध्ययनों के लिए एक सीमा हो सकता है अगर किसी भी तरह GFP प्रोटीन समारोह बदल। प्रोटीन की सी टर्मिनस के लिए GFP जोड़ने के द्वारा, प्रोटीन की बड़ी संख्या को पहले से ही स्पष्ट कार्यात्मक परिवर्तन के बिना अध्ययन किया गया है, लेकिन ऐसी संभावना मौजूद है।

Radioisotopically लेबल ligands अक्सर बरकरार कोशिकाओं 11 के लिए बाध्य ligand अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, उन assays बाध्यकारी के बाद ligand स्थान के सरल निर्धारण की अनुमति नहीं है, और न ही वे ligand और रिसेप्टर एक साथ की तुलना की सुविधा वर्तमान रिपोर्ट में के रूप में करना। एक GFP का निर्माण भी यहाँ के रूप में एक लेबल झिल्ली प्रोटीन की जांच करने के लिए आगे अवसर प्रदान करता है। क्योंकि GFP टैग के सी टर्मिनल स्थान की, यह एक परख भर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में GFP टैग के स्थान की जांच करने के लिए संभव है। GFP के लिए एंटीबॉडी का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस GFP के साथ और permeabilization के बिना (चित्रा 5) एंटीबॉडी के लिए सुलभ की तुलना की अनुमति देता है। GFP-TMEM184A के अतिरिक्त अनुप्रयोगों जैसे rhodamine-हेपरिन (चित्रा 2) के साथ colocalization के रूप में GFP इमेजिंग का लाभ ले। झल्लाहट को रोजगार के रूप में दिखाया गया -2 rhodamine-हेपरिन उत्तेजित करने के लिए GFP से उत्सर्जन की अनुमति के लिए बाध्यकारी और intracellular टीआरए मूल्यांकन करने के लिए एक दिलचस्प तरीका प्रदान करता हैfficking। इसके अलावा, आंकड़ों से संकेत मिलता है कि GFP उत्तेजना हस्तांतरण करने के लिए rhodamine-ligand के लिए काफी करीब (10 एनएम के भीतर) है झल्लाहट। सबूत है कि एक ligand कार्यों के लिए GFP से इस तरह के हस्तांतरण parathyroid tetramethyl-rhodamine 14 के साथ टैग हार्मोन के लिए प्रकाशित किया गया है। वैकल्पिक झल्लाहट प्रौद्योगिकी (तस्वीर विरंजन और / या कंप्यूटर पर ही आधारित इमेजिंग पैटर्न) भी यहाँ एक उदाहरण के रूप में क्या दिखाया गया है की तुलना में अधिक जटिल विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है। इसी तरह, उम्मीदवार के साथ अन्य प्रोटीन की बातचीत EGFP / mCherry प्रणाली Albertazzi एट अल द्वारा रिपोर्ट के रूप में झल्लाहट के लिए अनुकूलित फ्लोरोसेंट टैग के साथ झल्लाहट का उपयोग कर जांच की जा सकती है। 15 और CFP / YFP और GFP जोड़े और वांग द्वारा पोटेशियम चैनल के अध्ययन के सहयोगियों ने 16 में इस्तेमाल किया। कई नए छोटे फ्लोरोसेंट अणु उदाहरण 17 के लिए तैयार किया जा रहा हैं। इन अणुओं मामलों में जहां GFP टैग प्रोटीन और एफ के बीच बातचीत झल्लाहट की संख्या में वृद्धि होगीluorescent ligands की जांच की जा सकती है। भविष्य के अध्ययन को भी निशाना बनाया शामिल कर सकते हैं जीन में परिवर्तन, निर्माण जीन समारोह के अनुक्रम विशिष्ट पहलुओं निर्धारित करने में मदद करने के लिए अनुमति देता है। GFP टैग झिल्ली प्रोटीन के लिए एक सीमा है जब प्रोटीन की सी टर्मिनस सामान्य रूप से अंदर है। ऐसे मामलों में, झल्लाहट फ्लोरोसेंट पानी में घुलनशील ligands के साथ assays संभव नहीं हो सकता। हालांकि, वैकल्पिक तंत्र का निर्माण में कहीं GFP जगह के लिए अभी भी कुछ इस तरह के प्रोटीन के लिए संभव हो सकता है, और यहाँ सूचना अन्य assays अभी भी नियोजित किया जा सकता है।

समारोह, स्थानीयकरण, और इन विवो में ligand बातचीत के अलावा, एक GFP टैग प्रोटीन एक विरोधी GFP एंटीबॉडी और पृथक विट्रो assays में रोजगार समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल प्रोटीन का उपयोग कर अलग किया जा सकता है, जहां GFP प्रोटीन की एक निष्पक्ष अलगाव की अनुमति देता है और एक अपेक्षाकृत पृथक नियंत्रण (मुक्त GFP)। एक साथ इन assays मजबूत अतिरिक्त वें साबित करने की जरूरत सबूत प्रदान कर सकते हैंउम्मीदवार प्रोटीन कार्यों पर धारणा के रूप में।

इसके अलावा, क्योंकि GFP प्रोटीज प्रतिरोधी जब तक साइटों है कि कॉम्पैक्ट संरचना 18 से दूर विस्तार संशोधित है, कोशिकाओं की सीमित प्रोटीज उपचार बाह्य GFP जारी करना होगा। प्रोटीज दरार प्रोटीन के लिए जो GFP जुड़ा हुआ है या एक डिजाइन लिंकेज के क्षेत्र में घटित होता है। जारी की उत्पाद एक विस्तार GFP अनुक्रम के एन टर्मिनल के साथ GFP होगा। यदि प्रोटीन की सी टर्मिनस के लिए जो GFP जुड़ा हुआ है trypsin GFP जारी नहीं करना चाहिए intracellular है। संभावित उत्पादों के प्रारंभिक विश्लेषण trypsin की ओर से जारी एक GFP टैग प्रोटीन के साथ एक स्पष्ट आणविक वजन पैटर्न का सुझाव सकता है। कई झिल्ली प्रोटीन के लिए, इस तरह की तकनीक GFP की रिहाई, या उसके अभाव से झिल्ली टोपोलॉजी के लिए स्पष्ट साक्ष्य के रूप में नतीजा होगा।

साथ में, विशिष्ट assays प्रस्तुत किया है और / या इस रिपोर्ट में प्रस्तावित तकनीक टी के एक व्यापक नमूने प्रदानटोपी एक fluorescently टैग निर्माण के साथ शुरू करने से उपन्यास प्रोटीन की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इस तरह के निर्माणों को आसानी से व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है। उन्हें तकनीक की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोग करने का अवसर उन्हें आर्थिक रूप से सीमित बजट पर भी छोटे प्रयोगशालाओं के लिए संभव बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in Figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)		 Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line		 Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10x solution

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References

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आनुवंशिकी अंक 120 GFP TMEM184A हेपरिन नाड़ी कोशिकाओं exogenous अभिव्यक्ति सह स्थानीयकरण
एक GFP टैग TMEM184A का प्रयोग हेपरिन रिसेप्टर पहचान की पुष्टि के लिए निर्माण
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Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li,… More

Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

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