Summary
与羧基末端设计用于真核表达GFP的标签的构建编码TMEM184A，在旨在证实TMEM184A的鉴定如在血管细胞肝素受体测定中使用。
Abstract
当新的蛋白质通过基于亲和力的分离和生物信息学分析发现，他们往往在很大程度上未鉴定。针对预测序列中的特定肽抗体允许一些本地化实验。然而，与抗体的其他可能的相互作用往往不能排除。这种情况提供给开发一套依赖于蛋白质序列测定的机会。具体地，得到含有耦合到在蛋白质的C末端的绿色荧光蛋白编码序列的基因序列的构建体和用于这些目的。实验以表征本地化，配体亲和力和功能的获得最初设计和执行，以确认TMEM184A的鉴定为肝素受体1。此外，该构建体可用于研究，处理膜拓扑问题，并详细蛋白质 - 配体相互作用。本报告介绍AR的基础上在血管细胞中表达的GFP-TMEM184A构造，可以很容易地适用于其他的新的蛋白质实验方案法兰。
Introduction
对于新功能的候选蛋白的鉴定常常取决于基于亲和力的分离方法并进行部分序列测定。新发现的蛋白质的最近的例子包括跨膜蛋白184A（TMEM184A），之后肝素亲和互动1确定了肝素受体，并TgPH1，结合磷酸肌醇PI（3,5）P 2 2 PH结构域蛋白。其他新的蛋白质鉴定涉及肽的直接序列分析，例如由维生素等。谁用跨膜肽识别蛋白产品之前未基因3。同样地，新的蛋白质序列的鉴定可以通过使用生物信息学的先前特征的蛋白质家族的搜索，如新4TM蛋白4的识别来完成的。水通道蛋白家族基因序列的考试都有人所以产生了新成员的身份与新功能5。鉴定后，蛋白质功能的分析通常是有时可以使用蛋白质功能的一个特定的测定法，诸如在水通道壳体被检查的下一个步骤。
如果可能的话，一个新发现的蛋白质的功能，可以与特定的酶或类似的体外检测功能进行检查。因为新的蛋白质的许多功能取决于只发生在完整细胞或生物体， 在体外测定法复杂的相互作用并不总是有效的。然而， 在体内测定，必须以这样的方式，它们依赖于基因序列来设计。在细胞培养和/或简单的模式生物，击倒可以提供证据为蛋白质/功能鉴定6。与如上所述确定的新的蛋白质，它通常是不足以简单地击倒的蛋白质进行确认的功能，一个d 在体内依赖于基因序列功能测定法的设计成为新的蛋白质的表征重要。
最近TMEM184A鉴定为肝素受体使用亲和层析和MALDI MS 1（其调节血管平滑肌和内皮细胞的炎性应答的增殖），7提供给开发实验的集合的机会后击倒得到的结果与识别相一致。最近的综述证实肝素与许多生长因子，它们的受体，细胞外基质组分，细胞粘附受体，和其它蛋白质8特异性相互作用。在血管系统，肝素和硫酸乙酰肝素蛋白多糖（含有在结构上与肝素类似的硫酸乙酰肝素链）与几百蛋白9相互作用。在功能上证实塔ŧTMEM184A参与了肝素吸收和结合，即用于TMEM184A基因构建技术开发的。本报告包括实验的基础上GFP-TMEM184A集合构建用于确认TMEM184A的身份肝素受体。
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Protocol
1. GFP蛋白质构造的设计
- 购买或设计和建造，根据有关的蛋白质有GFP标记的结构。
注：对于购买构建体，标准载体可从商业实验室，包括部分或全部的以下建议：对于膜蛋白，选择的GFP的C-末端的位置，因为它不太可能与膜蛋白质运输到干扰。考虑的感兴趣的基因，如果有理由相信有关蛋白质的C-末端被紧凑地折叠成蛋白质的结构域将GFP之间的延伸。选择一般的真核细胞表达的概念，但是允许建设生产细菌系统。包括一个切割位点（如为TEV蛋白酶），通过该如果需要一些实验，其中绿色荧光蛋白可以与蛋白活性干扰GFP可以被删除。添加其它嵌如本地化或亲和力的附加标签teractions（ 例如，的His6）。这不是必需的本文所述的测定法，但可能会导致其他测定法，或者是有用的直接相邻的基因，绿色荧光蛋白之前，如果去除的GFP是期望的。
2.血管细胞GFP-TMEM184A表达
- 培养内皮细胞或如前面1，6，7报告了0.2％明胶包被的组织培养皿中的血管平滑肌细胞。
- 加入5毫升细胞培养物胰蛋白酶溶液（0.5％重量/体积）至漂洗100mm时，或更大，细胞汇合菜。在37℃下孵育，直至细胞被刚好从板释放，并将细胞转移到无菌聚丙烯离心管中。
- 添加胰蛋白酶抑制剂（ 例如，常规培养基等体积的），如在常规培养中使用，对小区/胰蛋白酶溶液，以限制胰蛋白酶活性。沉淀细胞在approxim 5分钟ately 600 XG（或适当的速度和时间，只是沉淀为标准组织培养的细胞）。吸出上清液。
- 悬浮细胞在1mL HEBS（HEPES缓冲盐水）电穿孔缓冲液中，限制时间的细胞的量是在沉淀或悬浮液。放置在冰上的细胞悬浮液，并进行在冰上剩余步骤。
注：颗粒可以一次再悬浮之前被洗涤HEBS。 - 添加GFP标记TMEM184A质粒足够体积，以使细胞达到20微克/毫升的DNA的终浓度。使用相同的协议GFP的构建体。
- 将大约0.4毫升在试管电在HEBS细胞的解决方案。预冷却使用前的试管。
- 使用以下条件电穿孔所述细胞：指数衰减，500微法，∞欧姆和170 V.
注：对于给定细胞类型的电压应被优化。与内皮细胞和平滑肌CEL初步研究升类型分别用GFP-纽构造完成，以确定这里提到的最佳电压值， 如 10。- 为了优化电，开始与设备制造商的建议（其中包括一些标准的细胞类型条件下）。使用期望构建体或对照荧光蛋白构建体大小和荧光特性，以需要的结构相似。
注意：小型核酸似乎更容易进入细胞大于构建体，所以只用荧光蛋白的构建体可以更容易地表达比较大的一个。 - 使用荧光显微镜来确定细胞生存力，其中，所述荧光构建体24和48小时后表达的细胞的百分比，和表达的强度。
注：降低电压和/或时间稍微如果生存率低。瞄准最短的时间从培养表面的细胞释放和返回之间可能细胞培养，以提高生存率。在时间上或第二脉冲略有增加可以改善结构的摄取，如果存活率高，低表达。最佳条件和表达将细胞类型之间有所不同。如果表达构建体的细胞的百分比高，但强度低，增加了DNA浓度和监测转染的细胞随着时间的推移对最佳强度，这将取决于蛋白质半衰期以及表达，可以改善强度。染色强度可以放大一些测定中，如果有必要，通过用抗GFP抗体的GFP免疫荧光染色
- 为了优化电，开始与设备制造商的建议（其中包括一些标准的细胞类型条件下）。使用期望构建体或对照荧光蛋白构建体大小和荧光特性，以需要的结构相似。
- 电穿孔后，种子细胞成6管30毫米的组织培养孔与盖玻片成像或到组织培养皿。培养使用标准的细胞培养过程的细胞。
- 可选：24小时后，更换培养基，以消除任何HEBS电缓冲区。
3. GFP-TMEM可视化184A本地化
- 用PBS冲洗并轻轻摇动的细胞培养至少24小时后。限制暴露于强光，避免GFP褪色。
- 用4％多聚甲醛（PFA）的PBS在RT下轻轻摇动15分钟的细胞。避免使用任何含甲醇的试剂可通透细胞。如果不是必要评估配体相互作用可以使用固定用甲醇。
注意：多聚甲醛是有毒的。穿戴合适的个人防护装备。使用在通风橱中，小心，并放弃正常。 - 如上用PBS冲洗。对于基于抗体染色，见下文3.6。
- 摩盖玻片使用的Mowiol或其他适当的安装介质幻灯片。
- 使用具有合适的过滤器集的GFP激发和发射光谱共焦或荧光显微镜图像的幻灯片。共聚焦显微镜是优选的，因为在z平面中分离的样品的能力。图像保存在曲灰度antitation目的，TIF格式（除了全色图像为插图）。
- 对于通过细胞表达与WT TMEM184A比较，准备使用准备从TMEM184A序列的肽（S）一抗其他细胞免疫， 如 1。 GFP-TEMEM184A的识别，也可以使用抗GFP的完成。评估由相同的显微技术这两种细胞样本。
4.罗丹明肝素结合并共定位与GFP-TMEM184A转染细胞
- 治疗的GFP-TMEM184A表达细胞用100微克/毫升罗丹明 - 肝素加入到培养基中，并让细胞孵育特定的时间量，典型地为A7r5细胞少于10分钟。冲洗和修复为3.1和3.2。
注意：最佳时间和配位体的浓度依赖于细胞的反应，所得到的配位体和图像强度的荧光强度。这concentrat被采用肝素的离子，因为它导致在其他测定11的50％以上的反应。该浓度可以用标准荧光显微镜技术来可视化，因此，没有必要来增加它。罗丹明肝素与细胞中的低荧光的未标记肝素结果的稀释，因而是对图像和量化更加困难。 - 定量罗丹明肝素由于GFP-TMEM184A转结合，无需转GFP-TMEM184A准备完全相同的细胞。
- 图片使用共聚焦显微镜用适当的GFP（488纳米）和罗丹明（543纳米）激发和发射单元（500 - GFP的530 nm和罗丹明大于560纳米）值来确定共定位。获得至少50个细胞的图片来自至少三个独立的实验获得的统计数据。实验中保持相同的设置，并采用一个对照样品（多个）（ 例如，转染的细胞与不治疗）个在可以用来对多个实验分析标准化的数据。
- 检查用的计算机程序，以确定相对于若丹明在每个细胞结合/摄取为结合定量的图像。
注意：因为它们是方便的分析，并且可以被转换为灰度在很多计算机程序，如果他们不最初保存在格式TIF图像应被采用。的Image J（免费软件）在本分析使用，并允许在图象中的任何用户定义区域被测定区域和像素强度。- 使用手绘工具在荧光图像中圈一个单元格，使用测量工具，以确定该空间内的强度。
注意：这些测量提供所需的信息以计算总强度，用于提供一种方法，不同的小区使用不同的几何形状进行比较的用户定义的区域（全细胞，核等 ）。平均强度超过背景的区域可以报告，并有利于分析背景强度的收藏品。 - 导出到一个电子表格来计算乘以强度的面积和减去背景相同数量的区域。平均足够的细胞/实验荧光/细胞获得统计学意义。
- 使用手绘工具在荧光图像中圈一个单元格，使用测量工具，以确定该空间内的强度。
5.从GFP-TMEM184A荧光共振能量转移罗丹明肝素
- 制备转染细胞并用200微克/毫升罗丹明标记的配体如在3.1孵育。注意，温育时间与荧光配体是细胞类型依赖性的。只有PFA修复，并安装幻灯片成像。
- 首先，在激发405nm和图像罗丹明发射（566 - 685纳米; FRET）。其次，在激发488 GFP（493图像 - 530），第三，激发在561罗丹明（图像在566 - 685）。没有GFP-TMEM184A或不罗丹明肝素控制是至关重要的。
6.罗丹明Hepari的活细胞成像吸氮量
- 种子GFP-TMEM184A转染的细胞变成专为活细胞成像个别菜肴和治疗在协议3。
注意：需要的细胞的数量取决于所需的细胞类型和密度。为了最大限度地减少细胞是在悬浮液中的时间量，不计的细胞。从100毫米融合菜分为六个35毫米实时成像菜的种子细胞，以获得细胞接近汇合在48个小时。 - 48小时后，更换培养基介质无酚红。
- 转移细胞的菜共聚焦显微镜用加温阶段为了保持温度，聚焦显微镜。
- 吸取100微克/毫升罗丹明肝素入菜，轻轻混匀。
- 立即开始录制实时图像。如果肝素没有细胞摄取鉴于区域内发生，将盘略识别细胞与含有罗丹明标记的至少一个绿囊泡。
注：成像激发和发射细节是相同的肝素摄取协议（第5）。图像之间的时间是约16秒。实验和显微镜的条件典型地将确定一个能得到图像的速度。
7.从培养细胞分离GFP-TMEM184A和GFP的
- 除去培养基并用PBS清洗后，加入2毫升0.2％（重量/体积）CHAPS的1×PBS溶液与蛋白酶抑制剂对表达GFP-TMEM184A或GFP（用于控制结合测定）细胞的150毫米的钢板。刮去细胞从培养皿，放置在冰上的15mL的聚丙烯管中的细胞/ CHAPS溶液，并通过敲击拌匀。完成在强光下的所有步骤，确保GFP标记漂白下面结合分析。
- 特异性结合的GFP-TMEM184A（或适当GFP对照），加入2微克/毫升生物素化的抗GFP抗体的溶液中并在4℃用摇动孵育过夜。
- 加入500μl的链霉亲和琼脂糖珠到至少5毫升0.2％CHAPS / PBS中并离心以大约600×g离心3至5分钟。去除上清。用新鲜的CHAPS / PBS每次重复两次以上。添加珠粒的抗体和细胞溶液中并在4℃下用摆动以允许珠粒结合到结合于GFP或GFP-TMEM184A生物素化的抗GFP抗体孵育过夜。
- 通过离心（如7.3）沉淀珠子和除去未结合的材料。至少添加5mL的0.2％CHAPS / PBS /蛋白酶抑制剂洗。重复洗涤和离心至少3倍，有效地去除任何未结合的蛋白质。
- 除去最后的洗涤后，（用盐酸pH至2.0）在冰上3分钟以解离抗体-GFP结合（导致自由GFP-TMEM184A或免费用1mL的0.2M甘氨酸/ 0.2％CHAPS的PBS孵育珠粒GFP）。通过点击每30秒轻轻拌匀。
- 离心机在约600 XG和传送含有纯p上清rotein到一个新的15毫升管中，接着立即中和用5毫升1M的碳酸氢钠（使pH为7）。
- 集中使用10,000道尔顿分子量截留离心浓缩所述样品（使用由供应商推荐离心速度）。当音量达到约0.5毫升，加0.2％CHAPS / PBS。继续浓缩，加入更多的0.2％CHAPS /直至/已添加的PBS 0.2％CHAPS的至少十体积（倍起始样品体积）的PBS。
- 以确定分离的GFP或GFP标记的蛋白的量的估计值，获得的吸光度在280nm处读出，并将其与从牛血清白蛋白或其他控制蛋白质在相同缓冲液制备的标准曲线。
注：由于消光系数的差异，这种浓度的估计，但可提供近似的蛋白浓度，以方便进一步分析不浪费样本。准确的蛋白质浓度可以阻止用微型洛瑞蛋白质测定法作出某些对在相同的缓冲液作为样品制备的标准蛋白质开采。分离的蛋白质的进一步分析可以通过分离的蛋白质（使用GFP的抗体检测）和比较所预测的分子量的蛋白质印迹来实现。可替代地，使用TMEM184A抗体应导致预测的构建体大小的条带，但也可能导致一个WT TMEM184A频带如果二聚体（或更高阶低聚物）存在于样品中。纯度的估计可通过从原料的等分试样从分离的样本VS总蛋白染色总蛋白印迹来获得。
8. 在体外肝素结合分析
- 通过用200μL的0.2％CHAPS / PBS清洗3 5分钟倍洗涤摇动制备黑色抗生物素蛋白包被的96孔板中。准备采用相同的洗涤过程相同的黑色未涂覆的96孔板中。准备布局为实验样品（一式三份）在试验过程中要遵循。包括标准肝素浓度，缓冲控制，且与GFP样品井井无肝素确认GFP的漂白。
注意：如果优化隔离或配体相互作用缓冲剂是有问题的蛋白质不同，完成所有的板制剂和洗涤用的最佳缓冲系统。 - 加入100微升60皮摩尔/孔生物素化的抗GFP的到GFP结合期望的抗生物素蛋白包被的平板的所有孔中。抗体的量是足以刚好饱和的高亲和性抗生物素蛋白孔中。
- 加缓冲器仅用于控制目的的所有孔（无GFP或GFP-TMEM184A结合需要的话）。密封井用板盖，防止水分蒸发。孵育2小时在RT，振荡。
注：加入到孔中，并温育时间的卷根据从提供者的建议。
- 加缓冲器仅用于控制目的的所有孔（无GFP或GFP-TMEM184A结合需要的话）。密封井用板盖，防止水分蒸发。孵育2小时在RT，振荡。
- 清洗所有井三次5分钟用200微升0.2％CHAPS / PBS中。
- 添加100微升5纳摩尔/孔的GFP-TMEM184A或GFP的拨出的抗生物素蛋白包被的板的孔中，并在室温下振荡孵育1小时。洗一遍为8.3。
注意：被选择蛋白的这一浓度，以确保所有位点用过量GFP或GFP-TMEM184A饱和。这是重要的，以确保蛋白质的相同量被绑定到每个孔中。较低量的蛋白质也可能饱和的位点，这可能通过评估孵育几个浓度的蛋白质与板和比较未结合的蛋白质和配体结合测定后残留未结合的蛋白质被检查的可能性。 - 制备各种浓度的荧光素标记的肝素， 例如 ，10，25，50，75，100，200微克/毫升，在0.2％CHAPS / PBS中。不要在黑暗中这一点，所有剩余的工作。
注意：在此之前制备的浓度，为其它配体的具体浓度，应确定为protei问题N个目标。的最低浓度应在平板读数器检测的。因此，重要的是首先确定，可以准确地在所使用的缓冲系统来检测的范围内。然后确定获得可测量的结合所需要的范围内。低于10微克/毫升的荧光素 - 肝素的浓度没有一致地注册中使用的缓冲液条件下的读板器。同样，虽然如在其他测定中使用若丹明肝素，可以在板读数器可视化，在缓冲条件和用于结合所需的浓度，对标准荧光读数不与荧光团可再现不同。 - 添加100μL的荧光素肝素到适当的测试孔中的抗生物素蛋白涂覆的板和浓度标准孔中都抗生物素蛋白涂覆的和未涂覆的板。孵育10分钟，在室温下振荡。板块保持在黑暗中（或覆箔）。
- 使用板意图德，记录从肝素的初始荧光发射在两个板和初始荧光（总）从孔中的抗生物素蛋白涂覆的板发射与固定GFP-TMEM184A或GFP的对照孔。如果有必要，调整仪器增益，以确保最低和最高浓度之间的肝素荧光检测。
注：确保在板读取器从上方读取孔中，在孔中的最佳位置读取，如果这是可调节的。有问题的研究中，最佳位置为约75％下降的孔中。可与板读数器信息应该提供所特有的问题的平板读数器读取结合样品的测定法在黑色板的建议。 - 从与固定GFP-TMEM184A或GFP的孔除去未结合的荧光肝素并放入在涂覆非黑色板相应的孔中。立即读取荧光发射。
- 加100μL新鲜的0.2％CHAPS / PBS回INTØ井从中荧光肝素被删除，并读取荧光发射。
- 重复步骤8.8 - 8.9的3倍。
注意：从涂覆板这些读数表明剩余在GFP或GFP-TMEM184A井荧光素肝素。如果第三未结合的样品中发现显著的荧光，应该发生的额外冲洗。如果荧光继续在每次洗涤被去除，配体的结合可能是低亲和力，和条件应重新评估。最终读数构成了束缚肝素读数。 - 从取出的，未结合的，样品中的未涂覆板，获得号码每次洗涤记录荧光发射。这些都是“绑定”读数。
- 使用在8.7得到的总肝素排放值，以确认肝素加入到每个孔的正确的水平。减去值平均背景读数。
注意：井无任何荧光肝素作为因抗体，GFP和缓冲的背景。 AveragE中的背景重复获得的背景值。从结合和未结合的读数减去平均背景读数得到的实际值。 - 采用发射的曲线图与总荧光素肝素加入到确定发射与肝素的量的比例。
注：抗体单独，或抗体和抗原导致荧光的一些淬火。因此，总的肝素是基于如在8.7注意到总加入肝素确定。 - 画出修正约束与肝素增加肝素同时适用于GFP-TMEM184A情况和GFP情况下，一式三份。
- 通过加入从所有洗涤未结合的读数为特定浓度确定游离配体。
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Representative Results
而，在理论上，任何DNA构建体转染到细胞中可以与亲脂转染试剂来完成，以前的报道显示GFP的更有效的转染构建成利用电12内皮细胞。这里提供的协议典型地实现了使用的主要来源的内皮细胞和平滑肌细胞的大于80％的GFP构建表达。使用时可能会迅速提供这种构造的商用系统所采用的结构设计。主要用途集中于位置的问题，因此，正确传递到膜，具有最佳的真核细胞蛋白的表达，并继续构建生产是主要的考虑因素一起。其它考虑可以包括：不同位置的GFP为不同的本地化的蛋白质或蛋白质具有C-末端是一个折叠区域的一部分，wanti的可能性纳克除去GFP（添加蛋白酶切割位点），以及一个第二亲和位点。后者将提供纯化的GFP构建体和稳定其一个表面上用于结合试验的替代方式。以确认打击TMEM184A不同的商业抗体染色模式，血管细胞表达GFP-TMEM184A进行比较与商业抗体染色相同的细胞。时间GFP-TMEM184A，这似乎积累了至少72小时的转染影响发行后的长度。的时间的转染导致最佳表达后的长度由细胞类型而不同，并且应当为每个技术进行优化。随着时间的推移，更多的GFP标签是在围核区。根据处理，GFP漂白也有发生。结果表明GFP-TMEM184A在细胞表面并以类似于与TMEM184A抗体染色（ 图1）观察到的本地化周围核和其它囊泡结构。主细胞中
使用荧光配体（若丹明肝素）的促进配体和受体的共定位的评价随时间，和两个标签使得能够进行实时成像（ 图2和电影1）。 图2C是通过激励的GFP在405nm成像，但是从罗丹明（中间图像）捕获的发射。 GFP激发波长为405nm产生有限的排放，以及被限制，但这种阻碍罗丹明的激发和虚假的FRET信号。类似地，FRET的INDUCED罗丹明排放昏了。在用GFP-TMEM184A表达的控制，但没有若丹明肝素，以及其他与仅罗丹明肝素有一个与405nm激发没有若丹明发射。此后，总的GFP（左图片）和总罗丹明（右侧图像），使用标准的激发/发射波长为每个荧光团进行了测量。在C中的数据进一步支持了配位体和GFP-TMEM184A的共定位。相比A7r5细胞在RAOEC罗丹明肝素摄取需要较长的温育。在细胞中观察到对FRET没有证据没有若丹明肝素或在未转染细胞。一种理想的实验将包括另一个面的GFP构建体应具有不共定位与配位体。
采集或功能恢复也可以用GFP蛋白质构建体和若丹明肝素来完成。这提供了用GFP作为证据的表达水平与配体合作的机会本地化和量化的相互作用。具体地讲，肝素摄取GFP-TMEM184A增加构建体转染的A7r5细胞（ 图3）。它占用非常有限罗丹明肝素稳定击倒细胞中产生1，而这些在那里提供增益功能，可以评估的系统。 GFP-TMEM184A构建体转染导致可能在野生型细胞或以上（ 图3）的电平再次内在化罗丹明肝素的细胞。应当指出的是，“无肝素”图像稳定敲除细胞，其不表达绿色荧光蛋白作为用于击倒构建体记者的。背景荧光在这些细胞中较高，如所示的图像中观察到的。
它通常是有助于使用分离的受体测定配体特异性的降低其它蛋白质与配体相互作用的可能性。若采用GFP-protei的Ñ构建体提供了这方面的GFP标签可以作为该蛋白质的分离的把手一个显著优点并避免抗体或其它亲和试剂用另外的蛋白质的可能的相互作用。 GFP也可以在细胞中的相同群体所表达，并使用相同的GFP的亲和力方法分离。这提供了一个控制蛋白配体相互作用的研究。在TMEM184A系统中，GFP-TMEM184A分离使用抗GFP抗体亲和力过程导致特定，饱和肝素结合，而对照GFP的不结合任何肝素（ 图4）。
通常，在构建体的GFP标签被放置在一个蛋白的一端。 C-末端位置便于正确蛋白质运输到膜。因此，绿色荧光蛋白上的膜的特定侧的可用性可以为膜蛋白的特定拓扑结构提供了证据，如果折叠和拓扑不是lready闻名。与针对GFP的抗体（例如图5）简单免疫荧光染色能够提供基于非透化的细胞的抗体的访问的GFP的位置的证据。的抗GFP抗体识别即使漂白的GFP。在图5所示免疫荧光染色表明显著抗GFP染色而不GFP-TMEM184A转染的细胞提供初步证据表明在质膜的GFP是细胞外的通透。显然，在小泡胞内蛋白也变得在透化的细胞染色。在图2C的FRET图像是与此提出的拓扑一致的。
图1：在单元格中GFP-TEMEM184A本地化确认TMEM184A本地化通过免疫荧光检测。 A）BAOECs转染GFP-TMEM184A固定用4％PFA。未转染的细胞或用冰冷的甲醇（MeOH）固定和透化或4％PFA后的Triton X-100透化（如上所述）处理。使用针对从TMEM184A（CTD）的C-末端肽的抗体或从TMEM184A（NTD）的N末端肽和具有标记TRITC次级抗兔抗体的未转染的细胞进行染色。 B））的初级（BAOSMC）平滑肌细胞克隆（的A7r5的实施例和类似地进行处理。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：罗丹明肝素GFP-TMEM184A的成像。 A）用GFP-TMEM184A电A7r5s用100微克/毫升罗丹明肝素处理过的次指出，然后用4％PFA。图像代表两个独立的实验。 B）A7r5细胞用立即实时成像加入GFP-TMEM184A和罗丹明肝素染。电影的选择的帧被示出为白色竖线指向含有罗丹明肝素GFP的涂覆囊泡的初始定位。将GFP标签和罗丹明一起移动。比例尺= 2微米。 C）在A处理RAOECs进行成像在405（GFP通过激励荧光共振能量转移，为FRET）相比，标准设定，请参阅协议3.5。 A组和B中的两个时间点，最初发表在生物化学杂志 。普格，RP 等人。 1。版权所有美国社会为生物化学与分子生物学。 请点击此处到vIEW这个数字的放大版本。
图3：GFP-TMEM184A转染提供功能的增益。 A）中的显着罗丹明肝素较低水平被认为在稳定击倒A7r5细胞相比野生型A7r5s，参见实施例的图像。 “无肝素”的形象是表达GFP作为结构存在的一个标志物稳定击倒细胞。比例尺= 10微米。 B）的转染GFP-TMEM184A成野生型和稳定敲除细胞显著增加基于超过50个细胞/条件在三个独立的实验的分析，这些细胞中的若丹明肝素信号。误差棒表示SEM。 P <0.0001基于一个Tukey检验。这个数字最初发表在生物化学杂志 。普格，RP 等人。 1。版权所有美国社会为生物化学与分子生物学。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：隔离GFP-TMEM184A绑定肝素。 GFP-TMEM184A或GFP分离并结合于抗生物素蛋白包被测定板。荧光肝素浓度通过1.111纳摩尔添加了从0.056纳摩尔。肝素结合通过在519处测量发射决定的。 GFP-TMEM184A（正方形）。 GFP控制（圆圈）。这个数字最初发表在生物化学杂志 。普格，RP 等人。 1。版权所有美国社会为生物化学与分子生物学。 _blank“>请点击此处查看该图的放大版本。
图5：GFP-TMEM184A 和膜拓扑。 GFP-TMEM184A转染的细胞或用4％PFA（顶部）或用4％PFA和使用的Triton X-100（底部）透化。细胞用抗GFP初级抗体和Cy3标记的第二抗体相同染色。比例尺= 10微米。两种不同的实验中示出。二级只染色的细胞基本上没有表现出染色。 请点击此处查看该图的放大版本。
PLOAD / 55053 / movie.mp4“目标=”_空白“>电影1：GFP-TMEM184A与罗丹明肝素活成像（右键点击下载）A7r5细胞被视为在图2B这部电影展示了GFP- TMEM184A并在顶部一起移动罗丹明肝素囊泡。独立的彩色版本除了电影的合并版本被示出。用GFP囊泡和含有罗丹明被圈定。
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Discussion
此处所报告的协议被设计成提供用于鉴定TMEM184A作为在血管细胞1肝素受体确证证据。击倒技术被常规用作一种机制以确认新的蛋白质的鉴定。然而，击倒后，一些功能损失通常不是足以证明候选蛋白实际上是正确的受体（或其他功能蛋白）。同样重要的是要有证据表明该候选蛋白实际上具有的功能。用人有标签GFP的新基因的构建实现功能的实验增益和促进基于绿色荧光蛋白的亲和力标签蛋白的分离。在这个协议中采用电穿孔促进了构建体的非常高的转染效率（细胞的大于80％的所表达的构建体）。然而，如果电穿孔是不可用或不希望的，可以使用其它转染机制。有几个优点选择GFP标记构建物为一种新的蛋白质功能的确认。首先，将绿色荧光蛋白作为用于转染和基因表达记者和它允许通过GFP监视过表达若无蛋白质表达的细胞系是不可用的。第二，将GFP标签提供了不依赖于任一配体的亲和力或抗体针对肽的蛋白质的纯化的工具。第三，将GFP标记提供一个工具来检查复杂免疫定位使用针对靶蛋白质序列的独特的肽产生的抗体可视化来确定实际的基因产物是否类似地本地化。
用基因构建功能测定的增益被用于多种目的，包括用于新的蛋白质功能13识别高通量筛选的。理想情况下，功能测定的增益将采用一个充分研究克隆的细胞里NE不表达有关的基因（所述细胞仍必须表达相配合的基因产物，其允许新表达基因的功能）。时使用特定的GFP标记构建体如在本试验中，它是用细胞，其中所述GFP蛋白可以起到关键的。因此，细胞的选择取决于函数和，可能的是，在其中的功能通常会发生，以确保配合蛋白质存在的细胞类型。 GFP标记允许在将GFP标记蛋白的荧光可以遵循作为功能测定法的一部分的情况下监视功能的附加方式（ 例如， 见图2和3）。一个限制到这些研究将是如果GFP以某种方式改变蛋白质的功能。通过连接的GFP到该蛋白质的C-末端，大批蛋白质已经研究了没有表面官能改动，但这种可能性是存在的。
RadioisotopicaLLY标记配体经常被用来研究配体结合到完整细胞11。然而，这些试验不容许简单地确定位置配体结合后，也不利于配体与受体一起比较如本报告。 GFP的结构也提供了更多的机会来这里检查标记膜蛋白。因为GFP标签的C-末端的位置，它能够在整个测定法检查的GFP标记的转染细胞中的位置。使用抗体的GFP免疫允许使用和不透（ 图5）的抗体可访问的GFP比较。 GFP-TMEM184A的额外的应用程序利用的GFP成像诸如罗丹明肝素（ 图2）的共定位。用人FRET允许来自GFP的发射激发罗丹明肝素如图2C提供了一个有趣的方式来评估绑定和细胞内TRAfficking。此外，FRET数据表明GFP是足够接近（10nm内）到罗丹明 - 配体转移激励。证据表明绿色荧光蛋白与配体作品，转移已发表了标记四甲基若丹明14甲状旁腺激素。替代FRET技术（光漂白和/或计算机驱动成像图案）也可以采用除这里作为例子示出什么更复杂的分析。类似地，可能使用FRET与FRET优化如由Albertazzi 等报道EGFP / mCherry系统荧光标签进行检查与候选其他蛋白质的相互作用。在王的同事16钾离子通道的研究和使用15和CFP / YFP和GFP对。许多新的小型荧光分子被设计，例如17。这些分子会增加，其中FRET GFP标记蛋白和F之间的相互作用病例数luorescent配位体可以被检查。未来的研究也可以涉及靶向改变基因，允许构建体，以帮助确定基因功能的序列具体方面。对于GFP标记的膜蛋白的一个限制是，当该蛋白的C末端通常是内侧。在这种情况下，FRET荧光水溶性配体测定法可以是不可能的。然而，备选的机制来放置的GFP在该构建别处可能仍然是可能的一些这样的蛋白质，并且在这里所报告的其它测定仍可以使用。
除了功能，定位， 和体内配体的相互作用，一GFP标记蛋白可以利用抗GFP抗体和用于检查功能使用体外测定分离的蛋白质进行分离，其中的GFP允许蛋白质的无偏隔离和相对隔离控制（免费GFP）。总之，这些分析可以提供证明日需要强有力的补充证据在候选蛋白质功能的假设。
此外，因为绿色荧光蛋白是蛋白酶抗性的，除非与从紧凑结构18延伸远离部位改性，细胞的有限蛋白酶处理应释放胞的GFP。蛋白酶裂解位将发生在哪个GFP连接的蛋白质或在设计的连接区域。发布的产品将是绿色荧光蛋白与一个扩展的N-末端的绿色荧光蛋白序列。如果到GFP连接的蛋白质的C末端胰蛋白酶不应该释放的GFP是细胞内的。潜在产品的初步分析可以建议与胰蛋白酶发布了GFP标记蛋白明显的分子量格局。对于许多膜蛋白，这种技术会导致由绿色荧光蛋白的释放，或缺乏对膜拓扑的明确证据。
总之，具体的检测提出和/或在本报告中提出了提供技术吨的广泛采样帽子可以采用通过用荧光标记的结构开始研究新的蛋白质。这种构建体可以商购容易地获得。使用它们广泛的技术的机会，使他们即使在预算有限的小型实验室经济上可行。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (PFA, methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96-well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in Figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in Figure 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35-mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm - C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10x solution |
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