Ved hjælp af en GFP-mærket TMEM184A Construct til Bekræftelse af Heparin receptor Identity

Summary

En konstruktion, der koder TMEM184A med et GFP-tag ved carboxyterminalen designet til eukaryot ekspression, blev anvendt i assays designet til at bekræfte identifikationen af ​​TMEM184A som heparin receptor i vaskulære celler.

Abstract

Når nye proteiner identificeres gennem affinitet-baserede isolation og bioinformatik analyse, er de ofte stort set ikke-karakteriserede. Antistoffer mod specifikke peptider inden den forudsagte sekvens tillade nogle localization eksperimenter. Men andre mulige interaktioner med antistofferne ofte kan ikke udelukkes. Denne situation gav mulighed for at udvikle et sæt af analyser afhængig af protein sekvens. Specifikt blev en konstruktion, der indeholder gensekvensen koblet til GFP-kodende sekvens ved den C-terminale ende af proteinet opnået og anvendt til disse formål. Forsøg at karakterisere lokalisering, ligand affinitet, og gevinst på funktion blev oprindeligt udviklet og gennemført for at bekræfte identifikationen af TMEM184A som heparin receptor ^1. Desuden kan konstruktionen anvendes til undersøgelser vedrørende membran topologi spørgsmål og detaljerede protein-ligand-interaktioner. Nærværende rapport præsenterer arange af eksperimentelle protokoller baseret på GFP-TMEM184A konstrukt udtrykkes i vaskulære celler, der let kan tilpasses til andre hidtil ukendte proteiner.

Introduction

Identifikation af kandidat proteiner til nye funktioner ofte afhænger affinitet-baserede isolation protokoller efterfulgt af delsekvens beslutsomhed. Nylige eksempler på nyligt identificerede proteiner indbefatter transmembranprotein 184A (TMEM184A), en heparin-receptor identificeret efter heparin affinitetsvekselvirkninger ^1, og TgPH1, et pleckstrin homologi domæne protein, der binder phosphoinositid PI (3,5) _P2 ^2. Andre hidtil ukendte protein identifikation indebærer direkte sekvensanalyse af peptider som den, Vit, et al. der brugte transmembrane peptider til at identificere proteinprodukter fra tidligere karakteriserede gener ^3. På samme måde kan identificere nye proteinsekvenser opnås ved hjælp af bioinformatik søger af tidligere karakteriserede protein familier såsom identifikation af nye 4TM proteiner ^4. Undersøgelse af aquaporin familie gensekvenser har alså gav identifikation af nye medlemmer med nye funktioner ^5. Efter identifikation, analyse af proteinfunktion er typisk et næste skridt, der undertiden kan undersøges ved anvendelse af et specifikt assay for proteinfunktion såsom i aquaporin tilfældet.

Når det er muligt, kan funktionen af en nyligt identificerede protein undersøges med specifikke enzymatiske eller lignende in vitro-funktion analyser. Fordi mange funktioner af hidtil ukendte proteiner afhænger komplekse vekselvirkninger, der forekommer kun i intakte celler eller organismer, in vitro assays er ikke altid effektive. Dog skal de in vivo-assays designes på en sådan måde, at de er afhængige af gensekvensen. I cellekultur og / eller simple modelorganismer, kan knockdown fremlægge dokumentation for proteinet / funktion identifikation ^6. Med hidtil ukendte proteiner identificeret som bemærket ovenfor, er det ofte utilstrækkelig til blot vælte et protein for at bekræfte funktionen, end udformningen af in vivo funktionelle assays, der afhænger af gensekvens bliver vigtig for karakterisering af hidtil ukendte proteiner.

Den nylige identifikation af TMEM184A som heparin receptor (der modulerer proliferation i vaskulær glat muskulatur og inflammatoriske reaktioner i endotelceller) ved hjælp af affinitetskromatografi og MALDI MS ^{1, 7} gav mulighed for at udvikle en samling af analyser efter knockdown givet resultater i overensstemmelse med identifikationen . En nylig gennemgang bekræftede, at heparin interagerer specifikt med mange vækstfaktorer, deres receptorer, ekstracellulære matrixkomponenter, celleadhæsionsreceptorer, og andre proteiner ^8. I det vaskulære system, heparin og heparansulfatproteoglycaner (indeholdende heparansulfat kæder samme struktur som heparin) interagerer med flere hundrede proteiner ^9. At funktionelt bekræfte that TMEM184A var involveret med heparin optagelse og binding blev teknikker, der er ansat genkonstruktionen for TMEM184A udviklet. Nærværende rapport indeholder en samling af analyser baseret på en GFP-TMEM184A konstruere til brug i at bekræfte identiteten af ​​TMEM184A som heparin receptor.

Protocol

1. Design af en GFP-protein Construct

1. Indkøb, eller design og opbygning, et GFP-mærket konstruktion baseret på det pågældende protein.
   BEMÆRK: en købt konstrukt, standard vektorer er tilgængelige fra kommercielle laboratorier, der omfatter alle eller nogle af følgende forslag: For et membranprotein, vælg C-terminale placering af GFP, fordi det er mindre sandsynligt, at forstyrre membranprotein trafficking. Overvej en forlængelse mellem genet af interesse og GFP hvis der er grund til at antage, at C-terminalen af ​​det pågældende protein er kompakt foldet ind et domæne af proteinet. Vælg konstruktionen til generel eukaryot celle-ekspression, men tillade konstruere produktion i bakterielle systemer. Omfatte et spaltningssted (såsom for TEV-protease), hvorved GFP kan fjernes om ønsket for nogle eksperimenter, hvor GFP kan forstyrre det protein-aktivitet. Tilføj andre indsatser, såsom en ekstra tag for lokalisering eller affinitet iteractions (f.eks His6). Dette var ikke nødvendigt for analyserne beskrevet heri, men kan lette andre assays, eller være nyttige direkte tilstødende til genet, før GFP, hvis der ønskes fjernelse af GFP.

2. GFP-TMEM184A Expression i Vaskulære Cells

1. Kultur endotel- eller vaskulære glatmuskelceller på 0,2% gelatineovertrukne vævsdyrkningsskåle som rapporteret tidligere ^{1, 6, 7.}
2. Tilsæt 5 ml cellekultur trypsin-opløsning (0,5% w / v) til en skyllet 100 mm eller større, sammenflydende skål med celler. Der inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne netop frigivet fra pladen, og overføre cellerne til et sterilt polypropylen centrifugerør.
3. Tilføj en trypsininhibitor (fx et tilsvarende volumen af regulært dyrkningsmedium), som anvendes rutinemæssigt kultur, til cellen / trypsin opløsning begrænse trypsinaktivitet. Pelletere cellerne i 5 minutter ved approximdelbart 600 xg (eller passende hastighed og tid til bare pelletere celler til standard vævskultur). Aspirere supernatanten.
4. Resuspender cellerne i 1 ml HeBS (Hepes-pufret saltvand) elektroporering buffer, der begrænser mængden af ​​tid, cellerne er i pelleten eller suspension. Placer cellesuspensionen på is og udføre resterende trin på is.
   BEMÆRK: Pellet kan vaskes én gang med HeBS før resuspension.
5. Tilføj tilstrækkeligt volumen af ​​GFP-mærkede TMEM184A plasmid til cellerne for at opnå en slutkoncentration på 20 ug / ml DNA. Brug en identisk protokol for et GFP konstruktion.
6. Placere ca. 0,4 ml af cellen opløsning i HeBS i en elektroporation cuvette. Pre-chill kuvetterne før anvendelse.
7. Elektroporere cellerne under anvendelse af følgende betingelser: eksponentielt henfald, 500 uF, ∞ ohm, og 170 V.
   BEMÆRK: spænding for en given celletype bør optimeres. Indledende undersøgelser med endotel og glatte muskelceller cell typer blev opnået med et GFP-vinculin konstrukt at bestemme den optimale spændingsværdi her bemærkes, fx ^10.
   1. For at optimere elektroporation, starte med anbefalingerne fra producenten udstyr (som omfatter betingelser for nogle standard celletyper). Brug ønskede konstruktion eller en kontrol af fluorescerende proteiner ens i størrelse og fluorescerende egenskaber til den ønskede konstruktion.
      BEMÆRK: Små nukleinsyrer tilsyneladende trænge ind i celler lettere end større konstruktioner, så en konstruktion med kun et fluorescerende protein kan være lettere at udtrykke end en større.
   2. Brug fluorescensmikroskopi for at bestemme cellelevedygtighed, procentdelen af ​​celler, hvori det fluorescerende konstrukt udtrykkes efter 24 og 48 timer, og intensiteten af ​​ekspression.
      BEMÆRK: Sænk spændingen og / eller tid lidt, hvis overlevelse er lav. Målet for den kortest mulige mellem frigivelse af celler fra kulturen overflade og returnere tidceller til dyrkning kan forbedre overlevelse. Små stigninger i tid eller en anden puls kan forbedre konstruktion optagelse, hvis overlevelse er høj og udtryk er lav. Optimale betingelser og ekspression vil variere mellem celletyper. Hvis procentdelen af ​​celler, der udtrykker konstruktionen er høj, men intensiteten er lav, hvilket øger DNA-koncentration og overvågningen af ​​de transficerede celler over tid for optimal intensitet, som vil variere baseret på protein halveringstid samt ekspression, kan forbedre intensitet. Farvning intensitet kan forstørres for nogle analyser, hvis det er nødvendigt, ved immunfluorescensfarvning af GFP med anti-GFP antistoffer
8. Efter elektroporation, frø cellerne i seks 30 mm vævsdyrkningsbrønde med dækglas til billedbehandling eller ind vævskulturskåle. Dyrke cellerne under anvendelse af standard celledyrkningsprocedurer.
9. Valgfrit: Udskift dyrkningsmediet efter 24 timer for at fjerne enhver HeBS elektroporation buffer.

3. Visualisering af GFP-TMEM184A Lokalisering

1. Skyl cellerne med PBS og forsigtig omrystning efter dyrkning i mindst 24 timer. Begræns udsættelse for stærkt lys for at undgå GFP fading.
2. Fix celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur under forsigtig rystning. Undgå at bruge methanol indeholdende reagenser, som kan permeabilisere cellerne. kan anvendes fiksering med methanol, hvis det ikke er nødvendigt at vurdere ligand-interaktioner.
   Forsigtig: Paraformaldehyd er giftigt. Bær egnede personlige værnemidler. Anvendelse i et stinkskab, med omhu, og kassér korrekt.
3. Skyl med PBS som ovenfor. For antistofbaseret farvning, se 3.6 nedenfor.
4. Mount Dækglas til dias ved hjælp Mowiol eller andet egnet montering medium.
5. Billede dias ved hjælp af en konfokal eller fluorescensmikroskop med de passende filter sæt til GFP excitation og emission spektre. Konfokal mikroskopi foretrækkes på grund af evnen til at adskille prøverne i z-planet. Gem billeder i grå skala for quantitation formål i TIF-format (ud over fuld farve billeder til illustrationer).
6. Til sammenligning med WT TMEM184A udtrykt af cellerne, fremstille andre celler til immunfluorescens under anvendelse af primære antistoffer fremstillet til et peptid (er) fra TMEM184A sekvens, fx ^1. Identifikation af GFP-TEMEM184A kan også opnås ved anvendelse af antistoffer mod GFP. Vurdere begge celleprøver ved identiske mikroskopi teknikker.

4. Rhodamin-heparinbindende og co-lokalisering med GFP-TMEM184A-transficerede celler

1. Treat GFP-TMEM184A-udtrykkende celler med 100 pg / ml rhodamin-heparin sættes til dyrkningsmediet, og tillade cellerne at inkubere i et bestemt tidsrum, typisk mindre end 10 min til A7r5 celler. Skyl og fix som i 3.1 og 3.2.
   BEMÆRK: Den optimale tid og koncentration af ligand afhænger af celle-respons, fluorescensintensiteten af ​​liganden og image intensitet, der opnås. Denne koncentration af heparin blev ansat, fordi den resulterer i mere end 50% respons i andre analyser ^11. Denne fusion kan visualiseres ved anvendelse af standard fluorescens mikroskopi teknikker, så det ikke var nødvendigt at øge den. Fortynding af rhodamin-heparin med umærkede heparin resulterer i lavere fluorescens i cellerne, således er sværere at billede og kvantificere.
2. At kvantificere rhodamin-heparinbindende grund GFP-TMEM184A transfektion forberede identiske celler uden transficeret GFP-TMEM184A.
3. Billede af cellerne under anvendelse af et konfokalt mikroskop med det passende GFP (488 nm) og rhodamin (543 nm) excitation og emission (500 - 530 nm for GFP og større end 560 nm for rhodamin) for at bestemme co-lokalisering. Opnå billeder af mindst 50 celler fra mindst tre separate forsøg på at udarbejde statistikker. Oprethold identiske indstillinger inden eksperimenter, og beskæftiger en kontrolprøve (r) (f.eks transfekterede celler uden behandling) thved kan anvendes til at standardisere data til analyse af multiple eksperimenter.
4. Undersøg billeder ved hjælp af et computerprogram til at bestemme relative rhodamin bindende / optag i hver celle til kvantificering af binding.
   BEMÆRK: TIF-billeder bør ansættes som de er bekvemt for analyse og kan konverteres til gråtoner i mange computerprogrammer, hvis de ikke oprindeligt blev gemt i dette format. Billede J (freeware) blev anvendt i den foreliggende analyse og tillader område og pixel intensitet skal måles for enhver brugerdefineret område i et billede.
   1. Brug en frihånd værktøj til cirkel en celle i et fluorescerende billede og bruge foranstaltning værktøj til at bestemme intensiteten inden for denne plads.
      BEMÆRK: Disse målinger giver den nødvendige information til at beregne den samlede styrke for en brugerdefineret område (hel celle, en kerne, etc.) at tilvejebringe en måde at sammenligne forskellige celler med forskellige geometrier. Mean intensitet over et område på baggrund kan rapporteres, og at lettes samling af baggrunden intensitet til analyse.
   2. Eksport til et regneark til at beregne arealet ganget med intensitet og trække baggrunden for, at samme mængde område. Gennemsnit fluorescens / celle for nok celler / eksperiment for at opnå statistisk signifikans.

5. fluorescensresonansenergioverførsel fra GFP-TMEM184A til Rhodamin-Heparin

1. Forbered transficerede celler og inkuberes med 200 ug / ml rhodamin-mærket ligand som i 3.1. Bemærk, at inkubationstiden med fluorescerende ligand er celletype afhængig. Fix med PFA kun vejledende, og montere dias til billeddannelse.
2. Først ophidse ved 405 nm og image for rhodamin emission (566-685 nm; FRET). For det andet, ophidse ved 488 for GFP (billede på 493-530), og for det tredje ophidse ved 561 for rhodamin (billede ved 566-685). Kontrol uden GFP-TMEM184A eller uden rhodamin-heparin er kritiske.

6. Levende-celle Imaging af Rhodamin-Heparin Optagelse

1. Seed GFP-TMEM184A transfekterede celler i individuelle retter designet til live-cell imaging og behandle som i protokol 3.
   BEMÆRK: Antallet af celler, der kræves, afhænger af celletype og tæthed ønskes. For at minimere mængden af ​​tid celler er i suspension, ikke regne celler. Seed celler fra en 100 mm sammenflydende fad i seks 35 mm levende billeddiagnostiske retter at få celler nær sammenløb i 48 h.
2. Efter 48 h, erstatte mediet med dyrkningsmedium uden phenolrødt.
3. Overfør en skål af celler til et konfokalt mikroskop med en opvarmning stadium for at opretholde temperaturen, og fokusere mikroskopet.
4. Pipetter 100 ug / ml rhodamin-heparin i fadet og bland forsigtigt.
5. begynder straks at optage levende billeder. Hvis der ikke celleoptagelse af heparin forekommer i regionen i betragtning, bevæge skålen lidt at identificere celler med mindst en grøn vesikel indeholdende rhodamin mærket.
   BEMÆRK: Billedbehandling excitation og emission detaljerne ersamme som for heparin optagelse protokollen (afsnit 5). Tidsrummet mellem billeder var ca. 16 s. Betingelserne for eksperimentet og mikroskopet vil typisk bestemme den hastighed, hvormed kan opnås billeder.

7. Isolering af GFP-TMEM184A og GFP fra dyrkede celler

1. Efter fjernelse dyrkningsmedium og skylning med PBS, tilsættes 2 ml 0,2% (w / v) CHAPS 1x PBS-opløsning med proteasehæmmere til en 150 mm plade af celler, der udtrykker GFP-TMEM184A eller GFP (til kontrolformål bindingsassays). Skrab cellerne fra skålen, placere celler / CHAPS opløsning i en 15 ml polypropylen rør på is, og bland godt ved at trykke. Fuldført alle trin i klart lys at sikre GFP tag bleges for bindingsassayet nedenfor.
2. Til specifikt at binde GFP-TMEM184A (eller en passende GFP kontrol), tilsættes 2 ug / ml biotinyleret anti-GFP-antistof til opløsningen og inkuberes natten over ved 4 ° C med vipning.
3. Tilføj 500 uLaf streptavidin-agarose-perler til mindst 5 ml 0,2% CHAPS / PBS og centrifugeres ved cirka 600 x g i 3 til 5 min. Fjern supernatanten. Gentag to gange mere med frisk CHAPS / PBS hver gang. Tilføj perler til antistoffet og celle opløsning og inkuber natten over ved 4 ° C med vipning at give perlerne at binde til det biotinylerede anti-GFP-antistof bundet til GFP eller GFP-TMEM184A.
4. Pelletere kuglerne ved centrifugering (som i 7.3) og fjern det ubundne materiale. Tilføje mindst 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / proteaseinhibitorer at vaske. Gentag vask og centrifugering mindst 3x til effektivt at fjerne eventuelt ubundet protein.
5. Efter fjernelse den sidste vask inkuberes perlerne med 1 ml 0,2 M glycin / 0,2% CHAPS i PBS (pH til 2,0 ved anvendelse af HCI) på is i 3 min for at dissociere antistof-GFP-binding (hvilket resulterer i fri GFP-TMEM184A eller fri GFP). Bland forsigtigt ved at banke hver 30 s.
6. Centrifugeres ved ca. 600 x g og overføre supernatanten indeholdende det oprensede protein til et nyt 15 ml rør efterfulgt af øjeblikkelig neutralisering med 5 ml 1 M natriumbicarbonat (bringe pH til 7).
7. Koncentrer prøven under anvendelse af en 10.000 Dalton molekylvægt cut-off centrifugal-koncentrator (ansætte centrifugering hastighed anbefalet af leverandøren). Når volumenet når ca. 0,5 ml, tilsættes 0,2% CHAPS / PBS. Fortsæt koncentrere og tilføje flere 0,2% CHAPS / PBS indtil mindst ti bind (gange start prøve volumen) af 0,2% CHAPS / PBS er blevet tilføjet.
8. For at bestemme et estimat af mængden af ​​isoleret GFP eller GFP-mærkede protein, få en absorbans læsning ved 280 nm og sammenligne det med en standardkurve fremstillet ud fra bovint serumalbumin eller andet kontrolprotein i den samme buffer.
   BEMÆRK: På grund ekstinktionskoefficient forskelle, denne koncentration er et skøn, men kan give en omtrentlig proteinkoncentration at lette yderligere analyse uden at spilde prøve. Nøjagtig proteinkoncentration kan afskrækkebrydes i en mikro-Lowry-proteinassay foretage visse at forberede standard protein i den samme buffer som prøve. Yderligere analyse af det isolerede protein kan opnås ved western blotting af det isolerede protein (under anvendelse af antistof detektion for GFP) og sammenligning med den forudsagte molekylvægt. Alternativt bør brug af TMEM184A antistoffer resultere i et bånd med den forudsagte konstrukt størrelse, men kan også resultere i en WT TMEM184A band hvis dimerer (eller højere orden oligomerer) er til stede i prøven. Et skøn over renhed kan opnås ved farvning et blot for totalt protein fra isoleret prøve vs totalt protein fra en portion af udgangsmaterialet.

8. In vitro Heparin bindingsassay

1. Forbered en plade sort avidin-coatede 96-brønds ved vask med 200 pi 0,2% CHAPS / PBS tre gange i 5 min under omrystning. Forbered en identisk sort noncoated plade med 96 brønde under anvendelse af den samme vaskeprocedure. Forbered enlayout for de eksperimentelle prøver (i tre eksemplarer) til at følge under assayet. Medtag brønde til standard heparin koncentrationer buffer kontrol, og brønde med GFP prøver uden heparin at bekræfte blegning af GFP.
   BEMÆRK: Hvis optimerede isolation eller ligand interaktion buffere er forskellige for det pågældende protein, gøre alle de plade præparater og vask med den optimale buffersystem.
2. Tilsæt 100 pi 60 pmol / brønd biotinyleret anti-GFP til alle brønde i avidin-coatede plade, hvor GFP-binding er ønsket. Mængden af ​​antistof er tilstrækkelig til bare mætte høj affinitet avidin i brøndene.
   1. Tilføj buffer kun alle brugte til kontrolformål brønde (ingen GFP eller GFP-TMEM184A binding ønskede). Forsegl brøndene med en plade dække for at forhindre fordampning. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur under omrystning.
      BEMÆRK: Mængder føjet til brønde og inkuberingstider er baseret på anbefalinger fra udbyderen.
3. Vask alle brønde tre gangei 5 minutter med 200 pi 0,2% CHAPS / PBS.
4. Tilsæt 100 pi 5 nmol / brønd GFP-TMEM184A eller GFP til passende brønde i avidin-coatede plade og inkuber i 1 time ved stuetemperatur under omrystning. Vask igen som i 8.3.
   BEMÆRK: Denne koncentration af protein blev valgt for at sikre, at alle steder blev mættet med overskydende GFP eller GFP-TMEM184A. Dette er vigtigt at sikre, at den samme mængde protein er bundet til hver brønd. Lavere mængder af protein kan også mætte de steder, en mulighed, at kunne undersøges ved at evaluere ubundet protein er tilbage efter inkubation af adskillige koncentrationer af protein med pladen og sammenligne ubundet protein og ligandbindingsassays.
5. Fremstilling af forskellige koncentrationer af fluorescein-mærket heparin, fx 10, 25, 50, 75, 100, 200 ug / ml, i 0,2% CHAPS / PBS. Gør dette og alle resterende arbejde i mørke.
   BEMÆRK: Før forberede koncentrationer, bør fastsættes specifikke koncentrationer til andre ligander for Protein mål pågældende. Den laveste koncentration bør være detekterbar i pladelæseren. Derfor er det vigtigt først at bestemme området, der kan detekteres præcist i puffersystemet anvendt. Derefter bestemme området er nødvendig for at opnå målbar binding. Koncentrationer af fluorescein-heparin under 10 pg / ml ikke konsekvent registrere i pladelæser under pufferbetingelser anvendes. Tilsvarende mens rhodamin-heparin som anvendes i de andre assays, kunne visualiseres i pladelæseren, i bufferbetingelser og i de koncentrationer, der er nødvendige for binding, fluorescens aflæsninger for standarder var ikke reproducerbart forskellige med denne fluorofor.
6. Tilsæt 100 pi fluorescein-heparin passende testbrønde i avidin-coatede plade og koncentration standard brønde i både avidin-coatede og ikke-overtrukne plade. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur under omrystning. Holde pladerne i mørke (eller folie dækket).
7. Ved hjælp af en plade reader, registrerer den indledende fluorescensemission fra heparin i kontrol brønde på begge plader og den indledende fluorescens (total) emission fra brønde med immobiliseret GFP-TMEM184A eller GFP i avidin-coatede plade. Om nødvendigt justeres instrumentet gain for at sikre påvisning af fluorescerende heparin mellem laveste og højeste koncentrationer.
   BEMÆRK: Sørg for den plade læser brønde fra oven og læser på det optimale sted i brøndene, hvis der er justerbar. For undersøgelsen pågældende, den optimale placering var omkring 75% ned brøndene. Oplysninger fås med pladen læseren skal give forslag, der er unikke til pladen læseren pågældende til læsning analyser af bundet prøve i sorte plader.
8. Fjern ubundet fluorescerende heparin fra brønde med immobiliseret GFP-TMEM184A eller GFP og anbringes i tilsvarende brønde i den ikke-coatede sort plade. Umiddelbart læse fluorescensemissionen.
9. Tilsæt 100 pi frisk 0,2% CHAPS / PBS tilbage into brønde, hvorfra fluorescein-heparin blev fjernet, og læse fluorescensemission.
10. Gentag trin 8.8 - 8.9 3x.
    BEMÆRK: Disse aflæsninger fra den coatede plade indikerer fluorescein heparin tilbage i GFP eller GFP-TMEM184A brønde. Hvis betydelig fluorescens findes i den tredje ubundet prøve, bør en ekstra vask forekomme. Hvis fluorescens fortsat fjernes i hver vask, kan binding af ligand være lav affinitet, og betingelserne skal revurderes. Slutaflæsningen udgør det bundne heparin læsning.
11. Optag fluorescens emission fra de fjernede, ubundne, prøver i noncoated plade, indhentning numre for hver vask. Disse er de "ubundne" aflæsninger.
12. Anvender de samlede heparin emissionsværdier opnået i 8.7 for at bekræfte de korrekte niveauer af heparin tilsat til hver brønd. Træk gennemsnitlige baggrund aflæsninger fra værdierne.
    BEMÆRK: Wells uden fluorescein-heparin tjene som baggrund på grund af antistof, GFP og puffer. Average baggrunden gentages for at opnå baggrundsværdien. Fratræk gennemsnitlige baggrund aflæsninger fra de bundne og ubundne aflæsninger for at få aktuelle værdier.
13. Ansætte et plot af emission mod totalt fluorescein-heparin tilsættes for at bestemme omfanget af emission versus mængde heparin.
    BEMÆRK: antistof alene, eller antistof og antigen resulteret i nogle quenching af fluorescens. Derfor blev samlet heparin bestemt baseret på den samlede tilføjede heparin som anført i 8.7.
14. Plot den korrigerede bundet heparin versus den ekstra heparin for tre eksemplarer på både GFP-TMEM184A sag og GFP sagen.
15. Bestem fri ligand ved at tilsætte de ubundne aflæsninger fra alle vaske for en bestemt koncentration.

Representative Results

Mens i teorien transfektion af enhver DNA-konstruktion i celler kunne opnås med lipofile transfektionsreagenser, tidligere rapporter indikerer mere effektiv transfektion af GFP-konstruktioner i endotelceller under anvendelse af elektroporering ^12. Protokollen tilvejebragt her typisk opnået GFP-konstruktion ekspression i mere end 80% af de primære-afledte endotelceller og glatte muskelceller anvendte. Design af konstruktionen anvendte anvendt et kommercielt tilgængeligt system, der kunne levere dette konstrukt hurtigt. Den største påtænkte anvendelse var fokuseret på placering spørgsmål, derfor korrekt levering til membranen, sammen med optimal eukaryot protein-ekspression og fortsatte konstruktion produktion var primære overvejelser. Andre overvejelser kan omfatte: anden placering af GFP for forskelligt lokaliserede proteiner eller proteiner med en C-terminal, der er en del af en foldet region, muligheden for wanting at fjerne GFP (tilføjelse et proteasespaltningssted), og en sekundær affinitet site. Sidstnævnte ville give alternative måder til oprensning af GFP-konstruktion og stabiliserende det på en overflade til bindingsassayet. For at bekræfte farvningsmønstre for forskellige kommercielle antistoffer mod TMEM184A, vaskulære celler, der udtrykker GFP-TMEM184A blev sammenlignet med identiske celler farvet med de kommercielle antistoffer. Det tidsrum efter transfektion virkninger fordeling af GFP-TMEM184A, som syntes at akkumulere over mindst 72 timer. Det tidsrum efter transfektion resulterer i optimal ekspression varierer med celletype og bør optimeres for hver teknik. Over tid, mere GFP mærkede del i peri-nuklear region. Afhængig af håndtering, GFP blegning forekom også. Resultaterne viste GFP-TMEM184A på celleoverfladen og i peri-nukleare og andre vesikler strukturer ligner lokalisering observeret med TMEM184A antistoffarvning (figur 1). De primære celler i figur 5, hvor teknikken blev også anvendt til at evaluere membran topologi.

Anvendelsen af et fluorescerende ligand (rhodamin-heparin) lettes evalueringen af co-lokalisering af ligand og receptor over tid, og de to etiketter gjort det muligt at foretage direkte billedvisning (figur 2 og Movie 1). Figur 2C blev afbildet af spændende GFP ved 405 nm, men indfange emission fra rhodamin (midterste billeder). GFP excitation er begrænset ved 405 nm der giver begrænset emission så godt, men det forhindrede excitation af rhodamin og en falsk FRET signal. Tilsvarende FRET-induced rhodamin emission var svag. I kontrol med GFP-TMEM184A udtryk, men ingen rhodamin-heparin, og andre med kun rhodamin-heparin var der ingen rhodamin emission med 405 nm excitation. Bagefter blev samlet GFP (venstre billeder) og total rhodamin (højre billeder) målt ved anvendelse af standard excitation / emissionsbølgelængder for hver fluorofor. Dataene i C støtter yderligere co-lokalisering af liganden og GFP-TMEM184A. Rhodamin-heparin optagelse i RAOEC kræves længere inkubation i forhold til A7r5 celler. blev ikke observeret nogen evidens for FRET i celler uden rhodamin-heparin eller i utransficerede celler. En ideel eksperiment ville omfatte en anden overflade GFP-konstruktion, som ikke bør have co-lokalisering med liganden.

Anskaffelse eller genvinding af funktion kunne også ske med GFP-protein-konstruktioner og rhodamin-heparin. Dette gav mulighed for at bruge GFP som bevis for ekspression niveau og ligand samarbejdeLokalisering og at kvantificere de interaktioner. Specifikt blev heparin optagelse forøget i GFP-TMEM184A konstruktionen-transficerede A7r5 celler (figur 3). Stabile Knockdown celler, som optager meget begrænset rhodamin-heparin blev produceret ^en, og disse leveres et system, hvor gevinst på funktion kunne evalueres. Transfektion af GFP-TMEM184A konstruktionen resulterede i celler, som igen kunne internaliserer rhodamin-heparin på niveauet for vildtypeceller eller derover (figur 3). Det skal bemærkes, at "ingen heparin" billede af stabile knockdown-celler, som ikke udtrykker GFP som en reporter for knockdown-konstruktionen. Baggrundsfluorescens var højere i disse celler, som iagttaget i billedet vist.

Det er typisk nyttigt at bruge isolerede receptor til bestemmelse af ligand-specificitet at mindske sandsynligheden for andre proteiner, der interagerer med liganden. Anvendelsen af ​​en GFP-Protein-konstruktion giver en betydelig fordel i denne henseende, da GFP tag kan tjene som håndtag til isolering af proteinet og undgår mulige interaktioner antistoffer eller andre affinitetsreagenser med yderligere proteiner. GFP kan også udtrykkes i identiske populationer af celler og isoleres under anvendelse af samme GFP affinitet procedure. Dette tilvejebringer en kontrol protein for ligand interaktionsundersøgelser. I TMEM184A systemet, GFP-TMEM184A isoleret under anvendelse af et anti-GFP-antistof affinitet resulterede i specifik, mættelig heparinbinding, mens kontrolgruppen GFP ikke bandt nogen heparin (figur 4).

Typisk GFP tags på konstruktioner placeret ved en ende af et protein. Den C-terminale placering letter korrekt protein trafficking til en membran. Derfor kan adgangen til GFP på en bestemt side af en membran, giver dokumentation for specifik topologi af et membranprotein, hvis foldning og topologi er ikke enlready kendt. Enkel immunofluorescens farvning med antistoffer mod GFP (såsom i figur 5) kan dokumentere GFP placering baseret på antistof adgang i ikke-permeabiliseres celler. De anti-GFP antistoffer genkender GFP selvom bleget. Immunfluorescensfarvning vist i figur 5 antyder signifikant anti-GFP-farvning uden permeabilisering af GFP-TMEM184A transficerede celler tilvejebringer foreløbige beviser, at GFP på plasmamembranen er ekstracellulær. Det er klart, intracellulært protein i vesikler også bliver farvet i permeabiliserede celler. FRET billeder i figur 2C, er i overensstemmelse med den foreslåede topologi.

Figur 1: GFP-TEMEM184A Lokalisering i Celler Bekræfter TMEM184A Lokalisering Bestemt af Immunofluorescens. A) BAOECs transficeret med GFP-TMEM184A blev fikseret med 4% PFA. Ikke-transficerede celler blev enten behandlet med iskold methanol (MeOH) fastsættelse og permeabilisering eller 4% PFA efterfulgt af Triton X-100 permeabilisering (som angivet). De ikke-transfekterede celler blev farvet under anvendelse af et antistof mod et C-terminalt peptid fra TMEM184A (CTD) eller et N-terminalt peptid fra TMEM184A (NTD) og en sekundær anti-kanin-antistof mærket med TRITC. B) Eksempler på klonet (A7r5) og primære (BAOSMC) glatmuskelceller blev forarbejdet på samme måde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Imaging af GFP-TMEM184A med Rhodamin-Heparin. A) A7r5s elektroporeret med GFP-TMEM184A blev behandlet med 100 ug / ml rhodamin-heparin forgange angivet og derefter fikseret med 4% PFA. Billeder er repræsentative for to separate forsøg. B) A7r5 celler blev transficeret med GFP-TMEM184A og rhodamin-heparin blev tilsat med øjeblikkelig direkte billedvisning. Udvalgte rammer af filmen er vist med en hvid lodret bjælke peger på den oprindelige lokalisering af en GFP-coatet vesikel indeholdende rhodamin-heparin. GFP etiket og rhodamin bevæger sig sammen. Scale barer = 2 um. C) RAOECs behandles som i A blev afbildet for fluorescensresonansenergioverførsel af spændende ved 405 (GFP, for FRET), og i forhold til standard-indstillingerne, se protokol 3.5. Panel A, og de to tidspunkter i B, der oprindeligt blev offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP et al. ^1. Copyright American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Klik her for at view en større version af dette tal.

Figur 3: GFP-TMEM184A Transfektion Giver Gain af Funktion. A) Markant lavere niveauer af rhodamin-heparin ses i stabile Knockdown A7r5 celler i forhold til vildtype A7r5s, se eksempel billeder. Den "ingen heparin" billede af stabile Knockdown celler, der udtrykker GFP som en markør for konstrukt tilstedeværelse. Scale barer = 10 um. B) Transfektion af GFP-TMEM184A ind i både vildtype- og stabile knockdown-celler markant øger rhodamin-heparin signal i disse celler baseret på analyse af mere end 50 celler / tilstand i tre uafhængige forsøg. Fejl- søjler repræsenterer SEM. p <0,0001 baseret på en Tukey-test. Dette tal blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP et al. ^1. Copyright American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Isoleret GFP-TMEM184A Binder Heparin. GFP-TMEM184A eller GFP blev isoleret og bundet til avidin-coatede assayplader. Fluorescein-heparin blev tilsat i koncentrationer fra 0,056 nmol gennem 1.111 nmol. Heparin bundet blev bestemt ved at måle emission ved 519 nm. GFP-TMEM184A (firkanter). GFP-kontrol (cirkler). Dette tal blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP et al. ^1. Copyright American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: GFP-TMEM184A og Membrane topologi. GFP-TMEM184A transficerede celler blev enten fikseret med 4% PFA (øverst) eller fikseret med 4% PFA og permeabiliseret med Triton X-100 (nederst). Celler blev farvet identisk med anti-GFP primære antistoffer og Cy3-mærkede sekundære antistoffer. Scale barer = 10 um. er der vist to forskellige eksperimenter. Sekundære kun-farvede celler udviste i det væsentlige ingen farvning. Klik her for at se en større version af dette tal.

pload / 55053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Movie 1:.. Levende-imaging af GFP-TMEM184A med rhodamin-Heparin (Højreklik for at downloade) A7r5 celler blev behandlet som i figur 2B Filmen illustrerer GFP- TMEM184A og rhodamin-heparin vesikel i toppen bevæger sammen. separate farveversioner foruden den fusionerede version af filmen er vist. den vesikel med GFP og indeholdende rhodamin en cirkel.

Discussion

Protokollerne rapporteret her blev designet til at give bekræftende bevis for identifikation af TMEM184A som heparin receptor i vaskulære celler ^1. Knockdown teknikker anvendes rutinemæssigt som en mekanisme til at bekræfte identifikationen af ​​hidtil ukendte proteiner. Men nogle funktionelle resultat efter knockdown er typisk ikke tilstrækkeligt bevis for, at en kandidat protein er faktisk den korrekte receptor (eller andre funktionelle protein). Det er også vigtigt at have dokumentation for, at ansøgeren proteinet faktisk udviser den funktion. Anvender en konstruktion til et hidtil ukendt gen mærket med GFP muliggør forstærkning af funktion eksperimenter og letter isolering af det mærkede protein baseret på GFP affinitet. Elektroporering anvendes i denne protokol lettet meget høj transfektionseffektivitet af konstruktionen (større end 80% af cellerne udtrykte konstruktionen). Men andre transfektion mekanismer kan bruges, hvis elektroporation ikke er tilgængelig eller ikke ønskes. Der er flere fordele ved at vælge en GFP-mærket konstruktion for bekræftelse af et nyt protein funktion. Først GFP tjener som en reporter for transfektion og genekspression og det tillader overekspression skal overvåges gennem GFP hvis en cellelinie uden ekspression af proteinet er ikke tilgængelig. For det andet GFP tag et værktøj til oprensning af proteinet, der ikke afhænger af hverken ligand affinitet eller antistoffer mod peptider. Tredje, GFP tag giver et værktøj til at undersøge komplekse immunfluorescerende lokalisering visualiseret ved anvendelse af antistoffer dannet mod unikke peptider i målproteinsekvensen at afgøre, om det faktiske genprodukt er tilsvarende lokaliseret.

Gain funktions assays med genkonstruktioner bliver brugt til en række formål herunder high-throughput screening til identifikation af hidtil ukendte proteinfunktion ^13. Ideelt set ville gevinst på funktion analyser ansætte en velundersøgte klonet celle line, der ikke udtrykker det pågældende gen (cellerne skal stadig udtrykke samarbejdende genprodukter, der tillader funktion af det nyligt udtrykte gen). Når en bestemt GFP-mærket konstruktion som i de foreliggende assays, er det vigtigt at anvende celler, hvori GFP-protein kan fungere. Således er valget af celler afhænger af den funktion og, sandsynligvis, af celletypen, hvori funktionen normalt ville forekomme for sikre samvirkende proteiner er til stede. GFP-tagging giver en ekstra måde at overvåge funktion i det tilfælde, hvor fluorescensen af GFP-mærkede protein kan følges som en del af et funktionelt assay (f.eks se figur 2 og 3). En begrænsning til disse undersøgelser ville være, hvis GFP eller anden måde ændrer proteinfunktion. Ved at forbinde GFP til C-terminalen af ​​proteinet, har et stort antal proteiner allerede blevet undersøgt uden en tilsyneladende funktionel ændring, men en sådan mulighed eksisterer.

Radioisotopically mærkede ligander er ofte blevet anvendt til at undersøge ligand-binding til intakte celler ^11. Men disse analyser ikke tillade simpel bestemmelse af ligand placering efter binding, heller ikke lette sammenligninger af ligand og receptor sammen som i den foreliggende rapport. En GFP konstruktion giver også yderligere muligheder for at undersøge en mærket membranprotein som her. På grund af den C-terminale placering af GFP tag, er det muligt at undersøge placeringen af ​​GFP tag i transficerede celler i hele et assay. Immunofluorescens under anvendelse af antistoffer til GFP tillader sammenligning af GFP tilgængeligt for antistoffer med og uden permeabilisering (figur 5). Yderligere anvendelser af GFP-TMEM184A drage fordel af GFP billeddannelse såsom colokalisering med rhodamin-heparin (figur 2). Anvender FRET at tillade emission fra GFP til ophidse rhodamin-heparin, som vist i 2C giver en interessant måde at evaluere binding og intracellulær trafficking. Endvidere FRET data viser, at GFP er tæt nok (inden for 10 nm) til rhodamin-ligand til at overføre excitation. Bevis for, at en sådan overførsel fra GFP til en ligand værker er blevet offentliggjort for parathyreoideahormon tagget med tetramethyl-rhodamin ^14. Alternativ FRET teknologi (foto-blegning og / eller edb-drevne imaging mønstre), kan også anvendes til mere kompleks analyse, end hvad der er vist her som et eksempel. På samme måde kan interaktioner af andre proteiner med kandidaten undersøges ved hjælp af FRET med fluorescerende tags optimeret til FRET som i EGFP / mCherry systemet rapporteret af Albertazzi et al. ¹⁵ og den fælles fiskeripolitik / YFP og GFP par, der anvendes i kalium kanal undersøgelser af Wang og kolleger ^16. Mange nye små fluorescerende molekyler bliver designet, for eksempel ^17. Disse molekyler vil øge antallet af sager, hvor ærgre interaktioner mellem GFP-mærkede proteiner og fluorescent ligander kan undersøges. Fremtidige undersøgelser kan også involvere målrettede ændringer af genet, således at konstruktionen til at bestemme sekvens-specifikke aspekter af genfunktion. Én begrænsning for GFP-mærkede membranproteiner er, når den C-terminale ende af proteinet er normalt inde. I sådanne tilfælde FRET assays med fluorescerende vandopløselige ligander måske ikke muligt. Men for at alternative mekanismer placere GFP andetsteds i konstruktionen kan stadig være muligt for nogle sådanne proteiner, og de andre assays her rapporterede kunne stadig anvendes.

Foruden funktion, lokalisering, og in vivo ligand-interaktioner, kan en GFP-mærket protein isoleres ved anvendelse af et anti-GFP-antistof og det isolerede protein, der anvendes til at undersøge funktionen anvender in vitro-assays, hvor GFP muliggør en objektiv isolering af proteinet og en forholdsvis isoleret kontrol (fri GFP). Sammen disse analyser kan give stærke yderligere beviser er nødvendig for at bevise thi kandidat protein fungerer som en hypotese.

Yderligere, fordi GFP er proteaseresistente medmindre modificeret med websteder, der strækker sig væk fra den kompakte struktur ^18, bør begrænset protease behandling af celler frigiver ekstracellulær GFP. Proteasespaltningsstedet ville forekomme i protein, hvortil GFP er bundet eller i en konstrueret binding region. Den frigivne produkt ville være GFP med en forlængelse N-terminalt for GFP-sekvensen. Trypsin bør ikke frigive GFP hvis C-terminalen af ​​det protein, hvortil GFP er fæstnet, er intracellulært. En foreløbig analyse af potentielle produkter kunne foreslå en klar molekylvægt mønster med en GFP-mærket protein frigivet af trypsin. For mange membranproteiner, ville sådanne teknikker resulterer i klar evidens for membran topologi ved frigivelse af GFP, eller mangel på samme.

Sammen de specifikke analyser præsenteres og / eller foreslås i denne rapport giver et bredt udsnit af teknikker that kan anvendes til at undersøge hidtil ukendte proteiner ved at starte med en fluorescens mærkede konstrukt. Sådanne konstruktioner kan let opnås kommercielt. Muligheden for at bruge dem til en bred vifte af teknikker gør dem økonomisk muligt for selv små laboratorier på begrænsede budgetter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Light Sensitive
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Light Sensitive
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free)	Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific	PI28908 at Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes)	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	PI15510 at Fisher	Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates	Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific	064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line	ATCC	CRL 1444	Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	B304-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells	Cell Applications, Inc.	B354-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads	Sigma	S1638
HeBS	Available from Bio-Rad		Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus	Obtained from ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci used in Figure 1
GFP antibodies	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)	Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS	Purchased from Sigma	C5849	Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens	Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope	Nikon	C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens	Used for images in Figure 5
Confocal Microscope	Zeiss	Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens	Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes	Available from MidSci	EC2L	Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line	Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail
Cell Culture trypsin solution	Sigma	T4174	purchased as a 10x solution