L'utilisation d'un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity

Summary

Un TMEM184A codant pour la construction d'une étiquette de la GFP à l'extrémité carboxy-terminale conçu pour l'expression eucaryote, a été utilisé dans des essais visant à confirmer l'identification de TMEM184A comme récepteur d'héparine dans les cellules vasculaires.

Abstract

Lorsque de nouvelles protéines sont identifiées par l'isolement et l'analyse bioinformatique basée sur l'affinité, ils sont souvent en grande partie non caractérisés. Des anticorps dirigés contre des peptides spécifiques de la séquence prédite permettent des expériences de localisation. Cependant, d'autres interactions possibles avec les anticorps ne peuvent souvent pas être exclus. Cette situation a permis d'élaborer une série de tests qui dépendent de la séquence protéique. Plus précisément, une construction contenant la séquence de gène couplé à la séquence codant pour la GFP à l'extrémité C-terminale de la protéine a été obtenu et utilisé à ces fins. Des expériences pour caractériser la localisation, l' affinité du ligand, et le gain de la fonction ont été initialement conçues et réalisées pour confirmer l'identification des TMEM184A comme un récepteur d'héparine ^1. En outre, la construction peut être utilisé pour des études portant sur la membrane des questions de topologie et des interactions protéine-ligand détaillés. Le présent rapport présente arange de protocoles expérimentaux basés sur la construction GFP-TMEM184A exprimé dans les cellules vasculaires qui pourraient facilement être adapté à d'autres nouvelles protéines.

Introduction

L'identification des protéines candidates pour de nouvelles fonctions dépend souvent des protocoles d'isolement basées sur l'affinité suivie par une détermination de séquence partielle. De récents exemples de protéines nouvellement identifiées comprennent la protéine transmembranaire 184A (TMEM184A), un récepteur d'héparine identifié après les interactions d'affinité d' héparine ¹ et TgPH1, une protéine de domaine pleckstrine qui se lie phosphoinositide PI (3,5) _P2 ^2. Autre nouvelle identification des protéines implique une analyse de séquence directe de peptides tel que , par Vit, et al. qui a utilisé des peptides transmembranaires pour identifier les produits de protéines à partir de gènes précédemment non caractérisés ^3. De même, l' identification de nouvelles séquences de protéines peut être réalisée en utilisant la bioinformatique à la recherche de familles de protéines précédemment caractérisées telles que l' identification de nouvelles protéines 4TM ^4. L'examen des séquences de gènes de la famille des aquaporines a alainsi cédé l'identification de nouveaux membres avec de nouvelles fonctions ^5. Après l'identification, l'analyse de la fonction des protéines est typiquement une étape suivante qui peut parfois être examinée à l'aide d'un dosage spécifique de la fonction de la protéine comme dans le cas d'aquaporine.

Lorsque cela est possible, la fonction d'une protéine nouvellement identifiée peut être examinée avec enzymatique spécifique ou des tests de fonction similaires in vitro. Étant donné que de nombreuses fonctions nouvelles protéines dépendent des interactions complexes qui se produisent uniquement dans des cellules ou organismes intacts, dans des essais in vitro ne sont pas toujours efficaces. Cependant, les dosages in vivo doivent être conçus de telle sorte qu'ils dépendent de la séquence du gène. Dans la culture cellulaire, et / ou des organismes modèles simples, knockdown peut apporter la preuve pour l'identification de protéines / fonction ^6. Avec de nouvelles protéines identifiées comme indiqué ci-dessus, il est souvent insuffisant pour simplement renverser une protéine pour confirmer la fonction, und la conception des tests fonctionnels in vivo qui dépendent de la séquence du gène devient important pour la caractérisation de nouvelles protéines.

L'identification récente de TMEM184A comme un récepteur d'héparine (qui module la prolifération dans le muscle lisse vasculaire et des réponses inflammatoires dans les cellules endothéliales) utilisant la chromatographie d'affinité et MALDI MS ^{1, 7} a été l'occasion de développer une collection d'essais après knockdown a abouti à des résultats cohérents avec l'identification . Une étude récente a confirmé que l' héparine interagit spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance, leurs récepteurs, les composants de la matrice extracellulaire, des récepteurs d'adhésion cellulaire et d' autres protéines ^8. Dans le système vasculaire, l' héparine et l' héparane sulfate protéoglycanes (contenant du sulfate d' héparane des chaînes de structure similaire à l' héparine) interagissent avec plusieurs centaines de protéines ^9. Pour confirmer fonctionnellement that TMEM184A a été impliqué dans l'absorption d'héparine et de liaison, les techniques qui employaient la construction de gène pour TMEM184A ont été développés. Le présent rapport comprend une collection de tests basés sur une GFP-TMEM184A construire pour une utilisation à confirmer l'identité du TMEM184A comme un récepteur de l'héparine.

Protocol

1. Conception d'une construction GFP-protéine

1. Achat, ou de la conception et de la construction, une construction de GFP-tagged basé sur la protéine en question.
   NOTE: Pour une construction acheté, des vecteurs standards sont disponibles auprès des laboratoires commerciaux qui incluent certaines ou toutes les suggestions suivantes: Pour une protéine membranaire, sélectionner un emplacement de C-terminale de la GFP, car il est moins susceptible d'interférer avec le trafic de protéine membranaire. Considérons une extension entre le gène d'intérêt et de la GFP, s'il y a des raisons de croire que l'extrémité C-terminale de la protéine en question est compacte pliée dans un domaine de la protéine. Sélectionnez la construction pour l'expression générale de cellules eucaryotes, mais permettent de construire la production dans des systèmes bactériens. Inclure un site de clivage (par exemple, pour la protéase TEV), par lequel la GFP peut être enlevé si on le souhaite pour certaines expériences dans lesquelles la GFP pourrait interférer avec l'activité de la protéine. Ajouter d'autres inserts, comme une étiquette supplémentaire pour la localisation ou affinitéinteractions (par exemple, His6). Cela n'a pas été nécessaire pour les essais décrits ici, mais peut faciliter d'autres dosages, ou être utiles directement adjacent au gène, avant la GFP, si le retrait de la GFP est souhaitée.

2. GFP-TMEM184A Expression dans les cellules vasculaires

1. Endothélial de culture ou des cellules musculaires lisses vasculaires à 0,2% de gélatine revêtues de tissus boîtes de culture comme indiqué précédemment ^{1, 6, 7.}
2. Ajouter la solution de culture de cellules de 5 ml de trypsine (0,5% p / v) à un rinçage à 100 mm, ou plus, Antenne confluentes de cellules. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont libérées seulement à partir de la plaque, et transférer les cellules dans un tube en polypropylène de centrifugation stérile.
3. Ajouter un inhibiteur de trypsine (par exemple d' un volume égal de milieu de culture ordinaire), tel qu'il est utilisé dans la culture de routine, à la solution de cellules / trypsine pour limiter l' activité de la trypsine. Sédimenter les cellules pendant 5 min à envirdiatement 600 xg (ou vitesse appropriée et le temps juste pour sédimenter les cellules pour la culture de tissus standard). Aspirer le surnageant.
4. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon d'électroporation HeBS (solution saline tamponnée au HEPES), ce qui limite la quantité de cellules temporelles sont dans le culot ou une suspension. Placez la suspension de cellules sur la glace et réaliser les étapes restantes sur la glace.
   NOTE: Pellet peut être lavé une fois avec HeBS avant resuspension.
5. Ajouter un volume suffisant de GFP-étiqueté TMEM184A plasmide dans les cellules pour obtenir une concentration finale de 20 pg / ml d'ADN. Utiliser un protocole identique pour une construction de GFP.
6. Placer environ 0,4 ml de la solution de cellules dans HeBS dans une cuvette d'électroporation. Pré-refroidir les cuvettes avant utilisation.
7. Électroporation les cellules en utilisant les conditions suivantes: Exponential Decay, 500 mF, ∞ ohm, et 170 V.
   REMARQUE: La tension d'un type cellulaire donné doit être optimisée. Des études préliminaires avec endothéliale et cel musculaires lissestypes de l ont été accomplies avec une construction GFP-vinculine pour déterminer la valeur de tension optimale indiquées ici, par exemple ^10.
   1. Pour optimiser l'électroporation, commencer avec les recommandations du fabricant de l'équipement (qui comprennent les conditions pour certains types de cellules standard). Utilisez la construction désirée ou une protéine fluorescente de contrôle construisent similaire en taille et caractéristiques de fluorescence à la construction souhaitée.
      NOTE: Petit acides nucléiques semblent entrer dans les cellules plus facilement que les grandes constructions, donc une construction avec seulement une protéine fluorescente peut être plus facile à exprimer qu'une plus grande.
   2. En utilisant la microscopie à fluorescence pour déterminer la viabilité cellulaire, le pourcentage de cellules dans lesquelles la construction fluorescente est exprimée après 24 et 48 h, et l'intensité de l'expression.
      REMARQUE: Diminuer la tension et / ou le temps légèrement si la survie est faible. Visez le temps le plus court possible entre la libération de cellules de la surface de la culture et de retourles cellules de la culture afin d'améliorer la survie. Une légère augmentation dans le temps ou une seconde impulsion peuvent améliorer l'absorption de construction si la survie est élevée et d'expression est faible. Les conditions optimales et l'expression varient entre les types de cellules. Si le pourcentage de cellules exprimant le produit d'assemblage est élevé, mais l'intensité est faible, ce qui augmente la concentration de l'ADN et le suivi des cellules transfectées avec le temps pour une intensité optimale, qui va varier en fonction de la demi-vie des protéines, ainsi que l'expression peut améliorer l'intensité. intensité de fluorescence peut être agrandie pour certains essais, le cas échéant, par une coloration par immunofluorescence de la GFP avec des anticorps anti-GFP
8. Après l'électroporation, les cellules des graines en six 30 mm puits de culture tissulaire avec des lamelles couvre-objet pour l'imagerie ou dans des boîtes de culture de tissus. La culture des cellules en utilisant les procédures de culture cellulaire standard.
9. En option: Remplacer le milieu de culture après 24 h pour éliminer tout tampon d'électroporation HeBS.

3. Visualisation de la GFP-TMEM184A Localisation

1. Rincer les cellules avec du PBS et agitation douce après culture pendant au moins 24 h. Limiter l'exposition à la lumière vive pour éviter la décoloration GFP.
2. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 15 min à température ambiante sous agitation douce. Évitez d'utiliser des réactifs contenant du méthanol qui peut perméabiliser les cellules. La fixation avec du methanol peut être utilisé s'il est pas nécessaire d'évaluer les interactions ligand.
   Attention: paraformaldéhyde est toxique. Porter un équipement de protection individuelle approprié. Utilisation dans une hotte, avec soin, et jeter correctement.
3. Rincer avec du PBS comme ci-dessus. Pour l'anticorps à base de coloration, voir 3.6 ci-dessous.
4. Mont à lamelles de diapositives à l'aide Mowiol ou tout autre support de montage approprié.
5. Les diapositives d'images en utilisant un microscope confocal à fluorescence ou avec les jeux de filtres appropriés pour la GFP spectres d'excitation et d'émission. La microscopie confocale est préférée en raison de la capacité de séparer des échantillons dans le plan z. Enregistrer des images en niveaux de gris pour qudes fins de antitation au format TIF (en plus des images pleines de couleurs pour les illustrations).
6. A titre de comparaison avec WT TMEM184A exprimé par les cellules, d' autres cellules pour préparer immunofluorescence en utilisant des anticorps primaires préparées à un peptide (s) à partir de la séquence de TMEM184A, par exemple ^1. L'identification de la GFP TEMEM184A peut également être accomplie en utilisant des anticorps contre la GFP. Évaluer les deux échantillons de cellules par des techniques de microscopie identiques.

4. rhodamine-Heparin Binding et colocalisation avec des cellules GFP-TMEM184A-transfectées

1. Traiter les cellules GFP-TMEM184A exprimant avec 100 pg / mL rhodamine-héparine ajouté au milieu de culture, et permettre à des cellules à incuber pendant une période de temps spécifique, généralement moins de 10 min pour les cellules A7r5. Rincer et fixer comme dans 3.1 et 3.2.
   NOTE: Le temps optimal et la concentration de ligand dépend de la réponse des cellules, l'intensité de fluorescence du ligand et de l'image d'intensité obtenues. Ce concentration de l' héparine a été utilisée , car elle se traduit par une réponse de plus de 50% dans d' autres dosages ^11. Cette concentration peut être visualisé en utilisant des techniques de microscopie par fluorescence standard, de sorte qu'il n'a pas été nécessaire de l'augmenter. Dilution de rhodamine-héparine avec des résultats de l'héparine non marqués en fluorescence plus faible dans les cellules, est donc plus difficile à l'image et à quantifier.
2. Pour quantifier la liaison en raison de la GFP-TMEM184A transfection rhodamine-héparine, préparer des cellules identiques sans transfectées GFP-TMEM184A.
3. Imager les cellules en utilisant un microscope confocal à la GFP appropriée (488 nm) et de rhodamine (543 nm) excitation et d'émission (500-530 nm pour la GFP et supérieure à 560 nm pour la rhodamine) valeurs pour déterminer la co-localisation. Obtenir des images d'au moins 50 cellules à partir d'au moins trois expériences distinctes pour obtenir des statistiques. Maintenir des paramètres identiques dans les expériences, et d' employer un échantillon témoin (s) (par exemple, les cellules transfectées sans traitement) eà peut être utilisé pour normaliser les données pour l'analyse des expériences multiples.
4. Examiner les images à l'aide d'un programme d'ordinateur pour déterminer la liaison / absorption dans chaque cellule pour la quantification de la liaison par rapport rhodamine.
   REMARQUE: les images TIF devraient être employés comme ils sont pratiques pour l'analyse et peuvent être converties en échelle de gris dans de nombreux programmes informatiques si elles ne sont pas initialement enregistrées dans ce format. Image J (freeware) a été utilisé dans la présente analyse et permet la zone et l'intensité du pixel à mesurer pour une zone définie par l'utilisateur dans une image.
   1. Utilisez un outil à main levée pour faire le tour d'une cellule à l'intérieur d'une image fluorescente et utiliser l'outil de mesure pour déterminer l'intensité dans cet espace.
      NOTE: Ces mesures fournissent les informations nécessaires pour calculer l' intensité totale pour une zone définie par l' utilisateur (cellule entière, noyau, etc.) fournissant un moyen de comparer les différentes cellules avec des géométries différentes. Moyenne intensité sur une surface de fond peut être rapporté, et qui facilitents collection d'intensité de fond pour l'analyse.
   2. Exporter vers une feuille de calcul pour calculer l'aire multipliée par l'intensité et la soustraction de fond pour la même quantité de surface. Moyenne, la fluorescence / cellule pour les cellules assez / expérience pour obtenir une signification statistique.

5. Fluorescence Resonance Energy Transfer de GFP TMEM184A à la rhodamine Héparine

1. Préparer les cellules transfectées et incuber avec 200 pg / mL ligand de rhodamine-étiqueté comme en 3.1. A noter que le temps d'incubation avec le ligand fluorescent est le type cellulaire dépendante. Fixer avec PFA seulement, et monter des diapositives pour l'imagerie.
2. Tout d'abord, exciter à 405 nm et de l'image pour l'émission de rhodamine (566-685 nm; FRET). Deuxièmement, exciter à 488 pour la GFP (image au 493-530), et le troisième, exciter à 561 pour rhodamine (image au 566-685). Contrôles sans GFP-TMEM184A ou sans rhodamine-héparine sont critiques.

6. cellules vivantes Imaging de rhodamine-Heparin Uptake

1. Graine de la GFP-TMEM184A cellules transfectées dans des plats individuels conçus pour l'imagerie des cellules vivantes et traiter comme dans le protocole 3.
   NOTE: Le nombre de cellules nécessaires dépend du type de cellule et de la densité désirée. Afin de minimiser la quantité de temps les cellules sont en suspension, ne pas compter les cellules. cellules de semences à partir d'un plat de confluentes 100 mm en six 35 mm plats en direct d'imagerie pour obtenir des cellules proches de la confluence en 48 h.
2. Au bout de 48 heures, remplacer le milieu par du milieu de culture sans rouge de phénol.
3. Transférer une boîte de cellules à un microscope confocal à une étape de réchauffement pour maintenir la température et de focaliser le microscope.
4. Pipet 100 pg / mL rhodamine-héparine dans le plat et mélanger délicatement.
5. Immédiatement commencer l'enregistrement des images en direct. En l'absence de l'absorption cellulaire de l'héparine se produit dans la région en vue de déplacer le plat légèrement pour identifier les cellules avec au moins une vésicule contenant l'étiquette verte de la rhodamine.
   NOTE: excitation imagerie et d'émission spécifiques sont lescomme pour le protocole de l'héparine d'absorption (section 5). La période de temps entre les images était d'environ 16 s. Les conditions de l'expérience et le microscope typiquement déterminer la vitesse à laquelle les images peuvent être obtenues.

7. Isolation de la GFP-TMEM184A et GFP de cellules cultivées

1. Après avoir enlevé le milieu de culture et le rinçage avec du PBS, ajouter 2 ml de 0,2% (p / v) de CHAPS 1 x PBS avec des inhibiteurs de protéase à une plaque de 150 mm de cellules exprimant la GFP TMEM184A ou GFP (pour les essais de liaison de contrôle). Grattez les cellules de la boîte, placer la solution cellules / CHAPS dans un tube de 15 ml de polypropylène sur la glace, et bien mélanger en tapotant. Terminez toutes les étapes de la lumière pour assurer la balise GFP est blanchie pour l'essai de liaison ci-dessous.
2. Pour se lier spécifiquement GFP TMEM184A (ou un contrôle approprié de la GFP), ajouter un anticorps anti-GFP biotinylé 2 pg / ml à la solution et on incube pendant une nuit à 4 ° C avec balancement.
3. Ajouter 500 uldes billes de streptavidine-agarose à au moins 5 ml de 0,2% de CHAPS / PBS et centrifuger à environ 600 xg pendant 3 à 5 min. Retirer le surnageant. Répétez deux fois avec CHAPS frais / PBS à chaque fois. Ajouter des perles à la solution d'anticorps et de cellules et incuber pendant une nuit à 4 ° C avec une bascule pour permettre aux billes de se lier à l'anticorps anti-GFP biotinylé lié à la GFP ou GFP-TMEM184A.
4. Pellet les perles par centrifugation (comme dans 7.3) et retirer le matériau non lié. Ajouter des inhibiteurs au moins 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / protéase à laver. Répéter le lavage et la centrifugation au moins 3x pour éliminer efficacement toute protéine non liée.
5. Après avoir retiré le dernier lavage, l'incubation des perles avec 1 ml de glycine 0,2 M / 0,2% de CHAPS dans PBS (pH à 2,0 en utilisant du HCl) sur de la glace pendant 3 minutes pour dissocier la liaison anticorps-GFP (résultant en libre-GFP TMEM184A ou sans GFP). Mélanger doucement en appuyant sur toutes les 30 s.
6. Centrifuger à environ 600 x g et transférer le surnageant contenant le p purifiérotein dans un nouveau tube de 15 ml suivie d'une neutralisation immédiate avec du bicarbonate de sodium à 5 ml de 1 M (amener le pH à 7).
7. Concentrer l'échantillon à l'aide d'une coupure de concentrateur centrifuge 10.000 Dalton poids moléculaire (utiliser la vitesse de centrifugation recommandée par le fournisseur). Lorsque le volume atteint environ 0,5 ml, ajouter 0,2% de CHAPS / PBS. Continuer à se concentrer et ajouter plus de 0,2% de CHAPS / PBS jusqu'à au moins dix volumes (fois le volume de l'échantillon de départ) de 0,2% CHAPS / PBS ont été ajoutés.
8. Afin de déterminer une estimation de la quantité de GFP isolée ou de la protéine GFP-étiquetée, obtenir une lecture d'absorbance à 280 nm et de le comparer à une courbe étalon préparée à partir de sérum-albumine bovine ou une autre protéine de contrôle dans le même tampon.
   NOTE: En raison des différences de coefficient d'extinction, cette concentration est une estimation, mais peut fournir une concentration approximative de protéines pour faciliter l'analyse sans perdre de l'échantillon. la concentration de protéines précise peut être dissuaderminées en utilisant un dosage des protéines de Lowry micro assurant pour préparer la protéine standard dans le même tampon que celui de l'échantillon. Une analyse plus poussée de la protéine isolée peut être réalisée par transfert de Western de la protéine isolée (par détection d'anticorps pour la GFP) et la comparaison avec le poids moléculaire prédit. En variante, l'utilisation des anticorps TMEM184A devrait se traduire par une bande de la taille prédite de la construction, mais il pourrait également se traduire par une bande WT TMEM184A si dimères (ou des oligomères d'ordre supérieur) sont présents dans l'échantillon. Une estimation de la pureté peut être obtenu par coloration d'un transfert pour la protéine totale dans l'échantillon isolé contre la protéine totale à partir d'une aliquote du matériau de départ.

8. in vitro Heparin Binding Assay

1. Préparer une plaque d'avidine noir à 96 puits par lavage avec 200 ul de 0,2% de CHAPS / PBS trois fois pendant 5 minutes avec agitation. Préparer une plaque non revêtu de 96 puits noir identiques utilisant le même procédé de lavage. Préparer unmise en page pour les échantillons expérimentaux (en triple exemplaire) à suivre au cours de l'essai. Inclure des puits pour des concentrations standard d'héparine, le contrôle des tampons, et des puits avec des échantillons de GFP sans héparine pour confirmer le blanchiment de la GFP.
   NOTE: Si l'isolement ou les interactions ligand tampons optimisés sont différentes pour la protéine en question, faire toutes les préparations de la plaque et laver avec le système tampon optimal.
2. Ajouter 100 ul de 60 pmol / puits anticorps biotinylé anti-GFP dans tous les puits de la plaque revêtue d'avidine, où la liaison est désirée GFP. La quantité d'anticorps est suffisante pour saturer tout l'avidine à haute affinité dans les puits.
   1. Ajouter tampon seulement à tous les puits utilisés à des fins de contrôle (pas GFP ou GFP-TMEM184A de liaison souhaitée). Sceller les puits avec un couvercle de la plaque pour empêcher l'évaporation. Incuber pendant 2 heures à température ambiante, sous agitation.
      NOTE: Les volumes ajoutés à des puits et des temps d'incubation sont basées sur les recommandations du fournisseur.
3. Laver tous les puits trois foispendant 5 minutes avec 200 ul de 0,2% de CHAPS / PBS.
4. Ajouter 100 pi de 5 nmol / puits GFP-TMEM184A ou GFP dans les puits appropriés de la plaque de avidine revêtue et incuber pendant 1 h à température ambiante sous agitation. Laver à nouveau comme dans 8.3.
   Remarque: Cette concentration de la protéine a été choisie pour assurer que tous les sites ont été saturés avec un excès GFP ou GFP TMEM184A. Il est important de veiller à ce que la même quantité de protéine est liée à chaque puits. Des quantités plus faibles de protéines peuvent également saturer les sites, une possibilité qui pourrait être examinée en évaluant la protéine non liée restant après incubation de plusieurs concentrations de protéines avec la plaque et en comparant la protéine non liée et des essais de liaison de ligand.
5. Préparer diverses concentrations d'héparine marquée à la fluorescéine, par exemple, 10, 25, 50, 75, 100, 200 pg / ml, de 0,2% de CHAPS / PBS. Pour ce faire, et tout le travail restant dans l'obscurité.
   NOTE: Avant de préparer les concentrations, les concentrations spécifiques pour d'autres ligands doivent être déterminées pour le protein cible en question. La concentration la plus faible doit être détectable dans le lecteur de plaque. Par conséquent, il est important de déterminer d'abord la plage qui peut être détectée avec précision dans le système de tampon utilisé. Ensuite, déterminer la gamme nécessaire pour obtenir mesurable de liaison. Les concentrations de fluorescéine héparine inférieure à 10 pg / ml n'a pas enregistré de manière cohérente dans le lecteur de plaque dans les conditions tampons utilisées. De même, si la rhodamine héparine tel que celui utilisé dans les autres essais, peut être visualisé dans le lecteur de plaque, dans les conditions de tampon et aux concentrations nécessaires pour la liaison, les lectures de fluorescence pour les normes ne sont pas reproductibles différent à celui fluorophore.
6. Ajouter 100 pi de fluorescéine-héparine à des puits d'essai appropriées dans les plaques standard et de concentration des puits revêtues d'avidine à la fois dans la plaque non-revêtu avidine revêtu et. Incuber pendant 10 min à température ambiante sous agitation. Gardez les plaques dans l'obscurité (ou une feuille couverte).
7. L'utilisation d'une plaque reader, enregistrer l'émission de fluorescence initiale de l'héparine dans les puits de contrôle des deux plaques et la fluorescence initiale d'émission (au total) de puits avec immobilisée GFP GFP TMEM184A ou dans la plaque d'avidine. Si nécessaire, ajuster le gain de l'instrument pour assurer la détection de l'héparine fluorescente entre les concentrations les plus élevées le plus bas et.
   REMARQUE: Assurez-vous que le lecteur de plaque lit puits d'en haut et se lit à l'emplacement optimal dans les puits si cela est réglable. Pour l'étude en question, l'emplacement optimal est d'environ 75% par les puits. Information disponible avec le lecteur de plaque doit fournir des suggestions qui sont uniques au lecteur de plaque en question pour la lecture des analyses de l'échantillon lié dans des plaques noires.
8. Retirer l'héparine fluorescent non lié de puits avec immobilisée GFP-TMEM184A ou GFP et la placer dans les puits correspondants de la plaque non-enduit noir. Immédiatement lire l'émission de fluorescence.
9. Ajouter 100 pi frais 0,2% CHAPS / PBS retour into puits à partir duquel l'héparine fluorescéine a été éliminé, et lire une émission de fluorescence.
10. Répétez les étapes 08.08 à 08.09 3x.
    NOTE: Ces lectures de la plaque revêtue indiquent l'héparine fluorescéine restant dans les GFP ou la GFP-TMEM184A puits. Si la fluorescence importante se trouve dans le troisième échantillon non lié, un lavage supplémentaire devrait se produire. Si la fluorescence continue à être retiré dans chaque lavage, la liaison de ligand pourrait être faible affinité, et les conditions devraient être réévalués. La lecture finale constitue la lecture de l'héparine liée.
11. Enregistrer une émission de fluorescence des désinstallés, non consolidés, des échantillons de la plaque non revêtu, l'obtention des numéros pour chaque lavage. Ce sont les lectures "non liés".
12. Utilisez la valeur totale de l'héparine d'émission obtenus dans 8,7 pour confirmer les niveaux corrects de l'héparine ajoutée à chaque puits. Soustraire fond lectures moyennes des valeurs.
    NOTE: Wells sans fluorescéine-héparine servir comme fond due à l'anticorps, la GFP et de tampon. Etalemente le fond répète pour obtenir la valeur d'arrière-plan. fond Soustraire lectures moyennes des lectures liés et non liés pour obtenir des valeurs réelles.
13. Employez un terrain d'émission par rapport à la fluorescéine-héparine ajoutée totale pour déterminer l'ampleur des émissions par rapport à quantité d'héparine.
    REMARQUE: seul anticorps, ou l'anticorps et l'antigène ont donné lieu à une certaine extinction de la fluorescence. Par conséquent, l'héparine total a été déterminé en fonction de l'héparine ajoutée totale comme indiqué dans 8.7.
14. Tracer l'héparine liée corrigée par rapport à l'héparine ajoutée pour les triplicats tant dans le cas GFP-TMEM184A et le cas de la GFP.
15. Déterminer le ligand libre en ajoutant les lectures non consolidées de tous les lavages pour une concentration spécifique.

Representative Results

Bien qu'en théorie, la transfection d'une construction d' ADN dans des cellules peut être réalisée avec des réactifs de transfection lipophiles, les rapports précédents indiquent une transfection plus efficace de la GFP dans les cellules endothéliales construit en utilisant une électroporation ^12. Le protocole fourni ici typiquement obtenu GFP dans la construction d'expression supérieure à 80% des cellules endothéliales primaires et dérivées des cellules musculaires lisses utilisés. Conception de la construction employée a utilisé un système disponible dans le commerce qui pourrait fournir rapidement cette construction. L'utilisation prévue majeure a été axée sur les questions de localisation, donc la livraison correcte à la membrane, ainsi que l'expression de la protéine eucaryote et une production optimale de construction continue étaient des considérations primordiales. D'autres considérations peuvent inclure: l'emplacement différent de la GFP pour des protéines différentes localisées ou des protéines ayant une extrémité C-terminale qui fait partie d'une région pliée, la possibilité de Wanting pour enlever la GFP (en ajoutant un site de clivage de la protéase), et un site d'affinité secondaire. Celui-ci fournirait d'autres moyens de purification de la construction de la GFP et de stabilisation sur une surface pour l'essai de liaison. Pour confirmer les modèles de coloration pour les différents anticorps commerciaux contre TMEM184A, les cellules vasculaires exprimant la GFP-TMEM184A ont été comparées à des cellules identiques colorées avec les anticorps commerciaux. La longueur de temps après la distribution des impacts de transfection de la GFP-TMEM184A, qui est apparu à accumuler sur au moins 72 h. La longueur du temps après la transfection, résultant en une expression optimale varie selon le type de cellule et doit être optimisée pour chaque technique. Au fil du temps, plus l'étiquette de la GFP était dans la région péri-nucléaire. En fonction de la manipulation, le blanchiment GFP a également eu lieu. Les résultats indiquent GFP TMEM184A à la surface des cellules et dans les structures péri-nucléaire et d' autres semblables à des vésicules observées avec la localisation TMEM184A coloration d' anticorps (figure 1). Les cellules primaires figure 5 où la technique a aussi été utilisée pour évaluer la topologie membranaire.

L'utilisation d'un ligand fluorescent (rhodamine-héparine) a facilité l' évaluation de la co-localisation du ligand et le récepteur au cours du temps, et les deux marqueurs a permis de réaliser l' imagerie en temps réel (Figure 2 et le film 1). La figure 2C a été imagée en excitant la GFP à 405 nm, mais la capture des émissions de la rhodamine (images intermédiaires). GFP excitation est limitée à 405 nm à rendement émission limitée aussi bien, mais ce qui a empêché l'excitation de la rhodamine et un signal de FRET faux. De même, le FRET-induced rhodamine émission était faible. Dans les contrôles avec l'expression GFP-TMEM184A, mais pas de rhodamine-héparine, et d'autres avec seulement rhodamine-héparine il n'y avait pas d'émission de rhodamine avec 405 nm d'excitation. Ensuite, GFP totale (images de gauche) et la rhodamine totale (images de droite) ont été mesurées en utilisant des longueurs d'onde d'excitation / émission standard pour chaque fluorophore. Les données en C soutiennent davantage la co-localisation du ligand et de la GFP-TMEM184A. l'absorption d'héparine dans la rhodamine RAOEC une incubation plus longue requise par rapport aux cellules A7r5. Aucune preuve de FRET a été observée dans les cellules sans rhodamine-héparine ou dans des cellules non transfectées. Une expérience idéale comprendrait une autre surface GFP-construction qui ne devrait pas avoir co-localisation avec le ligand.

Acquisition ou récupération de la fonction pourrait également être réalisée avec des constructions GFP-protéine et la rhodamine-héparine. Cela a fourni l'occasion d'utiliser la GFP comme preuve pour le niveau d'expression et le ligand colocalisation et de quantifier les interactions. Plus précisément, l' absorption de l' héparine a été augmentée en GFP-TMEM184A Construct-cellules transfectées A7r5 (Figure 3). Cellules knockdown stables qui prennent la rhodamine-héparine très limitées ont été produits ^1, et ceux - ci ont fourni un système où gain de fonction pourrait être évaluée. La transfection de GFP-TMEM184A construction a donné lieu à des cellules qui pourraient à nouveau internaliser rhodamine-héparine au niveau des cellules de type sauvage ou au- dessus (Figure 3). Il convient de noter que l'image «pas d'héparine" est de cellules knockdown stables, qui n'expriment la GFP en tant que journaliste pour la construction de knockdown. fluorescence de fond était plus élevé dans ces cellules, comme observé dans l'image affichée.

Il est généralement utile d'utiliser le récepteur isolé pour la détermination de la spécificité du ligand pour diminuer la probabilité d'autres protéines qui interagissent avec le ligand. L'utilisation d'une GFP protein construction fournit un avantage significatif à cet égard que l'étiquette de la GFP peut servir de poignée pour l'isolement de la protéine et permet d'éviter les interactions possibles des anticorps ou d'autres réactifs d'affinité avec des protéines supplémentaires. GFP peut également être exprimé dans des populations de cellules identiques et isolé en utilisant la même procédure GFP d'affinité. Ceci fournit une protéine de contrôle pour les études sur les interactions ligand. Dans le système de TMEM184A, la GFP TMEM184A isolé en utilisant une procédure d'affinité avec un anticorps anti-GFP conduit à l'héparine saturable liaison spécifique, tandis que la GFP de contrôle ne se lie pas toute héparine (figure 4).

En règle générale, les balises GFP sur des constructions sont placés à une extrémité d'une protéine. L'emplacement de l'extrémité C-terminale correcte facilite le trafic des protéines à une membrane. Par conséquent, la disponibilité de la GFP sur un côté particulier d'une membrane peut fournir des preuves de topologie spécifique d'une protéine membranaire si la topologie de pliage et ne sont pas unéjà connue. Simple coloration par immunofluorescence avec des anticorps contre la GFP (comme sur la figure 5) peut fournir la preuve de la localisation de la GFP sur la base de l' accès de l' anticorps dans des cellules non perméabilisées. Les anticorps anti-GFP reconnaissent GFP même si blanchie. La coloration immunofluorescente représentée sur la figure 5 indique une coloration anti- GFP significative sans perméabilisation des cellules GFP-transfectées TMEM184A fournissant des preuves préliminaires que la GFP dans la membrane plasmique est extracellulaire. De toute évidence, une protéine intracellulaire dans des vésicules est taché également dans des cellules perméabilisées. Les images de FRET de la figure 2C sont compatibles avec cette topologie proposée.

Figure 1: GFP-TEMEM184A localisation dans les cellules Confirme TMEM184A Localisation Déterminé par immunofluorescence. A) BAOECs transfectées avec GFP-TMEM184A ont été fixées avec 4% de PFA. les cellules non transfectées ont été soit traitées avec du methanol (MeOH), la fixation de la glace et de perméabilisation ou 4% de PFA, suivi par du Triton X-100 perméabilisation (comme indiqué). Les cellules non transfectées ont été colorées en utilisant un anticorps dirigé contre un peptide C-terminal à partir TMEM184A (CCD) ou un peptide N-terminal à partir TMEM184A (NTD) et un anticorps secondaire anti-lapin marqués avec TRITC. B) Exemples de clones (A7R5) et (BAOSMC) Les cellules musculaires lisses primaires ont été traitées de manière similaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Imagerie de la GFP-TMEM184A avec rhodamine-Héparine. A) A7r5s électroporation avec GFP-TMEM184A ont été traités avec 100 pg / ml d' héparine-rhodamine pour latemps indiqués, puis fixées avec 4% de PFA. Les images sont représentatifs de deux expériences distinctes. B) cellules A7r5 ont été transfectées avec GFP-TMEM184A et la rhodamine-héparine a été ajouté à l' imagerie en direct immédiat. Les cadres sélectionnés du film sont présentés avec une barre verticale blanche pointant vers la localisation initiale d'une vésicule GFP enduit contenant rhodamine-héparine. L'étiquette de la GFP et de la rhodamine se déplacent ensemble. Barres d'échelle = 2 pm. C) RAOECs traités comme dans A ont été imagées par résonance de fluorescence de transfert d'énergie par excitation à 405 (GFP, pour FRET) et comparés aux paramètres standard, voir le protocole 3.5. Groupe A, et les deux points de temps en B, ont été publiées dans le Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Droit d'auteur de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.

Figure 3: GFP-TMEM184A Transfection Fournit gain de fonction. A) de manière significative les niveaux inférieurs de la rhodamine-héparine sont vus dans les cellules A7r5 knockdown stables par rapport au type sauvage A7r5s, voir des exemples d' images. L'image "non à l'héparine» est des cellules knock-down stable qui expriment la GFP comme marqueur de la présence de la construction. Les barres d'échelle = 10 pm. B) Transfection de la GFP-TMEM184A à la fois de type sauvage et les cellules knockdown stables augmente de manière significative le signal de rhodamine-héparine dans ces cellules basées sur l' analyse de plus de 50 cellules / état dans trois expériences indépendantes. Les barres d'erreur représentent SEM. p <0,0001 basé sur un test de Tukey. Ce chiffre a été publié dans le Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Droit d'auteur de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Isolated GFP-TMEM184A Lié Héparine. GFP-TMEM184A ou GFP a été isolé et lié à des plaques d'essai revêtues d'avidine. Fluorescéine-héparine a été ajouté à des concentrations de 0,056 nmol par 1.111 nmol. Héparine liée a été déterminée en mesurant l'émission à 519 nm. GFP-TMEM184A (carrés). contrôle de la GFP (cercles). Ce chiffre a été publié dans le Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Droit d'auteur de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology. _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: GFP-TMEM184A et Membrane Topologie. des cellules transfectées avec GFP-TMEM184A ont été soit fixées avec 4% de PFA (en haut) ou fixées avec 4% de PFA et perméabilisées en utilisant le Triton X-100 (en bas). Les cellules ont été colorées de manière identique avec des anticorps primaires anti-GFP et des anticorps secondaires Cy3-étiquetés. Les barres d'échelle = 10 pm. Deux expériences différentes sont représentées. seules les cellules colorées secondaires ont montré pratiquement aucune coloration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

pload / 55053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Film 1:.. en direct-imagerie de la GFP-TMEM184A avec rhodamine-Héparine (clic droit pour télécharger) cellules A7r5 ont été traités comme dans la figure 2B Le film illustre la GFP TMEM184A et vésicule rhodamine-héparine en haut se déplaçant ensemble. versions de couleurs distinctes, en plus de la version fusionnée du film sont présentés. la vésicule avec la GFP et contenant rhodamine est encerclé.

Discussion

Les protocoles présentés ici ont été conçus pour fournir une preuve de confirmation pour l'identification de TMEM184A en tant que récepteur de l' héparine dans des cellules vasculaires ^1. techniques Knockdown sont couramment utilisés comme un mécanisme permettant de confirmer l'identification de nouvelles protéines. Cependant, une certaine perte fonctionnelle après l'effet de choc est en général pas suffisamment de preuves qu'une protéine candidate est en fait le récepteur approprié (ou une autre protéine fonctionnelle). Il est également important d'avoir la preuve que la protéine candidate présente effectivement la fonction. Utilisant un assemblage pour un nouveau gène étiqueté avec la GFP permet un gain d'expériences fonctionnelles et facilite l'isolement de la protéine marquée par affinité sur la base de la GFP. Électroporation employé dans ce protocole a facilité une très grande efficacité de transfection de la construction (supérieure à 80% des cellules expriment la construction). Toutefois, d'autres mécanismes de transfection peuvent être utilisés si électroporation ne sont pas disponibles ou non désirée. Il existe plusieurs avantages à la sélection d'un produit d'assemblage de GFP étiquetées pour la confirmation d'une nouvelle fonction de la protéine. Premièrement, la GFP sert en tant que journaliste pour la transfection et l'expression des gènes et permet la surexpression à surveiller par le biais GFP si une lignée cellulaire sans expression de la protéine ne sont pas disponibles. D'autre part, la balise de GFP fournit un outil pour la purification de la protéine qui ne dépend pas de part et d'affinité de ligand ou d'anticorps contre des peptides. En troisième lieu, l'étiquette de la GFP fournit un outil pour étudier la localisation par immunofluorescence en utilisant des anticorps complexes générés visualisées contre des peptides uniques dans la séquence de la protéine cible pour déterminer si le produit génique réel est localisé de manière similaire.

Gain de tests fonctionnels avec des constructions de gènes sont utilisés pour un certain nombre de raisons , y compris le criblage à haut débit pour l' identification de la fonction nouvelle protéine ^13. Idéalement, le gain de tests fonctionnels emploierait un li cellulaire clonée bien étudiéne qui n'exprime pas le gène en question (les cellules doivent encore exprimer coopérant produits de gènes qui permettent la fonction du gène nouvellement exprimée). Lors de l'utilisation d'une construction GFP-étiqueté spécifique dans les présents essais, il est essentiel d'utiliser des cellules dans lesquelles la protéine GFP peut fonctionner. Ainsi, le choix des cellules dépend de la fonction et, probablement, le type de cellule dans laquelle la fonction se produirait normalement pour assurer les protéines coopérants sont présents. GFP-tagging permet à un moyen supplémentaire de la fonction de surveillance dans le cas où la fluorescence de la protéine GFP étiqueté peut être suivie dans le cadre d'un essai fonctionnel (voir par exemple les figures 2 et 3). Une limitation à ces études serait si GFP modifie en quelque sorte la fonction des protéines. En reliant la GFP à l'extrémité C-terminale de la protéine, un grand nombre de protéines ont déjà été étudiées sans altération fonctionnelle apparente, mais il existe une telle possibilité.

Radioisotopicaligands lly marqués ont souvent été utilisés pour étudier la liaison à des cellules intactes ¹¹ ligand. Cependant, ces tests ne permettent pas simple détermination de l'emplacement du ligand après la liaison, ils ne facilitent les comparaisons de ligand et le récepteur ainsi que dans le présent rapport. Une construction de GFP fournit également d'autres occasions d'examiner une protéine membranaire appelée ici. En raison de la position C-terminale de l'étiquette de la GFP, il est possible d'examiner l'emplacement de l'étiquette de la GFP dans les cellules transfectées à travers un dosage. Immunofluorescence en utilisant des anticorps à la GFP permet la comparaison de la GFP accessible aux anticorps avec ou sans perméabilisation (figure 5). Des applications supplémentaires de la GFP-TMEM184A tirer parti de l' imagerie de la GFP telle que la co - localisation avec de la rhodamine-héparine (figure 2). Employant FRET pour permettre l'émission de la GFP pour exciter le rhodamine-héparine comme indiqué dans 2C fournit un moyen intéressant d'évaluer tra liaison et intracellulairefficking. En outre, FRET données indiquent que la GFP est assez proche (à moins de 10 nm) à la rhodamine-ligand pour transférer l'excitation. La preuve que ce transfert de la GFP à une usine de ligand a été publié pour l' hormone parathyroïdienne marqués avec tétraméthyl-rhodamine ^14. Les technologies alternatives de FRET (photo-blanchiment et / ou modèles d'imagerie pilotés par ordinateur) peuvent également être utilisés pour une analyse plus complexe que ce qui est montré ici comme un exemple. De même, les interactions d'autres protéines avec le candidat peuvent être examinés à l' aide de FRET avec des marqueurs fluorescents optimisés pour le FRET comme dans le système EGFP / mCherry rapporté par Albertazzi et al. ¹⁵ et de la CFP / YFP et GFP paires utilisées dans les études de canal de potassium par Wang et ses collègues ^16. De nombreuses nouvelles petites molécules fluorescentes sont conçues, par exemple ^17. Ces molécules vont augmenter le nombre de cas où FRET interactions entre les protéines et f GFP-taggedligands luorescent peuvent être examinés. Les études futures peuvent également impliquer des changements au gène ciblé, ce qui permet la construction pour aider à déterminer les aspects spécifiques de la séquence de la fonction des gènes. Une limitation pour des protéines membranaires GFP étiqueté est alors l'extrémité C-terminale de la protéine est normalement à l'intérieur. Dans de tels cas, des dosages FRET avec des ligands fluorescents solubles dans l'eau peuvent ne pas être possible. Toutefois, d'autres mécanismes pour placer GFP ailleurs dans la construction pourrait encore être possible pour certaines de ces protéines, et les autres essais rapportés ici pourraient encore être utilisés.

En plus de la fonction, la localisation et in vivo des interactions ligand, une protéine GFP-étiquetée peut être isolée en utilisant un anticorps anti-GFP et la protéine isolée utilisée pour examiner la fonction en utilisant des essais in vitro , où la GFP permet un isolement non biaisée de la protéine et un contrôle relativement isolée (GFP libre). Ensemble, ces tests peuvent fournir des preuves solides supplémentaires nécessaires pour prouver eles fonctions des protéines de candidat comme hypothèse.

En outre, puisque la GFP est résistante à moins modifié avec des sites qui se prolongent loin de la structure compacte ¹⁸ protease de traitement de protéase limité de cellules devrait libérer la GFP extracellulaire. Le clivage de la protéase se produirait dans la protéine à laquelle est fixée la GFP ou dans une région de liaison conçu. Le produit libéré serait GFP avec une extension N-terminale à la séquence de la GFP. Trypsine ne doit pas libérer la GFP si l'extrémité C-terminale de la protéine à laquelle est fixée la GFP est intracellulaire. Une analyse préliminaire des produits potentiels pourrait suggérer un modèle de poids moléculaire clair avec une protéine GFP-tagged publié par la trypsine. Pour de nombreuses protéines membranaires, ces techniques se traduirait par une preuve claire pour la topologie de la membrane par la libération de la GFP, ou l'absence de celui-ci.

Ensemble, les dosages spécifiques présentés et / ou proposées dans le présent rapport de fournir un large échantillonnage de techniques tle chapeau peut être employé pour examiner des nouvelles protéines, en commençant par une construction fluorescence étiquetée. De telles constructions peuvent être facilement obtenus dans le commerce. La possibilité de les utiliser pour un large éventail de techniques qui les rend économiquement possible, même pour les petits laboratoires sur des budgets limités.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Light Sensitive
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Light Sensitive
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free)	Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific	PI28908 at Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes)	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	PI15510 at Fisher	Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates	Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific	064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line	ATCC	CRL 1444	Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	B304-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells	Cell Applications, Inc.	B354-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads	Sigma	S1638
HeBS	Available from Bio-Rad		Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus	Obtained from ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci used in Figure 1
GFP antibodies	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)	Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS	Purchased from Sigma	C5849	Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens	Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope	Nikon	C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens	Used for images in Figure 5
Confocal Microscope	Zeiss	Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens	Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes	Available from MidSci	EC2L	Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line	Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail
Cell Culture trypsin solution	Sigma	T4174	purchased as a 10x solution