Med hjälp av en GFP-märkta TMEM184A Construct för Bekräftelse av Heparin Receptor Identity

Summary

En konstruktion som kodar TMEM184A med en GFP-markör vid karboxiterminalen utformad för eukaryot expression, användes i analyser utformade för att bekräfta identifieringen av TMEM184A som ett heparin-receptor i vaskulära celler.

Abstract

När nya proteiner identifieras genom affinitetsbaserade isolering och bioinformatik analys, de är ofta i hög grad karaktäriserad. Antikroppar mot specifika peptider inom den förutsagda sekvensen tillåta vissa lokaliseringsexperiment. Men andra möjliga interaktioner med antikropparna ofta kan inte uteslutas. Denna situation gav en möjlighet att utveckla en uppsättning av analyser som är beroende av proteinsekvensen. Specifikt framställdes en konstruktion innehållande gensekvensen kopplad till GFP-kodande sekvensen vid den C-terminala änden av proteinet erhölls och användes för dessa ändamål. Experiment för att karaktärisera lokalisering, ligand affinitet och vinst på funktion ursprungligen utformas och genomföras för att bekräfta identifieringen av TMEM184A som en heparin receptor ^1. Dessutom kan konstruktionen användas för undersökningar behandlar membran topologi frågor och detaljerade protein-ligand-interaktioner. Denna rapport presenterar arange av experimentella protokoll baserade på GFP-TMEM184A konstruktionen uttrycks i vaskulära celler som lätt kan anpassas för andra nya proteiner.

Introduction

Identifiering av kandidatproteiner för nya funktioner beror ofta på affinitetsbaserade isoleringsprotokoll följt av partiell sekvensbestämning. Nya exempel på nyligen identifierade proteiner inkluderar transmembranprotein 184A (TMEM184A), en heparin receptor identifierades efter heparinaffinitetsinteraktioner ^1, och TgPH1, en pleckstrinhomologidomän protein som binder fosfoinositid PI (3,5) _P2 ^2. Andra nya proteinidentifiering innefattar direkt sekvensanalys av peptider, såsom att genom att Vit, et al. som använde trans peptider för att identifiera proteinprodukter från tidigare okarakteriserade gener ^3. På samma sätt kan identifiering av nya proteinsekvenser åstadkommas med hjälp av bioinformatik söker tidigare karakteriserade proteinfamiljer såsom identifiering av nya 4TM proteiner ^4. Undersökning av aquaporin familj gensekvenser har alså gav identifiering av nya medlemmar med nya funktioner ^5. Efter identifiering, är analys av proteinfunktion typiskt ett nästa steg som ibland kan undersökas med användning av en specifik analys av proteinfunktion såsom i akvaporinet fallet.

När det är möjligt, kan funktionen hos en nyligen identifierad protein undersökas med specifik enzymatisk eller liknande in vitro funktionsanalyser. Eftersom många funktioner nya proteiner är beroende av komplexa samspel som sker endast i intakta celler eller organismer, in vitro-analyser är inte alltid effektiva. Emellertid måste de in vivo analyser utformas på ett sådant sätt att de är beroende av gensekvensen. I cellkultur och / eller enkla modellorganismer, kan knockdown ge stödjande bevis för protein / funktionsidentifiering ^6. Med nya proteiner som identifieras som noterats ovan, är det ofta otillräcklig för att helt enkelt slå ner ett protein för att bekräfta funktionen, end utformningen av in vivo funktionella analyser som är beroende av gensekvens blir viktig för karakterisering av nya proteiner.

Den senaste tidens identifiering av TMEM184A som en heparin receptor (som modulerar proliferation i vaskulär glatt muskulatur och inflammatoriska svar i endotelceller) med hjälp av affinitetskromatografi och MALDI MS ^{1, 7} gav en möjlighet att utveckla en samling analyser efter knockdown gav resultat som överensstämmer med identifieringen . En nyligen genomförd granskning bekräftade att heparin interagerar specifikt med många tillväxtfaktorer, deras receptorer, extracellulära matrixkomponenter, celladhesionsreceptorer, och andra proteiner ^8. I kärlsystemet, heparin och heparansulfatproteoglykaner (innehållande heparansulfat kedjor med liknande struktur som heparin) interagera med flera hundra proteiner ^9. Funktionellt bekräfta that TMEM184A var inblandad med heparin upptag och bindning, var tekniker som används genkonstruktionen för TMEM184A utvecklas. Denna rapport innehåller en samling av analyser baserade på en GFP-TMEM184A konstruktion för användning i att bekräfta identiteten av TMEM184A som en heparin receptor.

Protocol

1. Konstruktion av en GFP-protein Construct

1. Inköp, eller design och bygga, en GFP-märkta konstruktionen baserad på proteinet i fråga.
   OBS: För en köpt konstruktion, standard vektorer är tillgängliga från kommersiella laboratorier som innehåller några eller alla av följande: För ett membranprotein, välj en C-terminal placering av GFP, eftersom det är mindre troligt att störa membranprotein trafficking. Överväga en förlängning mellan genen av intresse och GFP-om det finns anledning att tro att C-terminalen av proteinet i fråga är kompakt vikt till en domän av proteinet. Välj konstruktionen för allmän eukaryot celluttryck, men tillåter bygga produktionen i bakteriella system. Inkludera ett klyvningsställe (såsom TEV proteas), genom vilken GFP kan tas bort om så önskas för vissa experiment där GFP kan störa proteinaktiviteten. Lägg till andra insatser såsom en ytterligare tagg för lokalisering eller affinitet iteractions (t.ex. His6). Detta var inte nödvändigt för de analyser som beskrivs häri, men kan underlätta andra analyser, eller vara användbara i direkt anslutning till den gen, innan GFP, om avlägsnandet av GFP är önskvärd.

2. GFP-TMEM184A Expression i vaskulära celler

1. Kultur endoteliala eller vaskulära glattmuskelceller på 0,2% gelatinbelagda vävnadsodlingsskålar såsom tidigare ^{en, 6, 7} som rapporterats.
2. Tillsätt 5 ml cellodlings trypsinlösning (0,5% vikt / volym) till en sköljdes 100 mm, eller större, sammanflytande skål med celler. Inkubera vid 37 ° C tills cellerna just släppt från plattan, och överföra cellerna till en steril polypropen centrifugrör.
3. Lägga till en trypsininhibitor (t.ex., en lika volym av normalt odlingsmedium), som används vid rutinmässig kultur, till cellen / trypsinlösning för att begränsa trypsin-aktivitet. Pellets cellerna under 5 min vid approximbart 600 xg (eller lämplig hastighet och tid att bara pellets cellerna för standardvävnadsodling). Aspirera supernatanten.
4. Resuspendera cellerna i 1 ml HeBS (Hepes-salin) elektroporering buffert, vilket begränsar mängden tid celler i pellets eller avstängning. Placera cellsuspensionen på is och utföra resterande steg på is.
   OBS: Pellet kan tvättas en gång med HeBS före resuspension.
5. Tillsätt tillräcklig volym av GFP-tagged TMEM184A plasmiden till cellerna för att uppnå en slutlig koncentration av 20 | ig / ml DNA. Använda en identisk protokoll för en GFP-konstruktion.
6. Placera ungefär 0,4 ml av cell lösning i HeBS i en elektroporeringskyvett. Pre-chill kyvetterna före användning.
7. Electroporate cellerna med användning av följande betingelser: exponentiellt avtagande, 500 | iF, ∞ ohm, och 170 V.
   OBS: Spänningen för en given celltyp bör optimeras. Preliminära studier med endotelceller och glatta muskelceller cell typer uppnåddes med en GFP-vinkulin konstruktion för att bestämma den optimala spänningsvärdet noteras här, t ex ^10.
   1. För att optimera elektroporering, börja med rekommendationerna från tillverkaren av utrustningen (som omfattar villkoren för några vanliga celltyper). Använda den önskade konstruktionen eller en kontroll fluorescerande protein konstruera lika i storlek och fluorescerande egenskaper för att den önskade konstruktionen.
      NOT: Small nukleinsyror tycks komma in i celler lättare än större konstruktioner, så en konstruktion med endast en fluorescerande protein kan vara lättare att uttrycka än en större.
   2. Använd fluorescensmikroskopi för att bestämma cellviabilitet, procentandelen celler i vilka den fluorescerande konstruktionen uttrycks efter 24 och 48 timmar, och intensiteten av uttrycket.
      OBS: Minska spänning och / eller tid något om överlevnad är låg. Sikta på kortast möjliga mellan frisättning av celler från odlingsytan och återvända gångceller till kulturen för att förbättra överlevnaden. Små ökningar i tid eller en andra puls kan förbättra konstruktionen upptaget om överlevnad är hög och uttryck är låg. Optimala förhållanden och uttryck kommer att variera mellan olika celltyper. Om den procentuella andelen celler som uttrycker konstruktionen är hög, men intensiteten är låg, ökar DNA-koncentration och övervakningen av de transfekterade cellerna med tiden för optimal intensitet, som kommer att variera beroende på det protein halveringstid samt expression, kan förbättra intensitet. Färgningsintensitet kan förstoras för vissa analyser, om nödvändigt, genom immunofluorescens-färgning av GFP med anti-GFP-antikroppar
8. Efter elektroporering, ympa celler i sex 30 mm vävnadsodlingsbrunnar med täck för avbildning eller i vävnadsodlingsskålar. Odla cellerna med användning av standardcellodlingsförfaranden.
9. Valfritt: Byt odlingsmedium efter 24 h för att avlägsna eventuella HeBS elektroporering buffert.

3. Visualisering av GFP-TMEM184A Lokalisering

1. Skölj cellerna med PBS och försiktig skakning efter odling under åtminstone 24 timmar. Begränsa exponering för starkt ljus för att undvika GFP blekning.
2. Fix celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS under 15 min vid RT under försiktig skakning. Undvik att använda några metanolinnehållande reagens som kan permeabilisering cellerna. Fixering med metanol kan användas om det inte är nödvändigt att bedöma ligandinteraktioner.
   Varning: Paraformaldehyd är giftig. Bär lämplig personlig skyddsutrustning. Användning i ett dragskåp, med omsorg, och kasta ordentligt.
3. Skölj med PBS som ovan. För antikroppsbaserad färgning, se 3.6 nedan.
4. Mount täck till bilder med hjälp Mowiol eller annat lämpligt monteringsmedium.
5. Bild glider med hjälp av en konfokala eller fluorescensmikroskop med lämpliga filteruppsättningar för GFP excitation och emissionsspektra. Konfokalmikroskopi föredrages på grund av förmågan att separera proverna i z-planet. Spara bilder i gråskala för quantitation ändamål i TIF-format (förutom till full färgbilder för illustrationer).
6. För jämförelse med WT TMEM184A uttrycks av cellerna, framställa andra celler för immunofluorescens med användning av primära antikroppar framställda mot en peptid (er) från TMEM184A sekvensen, t ex ^en. Identifiering av GFP-TEMEM184A kan också åstadkommas med användning av antikroppar mot GFP. Utvärdera båda cell prover med identiska mikroskopitekniker.

4. Rhodamine-Heparin Binding och samlokalisering med GFP-TMEM184A-transfekterade celler

1. Behandla GFP-TMEM184A-uttryckande celler med 100 mikrogram / ml rodamin-heparin sattes till odlingsmedium och tillåta cellerna att inkubera under en viss tid, vanligen mindre än 10 minuter för A7r5 celler. Skölj och fixa som i 3.1 och 3.2.
   OBS: Den optimala tiden och koncentration av ligand beror på cellsvar, fluorescensintensitet av liganden och bildintensitet erhållas. denna Koncentratjon av heparin användes, eftersom det resulterar i mer än 50% svars i andra analyser ^11. Denna koncentration kan visualiseras med användning av standard fluorescensmikroskopi tekniker, så det inte var nödvändigt att öka den. Utspädning av rodamin-heparin med omärkta heparinresulterar i lägre fluorescens i cellerna, är därför svårare att avbilda och kvantifiera.
2. För att kvantifiera rodamin-heparinbindande grund av GFP-TMEM184A transfektion, förbereda identiska celler utan transfekterade GFP-TMEM184A.
3. Bild cellerna med hjälp av en konfokalmikroskop med lämplig GFP (488 nm) och rodamin (543 nm) excitation och emission (500-530 nm för GFP och större än 560 nm för rodamin) värden för att bestämma samlokalisering. Få bilder av åtminstone 50 celler från åtminstone tre separata experiment för att erhålla statistik. Bibehålla identiska inställningar inom experiment, och använda ett kontrollprov (s) (t.ex. transfekterade celler med ingen behandling) evid kan användas för att standardisera data för analys av flera experiment.
4. Undersök bilder med hjälp av ett datorprogram för att bestämma relativ rodamin bindande / upptag i varje cell för kvantifiering av bindning.
   OBS: TIF bilder bör användas eftersom de är bekväma för analys och kan konverteras till gråskala i många datorprogram, om de inte ursprungligen sparats i det formatet. Bild J (freeware) användes i denna analys och tillåter området och pixelintensiteten skall mätas för alla användardefinierade område i en bild.
   1. Använd en frihand verktyg för att ringa in en cell inom en fluorescerande bild och använda åtgärden för att avgöra intensiteten i det utrymmet.
      OBS: Dessa mätningar ger den information som behövs för att beräkna den totala intensiteten för ett användardefinierat område (helcell, kärna, etc.) som ger ett sätt att jämföra olika celler med olika geometrier. Medelintensitet över ett område på bakgrunden kan rapporteras, och att underlättasamling av bakgrundsintensiteten för analys.
   2. Export till ett kalkylprogram för att beräkna området multiplicerat med intensitet och subtrahera bakgrund för samma areal. Genomsnitt fluorescens / cell för tillräckligt med celler / experiment för att erhålla statistisk signifikans.

5. Fluorescensresonansenergiöverföring från GFP-TMEM184A till Rhodamine-Heparin

1. Förbered transfekterade celler och inkubera med 200 mikrogram / ml rodamin-märkt ligand som i 3.1. Notera att inkubationstiden med fluorescerande liganden är celltyp beroende. Fäst med endast PFA, och montera diabilder för avbildning.
2. Först, hetsas vid 405 nm och bild för rodamin utsläpp (566-685 nm, FRET). För det andra, hetsas vid 488 för GFP (bild på 493-530), och tredje, hetsas vid 561 för rodamin (bild på 566-685). Kontroller utan GFP-TMEM184A eller utan rodamin-heparin är kritiska.

6. Live-cell imaging av Rhodamine-Heparin Upptag

1. Seed GFP-TMEM184A transfekterade celler i enskilda rätter avsedda för levande cell imaging och behandla som i protokoll 3.
   OBS: Antalet celler som krävs beror på celltyp och densitet önskas. För att minimera den tid som cellerna är i suspension, räknas inte celler. Seed celler från en 100 mm konfluenta maträtt i sex 35 mm levande imaging rätter att erhålla celler nära sammanflytning i 48 timmar.
2. Efter 48 h, ersätt mediet med odlingsmedium utan fenolrött.
3. Överför en skål av celler till en konfokalmikroskop med en värmande skede för att bibehålla temperatur och fokusera mikroskopet.
4. Pipett 100 mikrogram / ml rodamin-heparin i skålen och blanda försiktigt.
5. Omedelbart börja spela in rörliga bilder. Om ingen cell upptag av heparin sker inom regionen i sikte, flytta skålen något att identifiera celler med åtminstone en grön vesikler innehållande rodamin etiketten.
   OBS: Imaging excitations- och emissions detaljerna ärsamma som för heparinupptag protokollet (avsnitt 5). Tidsperioden mellan bilderna var ca 16 s. Betingelserna för experimentet och mikroskopet kommer typiskt bestämma den hastighet med vilken kan erhållas bilder.

7. Isolering av GFP-TMEM184A och GFP från odlade celler

1. Efter avlägsnande odlingsmedium och sköljning med PBS, tillsätt 2 ml 0,2% (vikt / volym) CHAPS 1x PBS-lösning med proteashämmare till en 150 mm platta med celler som uttrycker GFP-TMEM184A eller GFP (för kontrollbindningsanalyser). Skrapa cellerna från skålen, placera celler / CHAPS lösning i en 15 ml polypropylen rör på is, och blanda väl genom att knacka. Slutför alla steg i starkt ljus för att säkerställa att GFP taggen bleks för bindningsanalysen nedan.
2. För att specifikt binda GFP-TMEM184A (eller en lämplig GFP-kontroll), tillsätt 2 mikrogram / ml biotinylerad anti-GFP-antikropp till lösningen och inkubera över natten vid 4 ° C under skakning.
3. Tillsätt 500 mikroliterav streptavidin-agaroskulor till åtminstone 5 ml 0,2% CHAPS / PBS och centrifugera vid ca 600 xg under 3-5 min. Avlägsna supernatanten. Upprepa två gånger med färsk CHAPS / PBS varje gång. Lägga pärlor till antikroppen och celllösning och inkubera över natten vid 4 ° C under skakning för att tillåta pärlorna att binda till den biotinylerade anti-GFP-antikropp bunden till GFP eller GFP-TMEM184A.
4. Pellets pärlorna genom centrifugering (som i 7.3) och avlägsna obundet material. Tillsätt minst 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / proteashämmare att tvätta. Upprepa tvätt och centrifugering åtminstone 3x för att effektivt avlägsna allt obundet protein.
5. Efter avlägsnande av slutliga tvätten, inkubera pärlorna med 1 ml av 0,2 M glycin / 0,2% CHAPS i PBS (pH-värdet till 2,0 med hjälp av HCl) på is under 3 min för att dissociera antikropps-GFP-bindning (vilket resulterar i fri GFP-TMEM184A eller fri GFP). Blanda försiktigt genom att knacka var 30 s.
6. Centrifugera vid cirka 600 xg och överföra supernatanten innehållande det renade protein i ett annat 15 ml rör, följt av omedelbar neutralisering med 5 ml 1 M natriumvätekarbonat (bringa pH till 7).
7. Koncentrera provet med en 10.000 Dalton molekylvikt cut-off centrifugalkoncentrator (anställa centrifugeringsvarvtal som rekommenderas av leverantören). När volymen når ungefär 0,5 ml, tillsätt 0,2% CHAPS / PBS. Fortsätt att koncentrera och lägga till fler 0,2% CHAPS / PBS tills åtminstone tio volymer (gånger utgångsprovvolym) av 0,2% CHAPS / PBS har lagts till.
8. Att bestämma en uppskattning av mängden av isolerad GFP eller GFP-märkt protein, erhålla en absorbansavläsning vid 280 nm och jämför den med en standardkurva framställd från bovint serumalbumin eller annan kontrollprotein i samma buffert.
   OBS: På grund av extinktionskoefficienten skillnader är denna koncentration en uppskattning, men kan ge en ungefärlig proteinkoncentration för att underlätta ytterligare analys utan att slösa prov. Exakt proteinkoncentration kan avskräckaminerade med användning av en mikro-Lowry proteinanalys att göra vissa att framställa den standardprotein i samma buffert som provet. Ytterligare analys av det isolerade proteinet kan åstadkommas genom western blotting av det isolerade proteinet (med användning av antikropp detektion för GFP) och jämförelse med den förutsagda molekylvikten. Alternativt bör användningen av de TMEM184A antikropparna resultera i ett band av den förutsagda konstruktionen storlek, men skulle också kunna resultera i en WT TMEM184A band om dimerer (eller högre ordningens oligomerer) är närvarande i provet. En uppskattning av renhet kan erhållas genom färgning av ett blot för totalt protein från det isolerade provet vs totalt protein från en alikvot av utgångsmaterialet.

8. In vitro Heparin Binding Assay

1. Förbereda en svart avidinbelagda 96-brunnsplatta genom tvättning med 200 | il 0,2% CHAPS / PBS tre gånger under 5 min med skakning. Förbereda en identisk svart noncoated 96-brunnar med användning av samma tvättförfarandet. Förbered enlayout för de experimentella proverna (i tre exemplar) för att följa under analysen. Inkludera brunnar för standardheparinkoncentrationer, buffertkontroller, och brunnar med GFP prover utan heparin för att bekräfta blekning av GFP.
   OBS: Om optimerade isolering eller ligand interaktions buffertar är olika för proteinet i fråga, gör alla plattpreparat och tvätta med den optimala buffertsystem.
2. Tillsätt 100 mikroliter av 60 pmol / brunn biotinylerad anti-GFP till samtliga brunnar i avidin-belagda plattan, där GFP-bindning är önskvärd. Mängden antikropp är tillräcklig för att bara mätta den med hög affinitet avidin i brunnarna.
   1. Lägg buffert endast till alla brunnar som används för kontrolländamål (ingen GFP eller GFP-TMEM184A bindning önskas). Försegla brunnarna med en platta lock för att förhindra avdunstning. Inkubera i 2 h vid RT, med skakning.
      OBS: Volymerna till brunnarna och inkubationstider är baserade på rekommendationer från leverantören.
3. Tvätta alla brunnar tre gångerunder 5 minuter med 200 mikroliter 0,2% CHAPS / PBS.
4. Tillsätt 100 | il av 5 nmol / brunn GFP-TMEM184A eller GFP till lämpliga brunnar i avidin-belagda plattan och inkubera i 1 h vid RT med skakning. Tvätta igen som i 8,3.
   OBS: Denna koncentration av protein valdes för att säkerställa att alla platser mättades med överskott GFP eller GFP-TMEM184A. Detta är viktigt för att säkerställa att samma mängd protein är bundet till varje brunn. Lägre mängder av protein kan också mätta platserna, en möjlighet som skulle kunna undersökas genom att utvärdera obundet protein som återstår efter inkubering flera koncentrationer av protein med plattan och jämföra obundet protein och ligandbindningsanalyser.
5. Framställa olika koncentrationer av fluoresceinmärkt heparin, t ex 10, 25, 50, 75, 100, 200 | ig / ml, i 0,2% CHAPS / PBS. Gör detta och allt återstående arbete i mörker.
   OBS: Innan förbereda koncentrationer, bör särskilda koncentrationer för andra ligander fastställas för protein målet i fråga. Den lägsta koncentrationen bör vara detekterbar i plattläsare. Därför är det viktigt att först bestämma det intervall som kan detekteras noggrant i buffertsystem som användes. Sedan bestämma området behövs för att erhålla mätbar bindning. Koncentrationer av fluorescein-heparin under 10 | j, g / ml inte konsekvent registrera sig i plattläsare under de betingelser som buffert som används. På liknande sätt, medan rodamin-heparin, såsom används i de andra analyserna, kunde visualiseras i plattläsaren, under de förhållanden som buffert och vid de koncentrationer som erfordras för bindning, fluorescensavläsningarna för standarder var inte reproducerbart annorlunda med den fluorofor.
6. Tillsätt 100 mikroliter av fluorescein-heparin till lämpliga testbrunnar i de avidinbelagda platt och koncentration standardbrunnar i både avidinbelagda och den icke-belagda plattan. Inkubera under 10 min vid RT med skakning. Hålla plattorna i mörker (eller folietäckt).
7. Med användning av en platt reader, spela den första fluorescensemission från heparin i kontrollbrunnarna i båda plattorna och den ursprungliga fluorescens (totalt) utsläpp från brunnar med immobiliserat GFP-TMEM184A eller GFP i avidin-belagda plattan. Vid behov, justera instrumentet förstärkning för att säkerställa detektering av fluorescerande heparin mellan lägsta och högsta koncentrationerna.
   OBS: Se till att plattläsaren läser brunnar från ovan och läser på den optimala platsen i brunnarna om det är justerbar. För studien i fråga, den optimala platsen var ca 75% ner brunnarna. Information finns med plattläsaren bör ge förslag som är unika för plattläsaren i fråga för att läsa analyser av bundet prov i svarta plattor.
8. Avlägsna obunden fluorescerande heparin från brunnar med immobiliserat GFP-TMEM184A eller GFP och placera i motsvarande brunnar i icke-belagda svart plåt. Omedelbart läsa fluorescensemissionen.
9. Tillsätt 100 mikroliter färska 0,2% CHAPS / PBS tillbaka into brunnar från vilka fluorescein-heparin avlägsnades, och läsa fluorescensemission.
10. Upprepa steg 8,8-8,9 3x.
    OBS: Dessa avläsningar från den belagda plattan indikerar fluorescein heparin kvar i GFP eller GFP-TMEM184A brunnar. Om väsentlig fluorescens finns i tredje obundet prov, bör en extra tvätt inträffa. Om fluorescens fortsätter att tas bort i varje tvätt, kan bindning av ligand vara låg affinitet, och de villkor bör omvärderas. Den slutliga avläsningen utgör den bundna heparin läsning.
11. Spela in fluorescensemission från de avlägsnade, obundna, prover i noncoated plattan, erhålla nummer för varje tvätt. Dessa är de "obundna" avläsningar.
12. Använd totala heparin utsläppsvärden som erhållits i 8.7 för att bekräfta korrekta nivåer av heparin till varje brunn. Subtrahera de genomsnittliga bakgrundsavläsningar från värdena.
    OBS: Wells utan fluorescein-heparin fungera som bakgrund på grund av antikropp, GFP och buffert. Average bakgrunden upprepar att få bakgrundsvärdet. Subtrahera den genomsnittliga bakgrundsavläsningar från de bundna och obundna avläsningar för att få verkliga värden.
13. Anställa en tomt på utsläpp jämfört med total fluorescein-heparin för att fastställa omfattningen av utsläppen jämfört med mängden heparin.
    OBS: antikropp enbart, eller antikropp och antigen resulterade i viss dämpning av fluorescens. Därför var den totala heparin bestämdes baserat på den totala sattes heparin som noterades i 8,7.
14. Rita den korrigerade bundna heparin kontra läggas heparin för tre exemplar i både GFP-TMEM184A fall och GFP fallet.
15. Bestäm fri ligand genom att tillsätta de obundna avläsningar från alla tvättar för en viss koncentration.

Representative Results

Medan, i teorin, transfektion av varje DNA-konstruktion in i celler skulle kunna åstadkommas med lipofila transfektionsreagens, tidigare rapporter indikerar mer effektiv transfektion av GFP-konstruktioner i endotelceller med användning av elektroporation ^12. Det protokoll som avses här uppnås typiskt GFP-konstruera uttryck i mer än 80% av de primära härledda endotelceller och glatta muskelceller som används. Utformning av konstruktionen som användes använde ett kommersiellt tillgängligt system som kan leverera denna konstruktion snabbt. Den stora användningsområde var inriktad på lokaliseringsfrågor, därför korrekt leverans till membranet, tillsammans med optimal eukaryot proteinuttryck och fortsatt konstruktion produktion var primära överväganden. Andra överväganden kan omfatta: annan plats av GFP för olika lokaliserade proteiner eller proteiner med en C-terminal som är en del av ett vikt område, möjligheten att wanting för avlägsnande av GFP (tillsats av ett proteasklyvningsställe), och en sekundär affinitet. Det senare skulle tillhandahålla alternativa sätt att rena den GFP-konstruktet och stabilisera det på en yta för bindningsanalysen. För att bekräfta färgningsmönster för olika kommersiella antikroppar mot TMEM184A, vaskulära celler som uttrycker GFP-TMEM184A jämfördes med identiska celler färgade med de kommersiella antikroppar. Hur lång tid efter transfektion effekter distribution av GFP-TMEM184A, som föreföll ackumuleras över åtminstone 72 timmar. Hur lång tid efter transfektion vilket resulterar i optimal expression varierar beroende på celltyp och bör optimeras för varje teknik. Med tiden mer GFP etikett var i peri-nukleära området. Beroende på hantering, GFP blekning skedde också. Resultaten indikerade GFP-TMEM184A vid cellytan och i peri-nukleära och andra vesikel strukturer liknande lokalisation observeras med TMEM184A antikroppsfärgning (figur 1). De primära cellerna i Figur 5 där tekniken användes även för att utvärdera membrantopologin.

Användningen av en fluorescerande ligand (rodamin-heparin) underlättas utvärdering av samlokalisering av ligand och receptor med tiden, och de två etiketter gjort det möjligt att genomföra levande avbildning (Figur 2 och Movie 1). Figur 2C avbildades av spännande GFP vid 405 nm, men fånga utsläpp från rodamin (mitten bilder). GFP excitation är begränsad vid 405 nm som ger begränsade utsläpp samt, men detta hindrade excitering av rodamin och en falsk FRET signal. På liknande sätt, FRET-Induced rodamin emission var svag. I kontroller med GFP-TMEM184A uttryck, men ingen rodamin-heparin, och andra med endast Rhodamine-heparin fanns ingen rodamin utsläpp med 405 nm excitation. Efteråt var total GFP (vänster bilder) och total rodamin (höger bilder) mätt med hjälp av standard excitation / emissionsvåglängder för varje fluorofor. Uppgifterna i C stödja ytterligare samlokaliseringen av liganden och GFP-TMEM184A. Rodamin-heparin upptag i RAOEC krävs längre inkubation jämfört med A7r5 celler. Inga bevis för FRET observerades i celler utan rodamin-heparin eller i otransfekterade celler. En idealisk experiment skulle inkludera en annan yta GFP-konstruktion som skulle ha någon samlokalisering med liganden.

Förvärv eller återvinning av funktion kan också åstadkommas med GFP-proteinkonstruktioner och rodamin-heparin. Detta gav möjlighet att använda GFP som bevis för uttryck nivå och ligand samarbetelokalisering och kvantifiera interaktioner. Specifikt, heparin upptag ökas i GFP-TMEM184A konstruktet-transfekterade A7r5-celler (Figur 3). Stabila knockdown celler som tar upp mycket begränsad rodamin-heparin framställdes ^en, och dessa tillhandahålls ett system där vinst av funktion kan utvärderas. Transfektion av GFP-TMEM184A konstruktet gav celler som återigen skulle kunna internaliserar rodamin-heparin på nivån för vildtyp-celler eller ovan (Figur 3). Det bör noteras att "ingen heparin" bild är stabila knockdown celler, som uttrycker GFP som en reporter för den knockdown konstruktionen. Bakgrundsfluorescens var högre i dessa celler, som observerades i bilden som visas.

Det är typiskt användbart att använda isolerade receptor för bestämning av ligandspecificitet att minska sannolikheten för andra proteiner som interagerar med liganden. Användningen av en GFP-protein konstruktionen tillhandahåller en betydande fördel i detta avseende eftersom GFP-taggen kan fungera som ett handtag för isolering av proteinet och undviker möjliga interaktioner av antikroppar eller andra affinitetsreagens med ytterligare proteiner. GFP kan också uttryckas i identiska populationer av celler och isolerades med användning av samma GFP affinitet förfarande. Detta ger ett kontrollprotein för ligand interaktionsstudier. I TMEM184A systemet, GFP-TMEM184A isolerades med användning av en anti-GFP-antikropp affinitets procedur resulterade i specifik, mättningsbar heparinbindning, medan kontroll GFP inte band någon heparin (figur 4).

Normalt är GFP taggar på konstruktioner placeras vid en ände av ett protein. Den C-terminala läge underlättar korrekt protein trafficking till ett membran. Därför kan tillgängligheten av GFP på en viss sida av ett membran tillhandahålla bevis för specifik topologi av ett membranprotein om veckning och topologi är inte ettlready kända. Enkel immunofluorescens färgning med antikroppar mot GFP (såsom i figur 5) kan ge bevis på GFP plats baserat på tillgång antikropp i icke-permeabiliserade celler. De anti-GFP antikroppar känner igen GFP även om blekt. Immunofluorescerande färgning visas i figur 5 tyder signifikant anti-GFP-färgning utan permeabilisering av de GFP-TMEM184A transfekterade celler som tillhandahåller preliminära belägg för att GFP vid plasmamembranet är extracellulär. Tydligt, intracellulära protein i vesiklar också blir färgas i permeabiliserade celler. FRET bilder i figur 2C är förenliga med den föreslagna topologi.

Figur 1: GFP-TEMEM184A lokalisering i celler bekräftar TMEM184A Lokalisering Bestämd genom immunofluorescens. A) BAOECs transfekterade med GFP-TMEM184A fixerades med 4% PFA. Icke-transfekterade celler antingen behandlas med iskall metanol (MeOH) fastställande och permeabilisering eller 4% PFA följt av Triton X-100 permeabilisering (som anges). De icke-transfekterade cellerna färgades med användning av en antikropp mot en C-terminal peptid från TMEM184A (CTD) eller en N-terminal peptid från TMEM184A (NTD) och en sekundär anti-kaninantikropp märkt med TRITC. B) Exempel på klonad (A7r5) och primära (BAOSMC) glatta muskelceller behandlades på liknande sätt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Visualisering av GFP-TMEM184A med Rhodamine-heparin. A) A7r5s electroporated med GFP-TMEM184A behandlades med 100 mikrogram / ml rodamin-heparin förgånger anges och fixerades sedan med 4% PFA. Bilder är representativa för två separata experiment. B) A7r5 celler transfekterades med GFP-TMEM184A och rodamin-heparin tillsattes med omedelbar levande bilder. Utvalda ramar av filmen visas med en vit lodrätt streck som pekar på den initiala lokaliseringen av en GFP-belagd vesikel innehållande Rhodamine-heparin. GFP etiketten och rodamin flytta ihop. Skalstrecken = 2 | j, m. C) RAOECs behandlas som i A avbildades för fluorescensresonansenergiöverföring av spännande på 405 (GFP, för FRET) och jämfört med standardinställningar, se protokoll 3,5. Panel A, och de två tidpunkterna i B, ursprungligen publicerad i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.

Figur 3: GFP-TMEM184A Transfektion Ger Gain funktion. A) betydligt lägre nivåer av rodamin-heparin ses i stabila knockdown A7r5 celler jämfört med vildtyp A7r5s, se exempel bilder. "Ingen heparin" bild är stabila knockdown celler som uttrycker GFP som en markör för konstruktion närvaro. Skalstrecken = 10 | im. B) Transfektion av GFP-TMEM184A i både vildtyp och stabila knockdown celler ökar signifikant rodamin-heparin signal i dessa celler som bygger på analys av mer än 50 celler / skick i tre oberoende experiment. Felstaplar representerar SEM. p <0,0001 baserat på ett Tukey test. Denna siffra var ursprungligen publicerad i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Isolerad GFP-TMEM184A Binder Heparin. GFP-TMEM184A eller GFP isolerades och bundet till avidinbelagda analysplattorna. Fluorescein-heparin tillsattes vid koncentrationer från 0,056 nmol till 1,111 nmol. Heparin bundet bestämdes genom att mäta emission vid 519 nm. GFP-TMEM184A (kvadrater). GFP kontroll (cirklar). Denna siffra var ursprungligen publicerad i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Copyright American Society for biokemi och molekylärbiologi. _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: GFP-TMEM184A och Membrane Topology. GFP-TMEM184A transfekterade cellerna antingen fixerades med 4% PFA (överst) eller fixerades med 4% PFA och permeabiliserades användning av Triton X-100 (botten). Celler färgades identiskt med anti-GFP-primära antikroppar och Cy3-märkta sekundära antikroppar. Skalstrecken = 10 | im. Två olika experiment visas. Sekundära only-färgade celler visade i huvudsak ingen färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

pload / 55.053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Film 1:.. Live-avbildning av GFP-TMEM184A med Rhodamine-heparin (Högerklicka för att ladda ner) A7r5 celler behandlades som i figur 2B Filmen visar GFP- TMEM184A och rodamin-heparin vesikler upptill rör sig tillsammans. Separata färgversioner utöver den sammanslagna versionen av filmen visas. Fölblåsan med GFP och innehållande rodamin är inringat.

Discussion

De protokoll som rapporteras här var utformade för att ge bekräftande bevis för identifiering av TMEM184A som ett heparin-receptor i vaskulära celler ^1. Knockdown tekniker används rutinmässigt som en mekanism för att bekräfta identifieringen av nya proteiner. Dock är några funktionell förlust efter knockdown normalt inte tillräckliga bevis för att en kandidat protein är faktiskt rätt receptor (eller annan funktionellt protein). Det är också viktigt att ha bevis för att kandidatprotein faktiskt uppvisar funktionen. Anställa en konstruktion för en ny gen taggade med GFP kan förstärkning av funktions experiment och underlättar isolering av det taggade proteinet baserat på GFP affinitet. Elektroporering användes i detta protokoll underlättas mycket hög transfektionseffektivitet av konstruktet (större än 80% av cellerna uttryckte konstruktionen). Emellertid kan andra transfektion mekanismer användas om elektroporering inte är tillgänglig eller ej önskad. Det finns flera fördelar med att välja en GFP-märkta konstruktionen för att bekräfta ett nytt protein funktion. Först tjänar GFP som en reporter för transfektion och genuttryck och det gör uttryck som skall övervakas genom GFP om en cellinje utan uttryck av proteinet är inte tillgänglig. För det andra ger GFP taggen ett verktyg för rening av proteinet som inte är beroende av antingen ligand affinitet eller antikroppar mot peptider. För det tredje ger den GFP taggen ett verktyg för att undersöka komplexa immunofluorescerande lokalisering visualiserades med användning av antikroppar genererade mot unika peptider i målproteinet sekvensen för att bestämma huruvida den faktiska genprodukten är på liknande sätt lokaliseras.

Förstärkning av funktionsanalyser med genkonstrukt används för ett antal syften, inklusive high-throughput screening för identifiering av nya proteiners funktion ^13. Helst skulle vinst funktionsanalyser anställa en väl studerade klonade cell line som inte uttrycker genen ifråga (cellerna måste fortfarande uttrycka samverkande genprodukter som tillåter funktion av den nyligen uttryckt gen). Vid användning av ett specifikt GFP-märkta konstrukt som i förevarande analyser, är det viktigt att använda celler i vilka GFP-proteinet kan fungera. Sålunda är valet av celler beror på funktionen och, sannolikt, på celltypen i vilken funktionen normalt skulle förekomma för att säkerställa samverkande proteiner är närvarande. GFP-märkning kan ytterligare ett sätt att övervakningsfunktion i det fall då fluorescens av GFP-märkta protein kan följas som en del av en funktionell analys (t ex, se figurerna 2 och 3). En begränsning till dessa studier skulle vara om GFP förändrar något proteiners funktion. Genom att länka den GFP till C-terminalen av proteinet, har ett stort antal proteiner som redan studerats utan en skenbar funktionell ändring, men existerar en sådan möjlighet.

Radioisotopically märkta ligander har ofta använts för att studera ligand-bindning till intakta celler ^11. Emellertid inte dessa analyser inte tillåter enkel bestämning av ligand plats efter bindning, inte heller underlätta jämförelser av ligand och receptor tillsammans som i denna rapport. En GFP konstruktion ger också ytterligare möjligheter att undersöka en märkt membranprotein som här. På grund av den C-terminala placeringen av GFP-taggen är det möjligt att undersöka lokaliseringen av GFP-taggen i transfekterade celler under en analys. Immunofluorescens med användning av antikroppar mot GFP möjliggör jämförelser av GFP tillgängliga för antikroppar med och utan permeabilisering (Figur 5). Ytterligare tillämpningar av GFP-TMEM184A dra nytta av GFP avbildning såsom samlokalisering med rodamin-heparin (Figur 2). Anställa FRET att möjliggöra emission från GFP att excitera rodamin-heparin som visas i 2C ger ett intressant sätt att utvärdera bindning och intracellulär trafficking. Vidare FRET data indikerar att GFP är tillräckligt nära (inom 10 nm) till rodamin-ligand för att överföra excitering. Bevis för att en sådan överföring från GFP till en ligand verk har publicerats för parathormon taggade med tetrametyl-rodamin ^14. Alternativ FRET teknik (fotoblekning och / eller datorstyrda avbildningsmönster) kan också användas för mer komplex analys än vad som visas här som ett exempel. På samma sätt kan växelverkan av andra proteiner med kandidaten undersökas med hjälp av FRET med fluorescerande taggar är optimerade för FRET som i EGFP / mCherry systemet rapporteras av Albertazzi et al. ¹⁵ och den gemensamma fiskeripolitiken / YFP och GFP par som används i kaliumkanal studier av Wang och kollegor ^16. Många nya små fluorescerande molekyler konstrueras, till exempel ^17. Dessa molekyler kommer att öka antalet fall där gräma interaktioner mellan GFP-märkta proteiner och fluorescent ligander kan undersökas. Framtida studier kan också innebära riktade förändringar i genen, vilket gör att konstruktionen för att fastställa sekvensspecifika aspekter av geners funktion. En begränsning för GFP-märkta membranproteiner är när C-terminalen av proteinet är normalt inuti. I sådana fall, FRET analyser med fluorescerande vattenlösliga ligander kan inte vara möjlig. Men för att alternativa mekanismer placera GFP annat ställe i konstruktionen kan fortfarande vara möjligt för vissa sådana proteiner, och de andra analyser som rapporteras här kan fortfarande användas.

I tillägg till funktionen, lokalisering, och in vivo ligandinteraktioner, kan en GFP-märkt protein isoleras med användning av en anti-GFP-antikropp och det isolerade proteinet används för att undersöka funktionen som använder in vitro-analyser där GFP tillåter en förutsättningslös isolering av proteinet och en jämförelsevis isolerad kontroll (fri GFP). Tillsammans dessa analyser kan ge ett starkt ytterligare bevis som behövs för att bevisa thpå kandidat proteinet fungerar som en hypotes.

Vidare, på grund GFP är proteasresistent om de inte ändras med platser som sträcker sig bort från den kompakta strukturen ^18, bör begränsad proteas behandling av celler frisätta extracellulär GFP. Proteaset klyvning skulle ske i proteinet till vilket GFP är fäst eller i en länkregion. Den frigjorda produkten skulle vara GFP med en förlängning N-terminalt till den GFP-sekvensen. Trypsin bör inte släppa GFP om C-terminalen av det protein till vilket GFP är fäst är intracellulär. En preliminär analys av potentiella produkter skulle kunna föreslå en tydlig molekylvikt mönster med en GFP-märkt protein frisätts av trypsin. För många membranproteiner, skulle sådana tekniker resultera i tydliga bevis för membrantopologin genom frisättning av GFP, eller brist på sådan.

Tillsammans de specifika analyser presenteras och / eller föreslås i denna rapport ger en bred provtagning av tekniker thatt kan användas för att undersöka nya proteiner genom att starta med en fluorescensmärkta konstrukt. Sådana konstruktioner kan lätt erhållas kommersiellt. Möjligheten att använda dem för ett brett spektrum av tekniker gör dem ekonomiskt möjligt även för mindre laboratorier på begränsade budgetar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Light Sensitive
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Light Sensitive
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free)	Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific	PI28908 at Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes)	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	PI15510 at Fisher	Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates	Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific	064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line	ATCC	CRL 1444	Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	B304-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells	Cell Applications, Inc.	B354-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads	Sigma	S1638
HeBS	Available from Bio-Rad		Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus	Obtained from ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci used in Figure 1
GFP antibodies	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)	Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS	Purchased from Sigma	C5849	Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens	Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope	Nikon	C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens	Used for images in Figure 5
Confocal Microscope	Zeiss	Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens	Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes	Available from MidSci	EC2L	Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line	Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail
Cell Culture trypsin solution	Sigma	T4174	purchased as a 10x solution