Summary
Een construct dat codeert TMEM184A met een GFP-tag aan het carboxy-uiteinde ontworpen voor eukaryotische expressie, werd gebruikt in testen die de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen bevestigen.
Abstract
Wanneer nieuwe eiwitten worden geïdentificeerd door middel van affiniteit gebaseerde isolatie en bioinformatica-analyse, zijn ze vaak grotendeels ongekarakteriseerd. Antilichamen tegen specifieke peptiden binnen de voorspelde sequentie toelaten dat sommige lokalisatie experimenten. Echter, andere mogelijke interacties met de antilichamen vaak niet worden uitgesloten. Deze situatie bood de gelegenheid om een reeks assays afhankelijk van de eiwitsequentie ontwikkelen. Specifiek, een construct bevattende de gensequentie gekoppeld met de GFP coderende sequentie aan het C-terminale uiteinde van het eiwit werd verkregen en gebruikt voor deze doeleinden. Experimenten te karakteriseren lokalisatie, ligand affiniteit en versterking van de functie werden oorspronkelijk ontworpen en uitgevoerd om de identificatie van TMEM184A als heparine receptor 1 bevestigen. Bovendien kan het construct worden gebruikt voor studies naar membraantopologie vragen en gedetailleerde eiwit-ligand interacties. Het voorliggende rapport presenteert arange experimentele protocollen gebaseerd op het GFP-construct TMEM184A expressie gebracht in vasculaire cellen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor andere nieuwe eiwitten.
Introduction
Identificatie van gegadigde eiwitten voor nieuwe functies vaak afhankelijk affiniteit gebaseerde isolatie protocollen gevolgd door een gedeeltelijke sequentiebepaling. Recente voorbeelden van nieuw geïdentificeerde eiwitten omvatten transmembraaneiwit 184A (TMEM184A), een heparine receptor geïdentificeerd na heparine-affiniteit interacties 1, en TgPH1, een pleckstrin homologie domein eiwit dat fosfoinositide PI (3,5) P2 2 bindt. Andere nieuwe proteïne-identificatie omvat directe sequentieanalyse van peptiden zoals door Vit, et al. die vroeger transmembraan peptiden aan eiwitproducten te identificeren sinds de voorgaande uncharacterized genen 3. Evenzo kan identificatie van nieuwe eiwitsequenties worden uitgevoerd met bioinformatica zoeken van eerder gekarakteriseerde eiwitten families zoals de identificatie van nieuwe eiwitten 4TM 4. Onderzoek van aquaporine familie gensequenties heeft alzo leverde de identificatie van nieuwe leden met nieuwe functies 5. Na identificatie, analyse van eiwitfunctie typisch een volgende stap die soms kunnen worden onderzocht met een specifieke assay van eiwitfunctie, zoals in het geval aquaporine.
Indien mogelijk, kan de functie van een onlangs geïdentificeerd eiwit, met specifieke enzymatische of vergelijkbare functie in vitro assays. Omdat veel functies van nieuwe eiwitten afhankelijk complexe interacties die alleen voorkomen in intacte cellen of organismen in vitro testen zijn niet altijd effectief. Wel moet de in vivo assays worden ontworpen zodanig dat deze afhankelijk gensequentie. In celcultuur en / of eenvoudig model organismen, kan knock-down bewijsmateriaal in te dienen voor het eiwit / functie identificatie 6. Met nieuwe eiwitten die zoals hierboven vermeld, is het vaak voldoende om alleen neerhalen een eiwit functie te bevestigen, eend de opzet van in vivo functionele assays die afhankelijk gensequentie wordt belangrijk voor de karakterisering van nieuwe eiwitten.
De recente identificatie van TMEM184A als heparine receptor (die moduleert proliferatie in vasculaire gladde spieren en ontstekingsreacties in endotheelcellen) middels affiniteitschromatografie en MALDI MS 1, 7 bood de gelegenheid om een verzameling assays ontwikkelen na knockdown vruchten afgeworpen in overeenstemming met de identificatie . Een recente beoordeling bevestigde dat heparine interageert specifiek met veel groeifactoren, hun receptoren, extracellulaire matrix componenten, celadhesie receptoren en andere eiwitten 8. In het vaatstelsel, heparine en heparansulfaat proteoglycanen (met heparansulfaat ketens gelijksoortige structuur heparine) interageren met honderden proteïnen 9. Om functioneel te bevestigen that TMEM184A was betrokken bij heparine opname en binding, technieken die het gen construct voor TMEM184A tewerkgesteld werden ontwikkeld. Het huidige rapport bevat een verzameling van testen op basis van een GFP-TMEM184A construct voor gebruik bij de bevestiging van de identiteit van TMEM184A als heparine receptor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp van een GFP-eiwit Construct
- Aankoop, of het ontwerp en de bouw, een GFP-tag construct op basis van het eiwit in kwestie.
OPMERKING: Bij een gekochte construct standaard vectoren zijn verkrijgbaar bij commerciële laboratoria dat sommige of alle van de volgende suggesties omvatten: Voor een membraaneiwit, selecteer een C-terminale plaats van het GFP omdat het minder waarschijnlijk verstoort membraaneiwit handel. Beschouw een verlenging tussen het gen van interesse en GFP indien aannemelijk is de C-terminus van het eiwit betrokken compact gevouwen in een domein van het proteïne. Selecteer het construct voor algemene eukaryotische cel meningsuiting, maar laat de bouw van de productie in bacteriële systemen. Onder een splitsingsplaats (zoals de TEV protease) waardoor GFP desgewenst sommige experimenten waarbij het GFP kunnen interfereren met de eiwitactiviteit kunnen worden verwijderd. Voeg andere inserts, zoals een extra tag voor het lokaliseren of affiniteit ininteracties (bijvoorbeeld His6). Dit was niet nodig de hierin beschreven assays, maar kan andere testen te vergemakkelijken, of nuttig zijn direct grenzend aan het gen voor het GFP, indien verwijderd GFP gewenst.
2. GFP-TMEM184A Expressie in vasculaire cellen
- Cultuur endotheelcellen of vasculaire gladde spiercellen op 0,2% gelatine beklede weefselkweekplaten zoals eerder 1, 6, 7 gerapporteerd.
- Voeg 5 ml celkweek trypsine-oplossing (0,5% w / v) aan een gespoeld 100 mm of groter, confluente schaal cellen. Incubeer bij 37 ° C totdat de cellen juist kunnen bewegen van de plaat, en breng de cellen naar een steriele polypropyleen centrifugebuis.
- Voeg een trypsineremmer (bijvoorbeeld een gelijk volume normale kweekmedium), zoals gebruikt in de routine cultuur, de cel / trypsine oplossing trypsineactiviteit beperken. Pellet de cellen gedurende 5 minuten bij approximlijk 600 xg (of de juiste snelheid en tijd om gewoon pellet de cellen voor standaard weefselkweek). Zuig het supernatant.
- Resuspendeer cellen in 1 ml HeBS (Hepes-gebufferde zoutoplossing) elektroporatiebuffer beperking van de hoeveelheid tijd cellen in de pellet of suspensie. Plaats de celsuspensie op ijs en uit te voeren overige stappen op het ijs.
LET OP: Pellet kan worden gewassen eenmaal met HeBS voorafgaand aan resuspensie. - Voeg voldoende hoeveelheid GFP-gelabeld TMEM184A plasmide aan de cellen tot een eindconcentratie van 20 ug / ml DNA bereiken. Gebruik een identiek protocol voor een GFP-construct.
- Leg ongeveer 0,4 ml van de celoplossing HeBS in een elektroporatie cuvet. Pre-chill de cuvetten voor gebruik.
- Electroporate de cellen onder de volgende omstandigheden: exponentieel, 500 uF, ∞ ohm en 170 V.
OPMERKING: De spanning voor een bepaald celtype worden geoptimaliseerd. Voorlopige studies met endotheel- en gladde spier cell types werden bereikt met een GFP-construct vinculin de optimale spanningswaarde opgemerkt, bijvoorbeeld 10 bepalen.- Om elektroporatie te optimaliseren, te beginnen met de aanbevelingen van de fabrikant van het apparaat (die de voorwaarden voor een aantal standaard celtypen bevatten). Gebruik het gewenste construct of control fluorescerend eiwit construct vergelijkbaar in grootte en fluorescerende eigenschappen voor de gewenste construct.
OPMERKING: Kleine nucleïnezuren lijken cellen gemakkelijker voer dan grotere constructies, zodat een construct slechts een fluorescerend eiwit gemakkelijker te drukken dan een groter een. - Met fluorescentiemicroscopie levensvatbaarheid van de cellen, het percentage cellen waarin het fluorescerende construct tot expressie wordt gebracht na 24 en 48 uur, en de intensiteit van expressie te bepalen.
LET OP: Verlaag de spanning en / of tijd iets als overleving laag is. Doel voor de kortst mogelijke tijd tussen de release van de cellen uit de kweek oppervlak en de terugkeercellen aan de cultuur om te overleven te vergroten. Een lichte toename in de tijd of een tweede puls kan construct opname verbeteren als de overleving is hoog en expressie is laag. Optimale omstandigheden en expressie zullen variëren tussen celtypen. Indien het percentage van cellen die het construct is hoog, maar intensiteit is laag, waardoor de DNA-concentratie en bewaken van de getransfecteerde cellen in de tijd voor een optimale intensiteit die varieert afhankelijk van halfwaardetijd van het eiwit en expressie, kan de intensiteit verbeteren. Kleuring intensiteit kan worden vergroot voor sommige assays eventueel door immunofluorescentie kleuring van GFP met anti-GFP antilichamen
- Om elektroporatie te optimaliseren, te beginnen met de aanbevelingen van de fabrikant van het apparaat (die de voorwaarden voor een aantal standaard celtypen bevatten). Gebruik het gewenste construct of control fluorescerend eiwit construct vergelijkbaar in grootte en fluorescerende eigenschappen voor de gewenste construct.
- Na elektroporatie, het zaad van de cellen in zes 30 mm weefselkweek wells met dekglaasjes voor imaging of in weefselkweek gerechten. Kweken van de cellen onder toepassing van standaard celkweek procedures.
- Optioneel: Vervang het kweekmedium na 24 uur aan een HeBS elektroporatie buffer te verwijderen.
3. Visualisatie van GFP-TMEM184A Localization
- Spoel de cellen met PBS en voorzichtig schudden na kweken gedurende ten minste 24 uur. Beperk blootstelling aan fel licht om GFP verkleuring te voorkomen.
- Fix cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Gebruik geen methanol bevattende reagentia die de cellen permeabel. Fixatie met methanol kan worden gebruikt als het niet nodig ligand interacties te evalueren.
Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Gebruik in een zuurkast, met zorg, en correct ontdoen. - Spoelen met PBS zoals hierboven. Voor antilichamen gebaseerde vlekken, zie 3.6 hieronder.
- Mount coverslips om dia's met behulp van Mowiol of een ander geschikt montage medium.
- Afbeelding dia's met behulp van een confocale of fluorescentiemicroscoop met de juiste filter sets voor GFP excitatie en emissie spectra. Confocale microscopie heeft de voorkeur vanwege de mogelijkheid om monsters te scheiden in het z-vlak. Bewaar afbeeldingen in grijstinten voor quantitation doeleinden in TIF-formaat (in aanvulling op full colour afbeeldingen voor illustraties).
- Ter vergelijking met WT TMEM184A door de cellen tot expressie bereiden andere cellen voor immunofluorescentie gebruikmakend van primaire antilichamen bereid op een peptide (s) vanaf het TMEM184A sequentie, bijvoorbeeld 1. Identificatie van GFP-TEMEM184A kan ook mogelijk met antilichamen tegen GFP. Evalueer beide celmonsters door identieke microscopische technieken.
4. Rhodamine-Heparine Binding en colocalisatie met GFP-TMEM184A-getransfecteerde cellen
- Behandel GFP-TMEM184A tot expressie brengende cellen met 100 ug / ml rhodamine-heparine toegevoegd aan kweekmedium en laat cellen incuberen gedurende een bepaalde tijd, typisch minder dan 10 min voor A7r5 cellen. Spoel en bevestig zoals in 3.1 en 3.2.
OPMERKING: De optimale tijd en concentratie van ligand afhankelijk celrespons, fluorescentie-intensiteit van het ligand en beeldintensiteit verkregen. dit concentration van heparine werd gebruikt omdat het leidt tot meer dan 50% respons in andere testen 11. Deze concentratie kan worden gevisualiseerd met behulp van standaard fluorescentie microscopie technieken, dus het was niet nodig om het te verhogen. Verdunning van rhodamine-heparine met ongelabelde heparine resulteert in lagere fluorescentie in de cellen, is dus moeilijker om de afbeelding en te kwantificeren. - Om de rhodamine-heparine binden als gevolg van GFP-TMEM184A transfectie kwantificeren, identieke cellen te bereiden zonder getransfecteerd GFP-TMEM184A.
- Beeld de cellen met behulp van een confocale microscoop met de geschikte GFP (488 nm) en rhodamine (543 nm) excitatie en emissie (500-530 nm voor GFP en groter dan 560 nm voor rhodamine) waarden co-localisatie. beelden van ten minste 50 cellen te verkrijgen uit ten minste drie afzonderlijke experimenten statistieken te verkrijgen. Onderhouden identieke instellingen in experimenten, en gebruik van een controlemonster (s) (bijvoorbeeld getransfecteerde cellen zonder behandeling) eten kunnen worden gebruikt om te normaliseren en analyse van meerdere experimenten.
- Onderzoek de beelden met behulp van een computerprogramma om relatieve rhodamine bepalen binding / opname in elke cel voor kwantificering van binding.
OPMERKING: TIF beelden moet indien zij geschikt voor analyse en kunnen worden omgezet in grijs schaal in vele computerprogramma's als ze niet oorspronkelijk zijn opgeslagen in dat formaat. Afbeelding J (freeware) werd in deze analyse en maakt stippellijn pixel intensiteit te meten van een door de gebruiker gedefinieerde gebied een beeld.- Gebruik een uit de losse hand op een cel cirkel binnen een tl-imago en het gebruik van de maatregel instrument om de intensiteit binnen die ruimte te bepalen.
Opmerking: Deze metingen verschaffen de benodigde informatie om de totale intensiteit te berekenen voor een door de gebruiker gedefinieerde gebied (hele cellen, kern, etc.) een manier om verschillende cellen te vergelijken met verschillende geometrieën. Gemiddelde intensiteit over een oppervlakte van achtergrond kan worden gemeld, en dat vergemakkelijkts collectie van de achtergrond intensiteit voor analyse. - Uitvoer naar een spreadsheet voor het gebied, vermenigvuldigd met de intensiteit te berekenen en aftrekken achtergrond die evenveel gebied. Het gemiddelde van de fluorescentie / cel voor voldoende cellen / experiment om statistische significantie te verkrijgen.
- Gebruik een uit de losse hand op een cel cirkel binnen een tl-imago en het gebruik van de maatregel instrument om de intensiteit binnen die ruimte te bepalen.
5. Fluorescence Resonance Energy Transfer van GFP-TMEM184A aan Rhodamine-heparine
- Bereid getransfecteerde cellen en geïncubeerd met 200 ug / ml rhodamine-gelabeld ligand zoals in 3.1. Merk op dat de incubatietijd met fluorescerende ligand celtype afhankelijk. Bevestig met slechts PFA, en dia's mount voor beeldvorming.
- Ten eerste, prikkelen bij 405 nm en het beeld voor rhodamine emissie (566-685 nm; FRET). Ten tweede, prikkelen bij 488 GFP (afbeelding bij 493-530) voor, en de derde, prikkelen op 561 voor rhodamine (afbeelding bij 566-685). Controles zonder GFP-TMEM184A of zonder rhodamine-heparine zijn kritisch.
6. live-cell imaging van Rhodamine-Heparin opname
- Het zaad van de GFP-TMEM184A getransfecteerde cellen in individuele schotels ontworpen voor live-cell imaging en te behandelen als in protocol 3.
Opmerking: Het aantal cellen nodig is, hangt van het celtype en gewenste dichtheid. Om de hoeveelheid tijd die cellen in suspensie een minimum te beperken, hebben de cellen niet mee. Zaad cellen van een 100 mm confluente schaal in zes 35 mm live-imaging gerechten aan cellen in de buurt van samenvloeiing te verkrijgen in 48 uur. - Na 48 uur, vervangen door kweekmedium medium zonder fenolrood.
- Transfer een schotel van cellen om een confocale microscoop met een warming podium om temperatuur te houden, en de focus van de microscoop.
- Pipet 100 ug / ml rhodamine-heparine in de schaal en meng.
- Meteen beginnen met het opnemen van live-beelden. Indien geen celopname heparine plaatsvindt binnen de regio weergeven door de schaal iets naar cellen te identificeren met ten minste één groene blaasje met het rhodamine label.
LET OP: Imaging excitatie en emissie details zijn dehetzelfde als voor de heparine opname protocol (hoofdstuk 5). De periode tussen de beelden was ongeveer 16 s. De omstandigheden van de proef en de microscoop typisch bepaalt de snelheid waarmee beelden kunnen worden verkregen.
7. Isolatie van GFP-TMEM184A en GFP uit gekweekte cellen
- Na verwijdering kweekmedium en spoelen met PBS, voeg 2 mL 0,2% (w / v) CHAPS 1x PBS oplossing proteaseremmers een 150 mm plaat van cellen die GFP-TMEM184A of GFP (voor controle bindingstesten). Schraap de cellen van de schotel, zet de cellen / CHAPS oplossing in een 15 ml polypropyleen buis op het ijs, en meng goed door te tikken. Voltooi alle stappen in fel licht om ervoor te zorgen het GFP-tag wordt gebleekt voor de binding assay hieronder.
- Specifiek binden GFP-TMEM184A (of een geschikte GFP controle), voeg 2 ug / ml gebiotinyleerd anti-GFP antilichaam aan de oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C met schommelen.
- Voeg 500 ulstreptavidine-agarose korrels tenminste 5 ml 0,2% CHAPS / PBS en centrifugeer bij ongeveer 600 xg gedurende 3 tot 5 minuten. Verwijder het supernatant. Herhaal twee keer met verse CHAPS / PBS per keer. beads toevoegen antilichaam en cel-oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C met schommelen om de korrels te binden aan het gebiotinyleerde anti-GFP antilichaam gebonden aan de GFP of GFP-TMEM184A.
- Pellet de parels door centrifugeren (zoals in 7.3) en verwijder de niet-gebonden materiaal. Voeg ten minste 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / proteaseremmers te wassen. Herhaal het wassen en centrifugeren tenminste 3x om effectief te verwijderen ongebonden eiwit.
- Na verwijdering van de laatste wasbeurt, incubeer de bolletjes met 1 ml 0,2 M glycine / 0,2% CHAPS in PBS (pH tot 2,0 met behulp HCl) op ijs gedurende 3 min dissocieert het antilichaam-GFP binding (leidend tot vrije GFP-TMEM184A of vrij GFP). Meng voorzichtig door te tikken op elke 30 s.
- Centrifugeer bij ongeveer 600 xg en breng het supernatant dat de gezuiverde pProtein een nieuwe 15 ml buis gevolgd door onmiddellijke neutralisatie met 5 ml 1 M natriumbicarbonaat (breng de pH op 7).
- Concentreer het monster met behulp van een 10.000 Dalton moleculair gewicht cut-off centrifugale concentrator (in dienst centrifugeren snelheid aanbevolen door de leverancier). Wanneer het volume ongeveer 0,5 ml bereikt, voeg 0,2% CHAPS / PBS. Verder concentreren en het toevoegen van 0,2% CHAPS / PBS tot ten minste tien delen (maal het uitgangsmonster volume) van 0,2% CHAPS / PBS toegevoegd.
- Om een schatting van de hoeveelheid geïsoleerde GFP of GFP-gemerkt eiwit te bepalen, het verkrijgen van een absorptiewaarde bij 280 nm en vergelijken met een standaardcurve bereid uit runderserumalbumine of andere controle-eiwit in dezelfde buffer.
LET OP: Door extinctiecoëfficiënt verschillen, deze concentratie is een schatting, maar kan bij benadering een eiwit concentratie verdere analyse te vergemakkelijken zonder verspilling monster. Nauwkeurige eiwitconcentratie te ontmoedigenbepaald met behulp van een micro-Lowry eiwit bepaling worden bepaald aan de standaard eiwit bereid in dezelfde buffer als het monster. Verdere analyse van het geïsoleerde eiwit kan worden bewerkstelligd door Western blotting van het geïsoleerde eiwit (met behulp van antilichaam detectie voor GFP) en vergeleken met het voorspelde molecuulgewicht. Als alternatief kan het gebruik van de TMEM184A antilichamen resulteren in een band van de voorspelde grootte construct, maar kan ook resulteren in een WT TMEM184A band als dimeren (of hogere orde oligomeren) aanwezig in het monster. Een schatting van zuiverheid kan worden verkregen door kleuring een blot van totaal eiwit van het geïsoleerde monster versus totaal eiwit uit een hoeveelheid van het uitgangsmateriaal.
8. In vitro bindingsassay Heparine
- Bereid een zwart-avidine gecoate 96-well plaat door wassen met 200 pl 0,2% CHAPS / PBS driemaal gedurende 5 minuten onder schudden. Bereid een identieke noncoated zwarte 96-putjesplaat toepassing van dezelfde wasprocedure. Bereid eenlayout voor de experimentele monsters (in drievoud) te volgen tijdens de test. Onder meer putten voor standaard heparine concentraties buffer controles, en putten met GFP monsters zonder heparine te bleken van GFP te bevestigen.
LET OP: Als optimale isolatie of ligand interactie buffers zijn verschillend voor het eiwit in kwestie, alles doen wat van de plaat voorbereidingen en het wassen met de optimale buffer systeem. - Voeg 100 pl 60 pmol / well gebiotinyleerd anti-GFP aan alle putjes in de met avidine beklede plaat waarin GFP binding wordt gewenst. De hoeveelheid antilichaam voldoende om alleen verzadigen met hoge affiniteit avidine in de putjes.
- buffer toe alleen op alle wells voor controledoeleinden (geen GFP of GFP-TMEM184A binding gewenst). Sluit de putten met een plaat deksel om verdamping te voorkomen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder schudden.
OPMERKING: Volumes toegevoegd aan de putjes en de incubatie tijden zijn gebaseerd op aanbevelingen van de provider.
- buffer toe alleen op alle wells voor controledoeleinden (geen GFP of GFP-TMEM184A binding gewenst). Sluit de putten met een plaat deksel om verdamping te voorkomen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder schudden.
- Spoel alle wells drie keergedurende 5 min met 200 ul 0,2% CHAPS / PBS.
- Voeg 100 ul van 5 nmol / putje GFP-TMEM184A of GFP aan putjes in de met avidine beklede plaat passende en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder schudden. Was opnieuw zoals in 8.3.
Opmerking: Deze eiwitconcentratie werd gekozen dat alle plaatsen werden verzadigd met overmaat GFP of GFP-TMEM184A. Dit is belangrijk dat dezelfde hoeveelheid eiwit gebonden aan elke well. Lagere hoeveelheden eiwit zou ook verzadigen plaatsen, de mogelijkheid dat door de beoordeling van ongebonden eiwit overblijft na incubatie van verscheidene concentraties van eiwitten met de plaat en het vergelijken van ongebonden eiwit en Ligandbindingstesten kunnen worden onderzocht. - Bereid verschillende concentraties fluoresceïne-gelabeld heparine, bijvoorbeeld 10, 25, 50, 75, 100, 200 ug / mL in 0,2% CHAPS / PBS. Doe dit en alle overige werkzaamheden in het donker.
Opmerking: alvorens met concentraties, specifieke concentraties voor andere liganden worden bepaald voor de Protein doel in kwestie. Moet de laagste concentratie detecteerbaar in de plaat lezer. Daarom is het belangrijk om eerst de range die nauwkeurig in het buffersysteem toegepast kan worden gedetecteerd bepalen. Dan bepalen de range die nodig zijn om meetbare binding te verkrijgen. Concentraties van fluoresceïne-heparine beneden 10 ug / ml niet op consistente inschrijven in de plaatlezer onder buffer omstandigheden gebruikt. Zo kwam rhodamine-heparine als gebruikt in de andere testen, kunnen worden gevisualiseerd in de plaatlezer, in de bufferomstandigheden en de voor bindingsconcentraties de fluorescentie metingen van normen niet reproduceerbaar afwijkt van dat fluorofoor. - Voeg 100 ul van fluoresceïne-heparine geschikte test putjes in de met avidine beklede platen en concentratienorm putten in zowel de met avidine gecoate en de niet-beklede plaat. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. Houd platen in het donker (of folie bedekt).
- Met behulp van een plaat reader Noteer de initiële fluorescentie-emissie van het heparine in de controle putjes van beide platen en de initiële fluorescentie (totaal) emissie van putjes geïmmobiliseerd GFP-TMEM184A of GFP in de avidine-beklede plaat. Pas indien nodig het instrument winst voor de detectie van fluorescerende heparine tussen de laagste en hoogste concentraties te waarborgen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de plaat leest putten van boven en leest op de optimale locatie in de putten als dat is verstelbaar. Voor de studie in kwestie, de optimale locatie was ongeveer 75% lager dan de putten. Informatie verkrijgbaar met de plaat lezer moet suggesties die uniek zijn voor de plaat lezer in kwestie zijn voor het lezen van assays van gebonden monster in zwarte platen bieden. - Verwijder ongebonden fluorescerende heparine uit putjes geïmmobiliseerd GFP-TMEM184A of GFP en plaats in overeenkomstige putjes in de niet-beklede zwarte plaat. Onmiddellijk lezen van de fluorescentie-emissie.
- Voeg 100 ul vers 0,2% CHAPS / PBS terug into putten waaruit de fluoresceïne-heparine werd verwijderd en lees fluorescentie-emissie.
- Herhaal stap 8,8-8,9 3x.
LET OP: Deze lezingen uit de gecoate plaat te geven fluoresceïne heparine die nog in de GFP of GFP-TMEM184A putten. Bij aanzienlijke fluorescentie in de derde niet-gebonden monster een extra wasbeurt optreden. Als fluorescentie in elke wasbeurt worden verwijderd blijft, binding van ligand misschien lage affiniteit zijn, en de voorwaarden moeten opnieuw worden geëvalueerd. De laatste lezing vormt de gebonden heparine lezen. - Record fluorescentie-emissie van het verwijderde, ongebonden, monsters in de noncoated plaat, het verkrijgen van nummers voor elke wasbeurt. Dit zijn de "ongebonden" metingen.
- Gebruik totale heparine emissiewaarden verkregen 8,7 om de juiste niveaus van heparine toegevoegd aan elk putje bevestigen. Trek de gemiddelde achtergrond lezingen uit de waarden.
OPMERKING: Wells zonder fluoresceïne-heparine dienen als achtergrond door antilichaam GFP en buffer. average de achtergrond wordt herhaald om de achtergrond waarde te verkrijgen. Aftrekken gemiddelde achtergrondconcentratie lezingen uit de gebonden en ongebonden lezingen de werkelijke waarden te krijgen. - Gebruik een perceel van emissie versus totale fluoresceïne-heparine toegevoegd aan de omvang van de emissie versus hoeveelheid heparine te bepalen.
OPMERKING: alleen antilichaam, of antilichaam en antigeen resulteerde in een aantal quenching van fluorescentie. Derhalve werd totaal heparine bepaald op basis van de totale toegevoegde heparine zoals in 8.7. - Plot de gecorrigeerde gebonden heparine versus de toegevoegde heparine voor de drie exemplaren in zowel de GFP-TMEM184A zaak en de GFP geval.
- Bepaal vrij ligand door toevoegen van de niet-gebonden waarden van alle wasbeurten voor een bepaalde concentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Terwijl in theorie transfectie van elke DNA-construct in cellen kunnen worden bereikt met lipofiele transfectie reagentia eerdere rapporten blijkt effectiever transfectie van GFP-constructen in endotheelcellen middels elektroporatie 12. Het protocol die hier gewoonlijk bereikt GFP-construct expressie in meer dan 80% van de primaire-afgeleide endotheelcellen en gladde spiercellen gebruikt. Het ontwerp van het construct in dienst gebruik gemaakt van een commercieel verkrijgbaar systeem dat deze constructie snel kunnen leveren. De belangrijkste beoogde gebruik was gericht op locatie kwesties, dus correcte levering aan het membraan, samen met een optimale eukaryote eiwit expressie en bleef construct productie waren primaire overwegingen. Andere overwegingen kunnen zijn: andere locatie van het GFP voor verschillend gelokaliseerde eiwitten of eiwitten met een C-terminus die deel uitmaakt van een gevouwen gebied de mogelijkheid wanting tot de GFP (het toevoegen van een protease-splitsingsplaats), en een secundaire affiniteit te verwijderen. Dat laatste zou alternatieve manieren zuiveren van het GFP-construct en stabiliseren op een oppervlak voor de bindingstest verschaffen. Om kleuring patronen voor verschillende commerciële antilichamen tegen TMEM184A bevestigen, vasculaire cellen die GFP-TMEM184A werden vergeleken met identieke cellen gekleurd met de commerciële antilichamen. De tijdsduur na transfectie effecten distributie van GFP-TMEM184A, die bleek te accumuleren over ten minste 72 uur. De tijdsduur na transfectie resulteert in optimale expressie kunnen per cel moeten worden geoptimaliseerd voor elke techniek. Na verloop van tijd, meer GFP label was in de peri-nucleair gebied. Afhankelijk van de hantering, GFP bleken ook opgetreden. De resultaten gaven GFP-TMEM184A op het celoppervlak en peri-nucleaire en andere blaasjes die overeenkomt met die waargenomen bij lokalisatie TMEM184A antilichaam kleuring (figuur 1). De primaire cellen in
Het gebruik van een fluorescerende ligand (rhodamine-heparine) vergemakkelijkt evaluatie van co-lokalisatie van ligand en receptor in de tijd, en de twee etiketten mogelijk te voeren levende imaging (figuur 2 en Film 1). Figuur 2C is afgebeeld door exciteren van het GFP bij 405 nm, maar vastleggen emissie van het rhodamine (middelste foto). GFP excitatie wordt beperkt bij 405 nm waardoor beperkte emissie als goed, maar dit belet excitatie van rhodamine en een valse FRET signaal. Ook de FRET-inductieveed rhodamine emissie was flauw. In de bedieningselementen met GFP-TMEM184A meningsuiting, maar geen rhodamine-heparine, en anderen met slechts rhodamine-heparine was er geen rhodamine emissie met 405 nm excitatie. Daarna totale GFP (links beelden) en de totale rhodamine (rechts images) werden gemeten met behulp van standaard excitatie / emissie-golflengten voor elke fluorofoor. De gegevens in C verdere ondersteuning van de co-lokalisatie van het ligand en het GFP-TMEM184A. Rhodamine-heparine opname in RAOEC vereist langere incubatie in vergelijking met A7r5 cellen. Geen bewijs voor FRET werd waargenomen in cellen zonder rhodamine-heparine of getransfecteerde cellen. Een ideale experiment zou onder ander oppervlak GFP-construct dat geen co-lokalisatie met het ligand moet hebben.
Verwerving of herstel van de functie kan ook worden bereikt met GFP-eiwit bouwt en rhodamine-heparine. Dit op voorwaarde dat de mogelijkheid om GFP te gebruiken als bewijs voor expressie niveau en de ligand co-Lokalisatie en om de interacties te kwantificeren. Specifiek werd heparine opname verhoogd GFP-construct getransfecteerde TMEM184A A7r5 cellen (Figuur 3). Stabiele knockdown cellen die nemen zeer beperkt rhodamine-heparine werden geproduceerd 1, en deze voorzien van een systeem waarbij winst van de functie kan worden geëvalueerd. Transfectie van GFP-TMEM184A construct resulteerde in cellen die opnieuw kunnen internaliseren rhodamine-heparine op het niveau van wildtype cellen of hoger (Figuur 3). Opgemerkt wordt dat het beeld "geen heparine" is van stabiele knockdown cellen die GFP tot expressie brengen als een reporter voor knockdown construct. Achtergrondfluorescentie was hoger in deze cellen, zoals waargenomen in het weergegeven beeld.
Het is meestal handig om geïsoleerde receptor gebruiken voor het bepalen van ligand specificiteit om de waarschijnlijkheid van andere eiwitten interactie met het ligand te verminderen. Het gebruik van een GFP-Protein construct verschaft een significant voordeel in dit opzicht als de GFP-tag kan dienen als een handvat voor isolatie van het eiwit en vermijdt mogelijke interacties van antilichamen of andere affiniteitsreagentia extra eiwitten. GFP kan ook worden uitgedrukt in dezelfde celpopulaties en geïsoleerd onder toepassing van dezelfde GFP affiniteit procedure. Dit verschaft een controle-eiwit voor ligand interactie studies. In het TMEM184A systeem, die het GFP-TMEM184A gebruikmaking van een anti-GFP antilichaam affiniteit resulteerde in specifieke verzadigbare binding van heparine, terwijl de controlegroep GFP geen heparine (figuur 4) niet binden.
Gewoonlijk GFP tags op constructen worden geplaatst aan een uiteinde van een eiwit. De C-eindstandige plaats vergemakkelijkt correct eiwittransport een membraan. Daarom kan de beschikbaarheid van GFP aan een bepaalde zijde van een membraan bewijs specifieke topologie van een membraaneiwit of vouwen en topologie zijn geenlready bekend. Eenvoudige immunofluorescentie kleuring met antilichamen tegen GFP (zoals in figuur 5) kan aantonen GFP locatie op basis van toegang antilichamen in niet-gepermeabiliseerde cellen. De anti-GFP antilichamen herkennen GFP zelfs indien gebleekt. Immunofluorescentiekleuring figuur 5 duidt op een aanzienlijke anti-GFP kleuring zonder permeabilisatie van het GFP-getransfecteerde cellen leveren TMEM184A voorlopige aanwijzingen dat de GFP in de plasmamembraan extracellulair is. Duidelijk, intracellulair eiwit in vesicles ook wordt gekleurd gepermeabiliseerde cellen. FRET afbeeldingen in figuur 2C zijn consistent met de voorgestelde topologie.
Figuur 1: GFP-TEMEM184A lokalisatie in cellen bevestigt TMEM184A Localization bepaald door immunofluorescentie. A) BAOECs getransfecteerd met GFP-TMEM184A werden gefixeerd met 4% PFA. Getransfecteerde cellen werden ofwel behandeld met ijskoude methanol (MeOH) vaststellen en permeabilisatie of 4% PFA gevolgd door Triton X-100 permeabilisatie (zoals aangegeven). De getransfecteerde cellen werden gekleurd met een antilichaam tegen een C-terminaal peptide van TMEM184A (CTD) of een N-eindstandig peptide van TMEM184A (NTD) en een secundair anti-konijn antilichaam gelabeld met TRITC. B) Voorbeelden van gekloonde (A7r5) en primaire (BAOSMC) gladde spiercellen werden op dezelfde wijze verwerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: beeldvorming van GFP-TMEM184A met Rhodamine-heparine. A) A7r5s geëlektroporeerd met GFP-TMEM184A werden behandeld met 100 ug / ml rhodamine-heparine vooraangegeven tijden en vervolgens gefixeerd met 4% PFA. Beelden zijn representatief voor twee afzonderlijke experimenten. B) A7r5 cellen werden getransfecteerd met GFP-TMEM184A en rhodamine-heparine werd toegevoegd onmiddellijk levende imaging. Geselecteerde frames van de film worden getoond met een witte verticale balk wijst naar de oorspronkelijke lokalisatie van GFP-bekleed vesikel met rhodamine-heparine. De GFP-label en de rhodamine samen bewegen. Schaalbalken = 2 urn. C) RAOECs behandeld als in A werden afgebeeld voor fluorescentie-resonantie-energie-overdracht door spannend 405 (GFP, voor FRET) en in vergelijking met standaard instellingen, zie protocol 3.5. Panel A, en de twee tijdstippen in B, werden oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Copyright van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3: GFP-TMEM184A Transfectie Biedt Gain van de functie. A) Significant lagere rhodamine-heparine gezien in stabiele knockdown A7r5 cellen in vergelijking met wildtype A7r5s, zie voorbeeld afbeeldingen. Het beeld "no heparine" is van stabiele knockdown cellen die GFP als een marker van construct aanwezigheid uit te drukken. Schaalbalken = 10 urn. B) Transfectie van GFP-TMEM184A in zowel wild-type en stabiele knockdown cellen verhoogt de rhodamine-heparine signaal in deze cellen gebaseerd op analyse van meer dan 50 cellen / aandoening bij drie onafhankelijke experimenten. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. p <0,0001 basis van een Tukey-test. Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Copyright van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Geïsoleerde GFP-TMEM184A Bindt Heparine. GFP-TMEM184A of GFP werd geïsoleerd en gebonden aan met avidine gecoate testplaten. Fluoresceïne-heparine werd toegevoegd in concentraties van 0,056 tot 1,111 nmol nmol. Heparine gebonden werd bepaald door emissie bij 519 nm. GFP-TMEM184A (vierkanten). GFP controle (cirkeltjes). Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Copyright van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: GFP-TMEM184A en Membrane Topology. GFP-TMEM184A getransfecteerde cellen werden ofwel gefixeerd met 4% PFA (boven) of met 4% PFA gefixeerd en gepermeabiliseerd met behulp Triton X-100 (onder). Cellen werden identieke gekleurd met anti-GFP primaire antilichamen en Cy3-gemerkte secundaire antilichamen. Schaalbalken = 10 urn. Twee verschillende experimenten worden getoond. Secundair Alleen-gekleurde cellen vertoonden vrijwel geen kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Pbelasting / 55053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Film 1:.. Live beeldvorming van GFP-TMEM184A met Rhodamine-heparine (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) A7r5 cellen werden behandeld zoals in figuur 2B De film illustreert de GFP TMEM184A en rhodamine-heparine vesicle boven elkaar te plaatsen. Individueel kleurvarianten naast de gefuseerde versie van de film worden getoond. de vesikel GFP en met rhodamine omcirkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protocollen hier vermeld zijn ontworpen om bevestiging op voor de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen 1 leveren. Knockdown technieken worden routinematig gebruikt als een mechanisme voor de identificatie van nieuwe eiwitten te bevestigen. Sommige functionele verlies na knockdown is gewoonlijk niet voldoende bewijs dat een kandidaat eiwit is eigenlijk de juiste receptor (of ander functioneel eiwit). Het is ook belangrijk om bewijs dat de gegadigde eiwit feitelijk de functie vertoont hebben. Gebruikmakend van een constructie voor een nieuw gen gelabeld met GFP maakt winst van functie experimenten en vergemakkelijkt isolatie van de gelabelde eiwit op basis van GFP affiniteit. Elektroporatie toegepast in dit protocol vergemakkelijkt zeer hoge transfectie-efficiëntie van het construct (meer dan 80% van de cellen brachten het construct). Echter zouden andere transfectie mechanismen worden gebruikt als elektroporatie niet beschikbaar is of niet gewenst. Er zijn verscheidene voordelen aan het selecteren van een GFP-construct hebben ter bevestiging van een nieuw eiwit functie. Ten eerste, de GFP dient als een reporter voor transfectie en genexpressie en geeft overexpressie worden gecontroleerd via GFP als een cellijn zonder expressie van het eiwit niet beschikbaar is. Ten tweede, het GFP-tag een werktuig voor zuivering van het eiwit die niet afhankelijk is van zowel ligand affiniteit of antilichamen tegen peptiden. Ten derde, het GFP-tag een werktuig om complexe immunofluorescentie lokalisatie onderzocht gevisualiseerd met behulp van antilichamen gegenereerd tegen unieke peptiden in de doelwit eiwitsequentie te bepalen of het genproduct eveneens gelokaliseerd.
Overexpressie-assays met genconstructen worden gebruikt voor een aantal doeleinden waaronder high-throughput screening voor identificatie van nieuwe eiwitfunctie 13. Idealiter winst van functie testen zou een goed bestudeerde gekloonde cel li in dienstne die het betreffende gen (de cellen moeten nog expressie meewerkende genproducten die functie van de nieuw tot expressie gebracht gen mogelijk) tot expressie brengt. Als een bepaalde GFP-construct hebben zoals in dit assays, is het essentieel om cellen gebruiken waarin het GFP-eiwit kan functioneren. Zo is de keuze van de cellen afhankelijk van de functie en, waarschijnlijk, van het celtype waarin de functie normaal optreden te waarborgen samenwerkende eiwitten aanwezig zijn. GFP-tagging kan een extra middel bewakingsfunctie in het geval dat de fluorescentie van het GFP-gelabeld eiwit te volgen als onderdeel van een functioneel assay (zie bijvoorbeeld figuren 2 en 3). Een beperking van deze studies zijn als GFP of andere manier wijzigt eiwitfunctie. Door het koppelen van GFP aan de C-terminus van het eiwit zijn grote aantallen eiwitten reeds onderzocht zonder duidelijke functionele wijziging, maar die mogelijkheid bestaat.
Radioisotopically gemerkte liganden zijn vaak gebruikt om ligandbinding aan intacte cellen 11 bestuderen. Echter, deze assays niet eenvoudig bepalen van ligand locatie kan worden na binding, noch hebben ze vergelijkingen van ligand en receptor samen te vergemakkelijken zoals in het onderhavige rapport. Een GFP-construct bevat ook meer mogelijkheden om een label membraaneiwit zoals hier te onderzoeken. Door de C-eindstandige plaats van het GFP-tag, is het mogelijk om de locatie van de tag in GFP getransfecteerde cellen onderzocht gedurende een test. Immunofluorescentie onder gebruikmaking van antilichamen tegen GFP maakt vergelijking van GFP toegankelijk voor antilichamen met en zonder permeabilisatie (Figuur 5). Bijkomende toepassingen van GFP-TMEM184A maken van GFP beeldvorming zoals colokalisatie met rhodamine-heparine (figuur 2). Gebruikmakend van FRET voor de emissie van GFP mogelijk maken om de rhodamine-heparine prikkelen, zoals weergegeven in 2C biedt een interessante manier om binding en intracellulaire tra evaluerenfficking. Verder FRET gegevens aan dat GFP dicht genoeg (binnen 10 nm) aan de rhodamine-ligand excitatie dragen. Het bewijs dat een dergelijke overdracht van GFP aan een ligand werken is voor bijschildklierhormoon getagd met tetramethyl-rhodamine 14 gepubliceerd. FRET alternatieve techniek (foto-bleking en / of computergestuurde imaging patronen) kan ook worden gebruikt voor meer complexe analyse dan wat hier als voorbeeld getoond. Evenzo kan interacties van andere eiwitten met de kandidaat gecontroleerd via FRET met fluorescerende labels geoptimaliseerd voor FRET als het EGFP / mCherry systeem Albertazzi et al. 15 en het GVB / YFP en GFP paren gebruikt in kaliumkanaal studies door Wang en zijn collega's 16. Veel nieuwe kleine fluorescente moleculen worden ontworpen, bijvoorbeeld 17. Deze moleculen zal het aantal gevallen waarin FRET interacties tussen GFP-gemerkte eiwitten en f verhogenluorescent liganden kunnen worden onderzocht. Toekomstige studies kunnen betrekken doelgerichte wijzigingen aan het gen, waardoor het construct om te bepalen sequentiespecifieke aspecten van genfunctie. Een beperking voor GFP-gelabeld membraaneiwitten is wanneer de C-terminus van het eiwit normaliter binnen. In dat geval FRET assays met fluorescerende wateroplosbare liganden wellicht niet mogelijk. Echter, alternatieve mechanismen voor GFP elders in het construct plaatsen mogelijk nog overal mogelijk om dergelijke eiwitten, en de andere hier vermelde assays kan nog worden toegepast.
Bovendien functioneren, lokalisatie en in vivo ligand interacties kan een GFP-gemerkt eiwit geïsoleerd met behulp van een anti-GFP antilichaam en het geïsoleerde eiwit gebruikt om de functie te onderzoeken gebruik in vitro assays waarin het GFP maakt een onbevooroordeelde isolatie van het eiwit en een relatief geïsoleerde controle (gratis GFP). Samen vormen deze assays kan sterk aanvullend bewijs nodig is om th kan bewijzenhoogte van de kandidaat eiwit functioneert als hypothese.
Omdat verder GFP protease resistent tenzij gemodificeerd met sites die weg uitstrekken van de compacte structuur 18, beperkt protease behandeling van cellen moet extracellulaire GFP loslaten. Het protease klieving zouden zijn opgetreden eiwit waaraan GFP is aangesloten of een koppeling gemaakt gebied. De vrijgemaakte product zou GFP met verlengde N-terminal naar de GFP sequentie. Trypsine niet GFP maken, indien de C-terminus van het eiwit waaraan GFP is bevestigd intracellulair. Een voorlopige analyse van de potentiële producten kunnen wijzen op een duidelijke molecuulgewicht patroon met een GFP-gelabelde eiwit vrijgegeven door trypsine. Voor veel membraaneiwitten, zouden dergelijke technieken leiden tot duidelijke aanwijzingen voor membraantopologie door afgifte van GFP, of het ontbreken daarvan.
Samen vormen de specifieke assays gepresenteerd en / of in dit verslag voorgestelde bieden een grote bemonstering van technieken thoed kan worden toegepast om nieuwe eiwitten te onderzoeken door te beginnen met een fluorescent gelabeld construct. Dergelijke constructen kunnen gemakkelijk commercieel verkregen worden. De mogelijkheid om ze te gebruiken voor een breed scala van technieken maakt ze economisch haalbaar is, zelfs voor kleine laboratoria op beperkte budgetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (PFA, methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96-well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in Figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in Figure 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35-mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm - C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10x solution |
References
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
- Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
- Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
- Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
- Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
- Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
- Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
- Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
- Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
- Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
- Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
- Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
- Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
- Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
- Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
- Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
