Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct

doi: 10.3791/55053 Published: February 17, 2017

Summary

Ein Konstrukt Codierung TMEM184A mit einem GFP-Tag am Carboxy-Terminus für eukaryotische Expressions entworfen wurde in Assays entwickelt, um zu bestätigen die Identifizierung von TMEM184A als Heparin-Rezeptor in vaskulären Zellen eingesetzt.

Abstract

Wenn neue Proteine ​​identifiziert werden durch Affinitäts-basierte Isolierung und Bioinformatik-Analyse, sind sie oft weitgehend uncharacterized. Antikörper, die gegen spezifische Peptide innerhalb der vorhergesagten Sequenz einige Lokalisierungs Experimente erlauben. Jedoch können auch andere mögliche Wechselwirkungen mit den Antikörpern oft nicht ausgeschlossen werden kann. Diese Situation bot die Möglichkeit, eine Reihe von Tests, abhängig von der Proteinsequenz zu entwickeln. Insbesondere ist ein Konstrukt, das das Gen-Sequenz am C-terminalen Ende des Proteins an das GFP-codierende Sequenz gekoppelt enthielt, wurde für diese Zwecke gewonnen und eingesetzt. Experimente Lokalisierung, Ligandenaffinität zu charakterisieren, und die Verstärkung der Funktion wurden ursprünglich entworfen und ausgeführt , um die Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor 1 bis bestätigen. Zusätzlich kann das Konstrukt für Studien Adressieren Membrantopologie Fragen und detaillierter Protein-Ligand-Wechselwirkungen eingesetzt werden. Der vorliegende Bericht stellt arange der experimentellen Protokolle auf der Basis der GFP-Konstrukt TMEM184A in vaskulären Zellen exprimiert, die leicht für andere neue Proteine ​​angepasst werden könnte.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Identifizierung von Kandidatenproteine ​​für neuartige Funktionen hängt oft von Affinität basierende Isolation Protokolle durch partielle Sequenzbestimmung gefolgt. Jüngste Beispiele für neu identifizierten Proteine sind Transmembranprotein 184A (TMEM184A), eine Heparin - Rezeptor identifiziert nach Heparin - Affinität Wechselwirkungen 1 und TgPH1, eine pleckstrin Homologie - Domäne - Protein , das Phosphoinositid PI (3,5) P 2 2 bindet. Andere neuartige Proteinidentifikation beinhaltet direkte Sequenzanalyse von Peptiden , wie sie von Vit, et al. die verwendeten Trans Peptide Proteinprodukte von bisher nicht charakterisierte Gene 3 zu erkennen. In ähnlicher Weise kann die Identifizierung neuer Proteinsequenzen erreicht werden Bioinformatik unter Verwendung von zuvor charakterisierten Proteinfamilien suchen, wie Identifizierung neuer 4TM Proteine 4. Die Prüfung der Aquaporinfamilie Gensequenzen hat also ergab die Identifizierung neuer Mitglieder mit neuen Funktionen 5. Nach der Identifizierung, Analyse der Proteinfunktion ist typischerweise ein nächster Schritt, die manchmal einen spezifischen Assay von Protein-Funktion, wie beispielsweise in dem Aquaporin Fall untersucht werden können.

Wenn möglich, die Funktion eines neu identifizierte Protein kann mit spezifischen enzymatischen oder ähnlichen in vitro - Assays Funktion untersucht werden. Da viele Funktionen der neuen Proteine in komplexen Wechselwirkungen abhängen , die nur in intakten Zellen oder Organismen auftreten, in - vitro - Tests sind nicht immer wirksam. Jedoch müssen die in - vivo - Tests in der Weise ausgebildet sein , dass sie auf der Gensequenz abhängen. In Zellkultur und / oder einfachen Modellorganismen, kann Knockdown Nachweise für sorgen für die Protein / Funktion Identifizierung 6. Mit neuartigen Proteine ​​identifiziert, wie oben erwähnt, ist es oft nicht einfach ein Protein abreißen zu Funktion bestätigen, eind die Gestaltung der in vivo funktionelle Assays , die auf Gensequenz abhängen wird zur Charakterisierung von neuen Proteinen wichtig.

Die kürzliche Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor (die Proliferation in der glatten Gefäßmuskulatur und Entzündungsreaktionen in Endothelzellen moduliert) unter Verwendung von Affinitätschromatographie und MALDI - MS - 1, 7 versehen , die Möglichkeit , eine Sammlung von Assays zu entwickeln , nach dem Zuschlags Ergebnisse erzielt , die mit der Identifizierung . Eine aktuelle Überprüfung bestätigt , dass Heparin spezifisch mit vielen Wachstumsfaktoren in Wechselwirkung tritt, ihre Rezeptoren, extrazellulären Matrixkomponenten, Zelladhäsion Rezeptoren und anderen Proteinen 8. Im Gefäßsystem, Heparin und Heparansulfat - Proteoglykane (enthaltend Heparansulfatketten ähnlich in Struktur zu Heparin) interagieren mit mehreren hundert Proteine 9. Um funktionell bestätigen that TMEM184A wurde mit Heparin-Aufnahme beteiligt und Bindung, Techniken, die das Genkonstrukt für TMEM184A eingesetzt wurden entwickelt. Der vorliegende Bericht enthält eine Sammlung von Assays auf Basis eines GFP-TMEM184A zur Verwendung konstruieren in die Identität von TMEM184A als Heparin-Rezeptor bestätigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Aufbau eines GFP-Protein-Construct

  1. Kauf oder Design und Build ein GFP-markierten Konstrukt basiert auf dem Protein in Frage.
    HINWEIS: Bei einem gekauften Konstrukt Standardvektoren sind von kommerziellen Laboratorien, die einige oder alle der folgenden Vorschläge sind: Für ein Membranprotein, wählen Sie einen C-terminalen Position des GFP, weil es weniger wahrscheinlich ist, mit Membranprotein Handel zu stören. Betrachten wir eine Erweiterung zwischen dem Gen von Interesse und dem GFP wenn Grund ist der C-Terminus des Proteins in Frage, zu glauben, kompakt in einer Domäne des Proteins gefaltet ist. Wählen Sie das Konstrukt für die allgemeine eukaryotische Zelle Ausdruck, sondern ermöglichen die Produktion in bakteriellen Systemen konstruieren. Umfassen eine Spaltstelle (wie für die TEV-Protease), durch die GFP entfernt werden kann, wenn für einige Experimente erwünscht, wo das GFP mit der Proteinaktivität stören könnten. In anderen Einsätzen wie einem zusätzlichen Tag für die Lokalisierung oder Affinität inWechselwirkungen (zB His6). Dies war nicht erforderlich, dass die hierin beschriebenen Assays, könnten aber andere Assays zu erleichtern, oder unmittelbar benachbart zu dem Gen, vor dem GFP, wenn die Entfernung von GFP gewünscht nützlich sein.

2. GFP-TMEM184A Expression in Gefäßzellen

  1. Kultur Endothel- oder vaskulären glatten Muskelzellen auf 0,2% Gelatine beschichteten Gewebekulturschalen , wie zuvor berichtet , 1, 6, 7.
  2. 5 mL Zellkultur Trypsin-Lösung (0,5% w / v) auf einen abgespült 100 mm oder größer, konfluente dish von Zellen. bei 37 ° C inkubieren, bis Zellen von der Platte nur freigegeben werden, und die Zellen in ein steriles Polypropylenzentrifugenröhrchen übertragen.
  3. Fügen Sie einen Trypsin - Inhibitor (beispielsweise ein gleiches Volumen regulären Kulturmedium), wie in Routinekultur verwendet, um die Zelle / Trypsin - Lösung zur Trypsin - Aktivität begrenzen. Pelletieren Sie die Zellen für 5 min bei approximzüglich 600 · g (oder andere geeignete Geschwindigkeit und Zeit zu pelletieren nur die Zellen für Standard-Gewebekultur). Den Überstand aspirieren.
  4. Die Zellen in 1 ml HeBS (Hepes-gepufferte Saline) Elektroporationspuffer, sind in dem Pellet oder Suspension die Menge an Zeitzellen zu begrenzen. Legen Sie die Zellsuspension auf Eis und führen verbleibenden Schritte auf dem Eis.
    HINWEIS: Pellet kann einmal mit HeBS vor der Resuspension gewaschen werden.
  5. Gebe ausreichend Volumen von GFP-markiertem TMEM184A Plasmid zu den Zellen in einer Endkonzentration von 20 ug / ml DNA zu erreichen. Verwenden Sie ein identisches Protokoll für eine GFP-Konstrukt.
  6. Es werden ca. 0,4 ml der Zelllösung in HeBS in einer Elektroporationsküvette. Pre-Chill die Küvetten vor der Verwendung.
  7. Elektroporation der Zellen unter den folgenden Bedingungen: Exponential Decay, 500 & mgr; F, ∞ Ohm und 170 V.
    HINWEIS: Die Spannung für einen gegebenen Zelltyp sollte optimiert werden. Vorläufige Studien mit endothelialen und glatten Muskulatur cell Typen wurden mit einem GFP-vinculin Konstrukt erreicht hier angemerkt , den optimalen Spannungswert , um zu bestimmen, zB 10.
    1. Zur Elektroporation zu optimieren, den Empfehlungen des Geräteherstellers starten (die Bedingungen für einige Standardzelltypen enthalten). Verwenden Sie das gewünschte Konstrukt oder ein fluoreszierendes Kontrollprotein in Größe und fluoreszierenden Eigenschaften auf die gewünschte Konstrukt ähnlich konstruieren.
      HINWEIS: Kleine erscheinen Nukleinsäuren in Zellen eindringen leichter als größere Konstrukte, so ein Konstrukt mit nur einem fluoreszierenden Protein kann einfacher sein, zum Ausdruck bringen, als eine größere.
    2. Verwenden der Fluoreszenzmikroskopie die Lebensfähigkeit der Zellen, den Prozentsatz der Zellen, in denen das Fluoreszenz exprimierende Konstrukt wird nach 24 und 48 h, und die Intensität der Expression zu bestimmen.
      HINWEIS: Verringern Sie die Spannung und / oder Zeit leicht, wenn das Überleben gering ist. Ziel ist es für möglichst kurzer Zeit zwischen Freisetzung von Zellen aus der Kulturoberfläche und RückkehrZellen zur Kultur Überleben zu verbessern. Ein leichter Anstieg in der Zeit oder einen zweiten Impuls kann Konstrukt Aufnahme verbessern, wenn das Überleben hoch ist und Ausdruck ist gering. Optimale Bedingungen und Ausdruck wird zwischen Zelltypen variieren. Wenn der Prozentsatz der Zellen, die das Konstrukt exprimieren, ist hoch, aber Intensität niedrig ist, die DNA-Konzentration zu erhöhen und die transfizierten Zellen über die Zeit für eine optimale Intensitätsüberwachung, die auf Proteinhalbwertszeit basierend variieren sowie Expression, Intensität verbessern. Färbungsintensität kann für einige Assays falls vergrößert werden, durch Immunfärbung von GFP mit Anti-GFP-Antikörpern
  8. Nach der Elektroporation Samen der Zellen in sechs 30-mm-Gewebekulturschalen mit Deck für die Bildgebung oder in Gewebekulturschalen. Kultur die Zellen unter Verwendung von Standard-Zellkulturverfahren.
  9. Optional: Ersetzen Sie das Kulturmedium nach 24 Stunden jede HeBS Elektroporationspuffers zu entfernen.

3. Visualisierung von GFP-TMEM184A Localization

  1. Spülen der Zellen mit PBS und vorsichtigem Schütteln nach mindestens 24 h zur Kultivierung. Begrenzung der Exposition gegenüber hellem Licht GFP Schwund zu vermeiden.
  2. Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min bei RT unter leichtem Schütteln. Vermeiden Sie methanolhaltige Reagenzien, die die Zellen permeabilisiert kann. Fixierung mit Methanol verwendet werden, wenn es nicht notwendig ist, Liganden-Wechselwirkungen zu bewerten.
    Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. Verwenden Sie in einem Abzug, mit Sorgfalt, und entsorgen Sie richtig.
  3. Spülen, wie oben mit PBS. Für Antikörper basierte Färbung, siehe 3.6 unten.
  4. Berg Deckgläser auf Objektträger Mowiol oder einem anderen geeigneten Befestigungsmedium.
  5. Bildobjektträger oder ein konfokales Fluoreszenzmikroskop mit entsprechenden Filtersätzen für GFP Anregungs- und Emissionsspektren. Konfokalmikroskopie wird wegen der Fähigkeit bevorzugt, Proben in der z-Ebene zu trennen. Speichern von Bildern in Graustufen für quantitation Zwecke im TIF-Format (zusätzlich zu den Vollfarbbilder für die Illustrationen).
  6. Zum Vergleich mit WT TMEM184A von den Zellen exprimiert wird , bereiten anderen Zellen für Immunofluoreszenz unter Verwendung von primären Antikörpern gegen ein Peptid hergestellt (s) von der TMEM184A Sequenz, zB 1. Identifizierung von GFP-TEMEM184A können auch Antikörper gegen GFP erreicht werden. Bewerten Sie die beiden Zellproben durch identische Mikroskopietechniken.

4. Rhodamin-Bindung von Heparin und Kolokalisation mit GFP-TMEM184A-transfizierten Zellen

  1. Behandlung von Zellen mit 100 ug / ml Rhodamin-Heparin hinzugefügt Kulturmedium GFP-TMEM184A-exprimierenden und lassen Zellen für einen bestimmten Zeitraum zu inkubieren, typischerweise weniger als 10 min für A7r5 Zellen. Spülen und beheben, wie in 3.1 und 3.2.
    HINWEIS: Die optimale Zeit und Konzentration des Liganden hängt von Zell-Antwort, die Fluoreszenzintensität des Liganden und Bildintensität erhalten. Dieses KonzentratIonen von Heparin verwendet wurde , weil es in mehr als 50% Reaktion in anderen Assays 11 führt. Diese Konzentration könnte Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken sichtbar gemacht werden, so war es nicht notwendig, sie zu erhöhen. Die Verdünnung von Rhodamin-Heparin mit unmarkierten Heparin führt zu einer geringeren Fluoreszenz in den Zellen, so ist schwieriger zu Bild und zu quantifizieren.
  2. Um das Rhodamin-Heparin-Bindung aufgrund von GFP-TMEM184A Transfektion quantifizieren, bereiten identische Zellen ohne transfizierten GFP-TMEM184A.
  3. Bild die Zellen mit einem konfokalen Mikroskop mit dem entsprechenden GFP unter Verwendung von (488 nm) und Rhodamin (543 nm) Anregung und Emission (500-530 nm für GFP und größer als 560 nm für Rhodamin) Werte Co-Lokalisierung zu bestimmen. Abrufen von Bildern von mindestens 50 Zellen, die aus mindestens drei getrennten Experimenten Statistiken zu erhalten. Pflegen Sie identische Einstellungen in Experimenten und verwenden eine Kontrollprobe (n) (zB Zellen , die mit keiner Behandlung) thbei Daten können verwendet werden, für die Analyse von mehreren Experimenten zu standardisieren.
  4. Prüfen, die Bilder eines Computerprogramms unter Verwendung von relativen Rhodamin Bindung / Aufnahme zur Quantifizierung in jeder Zelle der Bindung zu bestimmen.
    HINWEIS: TIF Bilder sollten, da sie bequem sind für die Analyse verwendet werden und kann in Maßstab viele Computerprogramme zu Grau umgewandelt werden, wenn sie nicht von Anfang an in diesem Format gespeichert wurden. Bild J (Freeware) wurde in der vorliegenden Untersuchung verwendet und ermöglicht Bereich und Pixelintensität für jeden benutzerdefinierten Bereich in einem Bild gemessen werden.
    1. Verwenden Sie ein Freihandwerkzeug, eine Zelle in einem Fluoreszenzbild zu umkreisen und das Messwerkzeug verwenden, um die Intensität in diesem Raum zu bestimmen.
      ANMERKUNG: Diese Messungen liefern die benötigten Informationen Gesamtintensität für einen Benutzer-definierten Bereich (ganze Zelle, ein Zellkern, etc.) zu berechnen , einen Weg bietet verschiedene Zellen mit unterschiedlichen Geometrien zu vergleichen. Mittlere Intensität über eine Fläche von Hintergrund gemeldet werden können und dass erleichterns Sammlung von Hintergrundintensität für die Analyse.
    2. Export in eine Tabelle auf den Bereich von der Intensität und subtrahieren Hintergrund für die gleiche Menge an Fläche multipliziert zu berechnen. Der Mittelwert der Fluoreszenz / Zelle genügend Zellen / Experiment statistische Signifikanz zu erhalten.

5. Fluorescence Resonance Energy Transfer von GFP-TMEM184A Rhodamin-Heparin

  1. Bereiten Sie transfizierten Zellen und Inkubation mit 200 ug / ml Rhodamin-markierten Liganden, wie in 3.1. Beachten Sie, dass die Inkubationszeit mit fluoreszierenden Ligand Zelltyp abhängig ist. Fix nur mit PFA, und montieren Folien für die Bildgebung.
  2. Zunächst erregt bei 405 nm und Bild für Rhodamin-Emission (566-685 nm; FRET). Zweitens bei 488 für GFP (bei 493 Bild - 530) zu erregen, und drittens (- 685 bei 566 Bild) bei 561 für Rhodamin erregen. Kontrollen ohne GFP-TMEM184A oder ohne Rhodamin-Heparin sind kritisch.

6. Live-Cell-Imaging-Rhodamin-Heparin Uptake

  1. Same ist das GFP-TMEM184A transfizierten Zellen in einzelne Gerichte entwickelt für Live-Cell-Imaging und zu behandeln, wie in Protokoll 3.
    HINWEIS: Die Anzahl von Zellen erforderlich ist, hängt vom Zelltyp und der Dichte gewünscht. Um die Menge an Zeitzellen in Suspension zu minimieren, keine Zellen zu zählen. Seed-Zellen aus einer 100 mm konfluenten Schale in sechs 35 mm Live-Bildgebung Gerichte Zellen in der Nähe Einmündung in 48 h zu erhalten.
  2. Nach 48 h, ersetzen Sie das Medium mit Kulturmedium ohne Phenolrot.
  3. Übertragen einer Schale von Zellen zu einem konfokalen Mikroskop mit einer Erwärmung der Bühne Temperatur zu halten, und das Mikroskop konzentrieren.
  4. Jeweils 100 & mgr; g / ml Rhodamin-Heparin in die Schüssel und vorsichtig mischen.
  5. Ab sofort beginnen, Live-Bilder aufnehmen. Wenn keine Zellaufnahme von Heparin in der Region im Hinblick auf, bewegen Sie die Schale leicht Zellen mit mindestens einer grün-Vesikel mit dem Rhodamin-Markierung zu identifizieren.
    HINWEIS: Imaging Anregungs- und Emissions Besonderheiten sind diegleiche wie für die Heparin-Aufnahme-Protokoll (Abschnitt 5). Die Zeitspanne zwischen den Bildern betrug etwa 16 s. Die Bedingungen des Experiments und dem Mikroskop bestimmt, typischerweise die Geschwindigkeit, mit der Bilder erhalten werden können.

7. Isolierung von GFP-TMEM184A und GFP aus kultivierten Zellen

  1. Nach dem Entfernen mit PBS Kulturmedium und Spülen, 2 ml 0,2% (w / v) CHAPS 1x PBS-Lösung mit Protease-Inhibitoren zu einer 150 mm-Platte von Zellen GFP-TMEM184A oder GFP (für Kontrollbindungsassays) exprimieren. Kratzen Sie die Zellen aus der Schale, legen Sie die Zellen / CHAPS-Lösung in einem 15 ml Polypropylen-Röhrchen auf Eis, und mischen Sie gut durch Antippen. Führen Sie alle Schritte in helles Licht, um sicherzustellen, das GFP-Tag für den Bindungsassay unter gebleicht wird.
  2. Um speziell GFP-TMEM184A (oder eine entsprechende GFP-Kontrolle) binden, fügen Sie 2 pg / ml biotinyliertem anti-GFP-Antikörper zur Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit Schaukeln.
  3. In 500 ulStreptavidin-Agarose-Kügelchen mindestens 5 ml 0,2% CHAPS / PBS und Zentrifugation bei etwa 600 × g für 3 bis 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie zwei weitere Male mit frischen CHAPS / PBS jedes Mal. Beads an den Antikörper und Zelllösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C unter Schütteln die Perlen zu erlauben, an den biotinylierten anti-GFP-Antikörpers an das GFP oder GFP-TMEM184A gebunden zu binden.
  4. Pellet die Perlen durch Zentrifugation (wie in 7.3) und entfernen Sie das ungebundene Material. Fügen Sie mindestens 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / Protease-Inhibitoren zu waschen. Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren mindestens 3x, um effektiv jegliches ungebundene Protein zu entfernen.
  5. Nach dem letzten Waschen entfernen, für 3 min die Perlen mit 1 ml 0,2 M Glycin / 0,2% CHAPS in PBS (pH-Wert auf 2,0 mit HCl) auf Eis inkubieren der Antikörper-GFP-Bindung (was frei GFP-TMEM184A oder frei zu distanzieren GFP). Vorsichtig mischen durch alle 30 s tippen.
  6. Zentrifuge bei etwa 600 · g und den Überstand des gereinigten p enthält,rotein auf ein neues 15 ml-Röhrchen durch sofortige Neutralisation gefolgt von 5 ml 1 M Natriumbicarbonat (bringen den pH-Wert auf 7).
  7. Konzentrieren Sie die Probe mit einem 10.000 Dalton Molekulargewicht cut-off Zentrifugalkonzentrator (verwenden Zentrifugierungsgeschwindigkeit vom Lieferanten empfohlen). Wenn das Volumen von etwa 0,5 ml erreicht, mit 0,2% CHAPS / PBS. Weiter zu konzentrieren und das Hinzufügen von mehr 0,2% CHAPS / PBS, bis mindestens zehn Volumina (-fache des Ausgangsprobenvolumen) der 0,2% CHAPS / PBS wurden hinzugefügt.
  8. Um zu bestimmen, um eine Schätzung der Menge an isolierter GFP oder GFP-markierte Protein, erhalten, die eine Extinktion bei 280 nm zu lesen und vergleichen es mit einer Standardkurve, hergestellt aus Rinderserumalbumin oder andere Kontrollproteins in dem gleichen Puffer.
    HINWEIS: Aufgrund der Extinktionskoeffizient Unterschiede, diese Konzentration ist eine Schätzung, kann aber eine ungefähre Proteinkonzentration liefern weitere Analyse zu erleichtern, ohne Probe zu verschwenden. Die genaue Proteinkonzentration kann abschreckenVerwendung einer Mikro-Lowry-Protein-Assay Herstellung bestimmter verminten das Standardprotein in dem gleichen Puffer wie die Probe herzustellen. Eine weitere Analyse des isolierten Proteins durch Western-Blotting des isolierten Proteins (mittels Antikörpernachweis für GFP) und der Vergleich mit dem vorhergesagten Molekulargewicht erreicht werden. Verwendung der TMEM184A Antikörper sollten alternativ ergeben eine Bande der vorhergesagten Grße Konstrukts, könnte aber auch in einem WT TMEM184A Band führen, wenn Dimere (oder höherer Ordnung Oligomere) in der Probe vorhanden sind. Eine Schätzung der Reinheit kann durch Färben einer blot für Gesamt-Protein aus der isolierten Probe vs Gesamtprotein aus einem Aliquot des Ausgangsmaterials erhalten werden.

8. In - vitro - Heparin - Bindungsassay

  1. Bereiten Sie eine schwarze Avidinbeschichtete 96-Well-Platte durch Waschen mit 200 & mgr; l 0,2% CHAPS / PBS dreimal für 5 Minuten unter Schütteln. Bereiten Sie eine identische schwarze nicht-beschichteten 96-Well-Platte die gleiche Waschverfahren verwendet wird. Bereite ein ..... vorLayout für die experimentellen Proben (in dreifacher Ausführung) während des Assays zu folgen. Fügen Sie Brunnen für Standard-Heparin-Konzentrationen, Pufferkontrollen und Vertiefungen mit GFP Proben ohne Bleichen von GFP zu bestätigen Heparin.
    HINWEIS: Wenn optimierte Isolation oder Ligand-Wechselwirkung Puffer für das fragliche Protein verschieden sind, tun alle Plattenzubereitungen und Waschen mit dem optimalen Puffersystem.
  2. Je 100 & mgr; l 60 pmol / Well biotinylierter anti-GFP in alle Vertiefungen in der Avidinbeschichtete Platte, wo GFP Bindung erwünscht ist. Die Menge an Antikörper ist ausreichend zu sättigen nur den hochaffinen Avidin in den Vertiefungen.
    1. In Puffer nur zu allen Vertiefungen für Kontrollzwecke verwendet werden (keine GFP oder GFP-TMEM184A gewünschte Bindung). Verschließen Sie die Vertiefungen mit einer Plattenabdeckung Verdunstung verhindern. Inkubieren für 2 h bei RT unter Schütteln.
      HINWEIS: Volumes zu den Vertiefungen und Inkubationszeiten hinzugefügt werden, auf Empfehlungen des Anbieters basiert.
  3. Waschen Sie alle Vertiefungen dreimalfür 5 min mit 200 & mgr; l 0,2% CHAPS / PBS.
  4. In 100 ul von 5 nmol / Well GFP-TMEM184A oder GFP zu geeigneten Vertiefungen in der Avidinbeschichtete Platte und Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln. Waschen Sie wieder wie in 8.3.
    ANMERKUNG: Diese Proteinkonzentration wurde gewählt, um sicherzustellen, daß alle Seiten mit überschüssigem GFP oder GFP-TMEM184A gesättigt waren. Dies ist wichtig, daß die gleiche Menge an Protein zu gewährleisten, zu jeder Vertiefung gebunden ist. Geringere Mengen an Protein könnte sättigen auch die Stellen, die Möglichkeit, dass durch die Auswertung ungebundene Protein, das nach Inkubation mehrere Konzentrationen des Proteins mit der Platte und den Vergleich ungebundene Protein und Ligand-Bindungs-Assays untersucht werden konnte.
  5. Bereiten verschiedener Konzentrationen von Fluorescein-markiertem Heparin, beispielsweise 10, 25, 50, 75, 100, 200 ug / ml, in 0,2% CHAPS / PBS. Tun Sie dies und alle im Dunkeln verbleibende Arbeit.
    HINWEIS: Vor Konzentrationen spezifische Konzentrationen für andere Liganden vorbereiten sollte für die protei bestimmt werdenn Ziel in Frage. Die niedrigste Konzentration sollte in der Plattenleser nachweisbar sein. Deshalb ist es wichtig, zuerst den Bereich bestimmen, die genau in dem Puffersystem eingesetzt detektiert werden kann. Dann bestimmen den Bereich messbare Bindung zu erhalten benötigt. Konzentrationen von Fluorescein-Heparin unter 10 & mgr; g / mL registrieren nicht konsistent in dem Plattenlesegerät unter Pufferbedingungen verwendet werden. In ähnlicher Weise, während Rhodamin-Heparin, wie in den anderen Tests verwendet, könnte in dem Plattenlesegerät sichtbar gemacht werden, in den Pufferbedingungen und bei den Konzentrationen für die Bindung erforderlich waren die Fluoreszenzmesswerte für die Standards nicht reproduzierbar anders mit diesem Fluorophor.
  6. Füge 100 & mgr; l Fluorescein-Heparin zu entsprechenden Testvertiefungen in den Avidin-beschichteten Platte und Konzentration Standardvertiefungen in sowohl dem Avidin-beschichteten und der unbeschichteten Platte. Inkubieren für 10 min bei RT unter Schütteln. Halten Platten im Dunkeln (oder Folie abgedeckt).
  7. Mit Hilfe einer Platte reader, notieren Sie die anfängliche Fluoreszenzemission aus dem Heparin in den Kontrollvertiefungen der beiden Platten und der anfänglichen Fluoreszenz (gesamt) Emission von Wells mit immobilisiert GFP-TMEM184A oder GFP in der Avidinbeschichtete Platte. Falls erforderlich, stellen Sie die Geräteverstärkung Detektion von Fluoreszenz Heparin zwischen dem niedrigsten und dem höchsten Konzentrationen zu gewährleisten.
    HINWEIS: Stellen Sie die Plattenleser bestimmte liest Brunnen von oben und liest an der optimalen Stelle in den Vertiefungen, wenn diese einstellbar ist. Für die Studie in Frage, war die optimale Lage, ca. 75% unter den Vertiefungen. Informationen zur Verfügung mit dem Plattenlesegerät sollte Vorschläge liefern, die auf die Plattenleser in Frage eindeutig sind für Assays der gebundenen Probe in schwarzen Platten zu lesen.
  8. Entfernen ungebundenen fluoreszierenden Heparin aus Brunnen mit immobilisiert GFP-TMEM184A oder GFP aufnehmen und in entsprechende Vertiefungen in der nicht beschichtete schwarze Platte. Unmittelbar lesen Sie die Fluoreszenzemission.
  9. 100 l Frisch 0,2% CHAPS / PBS zurück into Brunnen, aus denen das Fluorescein-Heparin wurde entfernt und die Fluoreszenzemission gelesen.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 8,8-8,9 3x.
    HINWEIS: Diese Messwerte von der beschichteten Platte zeigen Fluorescein Heparin verbleibenden in den GFP oder GFP-TMEM184A Brunnen. Wenn signifikante Fluoreszenz in der dritten ungebundene Probe gefunden wird, sollte eine zusätzliche Wasch auftreten. Wenn Fluoreszenz in jedem Waschen entfernt werden fortgesetzt, der Ligandenbindung könnte eine geringe Affinität sein, und die Bedingungen sollten neu bewertet werden. Die letzte Lesung stellt das gebundene Heparin Lesung.
  11. Nehmen Fluoreszenzemission von den entfernten, ungebunden, Proben in der nicht-beschichteten Platte, zu erhalten Nummern für jede Wäsche. Dies sind die "ungebundene" Lesungen.
  12. Verwenden Gesamtwerte Heparin Emission in 8.7 erhalten die richtigen Mengen an Heparin zu bestätigen zu jeder Vertiefung gegeben. Subtrahiert durchschnittlichen Hintergrundwerte von den Werten.
    HINWEIS: Wells ohne Fluorescein-Heparin als Hintergrund dienen aufgrund Antikörper, GFP und Puffer. Average der Hintergrund wiederholt den Hintergrundwert zu erhalten. Subtrahieren durchschnittlichen Hintergrundwerte von den gebundenen und ungebundenen Lesungen tatsächlichen Werte zu erhalten.
  13. Beschäftigen eine graphische Darstellung der Emission gegen insgesamt Fluorescein-Heparin das Ausmaß der Emission gegen Heparinmenge zu bestimmen, hinzugefügt.
    HINWEIS: Antikörper allein oder Antikörper und Antigen resultiert in einem gewissen Quenchen der Fluoreszenz. Daher wurde die Gesamt-Heparin bezogen auf das Gesamt hinzugefügt Heparin bestimmt, wie in 8.7 festgestellt.
  14. Zeichnen Sie die korrigierte gebundenen Heparin gegen den zusätzlichen Heparin für die dreifacher Ausführung sowohl in der GFP-TMEM184A Fall und das GFP-Fall.
  15. Bestimmen freier Ligand durch die ungebundenen Messwerte aus allen Waschungen für eine bestimmte Konzentration hinzugefügt wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Während in der Theorie, die Transfektion von DNA in Zellen jeder konstruieren könnte mit lipophilen Transfektionsreagenzien durchgeführt werden, zeigen früheren Berichten effektiver Transfektion von GFP - Konstrukten in endothelial Elektroporation 12 unter Verwendung von Zellen. Das Protokoll hier bereitgestellt typischerweise erreicht GFP-Konstrukt die Expression in mehr als 80% der primären abgeleitete Endothelzellen und glatte Muskelzellen verwendet. Entwurf des Konstrukts verwendet verwendet, um ein kommerziell erhältliches System, das dieses Konstrukt schnell liefern konnten. Der Haupteinsatzzweck wurde auf Standortfragen konzentriert, damit die korrekte Auslieferung an die Membran, zusammen mit optimalen eukaryotischen Proteinexpression und weiterhin Konstrukt Produktion primäre Überlegungen waren. Andere Überlegungen können sein: andere Stelle des GFP für unterschiedlich lokalisierten Proteine ​​oder Proteine ​​mit einem C-Terminus, die Teil einer gefalteten Region, die Möglichkeit der Wanti istng das GFP (Hinzufügen einer Protease-Schnittstelle) und eine sekundäre Affinität zu entfernen. Der letztere würde alternative Möglichkeiten des GFP-Konstrukt gereinigt und auf einer Oberfläche für den Bindungsassay stabilisieren. Um zu bestätigen, Färbungsmuster für verschiedene kommerzielle Antikörper gegen TMEM184A, Gefäßzellen, die GFP-TMEM184A wurden im Vergleich zu identischen Zellen mit den kommerziellen Antikörpern gefärbt. Die Länge der Zeit nach der Transfektion Auswirkungen Verteilung von GFP-TMEM184A, die mindestens 72 h erschien ansammeln. Die Länge der Zeit nach der Transfektion in eine optimale Expression resultierende variiert je nach Zelltyp und sollte für jede Technik optimiert werden. Im Laufe der Zeit war mehr GFP-Label in der peri-Kernregion. Je nach Handhabung, GFP Bleich kam es auch. Die Ergebnisse zeigten , GFP-TMEM184A an der Zelloberfläche und in peri-nuklearen und anderen Vesikel Strukturen ähnlich wie Lokalisation beobachtet mit TMEM184A Antikörper - Färbung (Abbildung 1). Die primären Zellen in Figur 5 , wo die Technik auch gezeigt Membrantopologie zu bewerten , wurde verwendet.

Die Verwendung eines fluoreszierenden Liganden (Rhodamin-Heparin) erleichtert Bewertung der Co-Lokalisierung von Ligand und Rezeptor über die Zeit, und die beiden Etiketten machte es möglich , Echtzeit- Bildgebung (Abbildung 2 und Film - 1) durchzuführen. 2C wurde bei 405 nm durch Anregung des GFP abgebildet wird , sondern aus dem Rhodamin (mittlere Bilder) Einfangen Emission. GFP Anregung bei 405 nm ergibt begrenzte Emission als auch beschränkt, sondern dies verhindert Anregung von Rhodamin und ein falsches FRET-Signals. Ähnlich ist die FRET-INDUCed Rhodamin-Emission war schwach. In Kontrollen mit GFP-Expression TMEM184A, aber keine Rhodamin-Heparin und andere nur mit Rhodamin-Heparin gab es keine Rhodamin-Emission bei 405 nm Anregung. unter Verwendung von Standard-Anregungs- / Emissions-Wellenlängen für jeden Fluorophor Anschließend wurden insgesamt GFP (linkes Bild) und Gesamt-Rhodamin (rechte Bilder) gemessen. Die Daten in C weitere Unterstützung der Co-Lokalisation des Liganden und der GFP-TMEM184A. Rhodamin-Heparin-Aufnahme in RAOEC erforderlich Inkubation länger als bis A7r5 Zellen verglichen. Kein Beweis für FRET wurde in Zellen ohne Rhodamin-Heparin oder in untransfizierten Zellen beobachtet. Ein ideales Experiment würde eine andere Oberfläche GFP-Konstrukt umfassen, die keine Co-Lokalisation mit dem Liganden haben sollte.

Der Erwerb oder Wiederherstellung der Funktion auch mit GFP-Protein-Konstrukte und Rhodamin-Heparin erreicht werden könnte. Dies bot die Möglichkeit, GFP zu verwenden, als Beweis für Expressionsniveau und Ligand Co-Lokalisierung und die Wechselwirkungen zu quantifizieren. Insbesondere wurde Heparin - Aufnahme in GFP-TMEM184A erhöht A7r5 Zellen Konstrukt transfizierten (Abbildung 3). Stabile Knockdown Zellen , die sehr begrenzte Rhodamin-Heparin einnehmen 1 wurden hergestellt, und diese ein System , in dem Gewinn der Funktion zur Verfügung gestellt ausgewertet werden konnten. Die Transfektion von GFP-TMEM184A Konstrukt resultierte in Zellen , die wiederum konnte Rhodamin-Heparin auf der Ebene der Wildtyp - Zellen internalisieren oder höher (Abbildung 3). Es sei darauf hingewiesen, dass die "kein Heparin" Bild von stabilen Knockdown Zellen, die GFP als Reporter für Zuschlags Konstrukt exprimieren. Hintergrund-Fluoreszenz wurde in diesen Zellen höher ist, wie dargestellt in dem Bild beobachtet.

Typischerweise ist es hilfreich isolierten Rezeptor zur Bestimmung der Ligandenspezifität zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit von anderen Proteinen mit dem Liganden in Wechselwirkung zu verringern. Die Verwendung eines GFP-protein-Konstrukt stellt einen bedeutenden Vorteil in dieser Hinsicht als GFP-Tag kann als Griff für die Isolierung des Proteins dienen und vermeidet mögliche Wechselwirkungen von Antikörpern oder anderen Affinitätsreagenzien mit zusätzlichen Proteinen. GFP können auch in identischen Populationen von Zellen exprimiert werden und isoliert das gleiche GFP Affinität Verfahren. Dies stellt eine Kontrollprotein für Studien Wechselwirkung Ligand. Im TMEM184A System isoliert die GFP-TMEM184A resultierte ein Anti-GFP - Antikörper - Affinitätsverfahren unter Verwendung von in spezifischen, sättigbare Heparinbindung, während die Kontroll GFP kein Heparin (Abbildung 4) gebunden haben.

Typischerweise GFP-Tags auf Konstrukte sind an einem Ende eines Proteins platziert. Die C-terminale Stelle erleichtert korrekte Proteintransport auf eine Membran. Daher kann die Verfügbarkeit von GFP auf einer bestimmten Seite einer Membran Beweise für bestimmte Topologie eines Membranproteins bereitstellen, wenn Falten und Topologie sind keinlready bekannt. Einfache Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen GFP (wie in 5) können in nicht-permeabilisierten Zellen auf Antikörper - basierte Zugriffs Nachweis der GFP Lage bereitzustellen. Die anti-GFP-Antikörper erkennen GFP selbst wenn gebleicht. Immunfluoreszenzfärbung in Figur 5 gezeigt , legt nahe , signifikante Anti-GFP - Färbung ohne Permeabilisierung der GFP-transfizierten Zellen TMEM184A vorläufige Hinweise vorausgesetzt , dass die GFP an der Plasmamembran extrazellulär ist. Offensichtlich intrazelluläre Protein in Vesikeln wird auch in permeabilisierten Zellen gefärbt. FRET Bilder in 2C sind konsistent mit dieser vorgeschlagenen Topologie.

Abbildung 1
Abbildung 1: GFP-TEMEM184A Lokalisierung in Zellen bestätigt TMEM184A Lokalisierung Bestimmt durch Immunofluoreszenz. A) BAOECs transfiziert mit GFP-TMEM184A wurden mit 4% PFA fixiert. Untransfizierten Zellen wurden entweder mit eiskaltem Methanol (MeOH) Fixierung und Permeabilisierung oder 4% PFA, gefolgt von Triton X-100 Permeabilisierung verarbeitet werden (wie bereits erwähnt). Die nicht-transfizierte Zellen wurden gefärbt mit einem Antikörper gegen ein C-terminales Peptid von TMEM184A (CTD) oder ein N-terminales Peptid von TMEM184A (NTD) und einem sekundären anti-Kaninchen-Antikörper, markiert mit TRITC. B) Beispiele für geklonte (A7r5) und primäre (BAOSMC) glatten Muskelzellen wurden in ähnlicher Weise verarbeitet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Imaging von GFP-TMEM184A mit Rhodamin-Heparin. A) A7r5s elektroporiert mit GFP-TMEM184A wurden mit 100 ug / ml Rhodamin-Heparin für die behandelteangegebenen Zeiten und dann mit 4% PFA fixiert. Bilder sind repräsentativ für zwei getrennte Experimente. B) wurden A7r5 Zellen , die mit GFP-TMEM184A und Rhodamin-Heparin wurde mit sofortiger Live - Bildgebung hinzugefügt. Ausgewählte Bilder des Films sind mit einem weißen vertikalen Balken gezeigt auf die Anfangs Lokalisierung eines GFP-beschichteten Vesikel enthalten, Rhodamin-Heparin. Die GFP-Label und das Rhodamin bewegen sich zusammen. Maßstabsbalken = 2 & mgr; m. C) RAOECs behandelt , wie in A wurden Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer durch Anregung bei 405 (GFP, für FRET) und im Vergleich zu den Standardeinstellungen abgebildet, siehe Protokoll 3.5. Panel A, und die zwei Zeitpunkte in B, wurden ursprünglich in dem Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Bitte klicken Sie hier , um die vIEW eine größere Version dieser Figur.

Figur 3
Abbildung 3: GFP-TMEM184A Transfection Bietet einen Funktionsgewinn. A) signifikant niedrigere Werte von Rhodamin-Heparin werden in stabilen Knockdown A7r5 Zellen im Vergleich zu Wildtyp - A7r5s, siehe Beispielbilder zu sehen. Die "kein Heparin" Bild ist stabiler Knockdown Zellen, die GFP als Marker Konstrukt Präsenz auszudrücken. Maßstabsbalken = 10 um. B) Transfektion von GFP-TMEM184A sowohl in Wildtyp und stabile Knockdown Zellen erhöht signifikant die Rhodamin-Heparin - Signal in diesen auf der Analyse von mehr als 50 Zellen / Zustand in drei unabhängigen Experimenten basiert Zellen. Die Fehlerbalken stellen SEM. p <0,0001 basierend auf einem Tukey-Test. Diese Figur wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Pugh, RP, et al. 1. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Getrennte GFP-TMEM184A Wird Heparin. GFP-TMEM184A oder GFP wurde isoliert und gebunden an Avidin-beschichteten Assayplatten. Fluorescein-Heparin wurde in Konzentrationen von 0,056 nmol bis 1.111 nmol zugegeben. Heparin gebunden wurde bestimmt durch Emission bei 519 nm zu messen. GFP-TMEM184A (Quadrate). GFP Kontrolle (Kreise). Diese Figur wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Pugh, RP, et al. 1. Urheberrecht der Amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. _blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: GFP-TMEM184A und Membrantopologie. GFP-TMEM184A transfizierten Zellen wurden entweder mit 4% PFA (oben) oder mit 4% PFA fixiert und permeabilisiert Verwendung Triton X-100 (unten). Die Zellen wurden identisch mit anti-GFP primären Antikörpern und Cy3-markierten sekundären Antikörpern gefärbt. Maßstabsbalken = 10 um. Zwei verschiedene Experimente sind gezeigt. Sekundäre nur gefärbten Zellen zeigten im wesentlichen keine Färbung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Film 1
pload / 55053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Film 1:.. Live Imaging von GFP-TMEM184A mit Rhodamin-Heparin (rechts zum Download klicken) A7r5 Zellen wie in 2B behandelt wurden Der Film zeigt die GFP- TMEM184A und Rhodamin-Heparin-Vesikel an der Spitze bewegte zusammen. Separate Farbvarianten neben der fusionierten Version des Films gezeigt. Das Vesikel mit GFP und enthält Rhodamin eingekreist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die Protokolle , die hier berichtet wurden entwickelt 1 bestätigenden Beweis für die Identifizierung von TMEM184A als Heparin - Rezeptor in vaskulären Zellen. Knockdown Techniken werden als ein Mechanismus zur Bestätigung der Identifizierung neuer Proteine ​​routinemäßig eingesetzt. Allerdings ist einige Funktionsverlust nach Zuschlags typischerweise nicht ausreichenden Nachweis, dass ein Kandidat Protein ist eigentlich die richtige Rezeptor (oder andere funktionelle Protein). Es ist auch wichtig, Beweise zu haben, dass der Kandidat Protein mit der Funktion tatsächlich aufweist. ermöglicht ein Konstrukt für ein neues Gen mit GFP Verstärkung Experimente Funktion markiert Der Einsatz und die Isolation des markierten Proteins auf GFP Affinität basiert. Elektroporation in diesem Protokoll verwendet erleichtert sehr hohe Transfektionseffizienz des Konstrukts (mehr als 80% der Zellen, die das Konstrukt exprimiert). Es könnten jedoch andere Mechanismen Transfektion verwendet werden, wenn die Elektroporation nicht verfügbar oder nicht erwünscht. Es gibt mehrere Vorteile für ein GFP-markiertes Konstrukt zur Bestätigung einer neuen Proteinfunktion auswählen. Erstens dient das GFP als Reportergen für die Transfektion und die Genexpression und es erlaubt die Überexpression durch GFP überwacht werden, wenn eine Zelllinie, ohne die Expression des Proteins nicht vorhanden ist. Zweitens stellt das GFP-Tag ein Werkzeug zur Reinigung des Proteins, die nicht an beiden Ligandenaffinität oder Antikörper gegen Peptide abhängt. Drittens stellt das GFP-Tag ein Werkzeug komplexe immunfluoreszierenden Lokalisation zu untersuchen visualisiert Antikörper erzeugt gegen einzigartige Peptide in die Zielproteinsequenz zu bestimmen, ob die Ist-Genprodukt ist in ähnlicher Weise lokalisiert werden.

Gain of function Assays mit Genkonstrukte werden für eine Reihe von Zwecken einschließlich der Hochdurchsatz - Screening zur Identifizierung neuer Protein - Funktion 13 verwendet. Im Idealfall würde beschäftigen, einen Funktionsgewinn-Assays eine gut studierte geklonten Zellen Line, die nicht das betreffende Gen nicht exprimiert (die Zellen müssen noch ausdrücken Genprodukte kooperierende, die Funktion des neu exprimierten Gens ermöglichen). Wenn eine spezifische GFP-markierten Konstrukts wie in den vorliegenden Assays verwendet wird, ist es kritisch Zellen, in denen das GFP-Protein-Funktion kann verwendet werden. Somit hängt die Wahl von Zellen auf der Funktion und wahrscheinlich auf dem Zelltyp, in dem die Funktion normalerweise vorhanden, um sicherzustellen, kooperierende Proteine ​​auftreten würde. GFP-Tagging eine zusätzliche Möglichkeit der Überwachungsfunktion in dem Fall erlaubt , wo die Fluoreszenz des GFP-markierte Protein kann als ein Teil eines funktionellen Assays verfolgt werden (siehe beispielsweise die Figuren 2 und 3). Eine Einschränkung dieser Studien wäre, wenn GFP irgendwie Proteinfunktion verändert. Durch die Verknüpfung der GFP an den C-Terminus des Proteins, eine große Anzahl von Proteinen bereits ohne eine scheinbare funktionelle Veränderung untersucht worden, aber eine solche Möglichkeit nicht existiert.

Radioisotopically haben markierten Liganden häufig verwendet worden Ligand 11 - Bindung an intakte Zellen zu studieren. diese Tests nicht erlauben einfache Bestimmung von Ligand Lage jedoch nach Bindung, noch haben sie erleichtern Vergleiche von Ligand und Rezeptor zusammen wie im vorliegenden Bericht. Ein GFP-Konstrukt bietet auch weitere Möglichkeiten, wie hier eine markierte Membranprotein zu untersuchen. Wegen der C-terminalen Position des GFP-Tag ist es möglich, die Position der GFP-Tag in transfizierten Zellen überall in einem Assay zu untersuchen. Immunofluoreszenz - Antikörper gegen GFP unter Verwendung ermöglicht den Vergleich von GFP zugänglich Antikörper mit und ohne Permeabilisierung (Abbildung 5). Zusätzliche Anwendungen von GFP-TMEM184A nutzen GFP Bildgebung wie die Kolokalisation mit Rhodamin-Heparin (Abbildung 2). FRET Einsatz Emission von GFP zu ermöglichen, das Rhodamin-Heparin zu erregen, wie in 2C gezeigt, stellt eine interessante Möglichkeit, Bindung und intrazelluläre tra zu bewertenfficking. Ferner FRET Daten zeigen, dass GFP nahe genug ist (innerhalb von 10 nm) mit dem Rhodamin-Ligand-Anregung zu übertragen. Der Nachweis , dass eine solche Übertragung von GFP an einen Liganden arbeitet , hat für Parathormon mit Tetramethyl-Rhodamin 14 markiert veröffentlicht. Alternative FRET-Technik (Photobleaching und / oder computergesteuerte Abbildungsmuster) kann auch für komplexere Analyse als verwendet werden, was hier als ein Beispiel dargestellt ist. In ähnlicher Weise Wechselwirkungen von anderen Proteinen mit dem Kandidaten könnten wie in der EGFP / mCherry System für FRET optimiert unter Verwendung von FRET mit Fluoreszenzmarkern untersucht werden al von Albertazzi et. 15 und die GFP / YFP und GFP - Paare in Kaliumkanal Studien , die von Wang und Kollegen verwendeten 16. Viele neue kleine fluoreszierende Moleküle konstruiert werden, beispielsweise 17. Diese Moleküle werden die Anzahl der Fälle erhöhen, in denen Wechselwirkungen FRET zwischen GFP-markierten Proteine ​​und fluorescent Liganden untersucht werden. Zukünftige Studien können auch Änderungen an dem Gen beinhalten gezielte, so dass das Konstrukt zu helfen, sequenzspezifische Aspekte der Genfunktion bestimmen. Eine Einschränkung für GFP-markierten Membranproteinen ist, wenn der C-Terminus des Proteins normalerweise nach innen ist. In solchen Fällen, FRET-Assays mit Fluoreszenzwasserlöslichen Liganden nicht möglich sein kann. Jedoch alternative Mechanismen GFP an anderer Stelle in dem Konstrukt zu platzieren noch möglich, dass einige solche Proteine ​​sein könnten, und die anderen hier berichteten Tests immer noch verwendet werden könnten.

Zusätzlich zur Funktion, Lokalisierung und in - vivo - Liganden - Wechselwirkungen, ein GFP-markiertes Protein kann ein Anti-GFP - Antikörper und das isolierte Protein isoliert werden verwendet , um Funktion zu untersuchen in vitro - Assays verwendet wird, wo der GFP eine unvoreingenommene Isolierung des Proteins ermöglicht , und eine vergleichsweise isoliert Kontrolle (frei GFP). Zusammen können diese Assays starke zusätzliche Beweise benötigt, um th zu beweisenan den Proteinfunktionen Kandidaten als vermutet.

Da ferner GFP - Protease resistent , es sei denn mit Stellen modifiziert , dass erstrecken sich von der kompakten Struktur 18, begrenzte Protease - Behandlung von Zellen ist , sollte extrazelluläre GFP freizusetzen. Die Spaltung Protease würde in dem Protein auftreten, denen GFP gebunden ist oder in einer Verknüpfungsregion ausgelegt. Das freigesetzte Produkt wäre GFP mit einem Verlängerungs N-terminal an die GFP-Sequenz. Trypsin nicht GFP freigeben, wenn der C-Terminus des Proteins GFP zugewiesen ist, intrazellulär. Eine vorläufige Analyse der potenziellen Produkte könnte ein klares Molekulargewicht Muster mit einem GFP-markierten Protein vorschlagen durch Trypsin freigesetzt. Für viele Membranproteine, würde dazu führen solche Techniken in klarer Beweis für die Membrantopologie durch die Freisetzung von GFP, oder deren Fehlen.

Zusammen bilden die spezifischen Tests vorgestellt und / oder in diesem Bericht bieten eine breite Probenahme von Techniken t vorgeschlagenHut kann neue Proteine, indem mit einem fluoreszierend markierten Konstrukt zu untersuchen, eingesetzt werden. Solche Konstrukte kommerziell leicht erhalten werden kann. Die Möglichkeit, sie für eine breite Palette von Techniken zu verwenden, macht sie auch für kleine Labors auf begrenzte Budgets wirtschaftlich machbar ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in Figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)
Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10x solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
  2. Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. (2016).
  3. Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. (2016).
  4. Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
  5. Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
  6. Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
  7. Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
  8. Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
  9. Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
  10. Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
  11. Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).
  12. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. (2011).
  13. Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
  14. Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
  15. Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
  16. Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
  17. Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
  18. Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
ein GFP-markierten TMEM184A Verwendung für die Bestätigung der Heparin-Rezeptor Identität Construct
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).More

Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter