Ved hjelp av en GFP-merket TMEM184A Construct for bekreftelse av Heparin Receptor Identity

Summary

Et konstrukt som koder for TMEM184A med en GFP-tag ved karboksy-terminus konstruert for eukaryot ekspresjon, ble anvendt i analyser konstruert for å bekrefte identifisering av TMEM184A som en heparin-reseptor i vaskulære celler.

Abstract

Når nye proteiner er identifisert ved affinitets-baserte isolasjon og bioinformatikk analyse, er de ofte er ukarakterisert i stor grad. Antistoffer mot spesifikke peptider innenfor den antatte sekvensen tillate noen lokaliserings eksperimenter. Men andre mulige interaksjoner med antistoffene ofte kan ikke utelukkes. Denne situasjonen gitt en mulighet til å utvikle et sett av analyser avhengig av proteinsekvensen. Nærmere bestemt ble en konstruksjon inneholdende gensekvensen koplet til GFP-kodende sekvensen ved den C-terminale ende av proteinet erholdt og anvendt for disse formål. Forsøk å karakterisere lokalisering, ligandaffinitet, og gevinst på funksjon ble opprinnelig designet og utført for å bekrefte identifiseringen av TMEM184A som heparin reseptor ^1. I tillegg kan konstruksjonen anvendes for undersøkelser rettet mot membran topologi spørsmål og detaljerte protein-ligand interaksjoner. Denne rapporten presenterer arange av eksperimentelle protokoller basert på den GFP-TMEM184A konstruksjonen uttrykt i vaskulære celler som lett kan tilpasses for andre nye proteiner.

Introduction

Identifisering av kandidat proteiner for nye funksjoner avhenger ofte på affinitet-basert isolasjon protokoller fulgt av delvis sekvensbestemmelse. Nyere eksempler på nylig identifiserte proteiner inkluderer trans protein 184A (TMEM184A), en heparin reseptor identifisert etter heparin affinitetsinteraksjoner ^1, og TgPH1, en pleckstrin homologi domene protein som binder phosphoinositide PI (3,5) P ₂ ^2. Annet nytt protein identifikasjon innebærer direkte sekvensanalyse av peptider slik som den som ved Vit, et al. som brukte trans peptider å identifisere proteinprodukter fra tidligere uncharacterized gener ^3. Tilsvarende kan identifisering av nye proteinsekvenser oppnås ved hjelp av bioinformatikk som søker av tidligere karakteriserte protein familier som identifisering av nye 4TM proteiner ^4. Undersøkelse av aquaporin familie gensekvenser har alså ga identifisering av nye medlemmer med nye funksjoner ^5. Etter identifikasjon og analyse av protein funksjon er typisk et neste trinn som noen ganger kan bli undersøkt ved hjelp av en spesifikk analyse av protein funksjon slik som i det tilfelle aquaporin.

Når det er mulig, kan funksjonen til en nylig identifiserte protein undersøkes med spesifikk enzymatisk eller lignende in vitro funksjonsanalyser. Fordi mange funksjoner av nye proteiner er avhengig av komplekse interaksjoner som forekommer bare i intakte celler eller organismer, in vitro analyser er ikke alltid effektive. Imidlertid må de in vivo, være utformet på en slik måte at de er avhengige av gensekvensen. I cellekultur, og / eller enkle modellorganismer, kan knockdown gi støtte bevis for protein / funksjonsidentifikasjon ^6. Med nye proteiner som er identifisert som nevnt ovenfor, er det ofte tilstrekkelig å bare slå ned et protein for å bekrefte funksjon, end utforming av in vivo funksjonelle analyser som er avhengige av gensekvens blir viktig for karakterisering av nye proteiner.

Den senere identifisering av TMEM184A som en heparin-reseptor (som modulerer proliferasjon i vaskulær glatt muskulatur og inflammatoriske responser i endotelceller) ved hjelp av affinitetskromatografi og MALDI MS ^{1, 7} gitt en mulighet til å utvikle en samling av analyser etter knockdown ga resultater i samsvar med identifikasjons . En nylig gjennomgang bekreftet at heparin interagerer spesifikt med flere vekstfaktorer og deres reseptorer, ekstracellulære matriks-komponenter, celle adhesjonsreseptorer, og andre proteiner ^8. I det vaskulære system, heparin og heparansulfat proteoglykaner (inneholdende heparansulfat kjeder tilsvarende i struktur til heparin) kommunisere med flere hundre proteiner ^9. Å funksjonelt bekrefte that TMEM184A var involvert med heparin opptak og binding, ble teknikker som benyttes genkonstruksjonen for TMEM184A utviklet. Denne rapporten inneholder en samling av analyser basert på en GFP-TMEM184A konstruere for bruk i å bekrefte identiteten til TMEM184A som heparin reseptoren.

Protocol

1. Design av en GFP-protein Construct

1. Kjøp, eller design og bygge, en GFP-merket konstruksjon basert på protein i spørsmålet.
   MERK: For en kjøpt konstruksjon, vanlige vektorer er tilgjengelige fra kommersielle laboratorier som inkluderer noen eller alle av følgende forslag: For en membran protein, velge en C-terminal plasseringen av GFP fordi det er mindre sannsynlighet for å forstyrre membran protein menneskehandel. Betrakt en forlengelse mellom genet av interesse og den GFP hvis det er grunn til å tro at den C-terminale enden av proteinet i spørsmålet er kompakt foldet inn i et domene av proteinet. Velg konstruksjon for generell eukaryote celle uttrykk, men la konstruere produksjon i bakterielle systemer. Omfatte et spaltningssete (slik som for TEV protease) ved hvilken GFP kan fjernes hvis det er ønskelig for noen eksperimenter hvor GFP kunne interferere med protein-aktivitet. Legg til andre innsatser som en ekstra kode for lokalisering eller tilhørighet imoter (f.eks His6). Dette var ikke nødvendig for analysene beskrevet heri, men kan lette andre analyser, eller være nyttige direkte ved siden av genet, før den GFP, hvis fjernelse av GFP er ønsket.

2. GFP-TMEM184A Expression i vaskulære celler

1. Kultur endotelial eller vaskulære glatte muskelceller i 0,2% gelatin-belagt vev kulturskåler som rapportert tidligere ^{1, 6, 7.}
2. Tilsett 5 ml cellekultur trypsin-oppløsning (0,5% w / v) til et skylles 100 mm eller større, sammenflytende skål av celler. Inkuber ved 37 ° C inntil cellene er bare frigjøres fra platen, og overføre cellene til en steril polypropylen sentrifugerør.
3. Legg til en trypsin-inhibitor (for eksempel et tilsvarende volum av vanlig kulturmedium), som anvendt i rutine kultur, til cellen / trypsin-løsning for å begrense trypsin-aktivitet. Pellet cellene i 5 min ved approximbart 600 xg (eller passende hastighet og tid til å bare pellet cellene for standard vev kultur). Aspirer supernatanten.
4. Resuspender celler i 1 ml HeBS (Hepes-bufret saltvann) elektroporasjon buffer, noe som begrenser den tiden cellene er i pelleten eller suspensjon. Plasser cellesuspensjonen på is og utføre resten på is.
   MERK: Pellet kan vaskes én gang med HeBS før resuspensjon.
5. Tilsett tilstrekkelig volum av GFP-merket plasmid TMEM184A til cellene for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 20 pg / ml DNA. Bruk en identisk protokoll for en GFP konstruere.
6. Plasser omtrent 0,4 ml av celleløsningen i HeBS i en electroporation kyvette. Pre-chill kyvetter før bruk.
7. Electroporate cellene ved hjelp av følgende betingelser: eksponentiell, 500 uF, ∞ ohm, og 170 V.
   MERK: spenning for en gitt celletype skal være optimalisert. Foreløpige studier med endotelceller og glatte muskelceller cell typer ble oppnådd med en GFP-vinculin konstruksjon for å finne den optimale spennings bemerket her, f.eks ^10.
   1. For å optimalisere elektroporering, start med anbefalingene fra maskinprodusenten (som omfatter forhold for noen standard celletyper). Bruk ønskede konstruksjon eller en kontroll fluorescent protein konstruere lik i størrelse og fluoriserende egenskaper til den ønskede konstruksjon.
      MERK: Liten nukleinsyrer ser ut til å gå inn celler lettere enn større konstruksjoner, så en konstruksjon med kun en fluorescerende protein kan være lettere å uttrykke enn en større.
   2. Bruke fluorescens mikroskopi for å bestemme celle-levedyktighet, prosentandelen av celler i hvilke den fluorescerende konstruksjon blir uttrykt etter 24 og 48 timer, og intensiteten av uttrykket.
      MERK: Reduser spenning og / eller tiden litt om overlevelse er lav. Sikt på kortest mulig tid mellom utgivelsen av celler fra kulturen overflaten og returceller til kultur for å forbedre overlevelse. Liten økning i tid eller en annen puls kan forbedre konstruksjonen opptak hvis overlevelse er høy, og uttrykket er lav. Optimale forhold og uttrykk vil variere mellom celletyper. Dersom prosentandelen av celler som uttrykker konstruksjonen er høy, men intensiteten er lav, noe som øker DNA-konsentrasjonen og overvåking av transfekterte celler over tid for optimal intensitet, som vil variere basert på protein halveringstid, så vel som ekspresjon, kan forbedre intensitet. Fargeintensitet kan forstørres for enkelte analyser, om nødvendig, ved immunofluorescens farging av GFP med anti-GFP-antistoffer
8. Etter electroporation, frø cellene i seks 30 mm vev kultur brønner med dekkglass for bildebehandling eller i vev kultur retter. Kultur av cellene ved hjelp av standard cellekulturfremgangsmåter.
9. Valgfritt: Bytt kulturmediet etter 24 timer for å fjerne eventuelle HeBS electroporation buffer.

3. Visualisering av GFP-TMEM184A Lokalisering

1. Skyll cellene med PBS og forsiktig risting etter dyrking i minst 24 timer. Begrense eksponering for sterkt lys å unngå GFP falming.
2. Løs celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 15 minutter ved romtemperatur med forsiktig risting. Unngå å bruke metanolholdig reagenser som kan permeabilize cellene. Fiksering med metanol kan benyttes dersom det ikke er nødvendig å vurdere ligand interaksjoner.
   Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr. Bruk i et avtrekksskap, med forsiktighet, og kast riktig.
3. Skyll med PBS som ovenfor. For antistoff basert farging, se 3.6 nedenfor.
4. Mount Dekk til lysbilder ved hjelp Mowiol eller annet egnet monteringsmedium.
5. Bilde lysbilder ved hjelp av en confocal eller fluorescens mikroskop med riktige filtersett for GFP eksitasjon og emisjonsspekter. Konfokal mikroskopi er foretrukket på grunn av evnen til å skille prøvene i z-planet. Lagre bildene i gråtoner for quantitation formål i TIF-format (i tillegg til full farge bilder for illustrasjoner).
6. For sammenligning med WT TMEM184A uttrykt av cellene, fremstille andre celler for immunofluorescens ved å bruke primære antistoffer fremstilt til et peptid (er) fra TMEM184A sekvens, for eksempel ^en. Identifisering av GFP-TEMEM184A kan også oppnås ved anvendelse av antistoffer mot GFP. Evaluere begge celleprøver av identiske mikroskopi teknikker.

4. Rhodamine-Heparin Binding og colocalization med GFP-TMEM184A-transfekterte celler

1. Unn GFP-TMEM184A-uttrykke celler med 100 mikrogram / ml rhodamine-heparin lagt til kultur medium, og la cellene til å ruge for en bestemt tidsperiode, vanligvis mindre enn 10 min for A7r5 celler. Skyll og fikse som i 3.1 og 3.2.
   NB: Den optimale tid og konsentrasjon av ligand som er avhengig av cellerespons, fluorescensintensiteten av liganden og bildeintensiteten oppnådd. dette Konsentraterion av heparin ble anvendt fordi den resulterer i mer enn 50% reaksjon i andre analyser ^11. Denne konsentrasjonen kan visualiseres ved bruk av standard fluorescens mikroskopiteknikker, slik at det ikke var nødvendig å øke den. Fortynning av rhodamin-heparin med umerkede heparin resulterer i lavere fluorescens i cellene, er således vanskeligere å avbilde og kvantifisere.
2. For å kvantifisere rhodamine-heparin bindende grunnet GFP-TMEM184A transfeksjon, forberede identiske celler uten transfektert GFP-TMEM184A.
3. Bilde cellene ved hjelp av en konfokalmikroskop med riktig GFP (488 nm) og rhodamine (543 nm) eksitasjon og emisjon (500-530 nm for GFP og større enn 560 nm for rhodamine) verdier for å fastslå samlokalisering. Få bilder på minst 50 celler fra minst tre separate forsøk å få statistikk. Opprettholde identiske innstillinger innenfor eksperimenter, og benytter en kontrollprøve (r) (f.eks transfekterte celler med ingen behandling) thved kan brukes for å standardisere data for analyse av flere eksperimenter.
4. Undersøke bildene ved hjelp av et dataprogram for å bestemme relativ rhodamine binding / opptak i hver celle for kvantifisering av bindende.
   MERK: TIF bilder bør benyttes som de er praktisk for analyse og kan konverteres til gråtoner i mange dataprogrammer om de i utgangspunktet ikke var lagret i dette formatet. Bilde J (freeware) ble anvendt i foreliggende analyse og tillater område og pikselintensiteten som skal måles, for hvilken som helst brukerdefinert område i et bilde.
   1. Bruk en frihånds verktøy for å sirkle en celle i et fluorescerende bilde og bruke måleverktøy til å bestemme intensiteten i det rommet.
      MERK: Disse målingene gir den nødvendige informasjonen til å beregne total intensitet for en brukerdefinert område (hele cellen, kjernen, etc.) som gir en måte å sammenligne ulike celler med forskjellige geometrier. Gjennomsnittlig intensitet over et område på bakgrunn kan bli rapportert, og som legger til rettes samling av bakgrunnsintensitet for analyse.
   2. Eksport til et regneark for å beregne arealet multiplisert med intensitet og trekke bakgrunnen for det samme beløpet av området. Gjennomsnittlig fluorescens / celle for nok celler / eksperiment for å oppnå statistisk signifikans.

5. Fluorescence Resonance Energy Transfer fra GFP-TMEM184A til Rhodamine-Heparin

1. Forbered transfekterte celler og inkuberes med 200 mikrogram / ml rhodamine-merket ligand som i 3.1. Legg merke til at inkubasjonstiden med fluoriserende ligand er celletype-avhengig. Fest med PFA bare og montere lysbildene for bildebehandling.
2. Først opphisse ved 405 nm og bilde for rhodamine utslipp (566-685 nm; FRET). For det andre, opphisse på 488 for GFP (bilde på 493-530), og tredje, opphisse på 561 for rhodamine (bilde på 566-685). Kontroller uten GFP-TMEM184A eller uten rhodamine-heparin er kritiske.

6. Levende celler Imaging av Rhodamine-Heparin Opptak

1. Seed GFP-TMEM184A transfekterte celler i enkelte retter utformet for live-cell imaging og behandles som i protokoll 3.
   MERK: Antall celler som kreves avhenger av celletype og tetthet ønsket. For å minimalisere mengden av tid celler er i suspensjon, ikke telle celler. Seed celler fra en 100 mm konfluent rett inn i seks 35 mm levende bilde retter å få celler nær samløpet i 48 timer.
2. Etter 48 timer, erstatte mediet med kultur medium uten fenol rødt.
3. Overfør et fat med celler til en konfokal mikroskop med en oppvarming scenen for å opprettholde temperaturen, og fokusere mikroskopet.
4. Pipetter 100 mikrogram / ml rhodamin-heparin i formen og forsiktig blanding.
5. begynne umiddelbart opptak levende bilder. Hvis ingen celle opptak av heparin forekommer innenfor samme område som i visningen, beveger tallerken lett å identifisere celler med minst en grønn vesikkel-inneholdende rhodamin etiketten.
   MERK: Imaging eksitasjon og utslipps detaljene ersamme som for heparin opptak protokollen (§ 5). Tidsperioden mellom bildene var ca 16 s. Betingelsene for forsøket og mikroskop vil typisk bestemme den hastighet med hvilken bilder kan oppnås.

7. Isolering av GFP-TMEM184A og GFP fra dyrkede celler

1. Etter fjerning av kulturmedium og skylling med PBS, tilsett 2 ml 0,2% (vekt / volum) CHAPS 1 x PBS-oppløsning med proteaseinhibitorer til en 150 mm plate av celler som uttrykker GFP-TMEM184A eller GFP (for kontrollbindingsanalyser). Skrap cellene fra fatet, plassere celler / CHAPS løsning i en 15 ml polypropylen rør på is, og bland godt ved å trykke på. Fullfør alle trinnene i sterkt lys for å sikre at GFP tag blekes for bindingsanalysen nedenfor.
2. Til spesifikt å binde GFP-TMEM184A (eller en passende GFP-kontroll), legge til 2 ug / ml biotinylert anti-GFP-antistoff til oppløsningen og inkuber over natten ved 4 ° C med gynge.
3. Legg 500 mLav streptavidin-agarose perler på minst 5 ml 0,2% CHAPS / PBS og sentrifuger ved ca. 600 x g i 3 til 5 min. Fjern supernatanten. Gjenta ytterligere to ganger med frisk CHAPS / PBS hver gang. Legg perler til antistoffet og celleløsning og inkuber over natten ved 4 ° C med gynge for å tillate kulene å binde til biotinylerte anti-GFP-antistoff bundet til GFP eller GFP-TMEM184A.
4. Pellet perler ved sentrifugering (som i 7.3) og fjern ubundet materiale. Tilsett minst 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / proteaseinhibitorer for å vaske. Gjenta vask og sentrifugering minst 3x for å effektivt fjerne ubundet protein.
5. Etter å ha fjernet den siste vask, inkuber perlene med 1 ml 0,2 M glycin / 0,2% CHAPS i PBS (pH til 2,0 ved bruk av HCl) på is i 3 minutter for å dissosiere antistoff-GFP-binding (som resulterer i fri GFP-TMEM184A eller fri GFP). Bland forsiktig ved å trykke på hver 30 s.
6. Sentrifuger ved omtrent 600 x g og overføre supernatanten inneholdende den rensede protein til et nytt 15 ml rør etterfulgt av umiddelbar nøytralisering med 5 ml 1 M natriumbikarbonat (bringe pH til 7).
7. Konsentrer prøven ved anvendelse av en 10.000 Dalton molekylvekt cut-off sentrifugal konsentrator (ansette sentrifugehastigheten som er anbefalt av leverandøren). Når volumet når omtrent 0,5 ml, tilsett 0,2% CHAPS / PBS. Fortsett å konsentrere seg og legge til flere 0,2% CHAPS / PBS før minst ti volumer (ganger startprøvevolum) av 0,2% CHAPS / PBS har blitt lagt til.
8. For å bestemme et estimat på mengden av isolert GFP eller GFP-merket protein, oppnå en absorbansavlesning ved 280 nm og sammenligner det med en standardkurve fremstilt fra bovint serumalbumin eller andre kontroll-protein i den samme buffer.
   MERK: På grunn av utryddelse koeffisient forskjeller, er denne konsentrasjonen et anslag, men kan gi en omtrentlig proteinkonsentrasjonen til rette for videre analyse uten å sløse med prøven. Nøyaktig Proteinkonsentrasjonen kan avskrekkeminelagt ved hjelp av en mikro-Lowry-proteinanalyse å være sikker på å fremstille standard protein i den samme buffer som prøven. Videre analyse av det isolerte protein kan oppnås ved Western-blotting av det isolerte protein (ved hjelp av antistoff deteksjon for GFP) og sammenlignet med den forutsagte molekylvekt. Alternativt kan anvendelse av TMEM184A antistoffer bør resultere i et band av den forutsagte størrelse konstruksjonen, men kan også resultere i en WT TMEM184A bånd hvis dimer (eller høyere-ordens oligomerer) er til stede i prøven. Et estimat av renhet kan oppnås ved farging et blot for total protein fra den isolerte prøven vs total protein fra en delmengde av utgangsmateriale.

8. In Vitro Heparin Binding Assay

1. Fremstille en svart avidin-belagte 96-brønns plate ved vasking med 200 ul 0,2% CHAPS / PBS tre ganger i 5 min med risting. Forbered en identisk svart noncoated 96-brønns plate ansette den samme vaskeprosedyren. Utarbeide enlayout for de eksperimentelle prøver (in triplo) for å følge i løpet av analysen. Inkluder brønner for standard heparin konsentrasjoner, buffer kontroller og brønner med GFP prøver uten heparin for å bekrefte bleking av GFP.
   MERK: Hvis optimaliserte isolerings- eller ligand interaksjoner buffere er forskjellig for proteinet i spørsmålet, gjøre alle de plate preparater og vasking med den optimale buffersystem.
2. Tilsett 100 ul av 60 pmol / brønn biotinylert anti-GFP til alle brønnene i avidin-belagte plate hvor GFP-binding er ønsket. Mengden av antistoff som er tilstrekkelig til bare å mette den høyaffinitets avidin i brønnene.
   1. Legg buffer bare til alle brønnene brukes til kontrollformål (ingen GFP eller GFP-TMEM184A binding ønskelig). Tett brønnene med en plate dekke for å hindre fordamping. Inkuber i 2 timer ved RT, med risting.
      MERK: Volumene lagt til brønner og inkubasjonstid er basert på anbefalinger fra leverandøren.
3. Vask alle brønnene tre gangeri 5 min med 200 ul 0,2% CHAPS / PBS.
4. Tilsett 100 ul av 5 nmol / brønn GFP-TMEM184A eller GFP til egnede brønner i en avidin-belagte plate og inkuberes i 1 time ved romtemperatur med risting. Vask igjen som i 8.3.
   MERK: Denne konsentrasjonen av protein ble valgt for å sikre at alle områder var mettet med overflødig GFP eller GFP-TMEM184A. Dette er viktig for å sikre at den samme mengde protein er bundet til hver brønn. Lavere mengder av protein kan også mette de områder, en mulighet som kan undersøkes ved å evaluere ubundet protein som er tilbake etter inkubering av flere konsentrasjoner av protein med platen og sammenligne ubundet protein og ligand bindingsanalyser.
5. Fremstille forskjellige konsentrasjoner av fluorescein-merket heparin, for eksempel, 10, 25, 50, 75, 100, 200 pg / ml, i 0,2% CHAPS / PBS. Gjør dette og alt gjenstående arbeid i mørket.
   MERK: Før forbereder konsentrasjoner, bør spesifikke konsentrasjoner for andre ligander fastsettes for Proteinkonn målet i spørsmålet. Den laveste konsentrasjonen skal være synlig i plateleser. Derfor er det viktig å først bestemme området som kan påvises nøyaktig i buffersystem som anvendes. Deretter bestemme omfanget nødvendig for å oppnå målbar binding. Konsentrasjoner av fluorescein-heparin under 10 pg / mL hadde ikke gjennomgående registrere i plateleser i henhold til bufferbetingelser. Tilsvarende, mens rhodamin-heparin slik som anvendt i de andre analyser, kan bli visualisert i plateleser, i bufferbetingelser og ved de konsentrasjoner som kreves for binding, fluorescens avlesningene for standardene var ikke reproduserbart forskjellig fra den som fluoroforen.
6. Tilsett 100 ul av fluorescein-heparin til passende testbrønner i avidinbelagte plate og konsentrasjon av standard brønner i både avidin-belagte og ikke-belagte plate. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur med risting. Hold platene i mørket (eller folie dekket).
7. Ved hjelp av en plate reader, registrerer den første fluorescensemisjonen fra heparin i kontrollbrønnene i begge plater og det første fluorescens (total) utslipp fra brønner med immobilisert GFP-TMEM184A eller GFP i den avidin-belagte plate. Hvis det er nødvendig, kan du justere instrumentet gevinst å sikre påvisning av fluorescerende heparin mellom laveste og høyeste konsentrasjoner.
   MERK: Vær sikker på platen leseren leser brønner ovenfra og leser på optimal plassering i brønnene hvis det er justerbar. For den aktuelle studien, den optimale plassering var omtrent 75% ned brønnene. Informasjon tilgjengelig med plateleser bør gi forslag som er unike for plateleser i spørsmålet for å lese analyser av bundet prøve i sorte plater.
8. Fjern ubundet fluorescerende heparin fra brønner med immobilisert GFP-TMEM184A eller GFP og fyll i tilsvarende brønner i den ikke-belagte svart plate. Umiddelbart lese fluorescensemisjonen.
9. Tilsett 100 ul friskt 0,2% CHAPS / PBS tilbake into brønner hvorfra det fluorescein-heparin ble fjernet, og lese fluorescensemisjon.
10. Gjenta trinn 08.08 til 08.09 3x.
    MERK: Disse målingene fra den belagte platen indikere fluorescein heparin igjen i GFP eller GFP-TMEM184A brønner. Dersom betydelig fluorescens er funnet i den tredje ubundne prøven, bør en ytterligere vask oppstår. Hvis fluorescens fortsetter å bli fjernet i hver vask, kan binding av ligand være lav affinitet, og forholdene bør revurderes. Den endelige lesing utgjør bundet heparin lesing.
11. Record fluorescens utslipp fra de fjernede, ubundet, prøver i noncoated plate, innhenting av tall for hver vask. Disse er de "ikke-bundne" avlesninger.
12. Bruk totale heparin utslipps verdier oppnådd i 8.7 for å bekrefte den riktige nivåer av heparin tilsatt til hver brønn. Trekk fra gjennomsnittlig bakgrunnsavlesninger fra verdiene.
    MERK: Wells uten fluorescein-heparin tjene som bakgrunn på grunn av antistoff, GFP og buffer. average bakgrunnen gjentas for å oppnå den bakgrunnsverdi. Trekk fra gjennomsnittlig bakgrunnsavlesninger fra de bundne og ubundne målinger for å få faktiske verdier.
13. Anvende et plott av utslipp i forhold til totalt fluorescein-heparin tilsettes for å bestemme omfanget av utslipp kontra mengden av heparin.
    MERK: Antistoff alene, eller antistoff og antigen resulterte i noen slukking av fluorescens. Derfor ble total heparin fastsettes basert på den totale lagt heparin som nevnt i 8.7.
14. Plott den korrigerte bundet heparin vs. lagt heparin for tre paralleller i både GFP-TMEM184A saken og GFP saken.
15. Bestemme fri ligand ved tilsetning av de ikke-bundne avlesninger fra alle vaskinger for en bestemt konsentrasjon.

Representative Results

Selv om i teorien transfeksjon av en hvilken som helst DNA-konstruksjon inn i cellene kan oppnås med lipofile transfeksjon reagenser, tidligere rapporter indikerer mer effektiv transfeksjon av GFP-konstruksjonene til endoteliale celler ved hjelp av elektroporering ^12. Protokollen gitt her oppnås typisk GFP-konstruere ekspresjon i mer enn 80% av de primære avledet endotelceller og glatte muskelceller som brukes. Utformingen av den anvendte konstruksjonen benyttes et kommersielt tilgjengelig system som kan levere denne konstruksjonen raskt. Den store tiltenkte bruken var fokusert på plasseringsproblemer, derfor riktig levering til membranen, sammen med optimal eukaryote protein uttrykk og fortsatte konstruere produksjon var primære hensyn. Andre hensyn kan omfatte: forskjellig plassering av GFP til en annen lokaliserte proteiner eller proteiner med en C-terminal som er en del av et brettet område, muligheten for wanting for å fjerne GFP (tilsetning av en protease spaltningssete), og en sekundær affinitet område. Det sistnevnte ville gi alternative måter for rensing av GFP konstruere og å stabilisere den på en overflate for bindingsanalysen. For å bekrefte fargemønstre for ulike kommersielle antistoffer mot TMEM184A, vaskulære celler uttrykker GFP-TMEM184A ble sammenlignet med identiske celler farget med de kommersielle antistoffer. Lengden av tid etter transfeksjon virkninger fordeling av GFP-TMEM184A, som syntes å hope seg opp i løpet av minst 72 timer. Lengden av tid etter transfeksjon som resulterer i optimal ekspresjon varierer avhengig av celletype og skal være optimalisert for hver enkelt teknikk. Over tid, mer GFP etiketten var i peri-atom regionen. Avhengig av kjøreegenskaper, GFP bleking også forekommet. Resultatene indikerte GFP-TMEM184A på celleoverflaten og i peri-nukleære og andre vesikkel strukturer som ligner på lokalisering observert med TMEM184A antistoff-farging (figur 1). De primære celler i figur 5, hvor teknikken ble også brukt til å evaluere membran topologi.

Bruken av en fluoriserende ligand (rhodamin-heparin) lettes evaluering av ko-lokalisering av ligand og reseptor over tid, og de to etiketter gjorde det mulig å utføre sanntidsavbildning (figur 2 og filmen 1). Figur 2C ble fotografert av spennende GFP ved 405 nm, men fange utslipp fra rhodamine (midterste bilde). GFP eksitasjon er begrenset ved 405 nm som ga begrenset utslipp også, men dette forhindret eksitasjon av rhodamine og en falsk FRET signal. Tilsvarende FRET-induced rhodamine utslipp var svak. I kontroller med GFP-TMEM184A uttrykk, men ingen rhodamine-heparin og andre med bare rhodamine-heparin var det ingen rhodamine utslipp med 405 nm eksitasjon. Etterpå ble total GFP (venstre bilde) og total rhodamine (høyre bilde) målt ved hjelp av standard eksitasjon / utslipp bølgelengder for hver fluorophore. Dataene i C understøtte ytterligere ko-lokalisering av ligand og GFP-TMEM184A. Rhodamine-heparin opptak i RAOEC kreves lengre inkubasjon i forhold til A7r5 celler. Ingen bevis for FRET ble observert i celler uten rhodamin-heparin eller i ikke-transfekterte celler. En ideell eksperiment ville inkludere en annen overflate GFP-konstruksjon som ikke skulle ha noen ko-lokalisering med liganden.

Oppkjøp eller gjenvinning av funksjon kan også oppnås med GFP-protein konstruksjoner og rhodamine-heparin. Dette ga mulighet til å bruke GFP som bevis for uttrykksnivå og ligand co-lokalisering og å kvantifisere interaksjoner. Nærmere bestemt, ble heparin opptak øket i GFP-TMEM184A konstruere-transfekterte A7r5-celler (figur 3). Stabile knockdown-celler som tar opp meget begrenset rhodamin-heparin ble produsert ^1, og disse ga et system hvor forsterkningen av funksjon kunne bli vurdert. Transfeksjon av GFP-TMEM184A konstruksjon resulterte i celler som igjen kunne internal rhodamin-heparin på nivå med villtype-celler eller ovenfor (figur 3). Det bør bemerkes at "ingen heparin" bilde er stabile knockdown-celler, som ikke uttrykker GFP som en reporter for knockdown-konstruksjonen. Bakgrunnsfluorescens var høyere i disse cellene, som observert i bildet som vises.

Det er ofte nyttig å bruke isolerte reseptor for bestemmelse av ligand spesifisitet for å redusere sannsynligheten for andre proteiner som vekselvirker med liganden. Bruken av en GFP-Proteinkonn-konstruksjon gir en betydelig fordel i denne forbindelse som GFP-taggen kan tjene som et håndtak for isolering av proteinet og unngår mulige interaksjoner av antistoffer eller andre interesse reagenser med ytterligere proteiner. GFP kan også uttrykkes i identiske populasjoner av celler og isolert ved anvendelse av samme prosedyre GFP affinitet. Dette tilveiebringer et kontrollprotein for ligand interaksjonsstudier. I det TMEM184A system, GFP-TMEM184A isolert ved anvendelse av et anti-GFP antistoffaffiniteten resulterte i spesifikk mettbar binding heparin, mens kontrollgruppen GFP ikke binde heparin (figur 4).

Vanligvis er GFP koder på konstruksjoner plassert i en ende av et protein. Den C-terminale plassering letter riktig protein handelen til en membran. Derfor kan tilgjengeligheten av GFP på en bestemt side av en membran tilveiebringe bevis for spesifikk topologi av et membranprotein hvis folding og topologi er ikke enlready kjent. Enkelt immunfluorescens farging med antistoffer mot GFP (slik som i figur 5) kan gi bevis for GFP plassering basert på antistoff-tilgang på ikke-permeabilized celler. De anti-GFP antistoffene gjenkjenner GFP selv om bleket. Immunofluorescerende farging vist i figur 5 antyder signifikant anti-GFP farging uten permeabiliseringen av de GFP-TMEM184A transfekterte celler som gir foreløpige bevis på at GFP på plasmamembranen er ekstracellulært. Åpenbart intracellulært protein i vesikler også blir farget i permeabilized celler. FRET bilder i figur 2C er i samsvar med denne foreslåtte topologi.

Figur 1: GFP-TEMEM184A Lokalisering i Cells Bekrefter TMEM184A Lokalisering Bestemmes av immunfluorescens. A) BAOECs transfektert med GFP-TMEM184A ble fiksert med 4% PFA. Nontransfected celler ble enten behandlet med is-kald metanol (MeOH) festing og permeabiliseringen eller 4% PFA fulgt av Triton X-100 permeabiliseringen (som nevnt). De nontransfected Cellene ble farget ved å bruke et antistoff mot et C-terminalt peptid fra TMEM184A (CTD) eller et N-terminalt peptid fra TMEM184A (NTD) og en sekundær anti-kanin-antistoff merket med TRITC. B) Eksempler på klonet (A7r5) og primær (BAOSMC) glatte muskelceller ble behandlet på samme måte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Imaging av GFP-TMEM184A med Rhodamine-Heparin. A) A7r5s elektroporert med GFP-TMEM184A ble behandlet med 100 ug / ml rhodamin-heparin forganger indikert og deretter fiksert med 4% PFA. Bildene er representative for to separate eksperimenter. B) A7r5 celler ble transfektert med GFP-TMEM184A og rhodamine-heparin ble lagt med umiddelbar levende avbildning. Utvalgte bilder fra filmen vises med en hvit loddrett strek som peker til den opprinnelige lokalisering av en GFP-belagt vesikkel som inneholder rhodamine-heparin. GFP etiketten og rhodaminfamilien flytte sammen. Skala barer = 2 mikrometer. C) RAOECs behandlet som i A ble fotografert for fluorescens resonans energi overføring av spennende ved 405 (GFP, for FRET) og sammenlignet med standard innstillinger, se protokoll 3,5. Panel A, og de to tidspunkter i B, ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Copyright American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Klikk her for å vIEW en større versjon av dette tallet.

Figur 3: GFP-TMEM184A Transfeksjon Gir Gain av funksjon. A) Signifikant lavere nivåer av rhodamin-heparin er sett i stabile knockdown A7r5 celler sammenlignet med villtype A7r5s, se eksempel bilder. "Ingen heparin" bilde er av stabile knockdown celler som uttrykker GFP som en markør for konstruksjon tilstedeværelse. Skala barer = 10 mikrometer. B) Transfeksjon av GFP-TMEM184A inn i både villtype og stabile knockdown-celler signifikant øker rhodamin-heparin-signal i disse celler basert på analyse av mer enn 50 celler / tilstand i tre uavhengige forsøk. Feilfelt representerer SEM. p <0,0001 basert på en Tukey-testen. Dette tallet ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Copyright American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Isolert GFP-TMEM184A binder Heparin. GFP-TMEM184A eller GFP ble isolert og bundet til avidinbelagte analyseplater. Fluorescein-heparin ble tilsatt i konsentrasjoner fra 0,056 nmol gjennom 1,111 nmol. Heparin bundet ble bestemt ved måling av emisjon ved 519 nm. GFP-TMEM184A (ruter). GFP kontroll (sirkler). Dette tallet ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. ^1. Copyright American Society for biokjemi og molekylærbiologi. _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: GFP-TMEM184A og Membran Topology. GFP-TMEM184A transfekterte celler ble enten fiksert med 4% PFA (øverst) eller fiksert med 4% PFA og permeabilisert ved hjelp av Triton X-100 (nederst). Celler ble farget identisk med anti-GFP primære antistoffer og Cy3 merkede sekundære antistoffer. Skala barer = 10 mikrometer. To forskjellige forsøk er vist. Sekundære bare-fargede celler viste egentlig ingen flekker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

pload / 55053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Movie 1:.. live-avbildning av GFP-TMEM184A med Rhodamine-Heparin (Høyreklikk for å laste ned) A7r5 celler ble behandlet som i figur 2B Filmen illustrerer GFP- TMEM184A og rhodamine-heparin vesikkel på toppen flytte sammen. Separate farge versjoner i tillegg til det fusjonerte versjonen av filmen blir vist. den vesikkel med GFP og inneholder rhodamin er sirkel.

Discussion

Protokollene som er rapportert her ble utformet for å gi bekreftende bevis for identifisering av TMEM184A som en heparin-reseptor i vaskulære celler ^1. Knockdown-teknikker rutinemessig anvendes som en mekanisme for å bekrefte identifisering av nye proteiner. Men noen funksjonell tap etter knockdown er vanligvis ikke tilstrekkelig bevis for at et kandidatprotein er den samme som reseptoren (eller annen funksjonelt protein). Det er også viktig å ha bevis for at kandidaten proteinet faktisk viser funksjonen. Ansette en konstruksjon for en roman gen merket med GFP gir gevinst på funksjons eksperimenter og letter isolering av merket protein basert på GFP affinitet. Elektroporering anvendes i denne protokollen lettes meget høy transfeksjonseffektivitet av konstruksjonen (større enn 80% av cellene uttrykte konstruktet). Imidlertid kan andre transfeksjon mekanismer brukes hvis elektroporasjon ikke er tilgjengelig eller ikke er ønsket. Det er flere fordeler ved å velge en GFP-merket konstruksjon for bekreftelse av en roman protein funksjon. For det første tjener den GFP som en reporter for transfeksjon og genekspresjon, og den tillater overekspresjon som skal overvåkes gjennom GFP hvis en cellelinje uten ekspresjon av proteinet ikke er tilgjengelig. For det andre gir de GFP-taggen et redskap for rensing av proteinet som ikke er avhengig av enten ligandaffinitet eller antistoffer mot peptider. For det tredje tilveiebringer GFP tag et verktøy for å undersøke komplekse immunofluorescerende lokalisering visualisert ved hjelp av antistoffer dannet mot unike peptider i målproteinet sekvens for å bestemme hvorvidt den aktuelle genproduktet er likeledes lokalisert.

Vinning av funksjonsanalyser med genkonstruksjoner blir brukt for en rekke formål, inkludert high-throughput screening for identifisering av nytt protein funksjon ^13. Ideelt sett ville gevinst på funksjonsanalyser ansette en godt studert klonet celle line som ikke uttrykker genet i spørsmålet (cellene må fremdeles uttrykker samvirkende genprodukter som tillater funksjon av den nylig uttrykt genet). Ved bruk av en spesifikk GFP-merket konstruksjon som i de foreliggende analyser, er det viktig å bruke celler i hvilke GFP-proteinet kan fungere. Således er valget av celler avhenger av funksjonen og, sannsynligvis på den celletype, hvor funksjonen normalt ville oppstå for å sikre samvirkende proteiner er til stede. GFP-merking kan en ytterligere måte å overvåke funksjon i det tilfelle hvor fluorescensen av GFP-merket protein kan følges som en del av en funksjonell analyse (se for eksempel figur 2 og 3). En begrensning til disse studiene ville være hvis GFP en eller annen måte forandrer proteinfunksjon. Ved å koble GFP til C-enden av proteinet, har et stort antall proteiner som allerede er blitt studert uten en åpenbar funksjonell endring, men en slik mulighet eksisterer.

Radioisotopically merkede ligander har ofte blitt brukt til å studere ligand-binding til intakte celler ^11. Men ikke disse analysene ikke tillate enkel bestemmelse av ligand plassering etter binding, heller ikke de rette for sammenligninger av ligand og reseptor sammen som i denne rapporten. En GFP konstruksjonen gir også ytterligere muligheter til å undersøke en merket membranprotein som her. På grunn av den C-terminale plassering av GFP-koden, er det mulig å undersøke plasseringen av GFP-taggen i transfekterte celler gjennom et assay. Immunfluorescens ved å bruke antistoffer til GFP tillater sammenligning av GFP tilgjengelig for antistoffer med og uten permeabiliseringen (figur 5). Andre anvendelser av GFP-TMEM184A dra nytte av GFP avbildning som colocalization med rhodamin-heparin (figur 2). Ansette FRET å tillate utslipp fra GFP å opphisse rhodamine-heparin som vist i 2C gir en interessant måte å vurdere binding og intracellulær trafficking. Videre FRET data indikerer at GFP er nær nok (i løpet av 10 nm) til den rhodamin-liganden for å overføre eksitasjon. Bevis for at slik overføring fra GFP til en ligand verk har blitt publisert for parathyreoideahormon tagget med tetra-rhodamine ^14. Alternative FRET-teknologi (foto-bleking og / eller datastyrt avbildningsmønster) kan også benyttes for mer kompleks analyse enn det som er vist her som eksempel. På samme måte kan interaksjoner av andre proteiner med kandidaten bli undersøkt ved hjelp av FRET med fluorescerende koder optimalisert for FRET som i EGFP / mCherry system rapportert av Albertazzi et al. ¹⁵ og CFP / YFP og GFP parene som brukes i kaliumkanal studier av Wang og kolleger ^16. Mange nye små fluorescerende molekyler blir utformet, for eksempel ^17. Disse molekylene vil øke antall saker der slite interaksjoner mellom GFP-merket proteiner og fluorescent ligander kan bli undersøkt. Fremtidige studier kan også innebære målrettet endringer i genet, slik at konstruksjonen for å fastslå sekvens spesifikke aspekter av gen-funksjon. En begrensning for GFP-merket membranproteiner er ved den C-terminale enden av proteinet er normalt på innsiden. I slike tilfeller FRET-forsøk med fluorescerende vannoppløselige ligander kan ikke være mulig. Imidlertid alternative mekanismer for å plassere GFP et annet sted i konstruktet kan fortsatt være mulig for noen slike proteiner, og de andre analysene rapportert her kan fortsatt anvendes.

I tillegg til funksjonen, lokalisering, og in vivo-ligand interaksjoner, kan en GFP-merket protein isoleres ved anvendelse av et anti-GFP-antistoff og det isolerte protein som brukes for å undersøke funksjonen ved anvendelse av in vitro-analyser hvor de GFP tillater en objektiv isolering av proteinet og en forholdsvis isolert kontroll (gratis GFP). Sammen disse analysene kan gi sterke ytterligere bevis for å bevise thpå kandidat protein fungerer som en hypotese.

Videre, fordi GFP er protease-resistent med mindre modifisert med områder som strekker seg bort fra den kompakte struktur ^18, bør begrenset protease behandling av celler frigjøre ekstracellulære GFP. Proteasespaltningsstillingen ville oppstå i proteinet til hvilken GFP er festet eller i en utformet binding region. Den frigjorte produktet vil være GFP med en utvidelse N-terminal til den GFP sekvensen. Trypsin bør ikke slipper GFP hvis den C-terminale enden av proteinet til hvilket GFP er festet er intracellulær. En foreløpig analyse av potensielle produkter kunne foreslå et klart molekylvekt mønster med GFP-merket protein utgitt av trypsin. For mange membranproteiner, ville slike teknikker resulterer i et klart bevis for membran topologi ved frigjøring av GFP, eller mangel derav.

Sammen de spesifikke analysene presentert og / eller foreslått i denne rapporten gir et bredt utvalg av teknikker tlue kan bli anvendt for å undersøke nye proteinene ved å starte med et fluorescent merket konstruksjon. Slike konstruksjoner kan lett skaffes kommersielt. Muligheten til å bruke dem for et bredt spekter av teknikker som gjør dem økonomisk mulig for selv små laboratorier på begrensede budsjetter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Light Sensitive
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Light Sensitive
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (PFA, methanol free)	Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific	PI28908 at Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes)	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	PI15510 at Fisher	Pay attention to shelf-life
Black 96-well plates	Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific	064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line	ATCC	CRL 1444	Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	B304-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells	Cell Applications, Inc.	B354-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads	Sigma	S1638
HeBS	Available from Bio-Rad		Can be prepared in the lab. The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus	Obtained from ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci used in Figure 1
GFP antibodies	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Used in Figure 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)	Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining.
CHAPS	Purchased from Sigma	C5849	Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35-mm dishes	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens	Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope	Nikon	C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens	Used for images in Figure 5
Confocal Microscope	Zeiss	Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens	Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes	Available from MidSci	EC2L	Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line	Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail
Cell Culture trypsin solution	Sigma	T4174	purchased as a 10x solution